Canfod A Nodweddu Nanoronynnau Mwynol-organig mewn Arennau Dynol

Tsui-Yin Wong^1,2,*, Cheng-Yeu Wu^1,2,3,* et al

Mae calcheiddiad ectopig yn gysylltiedig â chlefydau dynol amrywiol, gan gynnwys atherosglerosis, canser,cronigarenclefyd, adiabetesmellitus. Er bod nanoronynnau mwynau wedi'u canfod mewn pibellau gwaed wedi'u calcheiddio, mae natur a rôl y gronynnau hyn yn y corff dynol yn parhau i fod yn aneglur. Yma rydym yn dangos am y tro cyntaf bod dynolarenmeinweoedd a gafwyd o'r cam olafcronigarenclefydneu mae cleifion canser arennol yn cynnwys gronynnau mwynol crwn, amllamellar o 50 i 1,500 nm, ond ni welir unrhyw ronynnau mewn rheolaethau iach. Mae'r gronynnau mwynol i'w cael yn bennaf yn y matrics allgellog sy'n amgylchynu'r tiwbiau troellog, yn casglu dwythellau a dolenni Henle yn ogystal ag o fewn cytoplasm celloedd sy'n amlinellu tiwbyn, ac maent yn cynnwys ffosffad calsiwm amlgrisialog sy'n debyg i'r mwynau a geir mewn esgyrn a chalchiadau ectopig. Mae'rarenmae nanoronynnau mwynol yn cynnwys sawl protein serwm sy'n atal calcheiddiad ectopig mewn hylifau'r corff, gan gynnwys albwmin, fetuin-A, ac apolipoprotein A1. Gan fod y nanoronynnau mwynau-organig i'w cael nid yn unig mewn dyddodion calchedig ond hefyd mewn ardaloedd lle nad oes calcheiddiadau microsgopig, mae ein harsylwadau'n nodi y gall y nanoronynnau gynrychioli rhagflaenwyr calcheiddio a cherrig arennol mewn pobl.

Cyswllt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Mae calcheiddiad ectopig yn gysylltiedig ag atherosglerosis, canser,cronigarenclefyd, a diabetes mellitus 1-3. Mae astudiaethau diweddar yn dangos bod atherosglerosis acronigarenclefydmae cleifion ag arwyddion o galcheiddiad fasgwlaidd yn dangos mwy o afiachusrwydd a risgiau marwolaeth, sy'n awgrymu bod calcheiddiad ectopig yn niweidiol i iechyd pobl1,3. Gwelir calcheiddio digroeso hefyd mewn unigolion sy'n heneiddio ac mae'r rhan fwyaf o bobl dros 60 oed yn dangos arwyddion o galcheiddiad fasgwlaidd4. Am y rhesymau hyn, mae dehongli'r ffactorau sy'n achosi calcheiddiad ectopig a datblygu triniaeth effeithiol yn nodau pwysig.

Gellir diffinio calcheiddiad ectopig fel anghydbwysedd rhwng atalyddion a symbylyddion calcheiddio yn y corff. Mae atalyddion calcheiddio yn cynnwys proteinau serwm fel albwmin, fetuin-A, osteopontin, a phrotein matrics GLA yn ogystal â chyfansoddion bach fel pyroffosffad, tra bod hyperffosffademia a llid yn ysgogwyr mawr calcheiddiad5–7. Mae astudiaethau diweddar yn dangos bod inducers calchification yn actifadu proses cellog debyg i ffurfiant esgyrn yn ystod calcheiddiad fasgwlaidd7,8. Mae fesiglau matrics tebyg i'r rhai sy'n achosi mwyneiddiad wrth ddatblygu esgyrn hefyd wedi'u canfod mewn meinweoedd meddal wedi'u calcheiddio7–9. Mae'n debyg bod y fesiglau matrics hyn yn cael eu rhyddhau gan gelloedd cyhyrau llyfn fasgwlaidd sy'n gwahaniaethu i gelloedd tebyg i osteoblast, sy'n achosi calcheiddiad7.

Mae nanoronynnau mwynol (NPs) wedi'u canfod mewn meinweoedd meddal sy'n dangos arwyddion o galcheiddiad ectopig. Price et al. Canfuwyd bod y serwm o lygod mawr sy'n cael eu trin â naill ai'r bisphosphonate etironate neu gyda fitamin D harbwr mwynau-proteinau cymhlygau sy'n cynnwys yr atalyddion calcheiddiad fetuin-A a matrics GLA protein10,11. Yn yr un modd, Jahnen-Dechent et al. arsylwyd y gallai cyfadeiladau mwynau sy'n cynnwys fetuin-A, a elwir yn ronynnau calciprotein (CPPs), gael eu canfod yn hylif ascitig cleifion â pheritonitis calchynnu12. Mae astudiaeth ddiweddar gan Bertazzo et al. dangos presenoldeb NPs mwynau yn falfiau aortig a rhydwelïau coronaidd cleifion twymyn atherosglerotig a rhewmatig13. Er bod astudiaethau ar ffurfio gronynnau mwynol fel arfer wedi canolbwyntio ar y system gardiofasgwlaidd ddynol, mae'n parhau i fod yn aneglur a ellir dod o hyd i'r gronynnau mewn meinweoedd eraill ac a yw'r endidau hyn yn chwarae rhan mewn iechyd neu afiechyd.

Gwelsom yn gynharach fod NPS mwynau-organig yn ffurfio'n ddigymell mewn ffliw cyrff dynol ac anifeiliaid14-28. Disgrifiwyd y NPs mwynol hyn i ddechrau fel nanobacteria (DS) a chredwyd eu bod nid yn unig y celloedd lleiaf ar y ddaear29, ond hefyd yn achos trosglwyddadwy posibl o glefydau niferus, gan gynnwys clefyd Alzheimer, atherosglerosis, canser,arencarregffurfiad, polycysticarenclefyd, a prostatitis30–32. Fodd bynnag, mae ein canlyniadau wedi dangos bod DS mewn gwirionedd yn NPs mwynau anfyw sy'n dynwared bacteria cyffredin o ran eu morffoleg, twf, amlder, ac is-ddiwylliant15,18,22. Mae'r posibilrwydd y gall gronynnau mwynol tebyg i'r hyn a elwir yn DS i'w cael mewn meinweoedd dynol ac a yw'r gronynnau hyn yn chwarae rhan mewn afiechyd i'w archwilio eto.

Yn yr astudiaeth bresennol, rydym wedi datblygu dull nanomaterial i ganfod a dadansoddi NPs mwynau-organig mewn pobl afiach.arenmeinweoedd. Rydym yn dangos bod meinweoedd yr arennau o glefyd cronig yr arennau cam olaf a chleifion canser arennol yn cynnwys NPs mwynau amllamellar tebyg i'r gronynnau mwynau biomimetig sy'n gwaddodi'n ddigymell mewn hylifau'r corff in vitro. Mae ein canlyniadau yn datgelu mewnwelediadau beirniadol ynghylch cyfansoddiad biocemegol, mecanwaith ffurfio, a swyddogaeth fiolegol y gronynnau mwynau-organig hyn ac maent yn taflu goleuni ar fecanweithiau calcheiddio ectopig a chychwyn afiechyd yn y corff dynol.

Canlyniadau

Gwnaethom archwilio meinweoedd yr arennau a dynnwyd yn llawfeddygol oddi wrth gleifion dynol â naill ai clefyd cronig yn yr arennau cam olaf (n=2) neu ganser arennol (n=18; gweler Tabl 1; ar gyfer samplau canser arennol, gwnaethom ganolbwyntio ar yr elfennau nad ydynt yn - rhan ganseraidd o'r meinwe). Fel rheolyddion iach, buom yn astudio biopsïau arennau a gafwyd gan gleifion â naill ai trawma neu hematoma ond nad oedd ganddynt unrhyw swyddogaeth arennol annormal flaenorol (n=2; Tabl 1).

Dangosodd meinweoedd arennau unigolion iach nodweddion histolegol arferol, ac ni welwyd unrhyw galcheiddiad ectopig yn dilyn staenio von Kossa (Ffig. 1A, B). Ar y llaw arall, dangosodd meinweoedd arennau a gafwyd gan unigolion afiach ac wedi'u staenio â hematoxylin ac eosin (H&E) dystiolaeth o niwed i feinwe (Ffig. 2A-C, wedi'i nodi gan saethau), a dangosodd 80 y cant o'r meinweoedd heintiedig a archwiliwyd ddyddodion mwynoledig fel y'u datgelwyd. gan von Kossa staenio (Ffig. 1C-T, Ffig. 2E, F, calcheiddiad yn weladwy fel deunydd du a nodir gan saethau du; gweler hefyd Tabl 1). Sylwyd ar ddyddodion calchedig yn y cortecs a'r medwla, gan gynnwys y gofod allgellog o amgylch y tiwbiau troellog distal, tiwbiau troellog procsimol, dwythellau casglu a dolenni Henle yn ogystal â cytoplasm celloedd sy'n amlinellu'r tiwbiau a'r dwythellau (Ffig. 1C-T a Ffig. .2E, F). Ni chanfuwyd calcheiddiad yn y corpuscle arennol (Ffig. 2D).

Er mwyn archwilio natur y gwaddodion mwynau, gwnaethom baratoi adrannau arennau tra-denau i'w harsylwi trwy ficrosgopeg electron trawsyrru (TEM). Mewn sbesimenau sy'n cynnwys dyddodion mwynau microsgopig, canfuwyd gronynnau mwynol neu ronynnau yn cytoplasm celloedd epithelial arennol, yn y matrics allgellog o dan y bilen islawr, ac o fewn lwmen tiwbiau troellog procsimol a distal (Ffig. 3 A, B, mae gronynnau'n cael eu chwyddo ym mhanelau A1–A4 a B1–B4). Gwelwyd NPs mwynau hefyd o fewn celloedd yn leinio dolenni Henle a dwythellau casglu (Ffig. 3 C, D, wedi'u chwyddo mewn paneli C1, C2, a D1). Canfuwyd rhai gronynnau o fewn fesiglau mewngellol mewn celloedd arennol (Ffig. 3 A, paneli A1 ac A2). Roedd y dull microsgopeg electron a ddefnyddir yma hefyd yn ein galluogi i ddelweddu tu mewn i'r gronynnau mwynol; roedd rhai gronynnau'n cuddio modrwyau electron-drwchus am yn ail â haenau golau, electron-lucent (Ffig. 3A, paneli A3 ac A4, Ffig. 3C, panel C1). Mae nifer o bibellau gwaed, fel y rhenti vasa recta (rhydwelïau syth yr aren), wedi'n hamgylchynu gan nifer fawr o NPs mwynau (Ffig. 3D, panel D1). Felly canfuwyd NPs mwynau mewn gwahanol leoliadau ym mhob meinwe arennau dynol yn dangos arwyddion o galcheiddiad ectopig, ond ni chanfuwyd unrhyw ronynnau yn y rheolaethau iach a archwiliwyd.

Mae'n ymddangos bod y gronynnau mwynol a geir ym meinweoedd yr arennau yn debyg iawn i'r NPs mwynol-organig a ddisgrifiwyd yn ffurfio'n ddigymell mewn hylifau'r corff yn ein hastudiaethau blaenorol15,17 (ac yr ydym wedi'u galw'n fionau24). I wirio’r posibilrwydd hwn, fe wnaethom baratoi NPs (neu bionau) organig mwynau gan ddefnyddio dull dyddodiad fel y disgrifiwyd gennym yn flaenorol15. Mae'r dull hwn yn cynnwys ychwanegu ïonau gwaddodol fel calsiwm a ffosffad i gyfrwng meithriniad celloedd (cyfrwng Eryr wedi'i addasu gan Dulbecco neu DMEM) sy'n cynnwys hylif corff fel serwm dynol (HS), ac yna deor mewn amodau meithrin celloedd (gweler Dulliau). Roedd y gronynnau a gynhyrchwyd fel hyn (HS-NPS) naill ai'n sfferig neu'n ellipsoid ac yn dangos arwyneb mwynol llyfn neu grisialaidd (Ffig. 4A–E), yn debyg i'r gronynnau a ddisgrifiwyd yn gynharach yn hylifau'r corff22,23 yn ogystal ag mewn ascites dynol12 a rhydwelïau calchiedig13. Roedd y gronynnau mwynol yn debyg iawn i'r NPs mwynol neu ronynnau a welwyd yn meinweoedd yr arennau o ran eu morffoleg cyffredinol, strwythur amlhaenog, a nodweddion arwyneb (Ffig. 4 F - J). Roedd maint y gronynnau sy'n deillio o HS a gronynnau arennau hefyd yn gymaradwy, yn amrywio o 50 i 1,500 nm mewn diamedr (Ffig. 4A-E, F-J). Fel y nodwyd uchod, roedd rhai gronynnau arennau wedi'u hamgylchynu gan bilen lipid, o bosibl yn cynrychioli fesiglau cargo mewngellol neu fesiglau pilen allgellog (Ffig. 4H,I, dynodir pilenni gan saethau); strwythurau membranous o'r fath yn absennol yn HS-NP sbesimenau a baratowyd in vitro ( Ffig. 4 A - E ). Mae'r arsylwadau hyn yn awgrymu bod gronynnau arennau yn debyg i'r NPs mwynol-organig sydd wedi'u hymgynnull mewn serwm.

Gan ddefnyddio dadansoddiad diffreithiant electron ardal dethol, gwelsom fod y cyfnod mwynau o HS-NPs a baratowyd yn in vitro yn cynnwys nanomaterial amlgrisialog (Ffig. 4 E, mewnosodiad; sylwch ar y cylchoedd consentrig gwan). Cafwyd canlyniadau tebyg ar gyfer gronynnau arennau (Ffig. 4J, mewnosodiad) ac ar gyfer calcheiddiadau esgyrn a ectopig fel y disgrifiwyd mewn astudiaethau blaenorol33,35.

Fe wnaethom astudio cyfansoddiad cemegol HS-NPs a gronynnau arennau gan ddefnyddio sbectrosgopeg pelydr-X sy'n gwasgaru ynni (EDX). Dangosodd HS-NPs gopaon mawr o garbon (C), calsiwm (Ca), ocsigen (O), a ffosfforws (P) (Ffig. 4K), yn gyson â phresenoldeb mwyn calsiwm ffosffad. Nodwyd brig isel o silicon (Si) hefyd yn HS-NPs (Ffig. 4K), o bosibl yn cynrychioli cyfansoddyn mân gronynnau. Roedd gronynnau arennau hefyd yn dangos copaon o garbon, calsiwm, ocsigen, a ffosfforws, sy'n arwydd o fwyn calsiwm ffosffad, ynghyd â chopaon ychwanegol o silicon a haearn (Fe) (Ffig. 4L). Priodolwyd copaon wraniwm (U) i'r asetad wranyl a ddefnyddiwyd fel adweithydd cyferbyniol wrth baratoi sampl (gall presenoldeb wraniwm mewn rhai samplau o ronynnau mwynau fel gronynnau arennau a'i absenoldeb yn y meinwe reoli yn Ffig. 4M gael ei briodoli i'r uchel). affinedd wraniwm ar gyfer ffosffad, fel yr adroddwyd yn flaenorol35). Roedd rheolaeth sbectra EDX o feinwe'r arennau o amgylch y gronynnau yn dangos copaon o garbon ac ocsigen (Ffig. 4M), sy'n awgrymu bod calsiwm a ffosfforws i'w cael yn bennaf yn y gronynnau mwynol.

Roedd cymarebau calsiwm: ffosfforws (Ca:P) o HS-NPs a gronynnau arennau yn amrywio o 0.65 i 1.18. Mae'r cymarebau hyn yn wahanol i'r gwerth damcaniaethol o 1.67 a welwyd ar gyfer stoichiometrig hydroxyapatit ond maent yn dal i fod o fewn yr ystod a welwyd yn gynharach ar gyfer crisialau calsiwm ffosffad a apatit a welwyd ar wahanol raddau o grisialu15. Gyda'i gilydd, mae'r canfyddiadau hyn yn cadarnhau bod y gronynnau arennau yn cynnwys NPs calsiwm ffosffad.

Canfuwyd bod proteinau amrywiol yn atal calcheiddiad ectopig mewn modd systemig yn y corff36,37. Yn ogystal, credir bod y corona protein a geir ar wyneb NPs synthetig yn pennu bioddosbarthiad ac effeithiau'r gronynnau ar gelloedd in vivo38,39. Ar y llaw arall, mae cyfansoddiad protein NPs mwynol-organig a geir mewn meinweoedd arennau dynol yn parhau i fod yn anghyflawn. Canfuom yn flaenorol fod albwmin, fetuin-A, ac apolipoprotein-A1 (apo-A1) yn cynrychioli'r prif broteinau sy'n rhyngweithio â NPs mwynol-organig a ffurfiwyd yn hylifau'r corff17,20. Yma fe wnaethom ddefnyddio labelu immunogold i archwilio presenoldeb a lleoliad uwch-strwythurol y proteinau hyn o fewn gronynnau arennau.

Defnyddiwyd gwrthgyrff polyclonaidd yn erbyn albwmin serwm dynol (HSA), serum fetuin-A (HSF), apo dynol-1A, a HS cyfan i archwilio presenoldeb proteinau serwm mewn HS-NPs a gronynnau arennau. Dilyswyd penodoldeb y gwrthgyrff polyclonaidd (a baratowyd fel y disgrifiwyd yn gynharach25) gan ddefnyddio blotio Gorllewinol (Ffig. 5). Ymatebodd pob un o'r gwrthgyrff polyclonaidd yn bositif gyda'r HS-NPs a baratowyd in vitro yn ogystal â'r gronynnau mwynol a geir ym meinweoedd yr arennau dynol (Ffig. 6A, B, paneli A1-A3 a B1-B3; dotiau du). Adweithiodd yr gwrthgyrff yn bennaf â'r haenau electron-drwchus neu graidd tywyll HS-NPs a gronynnau arennau (Ffig. 6A, B), sy'n dangos y gallai'r ardaloedd tywyll hyn gynnwys lefelau uwch o broteinau o gymharu ag ardaloedd electron-lucent. Ni chynhyrchodd rheolaethau negyddol a berfformiwyd heb wrthgorff cynradd unrhyw adwaith (Ffig. 6A, B, paneli A4 a B4, rheolaeth). Daethom i'r casgliad bod gronynnau aren yn cynrychioli NPs mwynol-organig tebyg i HS-NPs yn seiliedig nid yn unig ar eu morffoleg a'u cyfansoddiad mwynau ond hefyd ar eu rhwymiad i'r prif atalyddion calcheiddio sy'n bresennol mewn serwm.

Defnyddiwyd microsgopeg imiwnofflworoleuedd nesaf i gadarnhau presenoldeb gronynnau mwynol sy'n cynnwys HSA a HSF mewn arennau dynol â chlefyd. Gan ddefnyddio'r dechneg hon, dangosodd meinweoedd arennau dynol

staenio positif ar gyfer y ddau broteinau mewn gwahanol feysydd, gan gynnwys yr interstitium o amgylch tiwbiau arennol yn ogystal â cytoplasm celloedd sy'n amlinellu tiwbyn (Ffig. 7 A, paneli A1 ac A2). Yn ogystal, sylwyd ar agregau protein sy'n cynnwys albwmin a fetuin-A yn yr ardaloedd hyn, er mewn symiau is o gymharu â staenio'r proteinau sengl (Ffig. 7A a phanel A3, staen cyfunol mewn melyn). Yn nodedig, gwnaethom sylwi bod y staenio protein a ganfuwyd gan immunofluorescence yn gorgyffwrdd yn agos â'r patrwm o galcheiddiad ectopig a welwyd gan ddefnyddio staenio von Kossa (Ffig. 7 A, B, mae calcheiddiad yn weladwy fel deunydd du a nodir gan saethau yn B). Mae'r canlyniadau hyn yn darparu cefnogaeth bellach ar gyfer presenoldeb gronynnau mwyno-organig yn y meinweoedd arennau dynol a archwiliwyd.

Trafodaeth

Er bod datblygiadau wedi'u gwneud yn ein dealltwriaeth o'r rhyngweithio rhwng NPs synthetig a chelloedd dynol, rydym yn gwybod llawer llai am effeithiau NPs mwynol-organig sy'n ffurfio'n ddigymell mewn hylifau'r corff. Mae ein hastudiaethau blaenorol wedi dangos bod y gronynnau hyn yn ffurfio mewn hylifau biolegol pan fydd y crynodiadau o galsiwm a ffosffad yn fwy na dirlawnder15,16. Gwelsom hefyd fod y gronynnau hyn yn cael eu mewnoli gan gelloedd imiwnedd ond mai dim ond gronynnau mawr sy'n achosi adweithiau imiwn pro-llidiol23. Fodd bynnag, nid oedd dosbarthiad y gronynnau hyn mewn meinweoedd dynol ac a ydynt yn chwarae unrhyw rolau ffisiolegol neu patholegol yn y corff wedi'u harchwilio hyd yn hyn.

Yn yr astudiaeth bresennol, canfuom am y tro cyntaf NPs mwyno-organig mewn arennau cleifion dynol sy'n dioddef o naill ai clefyd yr arennau cam olaf neu ganser yr arennau. Mae'r NPs mwynau-organig a ganfuwyd yn cynnwys calsiwm ffosffad wedi'i grisialu'n wael yn debyg i fwyn esgyrn, yn ogystal ag albwmin, fetuin-A, ac apo-A1 sy'n gweithredu fel atalyddion calcheiddio systemig mewn hylifau'r corff. Mae ein canlyniadau'n cyd-fynd ag adroddiadau blaenorol a ddisgrifiodd bresenoldeb cymhlygion protein-mwynau mewn meinweoedd fasgwlaidd a hylifau'r corff12,13,34,40. Gan fod y gronynnau a welsom wedi'u canfod mewn ardaloedd lle nad oes unrhyw galcheiddiadau microsgopig, mae ein harsylwadau'n awgrymu y gallai'r gronynnau gynrychioli rhagflaenwyr calcheiddiad ectopig mewn meinweoedd dynol. O ystyried y posibilrwydd y gall NPs mwynau-organig dyfu’n raddol o ran maint a chael eu trawsnewid o ronynnau i ffilm o dan amodau ffafriol fel y disgrifiwyd yn ein hastudiaethau blaenorol15,18, mae’r arsylwadau a gyflwynir yma yn awgrymu y gallai’r rhagsylweddion mwynau arwain at ffurfio mwy o faint. dyddodion mwynau mewn vivo, fel plac Randall a cherrig yn yr arennau.

Mae ein harsylwadau bod calcheiddiadau ectopig mwynau a NPs mwynau-organig i'w cael mewn strwythurau anatomegol amrywiol o'r arennau yn gyson â chanfyddiadau blaenorol calcheiddiadau ectopig yn yr organ hwn41. Roedd arsylwadau Evan et al. yn nodi y gallai mwyneiddiad yn arennau cleifion â nephrolithiasis ddechrau a digwydd yn bennaf ym meinwe rhyng-raniannol dolenni Henle40,42. Sylwodd yr awduron hyn y gallai dyddodion mwynau sy'n ffurfio yn yr ardal hon ymwthio allan o ochr waelodol yr wrotheliwm ac arwain at ffurfio cerrig yn yr arennau. Mae ein harsylwadau'n awgrymu, yn ogystal â dolenni Henle, y gall ardaloedd eraill yn yr arennau gynnwys NPs mwynau a allai esblygu yn y pen draw i ffurfio dyddodion mwynau mawr mewn arennau dynol. Rydym hefyd yn ymchwilio i'r posibilrwydd y gall NPs mwynau sy'n ffurfio yn y cylchrediad gwaed drawsleoli i feinweoedd arennol ac achosi calcheiddiad ectopig a ffurfio cerrig yn yr arennau.

Mae nifer o ronynnau arennau a ganfuwyd yn yr astudiaeth bresennol i'w cael o fewn fesiglau mewngellol neu allgellog (Ffig. 4H, I) ac mae'r rhain yn debyg i'r fesiglau matrics a ddangoswyd i gymell calchiad mewn esgyrn a dannedd7,8. Gwelsom yn ddiweddar fod fesiglau sydd wedi'u hynysu o serwm dynol ac anifeiliaid yn achosi ffurfio NPs mwynau a gwaddodion microsgopig in vitro25. Sylwodd Schlieper et al.34 hefyd fod gronynnau mwynol a geir mewn rhydwelïau yn gysylltiedig â strwythurau pilenni a chynigiodd y gallai fesiglau matrics neu gyrff apoptotig gynrychioli cnewyllyn gronynnau mwynol yn y meinweoedd hyn. Yn yr un modd, mae Khan et al. adroddwyd bod dyddodion calsiwm ffosffad a geir yn arennau cleifion dynol â cherrig arennau idiopathig yn gysylltiedig â ffibrau colagen a fesiglau matrics9. Mae'r canlyniadau hyn yn awgrymu y gall y NPs mwynol-organig a ganfyddir mewn meinweoedd yr arennau ffurfio trwy fecanwaith sy'n cynnwys fesiglau pilen, sefyllfa sy'n cyfateb i'r hyn a welir mewn rhydwelïau atherosglerotig7,8. Ar y llaw arall, dangosodd astudiaeth ddiweddar nad oedd calcheiddiad ectopig a ganfuwyd mewn rhydwelïau bronnau menywod yn gysylltiedig â marcwyr celloedd osteogenig neu apoptotig43, sy'n awgrymu y gallai'r mecanwaith calcheiddio fod yn benodol i'r cyd-destun organ neu fiolegol dan sylw. Yn ogystal, gall NPs mwynol-organig fel y rhai a ddisgrifir yma ffurfio meinweoedd arennau dynol hefyd oherwydd methiant i gynnal crynodiadau ffisiolegol o ïonau (ee, calsiwm a ffosffad) ac atalyddion calcheiddio (ee albwmin, fetuin-A, ac apo). -A1) yn hylifau corff y dynol.

Mae ein canlyniadau'n awgrymu y gall haen electron-drwchus a chraidd NPs mwynau-organig gynnwys lefelau uwch o broteinau a moleciwlau organig o'i gymharu ag ardaloedd electron-lucent y gronynnau (Ffig. 6 A, B). Mae'n ymddangos bod yr haenau electron-drwchus hyn wedi'u mwyneiddio fel y gwelir gan natur grisialaidd y deunydd hwn o dan TEM (gweler Ffig. 4A-J). Mae awduron eraill, gan gynnwys Ryall41 ac Evan et al.44, wedi cynnig y gall yr haen electron-lucent gynrychioli mwynau tra gall haenau electron-drwchus gyfateb i foleciwlau organig. Gall y dehongliadau hyn fod yn rhannol o leiaf oherwydd y modd y cafodd y samplau eu prosesu a'u harchwilio ym mhob astudiaeth yn ogystal â natur y meinweoedd cychwynnol a ddefnyddiwyd.

Yn ogystal â chwarae rhan mewn calcheiddiad ectopig, gall gronynnau mwynau-organig achosi llid ym meinweoedd yr arennau. Rydym wedi dangos yn ddiweddar, er bod NPs mwynau-organig yn methu â chymell y secretion o interleukin pro-inflammatory-1 gan macroffagau dynol, mae agregau mwynau sy'n fwy nag 1 μm yn gallu gwneud hynny23. Dangoswyd bod rhyddhau interleukin-1 mewn ymateb i ddeunyddiau crisialog yn dibynnu ar actifadu cyfadeiladau moleciwlaidd mewngellol a elwir yn inflammasomes45–47. Yn ogystal, canfuwyd y gronynnau mwynol mewn arennau a oedd yn gartref i diwmorau ac mae'r cysylltiad rhwng canser a llid bellach yn adnabyddus48. Mae angen ymchwilio eto i'r posibilrwydd y gallai gronynnau mwynol cyfun actifadu llidus a chyfrannu at ddatblygiad llid a chanser mewn arennau neu feinweoedd eraill.

Yn ogystal â calcheiddiad ectopig, gall y gronynnau mwynol a ddisgrifir yma gymryd rhan mewn prosesau afiechyd eraill. Er enghraifft, rydym wedi cynnig yn gynharach y gallai NPs mwynau glymu i broteinau amrywiol yn hylifau'r corff a disbyddu'r moleciwlau organig hyn o hylifau'r corff20,26. Ar y llaw arall, gall y corff dynol atal ffurfio a chronni NPs mwynau o dan amgylchiadau arferol trwy ddibynnu ar bresenoldeb atalyddion calcheiddio a'r system reticuloendothelial (hy, macrophages). Felly gall NPs mwynau gronni dim ond unwaith y bydd cartrefostasis calsiwm systemig neu leol yn cael ei aflonyddu a phan fydd y mecanweithiau amddiffynnol wedi methu yn y corff dynol.

Rydym yn cynnig y gellir defnyddio'r dull nanomaterial a ddatblygir yma i astudio ffurfiant NPs mwynol-organig mewn meinweoedd anifeiliaid a dynol. Er enghraifft, gellir defnyddio gwrthgyrff a godir yn erbyn proteinau atalydd calcheiddio fel albwmin, fetuin-A, ac apo-A1 ar y cyd â dadansoddiad mwynau i ganfod a nodweddu ffurfiant NPs mwynau-organig ym modelau meinweoedd anifeiliaid. Gellir cymhwyso'r canlyniadau a geir gan ddefnyddio'r dull hwn i fesuriadau clinigol a wneir ar hylifau'r corff dynol er mwyn nodi paramedrau biolegol sy'n adlewyrchu cyflwr ffurfiant gronynnau mwynol a chalcheiddio ectopig yn y corff. Disgwyliwn y gallai'r wybodaeth hon arwain at ddatblygu strategaethau therapiwtig newydd i atal a thrin clefydau a chyflyrau dynol sy'n gysylltiedig â chalcheiddio ectopig.

Dulliau

Meinweoedd arennau.Cymeradwywyd y defnydd o feinweoedd dynol a'r arbrofion a gynhaliwyd yn yr astudiaeth hon gan Fwrdd Adolygu Sefydliadol Ysbyty Coffa Chang Gung; cynhaliwyd y dulliau a'r arbrofion yn unol â'r canllawiau cymeradwy. Cafwyd caniatâd gwybodus ysgrifenedig gan y cleifion. Rheolaeth Cafwyd meinweoedd arennau iach o fiopsïau o gleifion trawma a hematoma heb unrhyw hanes o glefyd yr arennau (n=2); cafwyd meinweoedd yr arennau hefyd gan gleifion canser arennol (n=20) a chan gleifion cam olaf clefyd yr arennau (n=2) y cafodd eu harennau eu tynnu neu eu biopsïo yn ystod llawdriniaeth drawsblannu (Tabl 1). Ar gyfer meinweoedd canser arennol, cafodd y rhan nad yw'n ganseraidd o'r feinwe ei dyrannu a'i dadansoddi yn yr astudiaeth bresennol.

Dadansoddiad histolegol.Roedd meinweoedd arennau wedi'u gosod ar flociau paraffin. Rhannwyd y blociau a chynheswyd tafelli meinwe ar blât poeth ar 70 gradd am 30 munud i gael gwared ar baraffin. Cafodd yr adrannau eu trochi i doddiant ffres o sylene dair gwaith am 15 munud i gael gwared ar y paraffin sy'n weddill yn llwyr. Ailhydradwyd yr adrannau gyda 95 y cant , 80 y cant , a 70 y cant ethanol am 5 munud bob tro. Golchwyd sbesimenau wedi'u hailhydradu â dŵr distyll dwbl (ddH2O) am 5 munud. Cafodd niwclysau celloedd eu staenio â hematocsilin am 8 munud. Tynnwyd y llifyn o'r sbesimenau gyda dŵr cynnes am 10 munud. Roedd sbesimenau arennau'n cael eu rinsio mewn ddH2O ac yn cael eu trochi 10 gwaith mewn 95 y cant ethanol. Cafodd y sbesimenau wedi'u trin ag ethanol eu gwrth-staenio ag eosin Y am 1 munud. Cafodd sbesimenau eu dadhydradu gyda 95 y cant a 100 y cant ethanol am 10 munud bob tro, ac yna cam dadhydradu mewn sylene am 10 munud. Cafodd y sbesimenau arennau dadhydradedig terfynol eu gosod ar sleidiau gwydr gyda 50 y cant o glyserol a'u harsylwi o dan ficrosgop ysgafn gyda chamera digidol.

Paratowyd sbesimenau wedi'u dad-baraffinio a'u hailhydradu fel y disgrifiwyd ar gyfer staenio H&E. Cafodd darnau wedi'u hailhydradu eu staenio ag arian nitrad (5 y cant), ac yna dod i gysylltiad â golau UV am 20 munud. Golchwyd yr hydoddiant gyda ddH2O am 15 munud. Cafodd yr adrannau eu staenio â sodiwm thiosylffad (5 y cant) am 5 munud, ac yna golchi â ddH2O am 15 munud. Cafodd yr adrannau eu staenio â choch cyflym niwclear (Sigma-Aldrich, St. Louis, MI) am 5 munud. Cafodd sbesimenau lliw eu dadhydradu'n olynol gyda 95 y cant a 100 y cant ethanol am 10 munud yr un, cyn dadhydradu mewn sylene am 10 munud. Cafodd sbesimenau arennau eu gosod ar sleidiau gwydr a'u harchwilio fel y disgrifiwyd uchod.

Microsgopeg electron a dadansoddiad EDX.Cafodd samplau arennau eu torri'n ddarnau llai na 1 mm o drwch gan ddefnyddio microsgop dyrannu CPLlL (Olympus, Tokyo, Japan). Roedd y meinweoedd yn sefydlog gyda 2.5 y cant glutaraldehyde ac 1 y cant paraformaldehyde yn 0.1 M byffer cacodylate ar 4 gradd dros nos. Cafodd samplau sefydlog eu golchi deirgwaith gyda 0.1 M byffer cacodylate mewn swcros 8 y cant (pH 7.2) ar rew am 10 munud. Deorwyd meinweoedd wedi'u golchi mewn halwynog wedi'i glustogi â ffosffad (PBS; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4) yn cynnwys 1 y cant o osmium tetroxide a 1.5 y cant o ferrocyanid potasiwm am 2 awr ar rew. Golchwyd y hancesi papur gyda ddH2O ar rew 10 munud dair gwaith. Cafodd meinweoedd wedi'u golchi eu staenio ar rew gydag 1 y cant o asetad wranyl yn ddH2O am 1 awr, cyn eu golchi deirgwaith gyda ddH2O ar rew. Cafodd meinweoedd arennau eu dadhydradu gyda 30, 50, 70, 80, a 90 y cant ethanol am 10 munud bob tro, ac eithrio pan gyrhaeddodd ethanol 70 y cant, ac os felly roedd y samplau'n cael eu storio ar 4 gradd dros nos. Cafodd meinweoedd eu staenio ag asid ffosffotungstic 1 y cant mewn 95 y cant ethanol am 15 munud, cyn dadhydradu gyda 95 y cant ethanol am 5 munud. Cafodd y sbesimenau eu trochi i propylen ocsid ar 40, 57, 67, a 100 y cant mewn ethanol am 10 munud bob tro, ac yna trochi arall mewn 100 y cant o propylen ocsid am 5 munud. Ymdreiddiwyd meinweoedd arennau gyda 50, 70, a 100 y cant Eponate 812 (Ted Pella, Redding, CA) am 1h bob tro. Paratowyd 812-samplau o arennau mewnblanedig eponate trwy ddeor ddwywaith i 100 y cant Eponate. Deorwyd samplau wedi'u mewnblannu i ffwrn ar 60 gradd dros nos i ganiatáu polymerization resin.

Roedd pelenni HS-NP wedi'u golchi a gafwyd fel yr uchod yn sefydlog gyda glutaraldehyde (2.5 y cant) a pharaformaldehyd (1 y cant) yn ddH2O am 4h ar 4 gradd. Roedd pelenni sefydlog yn cael eu golchi â ddH2O deirgwaith am 10 munud bob tro. Cafodd pelenni eu dadhydradu gyda deoriadau olynol i ethanol 30, 50, 70, 80, 90, 95, a 100 y cant, am 10 munud bob tro, ac eithrio pan gyrhaeddodd ethanol 70 y cant, lle cafodd y pelenni eu storio ar 4 gradd dros nos. Dim ond am 10 munud y rhoddwyd hydoddiannau ethanol eraill mewn cysylltiad â'r pelenni. Ymdreiddiwyd pelenni dadhydradedig â chyfrwng mewnosod gwyn LR (Gwyddorau Microsgopeg Electron, Hatfield, PA) gan ddefnyddio cymarebau gwahanol o ethanol a chyfrwng LR (3: 1, 1: 1, ac 1: 3) am 30 munud yr un. Ymdreiddiwyd y pelenni â chyfrwng LR ffres (100 y cant) dros nos cyn polymerization. Cafodd pelenni wedi'u treiddio â chyfrwng LR eu deor mewn ffwrn ar 60 gradd am 2 ddiwrnod i ganiatáu polymerization resin. Rhannwyd blociau o aren a HS-NPs i gynhyrchu sleisys â thrwch o 70-100 nm gan ddefnyddio microtome Reichert Ultracut S (Leica, Wetzlar, yr Almaen). Cafodd adrannau meinwe eu staenio â 4 y cant o asetad wranyl cyn delweddu o dan ficrosgop electron trawsyrru JEM 1230 (JEOL, Tokyo, Japan) a weithredwyd ar 100 kV. Cafwyd patrymau diffreithiant electron gan ddefnyddio'r un system. Defnyddiwyd gridiau nicel fel cymorth.

Ar gyfer dadansoddiad EDX, cafodd darnau tenau o feinweoedd yr arennau eu staenio ag asetad wranyl a'u golchi â ddH2O fel yr uchod, ac yna eu sychu mewn cabinet sychwr electronig. Arsylwyd sbesimenau o dan ficrosgop electron trawsyrru JEM 2100 cydraniad uchel (JEOL) a weithredir ar 120 kV. Cafwyd sbectra EDX mewn triphlyg gan ddefnyddio system INCA Energy EDS (Oxford Instruments, Abingdon, UK). Gwelwyd rhannau tenau o HS-NPs heb staenio.

Paratoi NPs mwynol-organig.Addaswyd yr holl atebion cychwynnol i pH 7.4 a'u sterileiddio trwy hidlo trwy 0.2μm pilenni cyn eu defnyddio. Cafwyd HS gan wirfoddolwyr dynol iach gan ddefnyddio techneg wythïen-bigiad confensiynol. Cymeradwywyd y defnydd o hylifau biolegol dynol yn yr astudiaeth hon gan Fwrdd Adolygu Sefydliadol Ysbyty Coffa Linko Chang Gung a chafwyd caniatâd gwybodus ysgrifenedig gan y gwirfoddolwyr. Paratowyd HS-NPs trwy ychwanegu 3 mM CaCl2 a Na2HPO4 yr un i DMEM (Gibco, Carlsbad, CA) sy'n cynnwys 10 y cant HS, ac yna deori am wythnos mewn amodau diwylliant celloedd (37 gradd, 5 y cant CO2, aer llaith). Cafodd y gronynnau eu pelennu trwy allgyrchiad ar 16,000 × g am 15 munud ar 4 gradd a'u golchi ddwywaith gyda byffer HEPES (20 mM HEPES, 1 mM CaCl2, 2 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl) gan ddefnyddio'r un weithdrefn allgyrchu.

SDS-PAGE a Western blotio.Yn y bôn, cynhaliwyd dadansoddiad SDS-PAGE a blotiau'r Gorllewin fel o'r blaen15. Yn gryno, 0.2 ug (Ffig. 5A,D) neu 1.2 ug (Ffig. 5B,C) o broteinau HS, 47 ug (Ffig. 5A,B,D) neu 590ug o broteinau HS-NP (Ffig. 5C), 0.1ug o HSA (Ffig. 5A–D), a 0.6ug (Ffig. 5A, C, D) neu {{23} Diddymwyd }.15ug o HSF (Ffig. 5B) mewn "byffer llwytho" 5 × (0.313 M Tris-HCl pH 6.8, 10 y cant SDS, 0.05 y cant bromophenol glas, 50 y cant glyserol, 12.5 y cant - mercaptoethanol) i grynodiad terfynol o 1 × , cyn gwresogi ar 95 gradd am 5 munud a gwahanu o dan amodau dadnatureiddio a lleihau ar SDS-TUDALEN 10 y cant gan ddefnyddio system gel mini (Hoefer, Holliston, MA). Roedd y rheolaeth NP (a ddefnyddir yn lôn 1 o Ffig. 5A-D) yn cynnwys NPs mwynau a baratowyd trwy ychwanegu 3 mM CaCl2 a Na2HPO4 yr un i DMEM (cyfrol olaf o 1ml), ac yna deori am un diwrnod mewn amodau meithrin celloedd; cafodd y gronynnau eu pelennu gan allgyrchiad ar 16,000 × g am 15 munud, eu golchi ddwywaith gyda byffer HEPES, a'u hailddarparu mewn 50ul o glustogiad HEPES. Proseswyd cyfanswm o 20ul o ronynnau wedi'u hailddarlledu ar gyfer SDS-PAGE fel uchod. Cafodd pilenni PVDF eu rhwystro am 1 awr mewn 5 y cant (w/v) llaeth wedi'i ddifetha ar dymheredd ystafell. Defnyddiwyd y prif wrthgyrff a gynhyrchwyd yn fewnol fel y disgrifiwyd o'r blaen25 ar wanhad o 1:1,000 ( -apo-A1 a -HS-NP), 1:3,000 ( -HSF) , neu 1:6,000 ( -HSA). Defnyddiwyd yr gwrthgorff eilaidd cyfunedig gwrth-gwningen gafr marchruddygl peroxidase yn seiliedig ar y cyfarwyddiadau a ddarparwyd gan y gwneuthurwr (Millipore, Billerica, MA). Datgelwyd y blotiau gan ddefnyddio cemiluminescence gwell (Amersham Biosciences, Amersham, UK) a ffilmiau autoradiograffig.

Labelu immunogold.Paratowyd samplau ar gyfer arsylwi TEM. Rhannwyd blociau HS-NP yn ddarnau llai na 70 nm o drwch. Cafodd adrannau sampl ar gridiau eu rhwystro gyda gelatin pysgod 1 y cant (Sigma) yn 0.1 M byffer HEPES (pH 8.0) am 25 munud. Deorwyd y gridiau â'r gwrthgyrff sylfaenol canlynol: -HSA, 1:30; -HSF, 1:50; -apo-A1, 1:30; -HS-NP, 1:60. Nid oedd y rheolaeth negyddol yn cynnwys unrhyw wrthgorff sylfaenol (gelatin pysgod 1 y cant mewn byffer HEPES). Cafodd yr adrannau deor eu rinsio â byffer HEPES am 15 munud. Cafodd adrannau wedi'u rinsio eu rhwystro â gelatin pysgod 1 y cant mewn byffer HEPES am 20 munud. Cafodd y sbesimenau eu trin â'r IgG gwrth-gwningen gafr aur-aur eilaidd am 1 awr. Golchwyd y sbesimenau gyda byffer HEPES am 10 munud, cyn eu golchi gyda ddH2O am 10 munud. Perfformiwyd arsylwadau TEM fel yr uchod.

Microsgopeg fflworoleuedd.Cafodd sleidiau meinwe arennau histolegol a baratowyd fel uchod eu rhwystro gydag albwmin serwm buchol 1 y cant am 1 awr ar dymheredd yr ystafell. Deorwyd y sleidiau â gwrthgyrff polyclonaidd cynradd ar wanediad o 1:4,000. Ar ôl golchi camau, deorwyd y samplau gyda'r gwrthgyrff eilaidd gafr gwrth-gwningen-FITC (492/520nm) a gafr gwrth-cwningen-TRITC (550/570nm) (Jackson Immuno Research, West Grove, PA) am 1:100 ar gyfer 1awr. Golchwyd y cyfadeiladau gyda PBST am 15 munud. Defnyddiwyd y staen fflwroleuol 4′,6-diamidino{-2-phenylindole (DAPI) ar 10 ug/ml am 15 munud. Cafodd sbesimenau wedi'u staenio gan DAPI eu dadhydradu gyda 95 a 100 y cant o ethanol am 10 munud yr un, ac yna dadhydradu mewn sylene am 10 munud arall. Gosodwyd sbesimenau arennau dadhydradedig â chyfrwng mowntio fflworoleuedd Vectashield H{{-1000 (Vector Laboratories, Burlingame, CA) ac fe'u gwelwyd o dan ficrosgop confocal (LSM510 Meta; Zeiss, Oberkochen, yr Almaen) â chamera Spot Flex.

Mae Cistanche tubulosa yn atal clefyd yr arennau, cliciwch yma i gael y sampl

Cyfeiriadau

1. Giachelli, CM Calcification ectopig: casglu ffeithiau caled am fwyneiddiad meinwe meddal. Am J Pathol 154, 671–675 (1999).

2. Abedin, M., Tintut, Y. & Demer, LL Calcheiddiad fasgwlaidd: mecanweithiau a goblygiadau clinigol. Arterioscler Thromb Fasc Biol 24, 1161–1170 (2004).

3. Alexopoulos, N. & Raggi, P. Calcheiddiad mewn atherosglerosis. Nat Parch Cardiol 6, 681–688 (2009).

4. Allison, MA, Criqui, MH & Wright, CM Patrymau a ffactorau risg ar gyfer atherosglerosis calcheiddio systemig. Arterioscler Thromb Fasc Biol 24, 331–336 (2004).

5. Ketteler, M. et al. Diffygion proteinau rheoleiddio calsiwm mewn cleifion dialysis: cysyniad newydd o galcheiddiad cardiofasgwlaidd mewn wremia. Arennau Int Suppl 84, S84–87 (2003).

6. Kapustin, A. & Shanahan, CM Targedu calcheiddiad fasgwlaidd: meddalu targed caled. Curr Opin Pharmacol 9, 84–89 (2009).

7. Kapustin, AN & Shanahan, CM Calsiwm rheoleiddio fesiglau matrics cyhyrau llyfn fasgwlaidd sy'n deillio o gelloedd. Tueddiadau Cardiovasc Med 22, 133–137 (2012).

8. Doherty, TM et al. Calcification mewn atherosglerosis: bioleg esgyrn a llid cronig ar y groesffordd prifwythiennol. Proc Natl Acad Sci USA 100, 11201–11206 (2003).

9. Khan, SR, Rodriguez, DE, Gŵyr, LB a Monga, M. Cymdeithas placiau Randall gyda ffibrau colagen a fesiglau pilen. J Urol 187, 1094–1100 (2012).

10. Price, PA, Nguyen, TM & Williamson, MK Nodweddu biocemegol y cymhleth serwm fetuin-mwynau. J Biol Chem 278, 22153–22160 (2003).

11. Price, PA, Williamson, MK, Nguyen, TM & Than, TN Mae lefelau serwm y cymhleth fetuin-mwynau yn cydberthyn â chalchiad rhydweli yn y llygoden fawr. J Biol Chem 279, 1594–1600 (2004).

12. Heiss, A. et al. Rôl hierarchaidd fetuin-A a phroteinau serwm asidig wrth ffurfio a sefydlogi gronynnau calsiwm ffosffad. J Biol Chem 283, 14815–14825 (2008).

13. Bertazzo, S. et al. Mae microsgopeg electron nano-ddadansoddol yn datgelu mewnwelediadau sylfaenol i galcheiddiad meinwe cardiofasgwlaidd dynol. Nat Mater 12, 576–583 (2013).

14. Martel, J. & Young, JD Nanobacteria honedig mewn gwaed dynol fel nanoronynnau calsiwm carbonad. Proc Natl Acad Sci USA 105, 5549–5554 (2008).

15. Young, JD et al. Mae nanobacteria tybiedig yn cynrychioli gweddillion ffisiolegol a sgil-gynhyrchion diwylliant homeostasis calsiwm arferol. Plos Un 4, e4417 (2009).

16. Young, JD et al. Nodweddu gronynnau calsiwm ac apatite mewn serwm fel cyfadeiladau mwyno-protein pleomorffig ac fel rhagflaenwyr nanobacteria tybiedig. Plos Un 4, e5421 (2009).

17. Cyfadeiladau Wu, CY, Martel, J., Young, D. & Young, JD Fetuin-A/albwmin-mwyn sy'n debyg i ronynnau calsiwm serwm a nanobacteria tybiedig: arddangos cysyniad ataliad-hadu deuol. Plos Un 4, e8058 (2009).

18. Young, JD & Martel, J. Cynnydd a chwymp nanobacteria. Sci Am 302, 52–59 (2010).

19. Martel, J., Wu, CY & Young, JD Gwerthusiad beirniadol o serwm arbelydredig gama a ddefnyddir fel porthwr yn niwylliant ac arddangosiad nanobacteria tybiedig a nanoronynnau calchynnu. Plos Un 5, e10343 (2010).

20. Martel, J. et al. Dadansoddiad proteomig cynhwysfawr o nanoronynnau mwynol sy'n deillio o hylifau'r corff dynol ac wedi'u dadansoddi gan sbectrometreg màs cromatograffaeth hylifol-tandem. Biocemeg rhefrol 418, 111–125 (2011).