Effaith Tanshinone IIA Ar Ymateb Llidiol a achosir gan LPS mewn Modd Dibynnol Inflamasome ROS-NLRP3 mewn Celloedd RAW264.7

Am fwy o wybodaeth:emily.li@wecistanche.com

Uchafbwyntiau

Gallai Tan IIA atal yr ymateb llidiol a mynegiant NLRP3 wedi'i ysgogi gan LPS neu LPS ynghyd ag ATP. Gallai acetylcysteine ​​(N-acetyl-l-cysteine, NAC), atalydd ROS, atal LPS ynghyd â chynnydd a achosir gan ATP yn y lefel NLRP3. Gall y mecanwaith sy'n sail i effeithiau Tan IIA gynnwys rheoleiddio'r llwybr ROS-NF-κB/P38-NLRP3. Roedd yr astudiaeth hon yn nodweddu mecanwaith moleciwlaidd Tan IIA ymhellach ac yn darparu meddyliau newydd i'w therapi clinigol.

Haniaethol

Mae tystiolaeth sy'n dod i'r amlwg wedi dangos bod Tanshinone IIA (Tan IIA) yn atal anaf cardiomyocytes, ffibroblastau cardiaidd, ac atherosglerosis. Fodd bynnag, mae'r mecanwaith moleciwlaidd sy'n sail i effeithiau Tan lA yn aneglur o hyd. Ymchwilio i rôl Tan ll A yn yr ymateb llidiol mewn modd llidus-ddibynnol ROS-NLRP3. Recriwtiwyd celloedd RAW264.7 a ysgogwyd gyda LPS i gynhyrchu model cell o ymateb llidiol. Dangosodd ein canlyniadau fod cynhyrchu NO wedi cynyddu'n sylweddol ar ôl cael ei ysgogi gan LPS. a Gostyngodd Tan IIA a gafodd ei drin yn sylweddol lefel y NO. Mynegiant mRNA o NLRP3. Cafodd IL-1B a TNF-a eu rhwystro'n sylweddol gan Tan LLA o'u cymharu â chelloedd a gafodd eu trin â LPS. Mynegiant protein NLRP3. Llofnodwyd IKBa, pp65/p65, a pp38/p38 wedi'u lleihau'n effeithlon gan Tan IIA, o gymharu â grwpiau a ysgogwyd gan LPS neu LPS ynghyd â ATP. Yn y cyfamser. Roedd Tan IA yn atal yn sylweddol lefel y ROS a achosir gan LPS ac ATP. A gallai NAC, atalydd ROS, hefyd atal mynegiant protein NLRP3. Yn seiliedig ar y canfyddiadau hyn, gellid dyfalu y gallai'r mecanwaith sy'n sail i effaith Tan IIA gynnwys rheoleiddio llwybr ROS-NF-kB/P38-NLRP3. Roedd yr astudiaeth hon yn nodweddu mecanwaith moleciwlaidd Tan IA ymhellach ac yn rhoi meddyliau newydd i'w therapi clinigol.

Geiriau allweddol: Tanshinone IIA,Llid, NLRP3 inflammasome, ROS

Manteision cynhyrchion Cistanche

Cefndir

Mae macrophages yn chwarae rhan bwysig wrth gadw homeostasis cardiaidd a threfnu atgyweirio meinwe yn ogystal ag ailfodelu. Yncalonmethiantcleifion, mae cytocinau prolidiol serwm uchel i fod i fod yn fiofarcwyr rhagfynegol o ganlyniadau clinigol gwaeth, allidgall gyfrannu at ddatblygiad methiant y galon [1]. Ondllidwedi dod i'r amlwg fel targed therapiwtig i drin clefydau cardiofasgwlaidd, fodd bynnag, mae'n ymddangos bod imiwneiddiad eang wedi methu â gwella canlyniadau clinigol naill ai ar ôl cnawdnychiant myocardaidd (MI) neu fethiant y galon [2,3].

Mae nifer o astudiaethau clinigol wedi dangos bod ataliad o aymfflamycholllwybr, megis yymfflamycholgallai cytocin, IL-1 , leihau digwyddiadau cardiofasgwlaidd rheolaidd yn effeithiol [4, 5]. Gellir dyfalu bod imiwnofodyliad ymateb llidiol arwyddocâd diagnostig a therapiwtig pwysig yn y broses o glefydau cardiofasgwlaidd.

NLRP3 inflammasome yw'r inflammasomes a astudiwyd fwyaf helaeth o bob math o inflammasomes. Mae wedi'i ddogfennu bod inflammasome NLRP3 yn chwarae rhan hanfodol mewn llawer o afiechydon, megis sglerosis ymledol (MS), clefyd Alzheimer (AD), atherosglerosis, gordewdra, a diabetes mellitus math 2 [6], ac mae mwy a mwy o dystiolaeth yn nodi bod NLRP3 mae inflammasome hefyd yn ymwneud ag isgemia myocardaidd / anaf atdlifiad (MI / RI) [7,8]. Gall mecanweithiau actifadu NLRP3 gynnwys cynhyrchu rhywogaethau ocsigen adweithiol (ROS), potasiwm efflux, a rhyddhau cathepsinau i'r cytosol ar ôl ansefydlogi lysosomaidd. Pan gafodd celloedd eu hysgogi gan bathogenau neu signalau perygl, cafodd NLRP3 ei actifadu a'i recriwtio pro-caspase-1 trwy'r protein adapter ASC. NLRP3. Gwnaeth ASC a pro-caspase-1 cynulliad cymhleth inflammasome NLRP3. O dan weithred y inflammasome NLRP3, cafodd pro-caspase-1 ei actifadu i fod yn caspase-1, gan arwain yn y pen draw at secretion IL-1 ac IL-18, ac achosi a cyfres o adweithiau llidiol [9,10].

Mae Tan IIA yn gyfansoddyn lipossoluble o Danshen (Sahia miltiorrhiza Bge), yn meddu ar briodweddau biolegol amrywiol ac yn cymryd rhan mewn cyfres o adweithiau biocemegol. Tan IA wedigwrth-ymfflamychol, gwrthocsidiolac yn hyrwyddo effaith angiogenesis, ac mae hefyd wedi'i wasgaru'n eang ar gyfer trin clefyd system cardio-serebro-fasgwlaidd [1, 12]. Mae tystiolaeth sy'n dod i'r amlwg wedi dangos bod Tan IIA yn atal anaf cardiomyocytes, ffibroblastau cardiaidd, atherosglerosis, aniwro-llid[13-16]. Fodd bynnag, mae'r mecanwaith moleciwlaidd sy'n sail i effeithiau Tan IIA yn aneglur o hyd.

Yn ystod anaf isgemia/atlifiad, mae monocyte/macrophage, neutrophils, a chelloedd endothelaidd yn cychwyn yymfflamycholymateb, gan achosi rhyddhau amrywiaeth oymfflamycholcytocinau, ac yn arwain at fwy o athreiddedd fasgwlaidd, oedema meinwe, a difrod. Mae Macrophage yn fath o gell rheoleiddio llidiol pwysig ymhlith yr hollymfflamycholrhywogaethau celloedd ac yn chwarae rhan hanfodol yn y broses o gnawdnychiant myocardaidd [17]. Gall monocyt / macrophage a recriwtir i'r myocardiwm difrodi ryddhau ROS ymhellach, cyfryngwyr llidiol, a phroteasau sy'n gwaethygu anaf myocardaidd [18].

Am y rheswm bod macrophages yn chwarae rhan bwysig wrth gadw homeostasis cardiaidd a threfnu atgyweirio meinwe, fe wnaethom recriwtio celloedd RAW264.7 a ysgogwyd gyda LPS i gynhyrchu model celloedd o ymateb llidiol. Ymchwiliodd yr astudiaeth bresennol a yw Tan IIA yn cael effaith ar macroffagau a ysgogwyd gan LPS, a'r mecanweithiau sy'n sail i effeithiau Tan ⅡA ar macrophage mewn modd ROS-NLRP3 sy'n ddibynnol ar inflammasome.

Defnyddiau a Dulliau

Diwylliant a Thriniaeth Celloedd

Prynwyd cell RAW264.7 o Ganolfan Diwylliant Cell Academi Gwyddorau Meddygol Tsieineaidd (Beijing, Tsieina). Cafodd celloedd eu meithrin mewn cyfrwng DMEM (glwcos uchel), ychwanegwyd 10 y cant o serwm buchol ffetws (FBS), 100 U/mL penisilin, a 100 ug/mL streptomycin. Cafodd celloedd eu meithrin ar 37 gradd mewn awyrgylch hollol laith gyda 5 y cant o CO2. Ar gyfer pob arbrawf, cafodd celloedd eu trin ar 80-90 y cant o gydlifiad celloedd. Cafodd y celloedd eu trin â chrynodiadau gwahanol o Tan IIA (ar 10,1, a 0.1 uM) ar gyfer gwahanol amseroedd, gyda neu heb 1 ug/mL LPS. Yn y cyfamser, cafodd celloedd yn y grŵp rheoli eu trin â chyfaint cyfartal o 0.1 y cant DMSO.

Mesur DIM cynhyrchu

DIM Defnyddiwyd Pecyn Assay (Beyotime, China) i fesur cynhyrchiad NO yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Yn gryno, gwanhawyd y safonau gyda DMEM ynghyd â 10 y cant FBS ac ychwanegwyd uwchnatydd safonol neu feithriniad celloedd 50μL at bob ffynnon o'r 96-plât ffynnon. Yna cafodd 50uL o Adweithydd Griess I a II eu pibedu i bob ffynnon o'r plât a chanfuwyd y dwysedd optegol (OD) gan ddarllenydd microplat amlfodd Varioskan LUX ar 540 nm.

Echdynnu RNA

Cafodd celloedd RAW264.7 eu platio ar ddwysedd o 1 × 1 0 6 cell / ffynnon gyda 10 y cant FBS DMEM mewn platiau chwe ffynnon. 24 awr yn ddiweddarach, tynnwyd y cyfrwng a'i ychwanegu gyda chyfrwng DMEM di-serwm, di-wrthfiotig yn lle hynny. Cafodd celloedd RAW264.7 eu trin â DMSO (rheolaeth), LPS (1 ug/mL) a LPS ynghyd â Tan IIA(10,1, a0.1uM am 6h. Yna echdynnwyd cyfanswm RNA i ganfod lefel mRNA NLRP3, IL{ {18}} , a TNF- .Echdynnwyd cyfanswm RNA trwy ddefnyddio'r adweithydd TRIzol (Ambion).Cafodd RNA ei fesur gan grynodiadau Va an sbectrophotometer ultramicrofluorescence (DeNovix) Defnyddiwyd pecyn synthesis cDNA HiFiScript (cwbiotech) ar gyfer trawsgrifio gwrthdro yn ôl cyfarwyddiadau'r gwneuthurwr Cafodd 1 ug o samplau RNA ei drawsgrifio'n ôl, ac roedd y camau adwaith fel a ganlyn: 42 gradd C am 50 munud, 85 gradd C am 5 munud, ac yna'n cael eu cynnal ar 4 gradd.

RT-PCR

Cynhaliwyd assay PCR ouantitative (OPCR) gydag offeryn O-PCR (Lightcycler 96, Roche), gan ddefnyddio cymysgedd UltraSYBR (cwbiotech). Roedd y protocol PCR yn 95 gradd am 10 munud, ac yna 40 cylch o 95 gradd ar gyfer 10au, 56 ar gyfer 30au, a 72 ar gyfer 32s. Dangosir y paent preimio a ddefnyddir ar gyfer qRT-PCR fel a ganlyn: GADPH-Forward: 5'-AACTTTGGCATTGTGGAAGG-3'; GADPH-Reverse:5'-ACACATTGGGGGTAGGAACA-3',NLRP3-Ymlaen: 5'-ATGCTGCTTCGACATCTCCT-3'NLRP3-Cefn:5'-AACCAATGCGATCCTGAC-3';IL-1 -Ymlaen:5'-GCCCATCCTGTGACTCAT-3';IL{ {32}Cefn:5'- AGGCCGGTATTTTCG-3':TNF- -Ymlaen:5'-GCAGATGGGCTGTACCTTTATC{39}}'TNF-a-Reverse:5'-GCAGATGGGCTGTACCTTTATC-3 ! Cyfrifwyd lefel mynegiant genynnau gan ddefnyddio'r dull 2-AACt.

Blotio gorllewinol

Cynhaliwyd blotio gorllewinol gyda'r canlynolgwrthgyrff: gwrthgorff gwrth-NLRP3(CST), gwrthgorff gwrth-pp38(CST), gwrthgorff gwrth-p38(CST), gwrthgorff gwrth-pp65(CST), gwrthgorff gwrth-GADPH (technoleg protein), gwrthgorff gwrth- -tiwbwlin (technoleg protein), gwrthgorff gwrth-HMGB1 (technoleg protein), gwrthgorff gwrth-p65 (technoleg protein), gwrth-IKB- gwrthgorff (technoleg protein). Echdynnwyd ffracsiynau protein o lysadau celloedd diwylliedig a defnyddiwyd Pecyn Profi Protein BCA Uwch (Beyotime, Tsieina) i fesur y crynodiadau protein. Cafodd proteinau eu dadnatureiddio a'u datrys ar SDS-PAGE, yna eu trosglwyddo i bilen PVDF. Ar ôl blocio gyda QuickBlockTMBlocking Buffer (Beyotime, China) am 1 h, yna deorwyd y pilenni PVDF â gwrthgyrff cynradd dros nos ar 4 gradd gradd. Yna golchwyd y pilenni gyda Western Wash Buffer (Beyotime, China) dair gwaith, a'u deor â gwrthgyrff eilaidd cyfun HRP am 1 awr ar dymheredd ystafell. Defnyddiwyd pecyn BeyoECL Plus (Beyotime, China) i ganfod y proteinau yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Defnyddiwyd C-DiGit 3600 (Li-Cor, UDA) i ddelweddu a chafodd y bandiau eu meintioli gan Image J Software.

Mesur croniad ROS

Defnyddiwyd Pecyn Asesu Rhywogaethau Ocsigen Adweithiol stiliwr DCFH-DA (Beyotime, China) i fesur lefelau ROS mewngellol mewn celloedd RAW264.7 yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Yn fyr, cafodd DCFH-DA ei wanhau â chyfrwng DMEM di-serwm ac addaswyd y crynodiad terfynol i 10μM/L. Ar ôl deori gyda llifyn DCFH-DA 10 μM am 30 munud ar 37 gradd C, golchwyd celloedd RAW264.7 deirgwaith gyda chyfrwng DMEM di-serwm, er mwyn cael gwared ar y gormodedd DCFH-DA. Ar gyfer rheolaeth gadarnhaol, wel, ychwanegwyd lμL o Rosup at y celloedd. Mesurwyd y fflworoleuedd gan ddefnyddio microsgop gwrthdro Nikon IX73. Mesurwyd y delweddau o gelloedd gan ddefnyddio Meddalwedd Delwedd J.

Dadansoddiad Ystadegol

Ailadroddwyd yr holl arbrofion o leiaf dair gwaith. Defnyddiwyd meddalwedd SPSS ar gyfer pob dadansoddiad, a pherfformiwyd y GraphPad Prism 5 ar gyfer y lluniad graffeg. Rhoddwyd yr holl ganlyniadau fel y gwerth cymedrig ± SD. Defnyddiwyd ANOVA un ffordd i ddadansoddi data ymhlith grwpiau a chymharu mewn parau gan ddefnyddio prawf SNK-q. Mae gwerth P< 0.05="" was="" considered="" statistically="" significant="" in="" all="">

Ffigur 1. Roedd gan Tan IIA effaith reoleiddiol ar gynhyrchu NO, NLRP3, IL-1 , TNF- mRNA

mynegiant

A. RAW264.7 Celloedd DIM cynhyrchu gwahanol grwpiau. Cafodd y celloedd eu rhag-drin â Tan IIA 10µM, 1µM, a

{{0}}.1µM am 30 munud ac wedi'i ysgogi gyda LPS (1 ug/mL) am 24 awr. * P < 0.05="" vs="" ctrl,="" #="" p="">< 0.05="" vs="" lps.="" bd.="" tan="">

yn meddu ar effaith reoleiddiol ar fynegiant mRNA o TNF- , NLRP3 , ac IL { { }} . Cafodd y celloedd eu rhag-drin â Tan IIA

Canlyniadau

Yr Effaith ar Gelloedd RAW264.7 DIM cynhyrchu Triniaeth Tan IIA

Mae NO, ail foleciwl negesydd, yn cyflawni swyddogaethau amrywiol mewn prosesau ffisiolegol a phatholegol celloedd. Mae NO secretu gan macroffagau yn chwarae rhan bwysig mewn adweithiau llidiol, imiwn a gwrth-firaol [19, 20]. Oherwydd y rhain, gellir defnyddio NO i amcangyfrif effeithiau LPS ar ymatebion imiwn ac ymfflamychol. Cafodd y celloedd eu trin â chrynodiadau gwahanol o Tan IIA (ar 10, 1, a 0.1 μM) gyda neu heb 1 ug/mL LPS am 24h, a chafodd y celloedd yn y grŵp rheoli eu trin â chyfaint cyfartal o 0.1 y cant DMSO. Fel y dangosir yn Ffigur 1A, o'i gymharu â'r grŵp rheoli, yn y grŵp model a ysgogwyd gyda LPS am 24 awr, cynyddodd cynhyrchiad NO yn sylweddol (P<0.05); and="" various="" concentrations="" of="" taniia="" treatment="" (at="" 10,="" 1,="" and="" 0.1="" μm)="" significantly="" decreased="" the="" no="" production=""><0.05) of="" the="" cells="" stimulated="" with="">

Yr Effaith ar fynegiant NLRP3, IL-1 a TNF- mRNA Triniaeth Tan IIA

Gallai celloedd RAW264.7 sy'n cael eu hysgogi â LPS ysgogi actifadu'r ymateb llidiol, a gallai Tan IIA gael ei leddfu, gan gynnwys mynegiant mRNA o NLRP3, IL-1, a TNF-. Fel y dangosir yn Ffigur 1B-D, o'i gymharu â'r grŵp rheoli, yn y grŵp model a ysgogwyd gan LPS, cynyddwyd mynegiant mRNA o NLRP3, IL-1 a TNF- yn sylweddol (P < {{1{{14}="" }}}.05);="" a="" gostyngodd="" crynodiadau="" amrywiol="" o="" driniaeth="" tan="" iia="" (yn="" 10,="" 1,="" a="" 0.1="" μm)="" yn="" sylweddol="" fynegiant="" mrna="" o="" nlrp3,="" il-1="" a="" tnf-="" (p=""><0.05) mewn="" celloedd="" a="" ysgogwyd="" gan="">

Yr Effaith ar fynegiant protein NLRP3 Triniaeth Tan IIA

Mae ATP, ail foleciwl signal, yn ysgogydd sydd ei angen ar gyfer actifadu llidus NLRP3. Felly, defnyddiwyd ATP i gymell actifadu NLRP3 [21, 22]. Dangosodd ein canlyniadau fod LPS ac ATP wedi ysgogi actifadu mynegiant protein NLRP3 ac y gallai Tan IIA ei leddfu. Fel y dangosir yn Ffigur 2, o gymharu â'r grŵp rheoli, yn y grŵp model a ysgogwyd gan LPS ac ATP, cynyddwyd lefel mynegiant protein NLRP3 yn sylweddol (P < 0.05);="" a="" gostyngodd="" triniaeth="" taniia="" (ar="" 10μm)="" yn="" sylweddol="" fynegiant="" protein="" nlrp3="" (p="">< 0.05)="" mewn="" celloedd="" a="" ysgogwyd="" gan="" lps="" ynghyd="" ag="">

Gallai Tan IIA atal gweithrediad llwybr NF-κB a p38 a achosir gan LPS

Fel y dangosir yn Ffigur 2, o'i gymharu â'r grŵp rheoli, yn y celloedd a ysgogwyd â LPS neu LPS ynghyd ag ATP, cynyddwyd mynegiant protein IKB , pp65/p65 yn sylweddol (P < 0.05);="" a="" thriniaeth="" tan="" iia="" (ar="" 10μm)="" yn="" gostwng="" yn="" sylweddol="" y="" upregulation.="" cafodd="" lefel="" protein="" pp38/p38="" ei="" huwchreoleiddio="" mewn="" celloedd="" a="" ysgogwyd="" gan="" lps="" ynghyd="" ag="" atp,="" a="" rhwystrwyd="" yr="" uwchreoleiddio="" gan="" tan="" iia="" (10μm)="" (ffigur="" 2).="" fodd="" bynnag,="" ni="" newidiodd="" lefel="" protein="" pp38/p38="" yn="" sylweddol="" mewn="" celloedd="" a="" ysgogwyd="" gan="" lps.="" at="" hynny,="" roedd="" mynegiant="" protein="" hmgb1="" hefyd="" wedi'i="" wella="" mewn="" celloedd="" a="" ysgogwyd="" gyda="" lps="" neu="" lps="" ynghyd="" ag="" atp="" ond="" ni="" ddangosodd="" unrhyw="" wahaniaeth="" ystadegol.="" mae'r="" canlyniadau="" hyn="" yn="" awgrymu="" y="" gall="" tan="" iia="" atal="" actifadu="" llwybr="" nf-κb="" a="" p38="" a="" achosir="" gan="" lps="" neu="" lps="" ac="">

Roedd gan Tan IIA effaith reoleiddiol ar ROS

I gadarnhau a allai Tan IIA chwilio am ROS mewngellol, gwerthuswyd cynhyrchu ROS mewngellol gan ficrosgopeg fflworoleuedd gan ddefnyddio Pecyn Assay Rhywogaethau Ocsigen Adweithiol. Roedd y celloedd RAW264.7 yn agored i LPS am 6 h, ac ychwanegwyd ATP 1 mM 30 munud cyn cynaeafu'r celloedd. Cafodd y celloedd ROS-positif eu delweddu fel smotiau gwyrdd llachar, a chynyddodd LPS ynghyd â thriniaeth ATP lefel y ROS mewngellol yn sylweddol, o'i gymharu â'r un yn y grŵp rheoli (Ffigur 3). Yn y cyfamser, roedd triniaeth gyda Tan IIA yn atal yr LPS ynghyd â chynnydd a achosir gan ATP mewn ROS mewngellol yn sylweddol (Ffigur 3). Roedd y canlyniadau hyn yn awgrymu bod gan Tan IIA allu gwrthocsidiol.

Ffigur 3. Roedd gan Tan IIA effaith reoleiddiol ar fynegiant ROS (bar graddfa 50μm)

Cafodd y celloedd eu rhag-drin â Tan IIA 10µM am 30 munud a'u hysgogi â LPS (1 ug/mL) am 5.5 h. Ychwanegwyd ATP 30 munud cyn cynaeafu celloedd. A. Delweddau fflworoleuedd cynrychioliadol o fynegiant cell ROS. B. Data meintiol o gyfartaledd ar draws tri arbrawf ar wahân. * P < 0.05="" vs="" ctrl,="" #="" p="">< 0.05="" vs="" lps/lps="" ynghyd="" ag="">

Ffigur 4. Roedd gan NAC effaith reoleiddiol ar fynegiant protein NLRP3.

Cafodd y celloedd eu rhag-drin â Tan IIA 10µM am 330 munud a'u hysgogi â LPS (1 ug/mL) / LPS (1 ug/mL) ynghyd â NAC (1mM) am 5.5 h. Ychwanegwyd ATP 30 munud cyn cynaeafu celloedd. A. Cynrychiolwr Blot gorllewinol o NLRP3. B. Data meintiol o gyfartaledd ar draws tri arbrawf ar wahân. * P < 0.05="" vs="" ctrl,="" #="" p="">< 0.05="" vs="" lps="" ac="">

Roedd gan NAC effaith reoleiddiol ar NLRP3

Gallai acetylcysteine ​​(N-acetyl-l-cysteine, NAC), sborionwr o ROS, atal mynegiant protein NLRP3. Fel y crybwyllwyd yn flaenorol, cynyddodd mynegiant protein NLRP3 yn sylweddol ar ôl ei ysgogi gyda LPS ynghyd ag ATP am 6h, ac roedd triniaeth gyda Tan IIA yn atal y LPS ynghyd â chynnydd a achosir gan ATP yn lefel protein NLRP3. At hynny, gallai triniaeth gyda NAC hefyd atal LPS ynghyd â chynnydd a achosir gan ATP yn lefel protein NLRP3 yn sylweddol (Ffigur 4). Dangosodd y canlyniadau hyn y gallai effaith reoleiddiol Tan IIA ar NLRP3 ddibynnu ar lwybr ROS-NLRP3.

Trafodaeth

Mae Macrophages yn cymryd rhan yn y broses o ymateb llidiol ac yn chwarae rhan hanfodol yn y broses o gnawdnychiant myocardaidd. Gall monocyte / macrophage a recriwtir i'r myocardiwm difrodi ryddhau ROS, cyfryngwyr llidiol, a proteas ymhellach, sy'n gwaethygu anaf myocardaidd [23]. Mae celloedd RAW264.7 wedi'u hystyried yn fodel macrophage arbrofol blaenllaw, ac maent yn chwarae rhan bwysig yn yr ymchwil i lwybrau signalau llidiol perthnasol macrophage [24]. Mae macrophages yn chwarae rhan hanfodol wrth gadw homeostasis cardiaidd a threfnu atgyweirio meinwe yn ogystal ag ailfodelu. Mae celloedd RAW264.7 a symbylwyd gan LPS wedi'u defnyddio'n helaeth i astudio cyffuriau sy'n meddu ar briodweddau gwrthlidiol a mecanweithiau sylfaenol [25,26].

Mae'r inflammasome NLRP3 yn gyfryngwr hanfodol o ymatebion llidiol, a bu tystiolaeth gynyddol bod inflammasome NLRP3 yn chwarae rhan hanfodol mewn clefydau'r galon. Mewn llongau arterial dynol, roedd mynegiant uchel NLRP3 yn cydberthyn â ffactorau risg o glefydau atherosglerotig a difrifoldeb clefyd rhydwelïau coronaidd [27], ac roedd lefel y genynnau sy'n gysylltiedig â llid NLRP3 yn gysylltiedig â phlac atherosglerotig [28]. Mae actifadu'r inflammasome NLRP3 hefyd wedi bod yn gysylltiedig ag ailfodelu cardiaidd andwyol. Cafodd NLRP3 ei actifadu mewn cardiomyocytes mewn model ailfodelu cardiaidd anffafriol a achosir gan lygod drwy gyfyngiad aortig traws (TAC), ac arweiniodd actifadu inflammasome NLRP3 at drawsnewid pro-caspase-1 i'w ffurf weithredol [29]. MCC950.a Gallai atalydd inflammasome NLRP3 atal effaith atherosglerotig, yn ôl pob tebyg mewn ffordd o atal adlyniad monocytes a lleihau cronni macroffagau mewnblac [30].

Mae Tan IIA yn fonomer mawr sy'n cael ei dynnu o Danshen, ac mae ganddo briodweddau biolegol amrywiol. Tan ⅡA wedigwrth-ymfflamychol, gwrthocsidiolac yn hyrwyddo effaith angiogenesis, ac fe'i defnyddiwyd yn eang ar gyfer trin afiechydon y system cardio-serebro-fasgwlaidd [11]. Mae tystiolaeth sy'n dod i'r amlwg wedi dangos bod Tan A wedi atal anaf cardiomyocytes, ffibroblastau cardiaidd, atherosglerosis, aniwro-llid[13-16]. Mae ein hastudiaethau blaenorol wedi dangos bod Tan IIA wedi cael effaith gwrthlidiol trwy atal llwybr signalau TLR4-MyD88-NF-KB ac addasu mynegiant miRNA cysylltiedig mewn celloedd RAW264.7 a symbylwyd gan LPS [31] . Yn ogystal, gallai Tan IIA hyrwyddo polareiddio macrophage o ffenoteip M1 pro-llidiol tuag at ffenoteip gwrthlidiol M2 [32]. Fodd bynnag, roedd y mecanwaith moleciwlaidd sy'n sail i effeithiau Tan IIA yn aneglur o hyd.

Mae ein canlyniadau wedi dangos bod cynhyrchu NO wedi cynyddu'n sylweddol mewn celloedd RAW264.7 wedi'u hysgogi â LPS, a bod triniaeth Tan IIA (ar 10, 1, a 0.1 uM) wedi lleihau cynhyrchiad NO y celloedd yn sylweddol. Gallai celloedd RAW264.7 sy'n cael eu hysgogi â LPS ysgogi actifadu'r ymateb llidiol, a gallai Tan IIA gael ei leddfu, gan gynnwys mynegiant mRNA o NLRP3, IL-1, a TNF- .ATP yw ail foleciwl signal o NLRP3 actifadu llidus. Yn yr astudiaeth, defnyddiwyd ATP i gymell actifadu NLRP3. Dangosodd y canlyniadau fod LPS ac ATP wedi ysgogi actifadu mynegiant protein NLRP3 ac y gallai Tan IIA ei leddfu. Yn y celloedd a ysgogwyd gan LPS neu LPS ac ATP cynyddwyd mynegiant protein IKBa, pp65/p65 yn sylweddol; a thriniaeth Tan IA (ar 10μM) gostwng yn sylweddol y upregulation. Cafodd lefel protein pp38/p38 ei huwchreoleiddio mewn celloedd a ysgogwyd â LPS ynghyd ag ATP, a rhwystrwyd yr uwchreoleiddio gan Tan IA(10uM). At hynny, roedd mynegiant protein HMGB1 hefyd wedi'i wella mewn celloedd a ysgogwyd gyda LPS neu LPS ynghyd ag ATP ond ni ddangosodd unrhyw wahaniaeth ystadegol. Roedd y canlyniadau hyn yn awgrymu y gallai Tan IIA atal actifadu llwybr NF-kB a p38 wedi'i ysgogi gan LPS neu LPS ac ATP.

Cynyddodd triniaeth LPS ynghyd ag ATP lefel ROS mewngellol yn sylweddol, ac ataliodd Tan IIA yr LPS ynghyd â chynnydd a achosir gan ATP mewn ROS mewngellol yn sylweddol. Mae asetylcysteine ​​(N-acetyl-I-cysteine, NAC) yn sborionwr ROS. Gallai NAC atal IPS ynghyd â chynnydd a achosir gan ATP yn lefel protein NLRP3 yn sylweddol. Awgrymodd y canlyniadau hyn fod gan Tan IIA y gallu gwrthocsidiol ac y gallai effaith reoleiddiol Tan IIA ar NLRP3 ddibynnu ar lwybr ROS-NLRP3.

I grynhoi. Gallai Tan IIA atal yr ymateb llidiol a mynegiant NLRP3 a ysgogwyd gan LPS neu LPS ynghyd ag ATP, a gallai NAC atal LPS ynghyd â chynnydd a achosir gan ATP yn lefel NLRP3. Trwy hyn, gellid dyfalu y gallai'r mecanwaith sy'n sail i effeithiau Tan IIA gynnwys rheoleiddio'r llwybr ROS-NF-kB/P38-NLRP3. Roedd yr astudiaeth hon yn nodweddu mecanwaith moleciwlaidd Tan IA ymhellach ac yn rhoi meddyliau newydd i'w therapi clinigol.

Cyfeiriadau

1 M.DeBerge.SJ. Shah, L. Weilbacher, et al Macrophages mewn methiant y galon gyda llai o ffracsiwn alldafliad yn erbyn cadw. Tueddiadau Mol. Med 2019, 25: 328-340.

2. GH. Gislason, S. Jacobsen, JN Rasmussen, et al Risg o farwolaeth neu ail-gnawdnychiant sy'n gysylltiedig â defnyddio atalyddion cyclooxygenase -2 detholus a chyffuriau gwrthlidiol ansteroidal an-ddewisol ar ôl cnawdnychiant myocardaidd acíwt. Cylchrediad 2006, 113: 2906-2913

3. DM McNamara, R. Holubkov, RCStarling, et al. Treial rheoledig o globulin imiwnedd mewnwythiennol mewn cardiomyopathi ymledol a ddechreuwyd yn ddiweddar. Cylchrediad 2001, 103:2254-2259.

4. PM Ridker, BMEverett, T.Thuren, et al. Therapi gwrthlidiol gyda canakinumab ar gyfer clefyd atherosglerotig. N Eng J Med 2017,377:1119-1131. PMRidker, JG MacFadyen, T. Thuren, et al.

5. Effaith ataliad beta interleukin â chanakinumab ar achosion o ganser yr ysgyfaint mewn cleifion ag atherosglerosis: canlyniadau archwiliadol o hap-dreial, dwbl-ddall, a reolir gan blasebo. Lancet 2017,390:1833-1842. H. Guo, JB Callaway, JP Ting.

6. mecanwaith gweithredu, rôl mewn clefyd, a therapiwteg. Nat Med 2015,21:677-687.

7. L.Minutoli.D.Puzzolo,M.Rinaldi, et al. NLRP3 wedi'i gyfryngu gan ROS actifadu llidus yn yr ymennydd. calon. anaf i'r arennau, ac isgemia'r testis/atlifiad. Oxid Med Cell Longley 2016.2016:2183026.

8. M.KawaguchiM.TakahashiTHata, et al. Mae actifadu ffibroblastau cardiaidd yn llidus yn hanfodol ar gyfer anaf isgemia myocardaidd/atlifiad. Cylchrediad 2011, 123:594-604. G. Trendelenburg. Rheoleiddio moleciwlaidd o ffawd celloedd

9. mewn isgemia cerebral: rôl y inflammasome a llwybrau cysylltiedig. Metab Llif Gwaed J Cereb 2014,34:1857-1867.

10.C. Jin, RAFlavell. Mecanwaith moleciwlaidd o NLRP3 actifadu inflammasome.J Clin Immunol 2010,30:628-631.

11.Y. Cai. W, Zhang, Z.Chen, et al. Mewnwelediadau diweddar i weithgareddau biolegol a systemau cyflenwi cyffuriau tanshinones. Int J Nanomedicine 2016,11:121-130.

12. M.Akaberi, M.Iranshahi, S. Mehri. Mae llwybrau signalau moleciwlaidd y tu ôl i effeithiau biolegol rhywogaethau salvia yn diterpenes mewn niwroffarmacoleg a chardioleg. Phytother Res2016.30:878-893.

13. D. Wang, Y.Liu, G.Zhong, et al. Cydnawsedd IIA tanshinone ac astragaloside IV wrth wanhau anaf cardiomyocytes a achosir gan hypocsia. Ethnopharmacol 2017,204:67-76.

14. Mae W. Chen, X.Li, S.Guo, et al.Tanshinone IIA yn cysoni croes-siarad awtophag a polareiddio mewn macroffagau trwy lwybr miR-375/KLF4 i wanhau atherosglerosis. Int Immunopharmacol 2019,70:486-497.

15. YT Tsai, SHLoh, CY Lee, et al. Mae Tanshinone A yn atal synthesis colagen uchel a achosir gan glwcos trwy ffactor niwclear erythroid 2- ffactor cysylltiedig 2 mewn ffibroblastau cardiaidd. Biocemeg Cell Ffisiol 2018,51:2250 2261.

16.N. Huang, Y.Li, Y. Zhou, et al. Effaith niwro-amddiffynnol celloedd mesenchymal tanshinone sy'n cael eu deor gan IA yn deillio o Abeta25-35-a achosir 5C Ar niwro-inflammation.Behav Brain Res 2019,365:48-55.

17.T. Heidt. G Courtesies, P Dutta, et al. Cyfraniad gwahaniaethol monocytau i facroffagau'r galon mewn cyflwr cyson ac ar ôl cnawdnychiant myocardaidd. Cylch 2014,115:284-295.

18. S. Steffens,F. Montecuco, F. Mach. Mae'r ymateb llidiol yn darged i leihau isgemia myocardaidd ac anafiadau atlifiad. Thromb Haemost 2019,102:240-247.

19.J. MacMicking, OW Xie. C. Nathan Ocsid nitrig a swyddogaeth macrophage Annu Parch Immunol 1997,15: 323-350.

20.SHHH. W, WU NO yn Work.Cell 1994.78: 919-925.

21. L. Franchi, T. Eigenbrod, R. Munoz-Planllo, et al The inflammasome: a caspase-1-llwyfan actifadu sy'n rheoleiddio ymatebion imiwn a phathogenesis clefydau. Nat Immunol 2009,10:241-247.

22. X. Dong Z. Zheng, P. Lin, et al Mae ACPAs yn hyrwyddo cynhyrchu beta IL-1 mewn arthritis gwynegol trwy actifadu'r NLRP3 inflammasome. Cell Mol Immunol 2019.

23. PJ. Murray, TA Wynn. Swyddogaethau amddiffynnol a phathogenaidd is-setiau macrophage. Nat Parch Immunol 2011,11:723-737.

24. Mae llwybr G Pascual, AL Fong, S.Ogawa, et al.A SUMOylation-ddibynnol yn cyfryngu traws-fesur genynnau ymateb llidiol gan PPAR-gama. Natur 2005,437:759-763.

25.X. Zhang G.Wang, ECGurley, et al. Mae apigenin flavonoid yn atal ymateb llidiol a achosir gan polysacarid lipo trwy fecanweithiau lluosog mewn macroffagau. PLoS Un 2014,9: e107072.

26. Z. Yuan, MA Syed, D.Panchal, et al. Mae modiwleiddio epigenetig wedi'i gyfryngu gan Curcumin yn atal mynegiant TREM-1 mewn ymateb i lipopolysaccharid. Int J Biocemeg Cell Biol 2012,44:2032-2043.

27.F.Zheng.S, Xing. Mae inflammasomes Zhong, et al NLRP3 yn dangos mynegiant uchel yn yr aorta o gleifion ag atherosglerosis. Cylchred Ysgyfaint y Galon 2013, 22:746-750.

28. G Paramel Varghese, L. Folkersen, RJ Strawbridge, et al. Mynegiant llidus NLRP3 ac actifadu mewn atherosglerosis dynol. J Am Heart Assoc 2015,5.

29.T. Mae Suetomi, A. Willeford, CSBrand, Llid Er al ac actifadu llidus NLRP3 a gychwynnwyd mewn ymateb i orlwytho pwysau gan Ca(2 plus )/ signalau delta protein kinase II sy'n ddibynnol ar galmodwlin mewn cardiomyocytes yn hanfodol ar gyfer ailfodelu cardiaidd anffafriol. Cylchrediad 2018, 138:2530-2544.

30. T. van der Heijden, E. Kritikou, W. Venema, et al. Mae ataliad inflammasome NLRP3 gan MCC950 yn lleihau datblygiad briwiau atherosglerotig mewn adroddiad byr llygod e-ddiffygiol apolipoprotein. Arterioscler Thromb Fasc Biol 2017,37:1457-1461.

31. G Fan.X. Jiang. X. Wu, e1 al. Gwrthlidiol gweithgaredd tanshinone IIA mewn macroffagau RAW264.7 a ysgogir gan LPS trwy miRNAs a TLR4-llwybr NF-kappaB. Llid 2016,39: 375-384.

32. S. Gao, Y. Wang, D. Li, et al. Mae Tanshinone IIA yn lleddfu ymateb llidiol ac yn cyfarwyddo polareiddio macrophage mewn celloedd RAW264.7 a symbylir gan lipopolysaccharid. Llid 2019, 42: 264-275.