Effeithiau Pwysau Darlifiad Ar Golled Podocyte yn Arennau'r Llygoden Darlifedig Arunig
Mar 13, 2022
Haniaethol
Cefndir/Nodau: Mae podocytes yn cael eu colli yn y rhan fwyaf o glefydau glomerwlaidd, gan arwain at glomerwlosclerosis a chynyddolclefyd yr arennau. Tybir yn gyffredinol bod podocytau yn agored i'r llif hidlo ac felly i rymoedd cneifio sylweddol sy'n gyrru eu datodiad o'r bilen islawr glomerwlaidd (GBM). Yn y cyd-destun hwn, mae elifiad proses traed wedi'i gynnig fel ymateb addasol posibl i gynyddu adlyniad podocytau i'r GBM. Dulliau: Rydym wedi profi'r damcaniaethau hyn gan ddefnyddio cliriad optegol a dadansoddiad morffometrig 3- cydraniad uchel yn y murine darlifedig ynysigaren.Fe wnaethom ymchwilio i ddeinameg datodiad podocyte ar wahanol bwysau darlifiad (50, 300 a mwy na 450 mmHg) mewn llygod ifanc neu hen iach (20 vs. 71 wythnos oed), neu lygod wedi'u chwistrellu â serwm gwrth-GBM i gymell traed byd-eang elifiad proses. Canlyniadau: Mae'r canlyniadau'n dangos bod podocytau iach mewn llygod ifanc wedi'u cysylltu'n dynn â'r GBM ac nid oedd hyd yn oed pwysau uwchsafig yn achosi datgysylltiad sylweddol. O'i gymharu â llygod ifanc, mewn llygod a llygod oedrannus â neffritis gwrth-GBM ac elifiad prosesau traed, roedd colled graddol raddol o podocytes eisoes wedi digwydd cyn darlifiad. Arweiniodd pwysau darlifiad uchel at golled ychwanegol cymharol fach o bodosytau mewn llygod oedrannus. Mewn llygod â neffritis gwrth-GBM, digwyddodd colled podocyt ychwanegol sylweddol ar yr adeg gynnar hon wrth gynyddu pwysau darlifiad i 300 mmHg neu uwch. Casgliad: Mae’r gwaith hwn yn darparu’r dystiolaeth arbrofol gyntaf bod podocytes yn hynod o wrthiannol i bwysau darlifiad cynyddol acíwt mewn ardal ynysig ex vivoarenmodel darlifiad. Dim ond mewn clefyd glomerwlaidd, mae niferoedd sylweddol o bodosytau anafedig yn datgysylltiedig yn dilyn cynnydd acíwt mewn pwysedd darlifiad.
Geiriau allweddol:gorbwysedd glomerwlaidd; Gor-hidlo glomerwlaidd; Straen mecanyddol; Dilyniant; Clefyd cronig yn yr arennau
BYDD CISTANCHE YN GWELLA CLEFYD YR ARREN/ARENAU
Rhagymadrodd
Mae gorbwysedd glomerwlaidd a gorhidlo yn niweidio'r glomerwlws gan arwain at glefyd glomerwlaidd cynyddol. Credir yn eang bod pwysau darlifiad cynyddol yn gwneud y tuft yn agored i fwy o straen mecanyddol gan herio adlyniad podocytes i'r bilen islawr glomerwlaidd (GBM), gan gyfrannu at eu datgysylltiad [1, 2]. Mae podocytes yn gelloedd ôl-mitotig hynod wahaniaethol, sy'n hanfodol ar gyfer rhwystr hidlo glomerwlaidd cyfan. Mae colled podocyte yn fwyaf tebygol o ganlyniad i ddatgysylltu celloedd hyfyw o'r GBM yn hytrach nag apoptosis neu necrosis [3-6] gan ei bod wedi bod yn bosibl meithrin podocytau a adferwyd o wrin cleifion [4]. Gall datgysylltu podocytau hyfyw o'r GBM ddeillio o fecanweithiau ymlyniad diffygiol neu rymoedd altemecanyddol. Gall ymlyniad diffygiol i'r GBM fod oherwydd anaf cellog neu fynegiant llai o foleciwlau adlyniad ac mae'n gysylltiedig yn bennaf â chlefydau glomerwlaidd ymfflamychol. O ran grymoedd mecanyddol sy'n berthnasol i'r podocyt, mae dau benderfynydd allweddol, sef pwysedd hidlo a llif hidlo [7-9]. Mae pwysau hidlo yn cynhyrchu straen amgylchynol ar y wal ac yn gweithredu fel grym ymwahanu ar y GBM. Mae amrywiadau mewn pwysedd hydrostatig trawsffurfiol yn cael eu digolledu'n effeithiol gan allu'r GBM i weithredu fel pilen elastig ac ehangu neu grebachu yn yr arwynebedd [8, 10]. Ar y llaw arall, mae llif hidlif ar draws y GBM yn rhoi grymoedd tangiadol ar wyneb podocytau, hy straen cneifio. Gwyddom o astudiaethau in vitro fod podocytes yn agored iawn i straen cneifio sy'n ymwahanu o'u swbstrad pan fyddant yn agored i straen cneifio mwy na 0.025 Pa [11] a mabwysiadu ffenoteip canolradd a allai eu helpu i wrthweithio grymoedd sy'n deillio o lif [12]. Mae p'un a yw gorbwysedd glomerwlaidd yn effeithio ar bodosytau trwy bwysau hidlo cynyddol a/neu hidliad cynyddol yn parhau i fod yn aneglur. Yn yr astudiaeth hon, rydym yn darparu'r dadansoddiad cyntaf o allu podocytau i wrthsefyll grymoedd mecanyddol cynyddol mewn model ex vivo. Cafodd colled podocyte ei fesur gyda chydraniad uchel gan ddefnyddio clirio meinwe a 3-dadansoddiad morffometrig dimensiwn mewn llygod ifanc ac iach
Defnyddiau a Dulliau
Cynhaliwyd yr holl arbrofion anifeiliaid yn unol â chanllawiau cyfraith yr Almaen ar gyfer lles anifeiliaid ac fe'u cymeradwywyd gan Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen (Az 84-02.04. 2015.A469). Roedd llygod yn cael eu cadw mewn cyfleuster penodol heb bathogen gyda mynediad am ddim i chow a dŵr a chylch 12-awr dydd/nos. Roedd bridio a genoteipio yn cael eu gwneud yn unol â gweithdrefnau safonol. Mae llygod Pod-rtTA/LC1/R26R/H2BeGFP ar gefndir genetig FVB/N wedi'u disgrifio o'r blaen [13]. Er mwyn actifadu mynegiant trawsgene o Pod-rtTA-eGFP, derbyniodd llygod doxycycline trwy'r dŵr yfed ad libitum am 7 diwrnod (2 g/l, swcros 5 y cant, wedi'i warchod rhag golau) ac yna cyfnod golchi allan o 1 wythnos yn unol ag adroddiadau blaenorol. Ysgogwyd neffritis gwrth-GBM gan un pigiad mewnperitoneol o 5 mg/g o serwm pwysau corff neffrotocsig fel y disgrifiwyd yn flaenorol [14].
BYDD CISTANCHE YN GWELLA SWYDDOGAETH YR AREN/ARRENAU
Darlifiad arennau
Yr ynysigarendefnyddiwyd model darlifiad fel y disgrifir mewn man arall [15]. Yn gryno, cafodd y llygod eu narcoteiddio â chwistrelliad mewnperitoneol o xylazine/ketamine (0, ip pwysau’r corff 1ml/10g), ac yna cafodd yr arennau eu darlifo â datrysiad Krebs-Henseleit-Henseleit wedi’i addasu’n gymhleth (Tabl 1) wedi’i ategu â 5 albwm serwm buchol y cant (BSA) ar 37 gradd i ddynwared yr amgylchedd ffisiolegol yn ystod yr arbrawf. vasodilatation mwyaf posibl yarenysgogwyd fasgwleiddiad gan 1. chwistrelliad isgroenol o verapamil (50µl) yn syth ar ôl sefydlu anesthesia a 2. ychwanegu papaverine i'r hydoddiant darlifiad. Ar ôl darlifiad cychwynnol am 5 munud ar 50 mmHg, chwistrellwyd lectin wedi'i labelu'n fflworoleuol (Communis I - RCA120; Vector Laboratories: RL-1082; 4 ul yn 986 ul o halwynog) i labelu celloedd endothelaidd.Arennauwedi'u darlifo am 5 munud ychwanegol gyda'r datrysiad Krebs-Henseleit wedi'i addasu gyda 5 y cant BSA. Ar ôl hynny, y chwitharena wasanaethodd fel rheolaeth baru ym mhob arbrawf yn cael ei ddileu ar ôl clymu'r chwith yn ofalusarennolllestri, wedi'u torri'n dafelli, a'u trochi'n uniongyrchol mewn paraformaldehyd 3 y cant (PFA) mewn halwynog wedi'i glustogi â ffosffad (PBS). Yr hawlaren was perfused either for additional 5 minutes at 300 mmHg or with supramaximal pressure (>>300mmHg, amcangyfrifwyd bod pwysau hidlo ymhell uwchlaw 400 mmHg), wedi'i gymhwyso â llaw, cyfanswm cyfaint o hydoddiant darlifiad 50 ml. Mae'rarennauwedi'u darlifo â phwysedd cyson o 50 mmHg neu 300 mmHg trwy ddefnyddio pwmp a reolir gan bwysau (Universal Perfusion Systems UP-100, Hugo-Sachs Electronics, yr Almaen). Yna y ddearenei dynnu, ei dorri'n dafelli 2 mm, a'i drochi mewn paraformaldehyd 3 y cant (PFA) mewn halwynog wedi'i glustogi â ffosffad (PBS).
Delweddu 3D a dadansoddiad cyfrifiannol Wedi'i drochi gan PFAarendeorwyd tafelli ar ysgydwr mecanyddol am 5 diwrnod ar dymheredd ystafell. Wedi hynny, golchwyd samplau sefydlog mewn 1x PBS a'u rhoi mewn ysgydwr mecanyddol dros nos ar dymheredd yr ystafell.Arennauyna gosodwyd tafelli mewn ethanol gradd uchel 100 y cant (Merck; 100983) am 1 awr ar dymheredd ystafell gydag ysgwyd ysgafn (o leiaf 1 newid i ethanol ffres), ac yna trochi uniongyrchol yn Ethyl Cinnamate (ECi) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO; 112372) ac fe'u gadawyd dros nos mewn ysgydwr ysgafn ar dymheredd ystafell dan amddiffyniad golau. Cyflawnwyd tryleuedd meinwe mewn llai nag 1 awr. Ar gyfer microsgopau unionsyth, defnyddiwyd siambrau mewnol tafladwy fel y disgrifiwyd yn flaenorol [16]. Perfformiwyd y rhan fwyaf o arbrofion gan ddefnyddio microsgop ffoton 2- (LaVision BioTec TriMScope, "Medizinische Fakultät RWTH Aachen, IZKF Aachen, Cyfleusterau Craidd). Defnyddiwyd meddalwedd delweddu Fiji i symud trwy echel Z pob pentwr o adrannau optegol cyfresol ac i ynysu glomerwli unigol trwy gnydau 3D [16] 40 glomeruli fesularen(20 subcortical ac 20 cyfochrog) i'w dadansoddi. Felly, dadansoddwyd cyfanswm o 1200 o glomeruli yn yr astudiaeth hon i gael canlyniadau gyda digon o gywirdeb. Nodwyd podocytau fel eGFP ynghyd â chelloedd. Perfformiwyd meintioli cyfaint capilari, cyfaint glomerwlaidd yn ogystal â rhif niwclysau (dotiau) a chyfaint gan ddefnyddio meddalwedd rendro a dadansoddi 3D (Imaris v9.1; Bitplane AG, Zurich, y Swistir) Cyfrifwyd pellter podocytes o'r polyn fasgwlaidd gan ddefnyddio Bitplane XTension "Spot Agosaf. Pellter". Perfformiwyd meintioli awtomataidd o podocytes fel y disgrifiwyd yn flaenorol [17]. Perfformiwyd dadansoddiad delwedd gan ddefnyddio Imaris (Biplane AG Zurich, y Swistir). Diffiniwyd pob glomerwlws gan ei rhydweli afferent â label lectin. 20 subcortical ac 20 cyfochrog (a ddiffinnir gan eu pellter o'r arwyneb cortigol).
BYDD CISTANCHE YN GWELLA POEN YN YR AREN/ARENIAD
Microsgopeg ysgafn ac Imiwnofflworoleuedd
Ar gyfer microsgopeg ysgafn, mae'r byffer o 4 y cant yn formalin-sefydlogarencafodd darnau eu dadhydradu, eu gwreiddio mewn paraffin a'u staenio ag asid cyfnodol-Schiff (PAS). Cyfrifwyd canran y glomerwli annormal/anafedig yn seiliedig ar nodi 50 trawstoriad glomerwlaidd cynrychioliadol fesul llygoden a ddewiswyd yn ystod taith gerdded systematig ar draws yarennolcortecs. Perfformiwyd ein protocol immunofluorescence safonol [18] ar adrannau 2 μm wedi'u hymgorffori â pharaffin. Defnyddiwyd y gwrthgyrff canlynol: gwrth-GFP polyclonaidd cyw iâr (ab13970; Abcam), gwrth-synaptopodin monoclonaidd llygoden (sc-515842; Biotechnoleg Santa Cruz), gwrth-lygoden polyclonaidd gwrth-lygoden p57 (sc-8298); -Cruz Biotechnology), cwningen polyclonal gwrth-WT1 (sc-192; Santa-Cruz Biotechnology), Cy2 asyn gwrth-cyw iâr (703-225-155; Dianova, Hamburg, yr Almaen), Alexa Fluor546 gafr gwrth-lygoden IgG1 (A-21123; Thermo Fischer), asyn polyclonaidd gwrth-gwningen AF555 (A31572; Life Technologies, Carlsbad, CA).
Microsgopeg Electron
Gosodwyd darnau bach o'r cortecs yn ateb Karnovsky a'u hymgorffori yn Epon (Serva, Heidelberg, yr Almaen). Archwiliwyd adrannau uwch-thin gyda microsgop electron trawsyrru ZEISS Leo 906 ar 60 kV trwy chwyddhad o 3597-6000x. Golchwyd samplau mewn 0.1 M ffosffad Soerensen (Merck, Darmstadt, yr Almaen), ôl-sefydlog mewn 1 y cant OsO 4 (Roth, Karlsruhe, yr Almaen) mewn byffer swcros 17 y cant (Merck, Darmstadt, yr Almaen) a'u dadhydradu trwy esgynnol cyfres ethanol ( 30, 50, 70, 90 a 100 y cant ) am 10 munud yr un. Ailadroddwyd y cam olaf 3 gwaith. Deorwyd sbesimenau dadhydradedig mewn propylen ocsid (Serva, Heidelberg, yr Almaen) am 30 munud, mewn cymysgedd o resin Epon (Serva, Heidelberg, yr Almaen) a propylen ocsid (1:1) am 1h ac yn olaf mewn Epon pur am 1h. Perfformiwyd polymerization Epon ar 90 gradd am 2 awr. Torrwyd rhannau ultrathin (70-100 nm) gan ultramicrotome (Reichert Ultracut S, Leica gyda chyllell diemwnt (Leica) a'u codi ar gridiau Cu/Rh (HR23 Maxtaform, Plano, Wetzlar Germany). staenio â 0.5 y cant asetad wranyl ac 1 y cant sitrad plwm (y ddau EMS, Munich, yr Almaen) Edrychwyd ar samplau ar foltedd cyflymiad o 60 kV gan ddefnyddio microsgop electron trosglwyddo Zeiss Leo 906 (Carl Zeiss, Oberkochen, yr Almaen).
Dadansoddiad ystadegol
Perfformiwyd dadansoddiadau ystadegol gyda meddalwedd GraphPad Prism v8. Mynegir pob gwerth fel modd ± SD. I gymharu 2 grŵp, defnyddiwyd prawf-t. Cymharwyd sawl grŵp gan ddefnyddio dadansoddiad o amrywiant; Defnyddiwyd cywiriad post hoc Tukey ar gyfer cymariaethau lluosog. Roedd pob prawf yn 2-gynffon a diffiniwyd arwyddocâd ystadegol fel P <>
Canlyniadau
Dull lled-awtomatig i bennu nifer y podocytes fesul glomerwlws Astudiwyd tri grŵp, hy llygod ifanc a hen iach a llygod â glomerwloneffritis gwrth-GBM (♂:♀ 1:1). Roedd llygod ifanc, iach yn 15-21 wythnos oed, tra roedd hen (oed) yn 74 wythnos oed. Cafodd elifiad proses traed byd-eang ei ysgogi mewn 14-20 o lygod yr wythnos ol trwy un pigiad o serwm gwrth-GBM 3 diwrnod cyn sefydlu'r perfwsiwr ynysigarenmodel (Ffig. 1A), fel y disgrifiwyd yn flaenorol [19].
Er mwyn pennu dylanwad pwysau darlifiad intrarenal ar podocytes,arennauyn destun gwahanol bwysau darlifiad yn yr ardaloedd ynysigarenmodel darlifiad. Yn gyntaf, y ddauarennaubob amser yn cael eu darlifo ar 50 mmHg am 5 munud. I brofi a oedd ein hydoddiant darlifiad wedi cadw cyfanrwydd y glomerwlws yn yr ansefydlog hyfywarennau, Cafodd 2 lygoden eu darlifo ar bwysedd cyson o 100 mmHg am 90 munud. Darlifiad, llif wrinol (pwysau corff 25 µl/mun/g) yn ogystal â chliriad inulin (22 µl/mun) wedi aros yn sefydlog dros yr amser cyfan (Ffig. Atodol 1 – ar gyfer yr holl ddeunydd atodol gwelerwww.cellphysiolbiochem.com).Mewn llygod arbrofol, ar ôl darlifiad cychwynnol ar 50 mmHg, y chwitharen was removed and served as a control in all experiments. Next, constant pressure of 300 mmHg or a pressure significantly higher than 300 mmHg (>>300 mmHg; gwasgedd hidlo supramaximal o tua 450 - 500 mmHg) wedi'i gymhwyso i'r dde sy'n weddillarenam 5 mun. (Ffig. 1B). Yn y perfused ynysigarennau, nodwyd podocytau gan ddefnyddio labelu niwclear gydag eGFP-histone yn ein llygod trawsgenig yn mynegi eGFP o dan yr hyrwyddwr podocin (eGFP: llygod Pod-rtTA). Mesurwyd niferoedd podocyt gan ddefnyddio cyfuniad o hyn mewn labelu metabolaidd in vivo a morffometreg 3D (Ffig. 1 C).
Colli podocyt mewn llygod iach ac oedrannus
Healthy mice contained 87.46 ± 5.66 (SD) podocytes per glomerulus at baseline (i.e.at physiological perfusion pressure of 50 mmHg) (Fig. 2A). Juxtamedullary glomeruli were larger than those in the outer cortex (Supplementary Fig. 2), but this was not associated with higher podocyte numbers (87.0± 23.65 vs. 90.1 ± 18.49, respectively, Fib 2B). No differences in the number of podocytes related to sex were observed (see below). In young mice, there was no significant loss of podocytes at high (300 mmHg) or maximal (>>300 mmHg) perfusion pressures (85.62 ± 10.83 and 81.98 ± 6.45 podocytes per glomerulus, respectively) (Fig. 1A). On PAS sections, mild histological changwere observed particularly in aged mice (Fig. 2A), which were independent of perfusion pressures. In addition, tubular dilatation and interstitial edema were apparent as a result of perfusion. In humans, older age (53 ± 10 years) has been associated with absolute and relative podocyte depletion [20]. Compared to young mice, our mice aged 72 weeks contained significantly lower numbers of podocytes per glomerulus at baseline (52.81 ± 13.8 SD), indicating that about 40% of the podocytes had been lost. Perfusion at high or maximal pressures resulted in only a very mild reduction of podocyte numbers (48.65 ± 16.8 SD and 41.06 ± 17.7 SD, respectively). Because of the precision of the counting method (absolute podocyte numbers in 40 glomeruli per mouse) [21], the loss of podocytes of 7.9% and 22% after perfusion with 300 or >>Mae 300 mmHg yn y drefn honno o'i gymharu â'r llinell sylfaen yn awgrymu nad yw'r cynnydd bach hwn mewn colled podocyte gyda phwysedd uwch yn ganfyddiad cyd-ddigwyddiadol. Ar adrannau PAS, arsylwyd newidiadau glomerwlaidd ysgafn mewn llygod oedrannus ar y gwaelodlin (ehangiad mesangial a sglerosis achlysurol, Ffig. 2 F). A
Colli podocyt ar ôl anaf acíwt
Rhoddwyd serwm gwrth-GBM ar lygod iach ifanc i achosi anaf sylweddol a phenodol i bodosytau. Ar y pwynt amser cynnar iawn (hy 3 diwrnod) ar ôl sefydlu glomerulonephritis gwrth-GBM, gwelwyd elifiad proses traed cyffredinol ym mhob glomeruli trwy ficrosgopeg electron trawsyrru (Ffig. 3A-D). Yn ynysig perfusedarennauobtained from these mice, at baseline (i.e. perfusion with 50mmHg) podocyte numbers per glomerulus were reduced by 20% compared to controls (69.76 ± 7.07 vs 87.46 ± 5.66, respectively) (Fig. 3E). Perfusion with higher pressures (300 and >>300 mmHg) resulted in significant further reductions of podocyte numbers per glomerulus (50.84 ± 7.82 and 53.18 ± 4.26, respectively), i.e. 27% and 24% additional reduction (Fig. 3E). When analyzing individual glomeruli, the anti-GBM mice, perfusion with >>Achosodd 300 mmHg fwy na 80 y cant o golled podocyte mewn lleiafrif o'r glomeruli (Ffig. 3E). Mae hyn yn unol â natur ffocal y model clefyd gwrth-GBM. O fewn glomeruli juxtamedullary, roedd colled podocyte yn fwy amlwg o'i gymharu â glomeruli subcortical (56.66 ± 16.9 a 47.35 ± 17.07, yn y drefn honno) (Ffig. 3F)
By transmission electron microscopy (TEM), specific changes were observed after high perfusion pressures, in particular focal podocyte detachment from the GBM and denuded basement membrane (Fig. 3D). Cellular debris was present within the capillaries as well as within Bowman's space (>>300 mmHg); ni ddangosodd yr endotheliwm newidiadau sylweddol. Nododd staen PAS ymlediad tiwbaidd. Tri diwrnod ar ôl chwistrellu serwm gwrth-GBM, nid oedd unrhyw friwiau cilgantaidd wedi datblygu eto (Ffig. 3G-I). Dangosodd gwrywod radd uwch o golled podocyte o'i gymharu â benywod (63.71 ± 2.11 yn erbyn 75.81 ± 3.83 podocytes fesul glomerwlws), sy'n gyson â'r sylw bod llygod drwg yn fwy agored i antiserwm gwrth-GBM ac yn ffurfio mwy o gilgantau cellog yn ystod y cyfnod hwn. yr afiechyd (Ffig. 3J). Fodd bynnag, roedd y golled ychwanegol o podocytes ar ôl pwysau darlifiad uchel yn debyg mewn gwrywod a benywod (Ffig. 3J).
Ffig. 3. Colli podocyt ar ôl anaf acíwt. (AB) Microsgopeg trosglwyddo electron o reolyddaren per- fused at a low pressure and after supramaximal pressure (>>300 mmHg) shows normal foot process architecture. (C-D) Transmission electron microscopy reveals the typical finding of foot process effacement after injection of anti-GBM serum at baseline. After perfusion with higher pressure, areas of denuded basement membrane were observed. (E) Total number of podocytes per mouse in anti-GBM mice at baseline and under higher (300 mmHg) or supramaximal pressures (>> 300 mmHg); (each circle represents 1 kidney; n=7 control kidneys with 50mmHg, n=8 anti-GBM kidneys with 50mmHg, n=4 kidneys with 300 mmHg or >> 300mmHg). (F) Total number of podocytes per glomerulus in juxtamedullary and subcortical glomeruli; each circle represents 1 subcortical glomerulus (n= 20 glomeruli pro mouse) and each triangle represents 1 juxtamedullary glomerulus (n= 20 glomeruli pro mouse). (G-I) Histologic staining of anti-GBM mice at baseline identified protein casts, whereas three days after injection of anti-GBM serum no crescentic lesions could be found. After perfusion with higher pressure, tubule-interstitial dilatation and edema were observed. (J) Total podocyte number per mouse between males and females; each circle represents 1 kidney (n=4 control kidneys with 50mmHg, n=4 anti-GBM kidneys with 50mmHg, n=2 kidneys with 300 mmHg or >>300mmHg). Ar gyfer cymariaethau lluosog ANOVA. ****P<0.0001, ***p ="" <="" 0,0001,=""><0.01,><0.05 and="" ns="" and="" ns="not" statistically="" significant;="" error="" bars="" represent="" means="" ±="">
Olrhain y podocytes coll yn y tiwbiau
eGFP plws podocytes arsylwyd yn rheolaidd o fewn y lumen y tiwbynau procsimol lle maent yn ymddangos i gadw at y brwsh-ffiniol o gelloedd tiwbyn procsimol ( Ffig. 4 A ). Ni chafodd y podocytes hyn eu golchi i ffwrdd mewn hyperperfusedarens, yn lle hynny roeddent yn glynu'n dynn wrth ymyl y brwsh i wrthsefyll llif rhyfeddol yr wrin cynradd ar bwysau darlifiad uchel iawn. I gadarnhau eu hunaniaeth, podocytes eu cyd-staenio â podocyte-benodol marcwyr (hy, p57, synaptopodin a WT-1) yn ychwanegol at y marciwr olrhain llinach genetig niwclear eGFP (Ffig. 4 B). Niferoedd podocyte yn sylweddol is yn y rhai glomeruli gyda podocytes glynu yn y tiwbyn procsimol cysylltiedig, a phresenoldeb podocytes mewn tiwbiau cydberthyn gwrthdro â nifer y podocytes y glomerwlws ( Ffig. 4 C ).
Colli podocytes yn ffafriol mewn lleoliad perihilar
Finally, we investigated whether podocyte loss driven by an acute increase in perfusion pressures might occur in preferential locations of the glomerulus (i.e. at the vascular pole vs. the tubular pole of the glomerular tuft). To analyze the spatial distribution of podocyte detachment, the vascular pole was marked in each glomerulus (acquired in 3D) based on the lectin signal and the distance of each podocyte from the vascular pole was determined semi-automatically. The individual distances from the vascular pole were separated into quartiles (Fig. 4E). As depicted in Fig. 4E, the majority of podocytes clustered in the 2 middle quartiles (i.e. quartile 2 and 3). Less than 12 % of the podocytes localized to either in the first, i.e. vascular pole, or the fourth quartile, i.e. most distant from the vascular pole. Upon perfusion with pressures >>300 mmHg, ni welwyd unrhyw newidiadau sylweddol yn y dosbarthiad gofodol o podocytes mewn llygod ifanc ac iach. Mewn llygod oedrannus, cynyddwyd pellteroedd podocyt o'r polyn fasgwlaidd yn gyffredinol, gan adlewyrchu hypertroffedd glomerwlaidd yn fwyaf tebygol, tra bod gorlifiad wedi arwain at ddatodiad ffafriol o podocytau yn agos at y polyn fasgwlaidd (gostyngodd y chwartel 1af o 11.5 i 4.9 y cant mewn llygod oedrannus, Ffig. 4E). ). Yn yr un modd, arsylwyd datodiad ffafriol o podocytes yn agos at y polyn fasgwlaidd mewn podocytes effaced (gwrth-GBM, chwartel 1af wedi gostwng o 25 i 5 y cant ).
Trafodaeth
Yn yr astudiaeth hon, archwiliwyd effeithiau acíwt pwysau hidlo uwch a llif hidlo ar golled podocyte yn yr aren murine wedi'i harllwyso ynysig, gan ddefnyddio'r dull mwyaf cywir ar hyn o bryd i bennu niferoedd podocyte. Canfyddiad mawr cyntaf ein hastudiaeth oedd nad yw podocytau iach yn agored i straen cneifio acíwt in vivo, fel yr awgrymwyd yn flaenorol gan astudiaethau diwylliant celloedd [11]. Er mawr syndod i ni, nid oedd hyd yn oed pwysau uwchffisiolegol eithafol (mwy na 450 mmHg) wedi achosi datgysylltiad podocyt sylweddol. Yn hytrach, datgelodd microsgopeg electronau trawsyrru fod tair haen y rhwystr hidlo wedi'u cadw'n gymharol dda. Roedd llygod hŷn yn dangos gostyngiad yn niferoedd podocyte (fel yr adroddwyd yn flaenorol) ac roedd hyn yn gysylltiedig â dim ond tueddiad cynyddol cyfyngedig iawn i bwysau darlifiad uchel. Yr ail ganfyddiad mawr oedd bod anaf podocytau blaenorol yn golygu bod podocytau'n agored i'r datodiad ar bwysau darlifiad uchel. Dangosodd llygod gwrth-GBM ymlediad prosesau traed byd-eang dridiau ar ôl chwistrellu'r antiserwm gwrth-GBM a nifer sylweddol yn datgysylltiedig ar bwysau darlifiad uchel. Mewn llygod oedrannus, rydym yn damcaniaethu bod ffisioleg podocyte mewn cyflwr cymharol dda, gan eu gwneud yn llai agored i ddatgysylltu. Trwy gymhwyso dull cyfrif lled-awtomataidd, dadansoddwyd pob glomerwlws ar wahân (dadansoddwyd cyfanswm o 1200 glomeruli). Gwnaethom gadarnhau bod gan glomerwli juxtamedullary gyfaint uwch na glomerwli subcortical. Yn ddiddorol, roedd niferoedd podocyt yr un fath, sy'n dangos bod dwysedd podocyte yn cael ei leihau mewn glomerwli cyfosodedig. Yn ogystal, roedd glomerwli juxtamedullary hefyd yn fwy agored i bwysau hidlo cynyddol o gymharu â glomerwli subcortical. Gallai'r canfyddiadau hyn esbonio'n rhannol pam y gellir arsylwi briwiau FSGS yn amledd uwch mewn glomeruli mor fwy [22, 23].
Ffig. 4. Canfod podocytes yn y procs cyfagos. tiwbyn. (A) Delwedd gynrychioliadol yn dangos eGFP ynghyd â podocytau (gwyrdd) yn y tiwbiau. (B) Staeniad imiwnofflworoleuedd podocytau wedi'u cyd-labelu gan yr histone transgene eGFP (gwyrdd), a'r marcwyr podocyte mewndarddol p57 (coch), wt-1 (coch), a synaptopodin (porffor). (C) Cydgysylltu nifer y podocytau fesul glomerwlws â nifer y podocytau a nodwyd yn y tiwbyn (n=81 glomeruli o lygod rheoli, n{5}} glomerwli o lygod oedrannus, ac n= 81 glomeruli o lygod gwrth GBM). Ar gyfer cymariaethau lluosog, defnyddiwyd ANOVA. ****P<0.0001,>< 0.01="" and="" ns="not" statistically="" significant;="" error="" bars="" represent="" means="" ±="" sd;="" in="" the="" graph,="" each="" circle="" represents="" 1="" podocyte;="" (d)="" schematic="" showing="" how="" the="" distance="" of="" podocytes="" from="" vascular="" pole="" was="" calculated.="" (e)="" distances="" of="" individual="" podocytes="" from="" the="" vascular="" pole.="" the="" individual="" distances="" from="" the="" vascular="" pole="" were="" separated="" into="">
Cyfyngiad ar yr astudiaeth hon yw'r cyfnod arsylwi byr, gan na ellir dod i unrhyw gasgliadau ynghylch addasu podocytau yn y tymor hir i bwysau hidlo cynyddol. Cynigiwyd mai ymateb cyntaf podocytau sy'n agored i straen cneifio yw mynd trwy newidiadau strwythurol amddiffynnol [8, 24]. Mae'r newidiadau hyn yn cynnwys colli holltau hidlo (hy FPE) a disodli diafframau hollt drwy gyffyrdd cau neu gyffyrdd tynn. Disgrifiwyd cau cyffyrdd yn flaenorol mewn sawl model clefyd glomerwlaidd [25-28]. Fodd bynnag, yn ein hastudiaeth, gwelsom fod podocytes ag FPE yn fwy agored i bwysau darlifiad uwch. Felly, dangosodd ein canlyniadau nad oedd y newidiadau addasol hyn yn ddigon i amddiffyn rhag datgysylltiad neu hyd yn oed y gwrthwyneb, eu bod yn gwneud podocytau yn fwy agored i ddatgysylltu. Nesaf, gellir dadlau bod y perfused ynysigarennad yw'n system ffisiolegol a bod y pwysau a ddefnyddiwyd yn llawer uwch nag o dan amodau in vivo. Hyd y gwyddom ni, dim model arall sy'n defnyddio hyfywedd cyflawnarenyn bodoli a fyddai’n caniatáu ymchwilio’n uniongyrchol i effeithiau pwysau darlifiad cynyddol. Trwy ddefnyddio fasodilators cyn ac yn ystod darlifiad, ymlediad mwyaf posibl o lestri cyn-glomerwlaidd fel y'i hysgogir i ganiatáu llif anghyfyngedig (gor-hidlo) a'r trosglwyddiad mwyaf posibl o bwysau darlifiad cynyddol i'r glomerwlws. Yn yr astudiaeth bresennol, astudiwyd effeithiau llym pwysau darlifiad uwch. Gallai effeithiau hirdymor hyperperfusion patholegol fod yn fwy niweidiol, gan arwain at golli hyd yn oed mwy o bodosytau. Fodd bynnag, mae ein hastudiaeth yn awgrymu nad yw'r golled gronig hon o podocytau yn cael ei gyrru gan rym pur llif hidlo fel y cyfryw ond yn hytrach yn hytrach gan y newidiadau addasol (cam-)mewn podocytau sy'n lleihau eu hymlyniad wrth y GBM. Mae cleifion â chlefydau glomerwlaidd yn elwa ar driniaeth gwrthhypertensive trwy atal newidiadau strwythurol (cam-)addasol i podocytau.
Casgliad
Mae'r gwaith hwn yn darparu'r dystiolaeth in vivo gyntaf bod podocytau iach ynghlwm yn hynod o gadarn â'r GBM mewn arennau llygoden iach a gallant wrthsefyll pwysau darlifiad uchel iawn hyd yn oed. Mae heneiddio neu anaf podocyte acíwt hyd yn oed yn fwy amlwg gydag elifiad byd-eang, yn gwneud podocytau yn agored i'r datodiad oherwydd pwysau cynyddol darlifiad.
