Hydrolysis Ensymatig Wedi'i Ddatblygu Ar Gyfer Yr Ensymau Masnachol Gradd Bwyd Priodol
Oct 19, 2022
Cysylltwchoscar.xiao@wecistanche.comam fwy o wybodaeth
2.2. Effaith Ultrafiltration ar Priodweddau Hydrolyzate Collagen
Gall proses ultrafiltration fod yn ddull defnyddiol, diwydiannol manteisiol ar gyfer cynhyrchu ffracsiynau peptid bach gyda maint moleciwlaidd dymunol a bioactifedd uchel, yn dibynnu ar gyfansoddiad yr hydrolysad cychwynnol a'r gweithgaredd sy'n cael ei astudio [19]. Dangosir hydoddedd, cynnwys grŵp amino am ddim, a chynnyrch CHs ar ôl lyoffileiddiad (Tabl 1). Hydoddedd a chynnwys grŵp amino am ddim y rheolydd oedd 11.95 y cant a 0.79 y cant , yn y drefn honno. Ar ôl hydrolysis ensymatig ac uwch-hidlo gyda thoriad pwysau moleciwlaidd 3 kDa, gwelwyd y hydoddedd uchaf (21.17 y cant), a chynnwys grŵp amino am ddim (14.17 y cant) yn CH-Alcalase<3 kda.="" however,=""><3 kda="" was="" the="" lowest="" yield="" (12.42%)observed.="" therefore,="" although="" ultrafiltration="" is="" useful="" in="" separating="" chs="" with="" a="" low="" molecular="" weight="" it="" may="" cause="" a="" reduction="" in="">
Mae pwysau moleciwlaidd cyfartalog hydrolysadau protein yn ffactor pwysig sy'n pennu eu priodweddau biolegol [19]. Yn gyffredinol, ffracsiwn cyfartalog gyda MW<3 kda="" represents="" a="" collagen="" hydrolysate;="" an="" average="" fraction="" with="" mw="">50 kDa represents gelatin, and an average fraction with MW>Mae 300 kDa yn cynrychioli colagen [20,21]. Dosbarthiad pwysau moleciwlaidd cymharol y rheolaeth (sampl cyn-drin), CH-Alcalase, a CH-Alcalase<3 kda="" is="" depicted="" in="" figure="" 4.="" the="" molecular="" weight="" distribution="" was="" over="" 20,100="" da="" for="" the="" control,="" which="" did="" not="" include="" the="" collagen="" hydrolysate=""><3 kda).="" this="" could="" not="" be="" numerically="" provided="" in="" this="" study,="" as="" the="" detection="" limit="" of="" the="" index="" detector="" system="" only="" ranged="" from="" 106="" to="" 20,100="" da.="" however,="" ch-alcalase="" showed="" detectable="" values="" in="" a="" higher="" range="" of="" relative="" molecular="" weight="" distribution,="" which="" ranged="" from="" 20,100="" da="" to="" 4270="" da="" (maximum="" peak:12,600="" da).="" in=""><3 kda,="" the="" molecular="" weight="" distribution="" mainly="" showed="" three="" peaks:="" one="" with="" an="" mw="" of="" approximately="" 4270="" da="" (maximum="" peak),="" one="" with="" an="" mw="" of="" approximately="" 424="" da,="" and="" one="" with="" an="" mw="" of="" approximately="" 222="" da="" and="" 102="" da.="" ultrafiltration="" is="" an="" effective="" purification="" method="" used="" to="" obtain="" low="" molecular="" weight="" peptides="" from="" crude="" hydrolysates.="" results="" indicated="" that="" enzymatic="" hydrolysis="" by="" alcalase="" clearly="" reduced="" the="" high="" mw="" of="" the="" control="" (either="" collagen="" or="" gelatin),="" and="" that="" ultrafiltration="" was="" an="" effective="" purification="" method="" that="" can="" be="" used="" to="" obtain="" low="" molecular="" weight=""><3 kda)="" from="" crude="" collagen="" hydrolysates.="" reportedly,="" low="" molecular="" weight="" peptides="" (2-20="" amino="" acids)="" are="" more="" biologically="" active="" compared="" to="" their="" parent="" polypeptide/proteins,="" which="" are="" larger="">
Dangosir cyfansoddiad asid amino yn y CHs (Tabl 2). Roedd gan y CHS gan wahanol broteasau gyfansoddiadau asid amino gwahanol a phriodweddau gwrthocsidiol [23]. Roedd cyfansoddiad asid amino colagen yn gyfoethog mewn glycin (Gly), proline (Pro), ac asid glutamig (Glu). Cynnwys asid amino CHs(CH-Alcalase a'r CH-Alcalase<3 kda)="" increased="" more="" than="" that="" of="" the="" control,="" following="" enzymatic="" hydrolysis="" with="" or="" without="" ultrafiltration.="" in="" particular,="" the="" content="" of="" gly,="" pro,="" and="" glu="" was="" much="" higher="" in=""><3 kda(gly="" 218="" mg/g,="" pro="" 152="" mg/g,="" and="" glu="" 120="" mg/g)="" than="" ch-alcalase(gly149="" mg/g,="" pro="" 95="" mg/g,="" and="" glu78="" mg/g).="" an="" increase="" in="" the="" content="" of="" these="" amino="" acids="" is="" strongly="" related="" to="" enhanced="" antioxidant="" capabilities="" [16,20].="" gly="" and="" pro="" contain="" hydrophobic="" amino="" acid="" groups,="" and="" glu="" contains="" negatively="" charged="" amino="" acid="" groups.="">coesyn cistancheAdroddwyd bod yr asidau amino hyn yn gwella gweithgaredd gwrthocsidiol oherwydd eu hydoddedd cynyddol mewn lipidau neu trwy adweithiau radical rhydd [1,24].
2.3. Gweithgareddau Gwrthocsidiol a Gwrth-heneiddio Hydrolysadau Collagen
Mesurwyd gweithgareddau gwrthocsidiol y CHs gan ddefnyddio assay gweithgaredd sborionu radical 2,2'-a-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-asid sulfonic (ABTS)) a assay pŵer lleihau. Gweithgaredd chwilota radical ABTS y rheolaeth (hongiad colagen), CH-Alcalase, a CH-Alcalase<3 kda="" at="" different="" concentrations="" is="" shown="" (figure="" 5a).abts="" radical="" scavenging="" activity="" of="" peptides="" assay="" is="" important="" to="" exclusively="" measure="" the="" ability="" of="" an="" antioxidant="" peptide="" to="" induce="" a="" hydrogen="" atom="" transfer="" [25].="" abts="" radical-scavenging="" effects="" of="" all="" treatments="" increased="" in="" a="" concentration-dependent="" manner=""><0.05). ch-alcalase="" and=""><3 kda="" showed="" much="" higher="" abts="" radical-scavenging="" activity="" values,="" with="" 41.4%-88.2%="" compared="" to="" the=""><8.5%. both="" ch-alcalase="" and=""><3 kda="" had="" high="" abtsradical-scavenging="" abilities="" of="" ~60%="" when="" concentrations="" were="" greater="" than="" 2.5="" mg/ml.=""><3 kda="" showed="" a="" significantly="" higher="" abts="" radical-scavenging="" activity="" value="" than="" ch-alcalase.="">dyfyniad salsa cistancheYn gyffredinol, gall gweithgaredd gwrthocsidiol peptidau gael ei ddylanwadu gan eu dilyniannau asid amino, nifer yr asidau amino rhad ac am ddim sy'n bresennol, graddau hydrolysis, a phwysau moleciwlaidd peptidau [26,27]. Yn benodol, roedd gan hydrolysadau pwysau moleciwlaidd isel briodweddau gwrthocsidiol cryfach o gymharu â hydrolysadau pwysau moleciwlaidd uchel [2,26].
Ffigur 5. Gweithgareddau gwrthocsidiol hydrolysadau colagen (CH) mewn 2,2'-a-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-asid sylffonig)(ABTS)scavening radical(A)a-rhydwythol pŵer (B) profion. Mae data a ddynodir gan lythrennau gwahanol (ac) yn dangos gwahaniaethau ystadegol arwyddocaol yn dibynnu ar wahanol driniaethau (t<0.05).>manteision a sgîl-effeithiau cistanche tubulosaMae data a ddynodir gan lythrennau gwahanol (AD) yn dangos gwahaniaethau ystadegol arwyddocaol yn dibynnu ar grynodiad (p < 0.05).
Gall Cistanche gwrth-heneiddio
Pwerau lleihau'r rheolaeth, CH-Alcalase, a CH-Alcalase<3 kda="" are="" shown="" (figure="" 5b).="" the="" reducing="" power="" of="" peptides="" may="" also="" serve="" as="" a="" significant="" indicator="" of="" their="" antioxidant="" potential="" [28,29].="" the="" reducing="" power="" of="" chs="" ranged="" from="" 0.074="" to="" 0.424="" in="" a="" dose-dependent="" manner=""><0.05). the="" control="" group="" had="" the="" lowest="" reducing="" power,="" which="" did="" not="" change="" significantly="" with="" increasing="" concentrations="" of="" the="" control.="" in="" contrast="" to="" abts="" radical-scavenging="" activity,="" the="" reducing="" power="" of="" ch-alcalase="" was="" higher="" than="" that="" of=""><3 kda.="">dyfyniad cistanche tubulosaAwgrymodd arsylwadau tebyg y gallai hydrolyzate colagen crai fod yn fwy effeithiol wrth leihau pŵer na pheptidau colagen uwch-hidlo [30].
Defnyddiwyd ataliad tyrosinase, collagenase, ac elastase i wirio eu heffeithiau gwrth-heneiddio in vitro [20]. Canlyniadau ataliad tyrosinase, collagenase, ac elastase gweithgaredd y rheolaeth, CH-Alcalase, a CH-Alcalase<3 kda="" are="" summarized="" (table="" 3).="" tyrosinase,="" collagenase,="" and="" elastase="" inhibitors="" have="" been="" used="" as="" important="" ingredients="" of="" cosmetics="" for="" skin="" whitening,="" anti-aging,="" and="" anti-wrinkling,="" respectively.="" collagenase="" and="" elastase,="" especially,="" are="" known="" to="" be="" major="" enzymes="" responsible="" for="" dehydration="" and="" wrinkle="" formation="" on="" the="" skin="" surface[31].="" the="" results="" indicated="" that="" the="" tyrosinase="" inhibition="" effect="" of="" vitamin="" c(95.50%,1="" mg/ml,="" positive="" control)="" was="" higher="" than="" that="" of="" the="" other="" treatments(table="" 4).="" tyrosinase="" inhibition="" effects="" of="" control,="" ch-alcalase,="" and=""><3 kda="" groups="" were="" 28.21%,="" 15.44%,="" and="" 30.20%,="" respectively.="" thus,="" the="" chs="" did="" not="" show="" a="" better="" skin="" whitening="" effect="" compared="" to="" the="" control.="" collagenase="" inhibition="" by="" the="" control,="" ch-alcalase,="" and=""><3 kda="" groups="" were="" 6.45%,54.37%,="" and="" 61.90%,="" respectively.="" in="" addition,="" ch-alcalase="" and=""><3 kda="" inhibition="" of="" collagenase="" corresponded="" to="" that="" of="" vitamin="" cat="" 1="" mg/ml.="" thus,="" chs="" obtained="" from="" this="" study="" may="" be="" effective="" collagenase="" inhibitors="" that="" may="" possibly="" play="" an="" important="" role="" in="" anti-aging="" activities.="" however,="" all="" collagen="" samples="" did="" not="" display="" elastase="" inhibition="" effects,="" which="" may="" result="" from="" a="" lack="" of="" skin="" elasticity.="" overall,="" vitamin="" c(1="" mg/ml)="" inhibited="" various="" activities="" of="" the="" enzymes="" in="" the="" following="" order:="" tyrosinase(95.50%)="">collagenase(48.09)> elastase(2/.00%o).CH-Alcalase(5 mg/mL)inhibited various activities of the enzymes in the following order: collagenase (54.37%)> tyrosinase (15.44%)>elastase (dim gweithgaredd). CH-Alcalase<3 kda="" (5="" mg/ml)="" inhibited="" these="" activities="" in="" the="" following="" order:="" collagenase="" (61.90%)="">tyrosinase (30.20%)>elastase (dim gweithgaredd). Nododd tueddiadau tebyg a adroddwyd mewn astudiaeth arall fod hydrolysadau colagen yn dangos potensial i weithredu fel asiantau gwrth-heneiddio ac atalyddion colagenas [20].
3. Defnyddiau a Dulliau
3.1. Pretreatment Croen Moch
Prynwyd croen mochyn gan gyflenwr lleol (Seoul, Korea), a chafodd holl fraster gweladwy a meinweoedd cyswllt croen y mochyn eu tynnu gan ddefnyddio llafn rasel. Cafwyd y croen mochyn a ddefnyddiwyd yn yr astudiaeth hon o un mochyn er mwyn lleihau amrywiad biolegol. Golchwyd croen mochyn wedi'i docio mewn dŵr ar 90 gradd am 1 munud bedair gwaith i gael gwared â braster a deunyddiau gweddilliol. Yna torrwyd y croen yn ddarnau sgwâr 1 cm a'i falu mewn dŵr distyll am 3 munud gan ddefnyddio cymysgydd llafn pedair adain (CNHR-26, Bosch, Hong Kong, Tsieina). Cafodd croen y mochyn maluriedig ei homogeneiddio ar gyflymder uchel (25,000rpm) am 5 munud gan ddefnyddio Ultra Turrax(T25, IKA Labotechnik, Staufen, yr Almaen). Cafodd tua 100g o'r cymysgedd croen mochyn (50 y cant o'r cynnwys solet terfynol) ei becynnu dan wactod a'i rewi ar -20 gradd a'i storio i'w ddefnyddio o fewn 1 mis.
3.2. Proteasau ac Adweithyddion Masnachol
Prynwyd Alcalase, Flavorzyme, Neutrase, a Protamex gan Novozymes (Bagsvaerd, Denmarc). Prynwyd Bromelain a Papain oddi wrth Daesong Sangsa (Seoul, Korea). Prynwyd yr holl gemegau ar gyfer profion gwrthocsidiol a gwrth-heneiddio gan Gwmni Cemegol Sigma-Aldrich (St.Louis, MS, UDA). Roedd yr holl adweithyddion a thoddyddion eraill a ddefnyddiwyd yn yr astudiaeth hon o radd ddadansoddol.
3.3. Hydrolysis Ensym
Datblygwyd hydrolysis ensymatig ar gyfer yr ensymau masnachol gradd bwyd priodol a ddefnyddiwyd (yn seiliedig ar argymhellion y gwneuthurwr; Tabl 4). Gwanhawyd y cymysgedd croen mochyn parod â dŵr distyll i gynnwys solet terfynol o 5 y cant. Dewiswyd y crynodiad hwn i sicrhau ymddygiad llif oherwydd ei gludedd isel. Gelwir y cymysgedd croen mochyn 5 y cant yn ataliad colagen (neu reolaeth). Cafodd yr ataliad colagen ei hydroleiddio mewn adweithyddion gan ddefnyddio chwe ensymau masnachol gradd bwyd ar gymhareb ensym: swbstrad o 1:100. Tynnwyd aliquots sampl (5 mL) ar 1, 3,6, 12, a 24 h o hydrolysis a'u gwresogi ar unwaith ar 100 gradd am 10 munud i anactifadu'r ensym, ac yna oeri i 0 gradd gan ddefnyddio dŵr iâ. Yn ystod yr amser samplu, rheolwyd pH gan ddefnyddio 1 M NaOH fel y bo'n briodol. Ar ôl oeri, cafodd samplau eu centrifugio ar 4000 × g am 15 munud, a chasglwyd y supernatant (hydrolysate colagen; CH). Crynhowyd CH ymhellach gan uwch-hidlo, gan ddefnyddio system AmiconStirred Cells (Catalog Rhif. UFSC 20001, EMD Millipore Corporation, Burlington, MA, UDA) gyda thoriad pwysau moleciwlaidd 3 kDa (MWCO)(UltracelMembrane, EMD Millipore Corporation, Burlington, MA, UDA) ar 60 psi nwy nitrogen, ar 20 gradd.adolygiadau cistanche tubulosaRoedd y CH a baratowyd yn cael ei rewi-sychu a'i gadw mewn cynwysyddion aerglos ar 20 gradd tan ddadansoddiad.
3.4. Pennu pH, Adfer Proteinau, Cynnwys Grŵp Amino Heb Hydoddedd, a Chynnyrch Cynhyrchu Pennwyd pH y samplau (rheolaeth a CHs) gan ddefnyddio mesurydd pH (Model S220, Mettler Toledo GmbH, Columbus, OH, UDA). Penderfynwyd ar adferiad neu hydoddedd protein trwy amcangyfrif cynnwys protein gan ddefnyddio assay protein asid bicinchoninic (BCA), yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr (Sigma-Aldrich, St. Louis, MS, UDA) gyda serwm albwmin fel y safon. Penderfynwyd ar gynnwys grŵp amino rhad ac am ddim trwy assay 2,4,6-trinitrobenzene acid sulfonic (TNBSA) yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, UDA) gan ddefnyddio L-leucine fel y safon. Mesurwyd pwysau gwlyb a sych i gyfrifo'r maes cynhyrchu.
3.5. Dosbarthiad Pwysau Moleciwlaidd
3.5.1.Sodiwm Dodecyl sylffad-Polyacrylamid Gel Electrofforesis (SDS-TUDALEN)
Mesurwyd patrymau samplau SDS-PAGE (rheolaeth a CHs) yn unol â dull a adroddwyd yn flaenorol [10]. Gwanhawyd samplau â 8 M wrea (crynodiad protein terfynol, 4 mg / mL). Roedd pob sampl yn gymysg ag un rhan o glustogfa sampl KTG 020 (10 y cant o glyserol, 2 y cant o SDS, 0.003 y cant o bromophenol glas, 5 y cant o -mercaptoethanol, a 63 mM Tris-HCl, pH6.8) gan KOMA Biotech Inc ., （Seoul, Korea）, a'i ferwi am 2 mun. Llwythwyd y cymysgedd sampl (20 μL) i geliau acrylamid EzWayTM PAG 6 y cant (KOMA Biotech Inc., Seoul, Korea). Yn dilyn electrofforesis, cafodd y gel ei osod, ei staenio a'i ddad-staenio. Penderfynwyd ar y pwysau moleciwlaidd gan ddefnyddio safonau pwysau moleciwlaidd ystod eang rhwng 10 a 210 kDa.
3.5.2. Cromatograffaeth Treiddiad Gel (GPC)
Penderfynwyd ar ddosbarthiad pwysau moleciwlaidd samplau yn ôl dull a adroddwyd yn flaenorol [3]. Perfformiwyd cromatograffaeth treiddiad gel (GPC) gan ddefnyddio system cromatograffaeth hylif perfformiad uchel YL91{00 (HPLC) (YL9100, Youngling Instrument Co., Ltd, Gyeonggi-do, Korea) gyda thair colofn Ultrahydrogel TM 120 ( 7.8 × 3000 mm) o Waters (Aberdaugleddau, MA, UDA). Y cam symudol oedd dŵr distylliedig / deionized ar gyfradd llif o 1.0 mL / min, a chafodd dosbarthiadau pwysau moleciwlaidd y peptidau colagen eu monitro gan ddefnyddio synhwyrydd mynegai plygiannol YL 9100 ar 40 gradd. Roedd pecyn safonau pwysau moleciwlaidd (106-67,500 Da, Polymer Standards Service, Mainz, yr Almaen) yn gwasanaethu fel y safon.
3.6.Amin0 Cyfansoddiad Asid
Dadansoddwyd cyfansoddiad asid amino y samplau trwy ddeillio â {{{{0}}fluorenyl ethoxy carbonyl (FMOC)-clorid a dealdehyd o-ffthalic (OPA) ar system HPLC Ultimate 3{000 ( Dionex, Idstein, yr Almaen) wedi'i gyfarparu â dau synhwyrydd (synhwyrydd fflworoleuedd a synhwyrydd UV） a VDSpher 100 C18-E （4.6 mm × 150 mm, maint gronynnau 3.5 μm, VDS Optilab, Berlin, yr Almaen). Cyfaint y pigiad oedd 1.0 L, ac roedd y cyfnod symudol yn cynnwys dau eluent: sodiwm ffosffad dibasic 40 mM (pH 7) a datrysiad methanol 45 y cant (o / v) acetonitrile / 45 y cant (v / v). Trwy gysylltu synhwyrydd UV a synhwyrydd fflworoleuedd, canfuwyd pelydrau uwchfioled ar 338 nm, canfuwyd deilliad OPA ar 450 nm o donfedd allyrru a 340 nm o donfedd excitation, canfuwyd deilliad FMOC ar 305 nm o donfedd allyriadau o a 266 nm o donfedd cyffro. Defnyddiwyd cymysgedd asid amino (1.0 nmol mL-I ar gyfer pob asid amino) ar gyfer graddnodi.
lle asid Atotalamino oedd y cynnwys ar ôl hydrolysis gan ddefnyddio 6 M HCl (ar 130 gradd am 24 h), ac asid amino Afree oedd y cynnwys ar ôl hydoddi mewn dŵr distyll.
3.7. Gwerthusiad o Weithgaredd Gwrthocsidiol
3.7.1.2,2'-Azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-asid sylffonig) (ABTS)Gweithgaredd Sborion Radical
Mesurwyd gweithgaredd chwilota radical ABTS CH yn unol â dull a adroddwyd yn flaenorol [20]. Cynhyrchwyd y cation radical ABTS trwy gymysgu hydoddiant stoc ABTS (7.0 mM) â persulfate potasiwm (2.45 mM) a deor y cymysgedd canlyniadol yn y tywyllwch ar dymheredd ystafell dros nos. Gwanhawyd hydoddiant radical ABTS mewn 5.0 mM halwynog byffer ffosffad (pH7.4) i lefel amsugnedd o 0.70±0.02 ar 734 nm. Cymysgwyd un ml o'r hydoddiant radical ABTS gwanedig ag 1 ml o bob sampl. Ddeng munud yn ddiweddarach, mesurwyd amsugniadau sampl (Sampl, gyda sampl) a rheolaeth (rheolaeth heb sampl) ar 734 nm. Cyfrifwyd gweithgaredd chwilota radical ABTS ( y cant ) fel a ganlyn:
3.7.2.Lleihau Grym
Mesurwyd pŵer lleihau CH yn ôl dull a adroddwyd yn flaenorol [20]. Cymysgwyd un ml o bob sampl ag 1 ml o 0.2 M byffer ffosffad (pH6.6) ac 1 ml o 1 y cant potasiwm ferricyanid. Deorwyd y gymysgedd ar 50 gradd am 20 munud, ac yna ychwanegwyd 1 ml o asid trichloroacetig 10 y cant. Cymysgwyd cyfanswm o 2 ml o'r cymysgedd deori hwn â 2 ml o ddŵr distyll a 0.4 ml o 0.1 y cant o ferric clorid. Ar ôl 10 munud, mesurwyd amsugnedd yr hydoddiant canlyniadol ar 700 nm ar sbectroffotomedr (OPTIZEN, Mecasys Co., Daejeon, Korea) Ystyriwyd bod amsugnedd cynyddol (ar 700 nm) o'r cymysgedd adwaith yn dangos pŵer lleihau cynyddol.
3.8. Gwerthusiad o'r Effaith Gwrth-Heneiddio
3.8.1. Atal Gweithgaredd Tyrosinase
Cafodd ataliad tyrosinase ei bennu gan ddull a ddisgrifiwyd eisoes [20]. Datrysiad rhag-gymysgedd sy'n cynnwys 70 μL o glustogfa ffosffad 0.1 M (pH6.8）, tyrosinase madarch 30uLof (167U/mL); Sigma-Aldrich, UDA), ac 20 L o'r sampl wedi'i ddeor am 5 munud ar 30 gradd . Yna ychwanegwyd tua 100μL o 3,4-dihydroxy phenyl-L-alanine (L-DOPA) i gychwyn yr adwaith ensymatig. Mesurwyd amsugno ar 492 nm am 20 munud i fonitro ffurfiad L-DOPA. Roedd asid asgorbig (1 mg/mL) yn rheolydd positif, a ddefnyddiwyd i gymharu. Cyfrifwyd y gymhareb ataliad fel a ganlyn:
lle'r oedd A yn gymysgedd â thyrosinase heb sampl; Roedd B yn gymysgedd heb sampl a thyrosinase; Roedd C yn gymysgedd gyda sampl a thyrosinase, ac roedd D yn gymysgedd gyda sampl ond heb tyrosinase.
3.8.2.Atal Gweithgarwch Collagenase
Cafodd ataliad collagenase ei bennu gan ddull a ddisgrifiwyd eisoes [20]. Yn gryno, paratowyd byffer tricin 50 mM (pH7.5) yn cynnwys 10 mM calsiwm clorid a 400 mM sodiwm clorid. Yna, 50mLof 1.0mM N-[3-(2-furyl) acryloyl]-Leu-Gly-Pro-Ala hydoddiant a 0.2 mg/ml collagenase (o Clostridium histolyticum, Math IA, 0.{ {19}} Ychwanegwyd FALGPA U/mg solid; Sigma-Aldrich, UDA) ym mhresenoldeb ac absenoldeb samplau. Stopiwyd yr adwaith trwy ychwanegu asid citrig (6 y cant). Gwahanwyd cymysgedd yr adwaith trwy ychwanegu asetad ethyl. Mesurwyd amsugnedd y supernatant ar 345 nm. Asid ascorbig (1 mg/mL) oedd y rheolaeth gadarnhaol ac fe'i defnyddiwyd i gymharu. Cyfrifwyd canran yr ataliad fel a ganlyn:
lle'r oedd A yn gymysgedd â cholagenase heb sampl; Roedd B yn gymysgedd heb sampl a cholagenase; Roedd C yn gymysgedd gyda sampl a cholagenase, ac roedd D yn gymysgedd gyda sampl ond heb golagenas.
3.8.3.Atal Gweithgarwch Elastase
Cafodd ataliad elastase ei bennu gan ddull a ddisgrifiwyd eisoes [20]. Gwasanaethodd N-succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide (Suc-Ala-Ala-Ala-pNA) fel y swbstrad, a chafodd rhyddhau p-nitroaniline ei fonitro am 2{{2{0}} min ar 25 gradd. Diddymwyd cyfran (1 ug) o elastase pancreatig mochyn math IV (PPE) mewn 1 ml o 0.2 M byffer Tris-HCl(pH 8.0).Y roedd cymysgedd adwaith yn cynnwys byffer Tris-HCl 0.2 M (pH8.0), 1 ppm PPE, 0.8 mM Suc-Ala-Ala-Ala-pNA, y sampl, a'r swbstrad a grybwyllwyd uchod. Mesurwyd amsugnedd ar 214 nm. Asid asgorbig (1 mg/mL) a ddefnyddiwyd fel y rheolaeth gadarnhaol a ddefnyddiwyd i gymharu. Cyfrifwyd y gymhareb ataliad fel a ganlyn:
lle'r oedd A yn gymysgedd ag elastase a heb sampl; Roedd B yn gymysgedd heb sampl ac elastase; Roedd C yn gymysgedd gyda sampl ac elastase, a D yn gymysgedd gyda sampl ond heb elastase.
3.9.Dadansoddiad Ystadegol
Cyflwynir data fel y gwyriad safonol cymedrig (SD). Aseswyd arwyddocâd gwahaniaethau rhwng grwpiau gan ddefnyddio cymariaethau lluosog a dadansoddiad o amrywiant (ANOVA), ac yna prawf gwahaniaeth arwyddocaol gonest Tukey (HSD). Ystyriwyd gwahaniaethau gyda gwerthoedd p o lai na 0.05 yn ystadegol arwyddocaol.
4. Casgliadau
Yn yr astudiaeth hon, cynhyrchwyd hydrolysadau colagen, cynhwysyn bwyd swyddogaethol, yn llwyddiannus trwy hydrolysis ensymatig, wedi'i ddilyn gan uwch-hidlo a phuro. Profwyd proteasau masnachol amrywiol am eu defnyddioldeb posibl wrth gynhyrchu hydrolysadau colagen iawn. CHS hydrolyzed gan Alcalase oedd y CHs hydrolyzed mwyaf effeithiol, ac roedd ultrafiltration wedi'i ddilyn gan buro yn effeithiol wrth gynhyrchu peptidau gweithredol â phwysau moleciwlaidd isel. Dangosodd y canlyniadau fod y CHs yn arddangos gweithgareddau atal gwrthocsidiol a cholagenas rhagorol. Felly, gellir defnyddio CHs a geir gan yr astudiaeth hon mewn diwydiannau bwyd, colur, neu fferyllol fel ychwanegyn naturiol, sydd â phriodweddau gwrth-ocsidiol a gwrth-heneiddio. Gallai astudiaethau pellach sy'n cynnwys gwerthusiad in vivo o weithgareddau heneiddio peptidau gweithredol mewn croen dynol fod yn ddefnyddiol.
Daw'r erthygl hon o Molecules 2019, 24, 1104; doi:10.3390/molecules24061104 www.mdpi.com/journal/molecules
