Priodweddau Llesol i Iechyd Detholiad Hadau Grawnwin A'i Ddylanwad ar Farcwyr Biocemegol Dethol yn y Gwaed, yr Afu A'r Arennau Rattus Norvegicus
Mar 10, 2022
Crynodeb:Mae cadmiwm (Cd) yn fetel trwm sy'n digwydd ym mhob rhan o'r amgylchedd, gan gynnwys y gadwyn fwyd. Yn y corff, mae'n achosi straen ocsideiddiol trwy gynhyrchu radicalau rhydd sy'n niweidiol i'r celloedd. Mae detholiad hadau grawnwin (GSE) yn cynnwys ystod eang o gydrannau sy'n weithredol yn fiolegol sy'n helpu i niwtraleiddio effeithiau andwyol radicalau rhydd. Yn yr astudiaeth hon, cafodd effeithiau GSE a baratowyd o gyltifar grawnwin grawnwin lled-ymwrthol Season, sy'n gyfoethog mewn ffenolig, ar farcwyr biocemegol llygod mawr brown sy'n agored i effeithiau cadmiwm eu monitro. Cynyddodd GSE y gweithgaredd gwrthocsidiol plasma ac, yn yarennaua'r afu, roedd cynnwys Cd wedi'i ostwng yn sylweddol gan gyd-weinyddiaeth GSE. Yn unol â hynny, cafodd y cynnydd mewn cynnwys creatinin a gweithgaredd aminotransferase alanin a'r gostyngiad mewn gweithgareddau catalase a superoxide dismutase a achosir gan gadmiwm eu harafu gan gyd-weinyddu GSE. Mae canlyniadau'r gwaith hwn yn datgelu bod echdyniad hadau grawnwin yn cynnig effaith amddiffynnol yn erbyn cymeriant metelau trwm i'r organeb.
1. Rhagymadrodd
Mae cadmiwm (Cd) yn fetel trwm sy'n digwydd ym mhob rhan o'r amgylchedd; mae'n rhan o gramen y Ddaear, wedi'i chynnwys mewn dŵr, yn cronni mewn planhigion, ac yn bresennol mewn organebau. Yn ogystal â'r gadwyn fwyd (o ran planhigion, mae'r rhan fwyaf o rawnfwydydd, cnydau gwraidd a llysiau yn ffynonellau, tra ymhlith organau anifeiliaid, yr afu a'r afu yn bennaf.arennauyn ffynhonnell), ffynhonnell bwysig o gadmiwm i bobl yw mwg sigaréts, exhalations o wahanol fathau o hylosgi, diwydiannau metelegol, a rhai gosodiadau trydanol [1,2]. Yn y corff, mae cadmiwm yn rhwymo'n bennaf i metallothionein, albwmin, a phroteinau plasma eraill yn y gwaed. Mae cadmiwm yn fetel gwenwynig peryglus sy'n achosi straen ocsideiddiol trwy gynhyrchu radicalau rhydd sy'n niweidiol i'r celloedd. Gall radicalau rhydd niweidio proteinau, lipidau, ensymau, a DNA, ac felly mae'n rhaid eu niwtraleiddio gan gwrthocsidyddion cyn mynd i mewn i'r celloedd [3].
Os na chaiff ei niwtraleiddio, mae Cd yn achosi dadelfennu celloedd coch y gwaed [4], yn cronni yn yr organeb—, yn enwedig yn yr afu aarennau-ac, oherwydd ei debygrwydd i sinc, sy'n elfen hanfodol, mae'n mynd i mewn i adweithiau ensymatig yn hawdd ac yn cymryd rhan mewn prosesau biocemegol [5]. Dim ond yn araf iawn y caiff ei ysgarthu a chydag anhawster o'r organeb [6]. Mae'n hysbys y gall gwrthocsidyddion gael effaith amddiffynnol yn erbyn straen ocsideiddiol a difrod metel trwm, ac roedd y gwaith arbrofol hwn yn seiliedig ar y ffaith hon. Mae detholiad hadau grawnwin (GSE) yn cynnwys ystod eang o gydrannau sy'n weithredol yn fiolegol yn ei fatrics [7] sy'n helpu i niwtraleiddio effeithiau andwyol radicalau rhydd. Mae GSE yn amddiffyn celloedd rhag difrod trwy reoleiddio difrod ocsideiddiol cellog, lleihau difrod organau, gwella'r cydbwysedd rhwng ocsidyddion a gwrthocsidyddion, a lleihau rhyddhau cyfryngwyr llidiol. Mae ganddo hefyd effeithiau gwrthlidiol, antiapoptotic, a pro-proliferative [8]. Mae cynnwys uchel fflafan cyddwys-3-ol neu procyanidins, sy’n cael eu harchwilio fel dull amgen o drin clefydau difrifol, yn arbennig o arwyddocaol [9,10]. Fodd bynnag, gall cynnwys a chyfansoddiad ffenolig hadau grawnwin, yn ogystal â gweithgaredd gwrthocsidiol yr echdyniad hadau, gael eu dylanwadu gan gyltifar grawnwin, gwreiddgyff, amodau hinsoddol, neu dechnegau tyfu [11-13] ac, felly, priodweddau gwrthocsidiol, fel yn ogystal ag effeithiau amddiffynnol dyfyniad concrit, ni ellir eu rhagweld yn hawdd. Nod y gwaith hwn oedd astudio effaith amddiffynnol GSE a baratowyd o gyltifar grawnwin lled-wrthiannol Cerason ar farcwyr biocemegol yn y gwaed, plasma, afu, aarennauo lygod mawr brown a oedd wedi bod yn agored i effeithiau cadmiwm.
Geiriau allweddol:dyfyniad hadau grawnwin; gwrthocsidyddion; cadmiwm; rattus norvegicus; marcwyr biocemegol; effaith amddiffynnol; aren, Arennol
BYDD CISTANCHE YN GWELLA SWYDDOGAETH YR AREN/ARRENAU
2. Canlyniadau a Thrafodaeth
2.1. Gweithgaredd Gwrthocsidiol a Chyfansoddiad Ffytocemegol o Detholiad Hadau Grawnwin
Profwyd y detholiad hadau grawnwin a baratowyd o'r amrywiaeth lled-wrthiannol Cerason ar gyfer gweithgaredd gwrthocsidiol, cyfanswm cynnwys polyphenolig, a gwrthocsidyddion unigol dethol. Penderfynwyd ar weithgaredd gwrthocsidyddion yn sbectroffotometrig gan ddefnyddio pedwar dull yn seiliedig ar wahanol egwyddorion (DPPH• , ABTS• plws , FRAP, FR) a phennwyd cyfanswm y cyfansoddion polyphenolig gyda'r dull Folin-Ciocalteu. Yn dibynnu ar y dull a ddefnyddiwyd, roedd y gweithgaredd gwrthocsidiol yn amrywio o 7 i 31 mg/g cyfwerth ag asid galig (GAE) a chyfanswm y cynnwys polyphenolig oedd 9.3 mg/g GAE (Tabl 1). Tynnodd canlyniadau'r rhan hon o'r arbrawf sylw at y potensial gwrthocsidiol uchel mewn hadau grawnwin.
2.2. Yn Vivo Penderfynu Effaith Echdyniad Hadau grawnwin yn y Llygod Mawr
2.2.1. Penderfynu Cynnwys Cadmium mewn Gwaed, Afu, ac ArennauCadmiwm yw'r metel gwenwynig mwyaf cyffredin mewn porthiant. Ar ôl rhoi trwy'r geg, caiff ei amsugno o'r coluddyn, ei gludo i'r afu, a'i gyfuno â grwpiau thiol o metallothionein (MT). Ar wahân i hyn, gall Cd hefyd gael ei rwymo i albwmin, neu broteinau eraill yn y gwaed [14]. Yn dilyn hynny, mae Cd yn cronni yn y corff, yn cael ei ysgarthu'n araf yn unig o'r corff trwy'r wrin a'r feces ac mae ganddo hanner oes biolegol o tua 20 mlynedd. Mae'r swm mwyaf (tua thraean) o gadmiwm i'w gael yn yarencortecs. Yn y gwaed, mae'r rhan fwyaf o gadmiwm (tua 90 y cant) yn bresennol yn y celloedd gwaed coch. Mae'n wenwynig i ystod eang o organau a'r prif dargedau yw'rarennau, esgyrn, ac ysgyfaint [15–17]. Adroddwyd bod GSE yn gostwng crynodiadau cadmiwm yn y celloedd gwaed coch ac yn yarennau,tra adroddwyd bod ei gynnwys yn yr afu yn cynyddu [14]. Mae'r canlyniadau ar gyfer y cynnwys cadmiwm gwaed yn yr astudiaeth hon i'w gweld yn Ffigur 1A. Ar ddechrau'r arbrawf, darganfuwyd 3.2 µg/kg o gadmiwm yng ngwaed yr anifeiliaid. Yn ystod yr arbrawf, ar ôl 14 diwrnod, roedd y gwerth cadmiwm cymedrig yn y grŵp gydag ychwanegu GSE a chadmiwm yn sylweddol uwch nag mewn grwpiau eraill (10.8 µg/kg, p=0.023). Ar ôl 28 diwrnod, roedd amrywioldeb y data yn rhy uchel i arsylwi arwyddocâd ystadegol.
Ar ddechrau'r arbrawf, ni chanfuwyd cadmiwm yn iau (Ffigur 1B) yr anifeiliaid arbrofol. Yn unol â hynny, ni chanfuwyd unrhyw gadmiwm yn iau'r anifeiliaid o'r grwpiau rheoli a GSE yn ystod yr arbrawf. Ar y llaw arall, ar ôl 14 diwrnod o'r arbrawf, y gwerth cadmiwm cymedrig yn y grŵp gydag ychwanegu cadmiwm oedd 5.8 mg/kg ac yn y grŵp gydag ychwanegu cadmiwm a GSE, y gwerth cymedrig oedd 5.2 mg/kg. Roedd y ddau werth hyn yn sylweddol wahanol i'r grŵp rheoli (p=0.002 a p=0.018 ar gyfer y grŵp cadmiwm yn unig a'r grŵp â chadmiwm a GSE, yn y drefn honno). Ar ôl 28 diwrnod, roedd y gwerth cymedrig yn y grŵp gydag ychwanegu cadmiwm wedi cynyddu i 6.7 mg/kg, a oedd yn wahanol iawn i'r lefel cadmiwm yn y grŵp gydag ychwanegu cadmiwm a GSE, a oedd wedi gostwng ychydig i 4.8 mg/kg (p=0.008).
Ar ddechrau'r arbrawf, ni chanfuwyd cadmiwm yn yarennau(Ffigur 1C) yr anifeiliaid arbrofol. Yn unol â hynny, ni chanfuwyd unrhyw gadmiwm yn yarennauo'r anifeiliaid o'r grwpiau rheoli a GSE yn ystod yr arbrawf. Ar y llaw arall, ar ôl 14 diwrnod, y gwerth cadmiwm cymedrig yn y grŵp gydag ychwanegu cadmiwm oedd 9.5 mg/kg ac yn y grŵp gydag ychwanegu cadmiwm a GSE, y gwerth cymedrig oedd 6.5 mg/kg. Roedd y ddau werth hyn yn sylweddol wahanol i'r grŵp rheoli (p < 0.001="" ar="" gyfer="" y="" ddau="" grŵp).="" ar="" ôl="" 28="" diwrnod,="" roedd="" y="" gwerth="" cymedrig="" yn="" y="" grŵp="" gydag="" ychwanegu="" cadmiwm="" wedi="" cynyddu="" i="" 16.6="" mg="" kg,="" a="" oedd="" yn="" wahanol="" iawn="" i'r="" lefel="" cadmiwm="" yn="" y="" grŵp="" gydag="" ychwanegu="" cadmiwm="" a="" gse,="" a="" oedd="" wedi="" cynyddu="" ychydig="" yn="" unig="" i="" 10.4="" mg="" kg="" (p="0.009)." felly,="" yn="">arennauac yn yr afu, gostyngwyd cynnwys Cd yn sylweddol gan weinyddiaeth GSE. Mae GSE yn cynnwys cyfansoddion ffenolig sy'n gallu celu Cd, gan leihau croniad Cd. Mae'n debyg bod ffurfio'r chelates hyn wedi arwain at lai o allu gan y proteinau i rwymo Cd, a allai felly gael ei ddileu yn fwy effeithiol o'r corff [18].
2.2.2. Pennu Cynnwys Creatinin ac Wrea
O ran y croniad cadmiwm yn yarennau, yarenyw un o'r organau targed pwysicaf ar gyfer gwenwyndra a achosir gan Cd. Felly, mae'rarenmarcwyr creatinin a wrea eu pennu yn y plasma. Mae pennu creatinin yn ddangosydd da o hidlo glomerwlaidd ac fe'i defnyddir yn bennaf i fonitro cwrsclefyd yr arennau. Mae'r berthynas rhwng crynodiad creatinin a hidlo glomerwlaidd yn hyperbolig; wrth i hidlo glomerwlaidd leihau, mae secretion creatinin hefyd yn lleihau [19]. Mae cymeriant cynyddol y cadmiwm metel trwm yn arwain atniwed i'r arennau, ac felly lleihau effeithlonrwydd secretion creatinin. O ganlyniad, mae lefel creatinin gwaed uchel yn dynodi aarennolanhwylder [20].
Yn ein hastudiaeth, cynyddwyd lefelau creatinin gan Cd, yn unol â chanlyniadau a gyhoeddwyd yn flaenorol [21]. Y gwerth cynnwys creatinin cymedrig (Ffigur 2A) yn yr anifeiliaid arbrofol ar ddechrau'r arbrawf oedd 3.0 mg/L. Yn y grŵp sy'n derbyn cadmiwm, bu cynnydd sylweddol yn y gwerthoedd a fonitrwyd i 5.1 mg/L (ar ôl 14 diwrnod, p=0.015) ac i 6.2 mg/L (ar ôl 28 diwrnod, p < 0.001).="" yn="" y="" grŵp="" y="" cafodd="" gse="" ei="" gyd-weinyddu="" â="" chadmiwm="" ar="" ei="" gyfer,="" roedd="" y="" cynnydd="" yn="" y="" marciwr="" hwn="" yn="" is="" (4.2="" mg/l="" ar="" ôl="" 14="" diwrnod="" a="" 5.5="" mg/l="" ar="" ôl="" 28="" diwrnod)="" ac="" yn="" ystadegol="" arwyddocaol="" dim="" ond="" ar="" ôl="" 28="" diwrnod,="" o'i="" gymharu="" â="" rheolaeth="" (="" p="">< 0.001).="" felly,="" arafwyd="" y="" cynnydd="" mewn="" crynodiad="" creatinin="" gan="" gyd-weinyddu="" gse,="" gan="" awgrymu="" gostyngiad="" yn="" yr="" effaith="" wenwynig="" a="" achosir="" gan="" gadmiwm.="" yn="" y="" grŵp="" sy'n="" derbyn="" gse="" yn="" unig,="" roedd="" gwerthoedd="">
Yn feintiol wrea yw cynnyrch diraddiol pwysicaf asidau amino a phroteinau. Mae'n cael ei ffurfio yn yr afu o amonia a ryddhawyd gan adweithiau dadamination yn ystod metaboledd asid amino. Mae'n cael ei ysgarthu o'r organeb yn bennaf gan yarennautrwy hidlo glomerwlaidd ac atsugniad tiwbaidd [22]. Yn achosafiechydon arennol, mae cyfradd cynhyrchu urea yn fwy na chyfradd ei glirio, sy'n arwain at gynnydd yn lefel urea gwaed. Ar ben hynny, mae cadmiwm yn atal ymgorffori asidau amino mewn proteinau, gan achosi uremia [21]. Ar y llaw arall, pan fydd swyddogaeth yr afu yn methu, mae synthesis wrea yn lleihau ac felly hefyd ei grynodiad mewn plasma [20]. Felly, mae crynodiad wrea gwaed yn dibynnu ar gynnwys protein dietegol,arennolysgarthiad, a swyddogaeth metabolig yr afu.
Yn ein hastudiaeth, cynyddwyd lefelau wrea gan Cd, yn unol â chanlyniadau a gyhoeddwyd yn flaenorol [21]. Gwerth cymedrig cynnwys wrea (Ffigur 2B) yn yr anifeiliaid arbrofol ar ddechrau'r arbrawf oedd 207 mg/L. Yn y grŵp sy'n derbyn cadmiwm, bu cynnydd sylweddol yn y gwerthoedd a fonitrwyd i 329 mg/L (ar ôl 14 diwrnod) a 425 mg/L (ar ôl 28 diwrnod). Yn y grŵp y cafodd GSE ei gyd-weinyddu â chadmiwm ar ei gyfer, dim ond ychydig yn is oedd y cynnydd yn y marciwr hwn - 325 mg/L ar ôl 14 diwrnod a 381 mg/L ar ôl 28 diwrnod. Roedd y ddau grŵp a oedd yn derbyn cadmiwm a chadmiwm yn unig ynghyd â GSE yn wahanol iawn i'r grŵp rheoli ar ôl 14 (p=0.001 a p=0.002, yn y drefn honno) a 28 diwrnod o'r arbrawf (p < 0.001="" ar="" gyfer="" y="" ddau).="" yn="" y="" grŵp="" sy'n="" derbyn="" gse="" yn="" unig,="" canfuwyd="" gwerthoedd="">
2.2.3. Pennu Gweithgaredd Gwrthocsidydd Plasma
Mae cadmiwm yn achosi ystod o effeithiau sy'n gysylltiedig yn bennaf â straen ocsideiddiol. Gan nad yw Cd yn rhydocs-actif, nid yw'n cynhyrchu rhywogaethau ocsigen adweithiol yn uniongyrchol. Serch hynny, mae eu cynhyrchiad ar ôl datguddiad Cd wedi'i adrodd mewn llawer o astudiaethau ac wedi'i adolygu gan Cuypers et al. [23]. Mae'r mecanweithiau sy'n arwain at aflonyddwch rhydocs yn ystod datguddiad Cd yn cynnwys disbyddu llai o glutathione a achosir gan affinedd Cd â grwpiau thiol, disodli Fe gan Cd mewn proteinau sy'n arwain at grynodiadau uwch o Fe rhydd rhydocs-weithredol, camweithrediad mitocondriaidd, ac anwythiad o ocsidasau NADPH, sy'n cataleiddio ffurfio radicalau superoxide [23]. Yn ystod straen ocsideiddiol, gall cyfansoddion gwrthocsidiol fel ffenolig derfynu cynhyrchu rhywogaethau adweithiol newydd trwy eu trosi i ffurfiau radical sefydlog. Felly, gall darnau planhigion sy'n gyfoethog mewn ffenolig ddarparu effeithiau amddiffynnol yn erbyn cyfansoddion sy'n cynnwys Cd neu Cd [24].
Yn yr astudiaeth hon, y gwerth gweithgaredd gwrthocsidiol plasma cymedrig (Ffigur 3) yn yr anifeiliaid arbrofol ar ddechrau'r arbrawf oedd 0.71 mg/L. Gwelwyd cynnydd bach ym mhob grŵp arbrofol o gymharu â'r grŵp rheoli. Fodd bynnag, yr unig wahaniaeth arwyddocaol oedd bod rhwng y grŵp a driniwyd gan GSE a'r grŵp rheoli ar ôl 28 diwrnod (p=0.012), yn cadarnhau effaith gadarnhaol GSE ar weithgaredd gwrthocsidiol plasma. Mae canlyniadau a adroddwyd yn flaenorol yn amwys; weithiau, canfuwyd cynnydd mewn potensial gwrthocsidiol plasma a achosir gan GSE [25] ac weithiau nid [14].
2.2.4. Pennu Gweithgareddau ALT ac AST
Mae straen ocsideiddiol yn gysylltiedig â cholli cyfanrwydd swyddogaethol pensaernïaeth pilen a achosir gan berocsidiad lipid cynyddol. Yn ei dro, mae athreiddedd cynyddol y bilen cytoplasmig yn arwain at ollyngiad o ensymau marcio hepatig (ALT ac AST) i waed [14]. Yn wir, mae ALT ac AST yn ddiagnostig arwyddocaol hyd yn oed mewn difrod cyfyngedig i'r afu oherwydd meddwdod ac mae eu cynnydd mewn serwm a achosir gan gadmiwm wedi'i adrodd yn gynharach [14] ac fe'i cadarnhawyd gan yr astudiaeth hon. Y gwerth actifedd ALT cymedrig (Ffigur 4A) yn yr anifeiliaid arbrofol ar ddechrau'r arbrawf oedd 0.84 µkat/L. Yn y grŵp sy'n derbyn cadmiwm, cofnodwyd cynnydd sylweddol yn y gwerthoedd a fonitrwyd i gyfartaledd o 1.52 µkat/L ar ôl 14 diwrnod (p < 0.001),="" a="" 1.87="" µkat/l="" ar="" ôl="" 28="" diwrnod="" (p="" {{).="" 13}}.004).="" yn="" y="" grŵp="" y="" cafodd="" gse="" ei="" gyd-weinyddu="" â="" chadmiwm="" ar="" ei="" gyfer,="" roedd="" cynnydd="" y="" marciwr="" hwn="" yn="" sylweddol="" arafach="" nag="" yn="" y="" grŵp="" a="" oedd="" yn="" derbyn="" cadmiwm="" yn="" unig="" (1.23="" µkat/l="" ar="" ôl="" 14="" diwrnod="" a="" 1.92="" µkat/l="" ar="" ôl="" 28="" diwrnod).="" ar="" ôl="" 14="" diwrnod="" o'r="" arbrawf,="" roedd="" y="" grŵp="" hwn="" yn="" wahanol="" i'r="" grŵp="" rheoli="" (p="0.009)" a'r="" grŵp="" cadmiwm="" (p="0.026)," tra,="" ar="" ôl="" 28="" diwrnod,="" roedd="" yn="" wahanol="" iawn="" dim="" ond="" o'r="" grŵp="" rheoli="" (p="0.003)." yn="" y="" grŵp="" sy'n="" derbyn="" gse="" yn="" unig,="" cynyddodd="" y="" gwerthoedd="" hefyd="" i="" 1.17="" µkat/l="" ar="" ôl="" 14="" diwrnod.="" roedd="" y="" gwerth="" hwn="" yn="" wahanol="" iawn="" i'r="" grŵp="" rheoli="" (p="0.024)" ac="" roedd="" yn="" debyg="" i="" werth="" y="" grŵp="" sy'n="" derbyn="" gse="" a="" chadmiwm.="" ar="" ôl="" 28="" diwrnod,="" roedd="" gwerthoedd="" y="" grŵp="" gse="" yn="" unig="" yn="" debyg="" i'r="" grŵp="">
Y gwerth cynnwys AST cymedrig (Ffigur 4B) yn yr anifeiliaid arbrofol ar ddechrau'r arbrawf oedd 2.07 µkat/L. Yn y grŵp sy'n derbyn cadmiwm, dim ond ar ôl 28 diwrnod o'r arbrawf y cofnodwyd cynnydd ystadegol arwyddocaol yn y gwerthoedd a arsylwyd (3.52 µkat/L, p=0.001). Yn syndod, yn y grŵp y cafodd GSE ei gyd-weinyddu â chadmiwm, roedd cynnydd y marciwr hwn yn gyflymach ac yn sylweddol wahanol i'r grŵp rheoli ar ôl 14 diwrnod a 28 diwrnod (2.67 a 2.84 µkat/L, yn y drefn honno, p {{15 }}.043 ar gyfer y ddau), er bod y gwerth ychydig yn is na'r grŵp cadmiwm yn unig ar ôl 28 diwrnod. Roedd gan yr amrywiad GSE-yn-unig werthoedd normal.
Yn ein harbrawf, roedd gweinyddiaeth GSE yn gallu arafu'r cynnydd mewn gweithgaredd ALT. Mae'r effaith hon yn cyfateb i'r canlyniadau a adroddwyd yn flaenorol [14] ac efallai ei achosi gan chwilota perocsidau lipid trwy drosglwyddo hydrogen o gyfansoddyn ffenolig i'r perocsid lipid rhad ac am ddim sy'n cynnwys radical. Ar y llaw arall, yn y tymor hwy, roedd yr effaith hon yn isel. Roedd y cynnydd mewn gweithgaredd AST a achosir gan gadmiwm yn cael ei gyflymu braidd gan weinyddiaeth GSE. Fodd bynnag, yn y tymor hwy, bu gostyngiad bach mewn gweithgaredd AUS. Felly, gall GSE wneud iawn yn rhannol am effaith wenwynig Cd ar gellbilenni.
2.2.5. Pennu Gweithgareddau SOD a CAT yn yr Afu
Yn ogystal â chyfranogiad uniongyrchol mewn adweithiau ocsideiddiol, mae cadmiwm yn atal gweithgaredd ensymau gwrthocsidiol megis SOD a CAT, ensymau sy'n gallu dadwenwyno radicalau superoxide a hydrogen perocsid, yn y drefn honno [14]. Mae SOD yn ensym sy'n diffodd y radical superoxide yn effeithiol ac yn ei drawsnewid yn hydrogen perocsid llai gwenwynig, y gellir ei ddadelfennu ymhellach gan gatalas neu berocsidas [26]. Mae CAT yn ensym sydd i'w gael ym mron pob organeb byw sy'n agored i ocsigen. Mae'n gweithredu fel catalydd ar gyfer dadelfennu hydrogen perocsid i ddŵr ac ocsigen [27]. Mae ganddo un o'r niferoedd trosi uchaf ymhlith ensymau [28] ac, fel ensym gwrthocsidiol, mae'n un o'r mecanweithiau amddiffynnol sy'n arwain at gynnal cydbwysedd yn y corff dynol [29]. Mae'n debyg bod mecanwaith gostyngiad a achosir gan Cd mewn gweithgareddau ensymau yn rhwymo Cd yn uniongyrchol i safleoedd gweithredol yr ensymau [30].
Gwelwyd y gostyngiadau mewn gweithgareddau SOD a CAT hefyd yn yr astudiaeth hon. Ar ddechrau'r arbrawf, y gweithgaredd ensym SOD cymedrig yn yr afu (Ffigur 5A) yr anifeiliaid arbrofol oedd 18.4 U/mg o'r protein. Ar ôl 14 diwrnod o'r arbrawf, roedd gweithgarwch SOD yn sylweddol uwch yn y grŵp a oedd yn derbyn GSE (21.1 U/mg) nag yn y ddau grŵp derbyn cadmiwm (p < 0.001="" a="" p="" {{="" 9}}.009="" ar="" gyfer="" y="" grwpiau="" cadmiwm="" yn="" unig="" a="" chadmiwm="" gyda="" gse,="" yn="" y="" drefn="" honno),="" ond="" dim="" ond="" yn="" y="" grŵp="" sy'n="" derbyn="" cadmiwm="" yn="" unig="" yr="" oedd="" gweithgaredd="" sod="" yn="" sylweddol="" is="" (16.7="" u/mg)="" nag="" yn="" y="" grŵp="" rheoli="" (p="0" .005).="" ar="" ôl="" 28="" diwrnod="" o'r="" arbrawf,="" roedd="" y="" ddau="" grŵp="" derbyn="" cadmiwm="" yn="" wahanol="" iawn="" i'r="" grŵp="" rheoli="" (16.4="" u/mg,="" p="0.002" a="" 17.6="" u/mg,="" p="0.023" ar="" gyfer="" cadmiwm="" yn="" unig="" a="" chadmiwm="" gyda="" gse,="" yn="" y="" drefn="" honno)="" a'r="" grŵp="" wedi'i="" drin="" â="" gse="" yn="" unig="" (p="">< 0.001="" a="" p="0.005" ar="" gyfer="" cadmiwm="" yn="" unig="" a="" chadmiwm="" â="" gse,="" yn="" y="" drefn="">
Ar ddechrau'r arbrawf, y gweithgaredd ensym CAT cymedrig yn yr afu (Ffigur 5B) oedd 32.7 U/mg o'r protein. Ar ôl 14 diwrnod o'r arbrawf, roedd gweithgarwch CAT yn sylweddol uwch yn y grŵp a oedd yn derbyn GSE (33.5 U/mg) nag yn y ddau grŵp derbyn cadmiwm (p=0.002 a p=0.031 ar gyfer y cadmiwm yn unig a chadmiwm gyda grwpiau GSE, yn y drefn honno), ond dim ond yn y grŵp sy'n derbyn cadmiwm yn unig yr oedd gweithgaredd CAT yn sylweddol is (23.8 U/mg) nag yn y grŵp rheoli (p=0.005). Fodd bynnag, ar ôl 28 diwrnod, gostyngodd gweithgaredd CAT yn y grŵp sy'n derbyn GSE ynghyd â chadmiwm ymhellach i 27.1 U / mg, cyrhaeddodd werthoedd y grŵp cadmiwm yn unig (25.8 U / mg), ac roedd yn wahanol iawn i'r grŵp rheoli (p { {21}}.033). Roedd y grŵp a gafodd ei drin â GSE ond yn wahanol iawn i'r ddau grŵp cadmiwm (p=0.026 a p=0.012 ar gyfer cadmiwm yn unig a chadmiwm â GSE, yn y drefn honno). Yn ddiddorol, cafodd y gostyngiadau a achoswyd gan gadmiwm eu harafu gan gyd-weinyddu GSE. Ar gyfer CAT, mae'r effeithiau hyn o GSE wedi'u harsylwi o'r blaen [14]. Mae effaith chelating y cyfansoddion ffenolig sydd yn GSE yn debygol o leihau gallu cadmiwm i glymu i safle actif yr ensym.
2.2.6. Pennu Cynnwys MT
Nid yw cadmiwm yn destun unrhyw drawsnewidiadau metabolaidd uniongyrchol, ond ym mhob meinwe, mae'n rhwym yn bennaf i metallothionein (MT). Mae MT yn perthyn i grŵp o broteinau mewngellol, pwysau moleciwlaidd isel, llawn cystein gyda phwysau moleciwlaidd o 6-10 kDa. Mae prif rôl MT yn yr organeb yn cynnwys cynnal homeostasis sinc, dadwenwyno metelau trwm, a diogelu rhag straen ocsideiddiol. Mae mynegiant MT yn anwythol gan lawer o ffactorau alldarddol ac mewndarddol megis ymbelydredd UV, metelau trwm, hormonau straen, radicalau rhydd o ocsigen, cyfryngwyr llid, haint, trawma, ac oncogenesis [31,32]. Mae MT yn cael ei syntheseiddio i raddau helaeth yn yr afu aarena'i ryddhau i'r gwaed. Er bod MT yn gyfrifol am groniad cadmiwm mewn meinweoedd trwy leihau ei ysgarthiad, mae MT yn amddiffyn rhag gwenwyndra acíwt yn ogystal â chronig a achosir gan Cd [33]. Yn ein hastudiaeth, cafodd y cynnwys MT ei fonitro yn y gwaed, yr afu, aaren.
Gwerth cymedrig cynnwys MT yng ngwaed (Ffigur 6A) yr anifeiliaid arbrofol ar ddechrau'r arbrawf oedd 23.9 nmol/g. Ar ôl 14 diwrnod, roedd y newidiadau'n fach iawn ac, ar ôl 28 diwrnod, gwelwyd amrywiaeth mawr rhwng yr atgynhyrchiadau, gan achosi amhendantrwydd ystadegol (p=0.948). Y gwerth cynnwys MT cymedrig ar gyfer yarennau(Ffigur 6B) yr anifeiliaid arbrofol ar ddechrau'r arbrawf oedd 21.46 nmol/g. Ni newidiodd y gwerthoedd yn sylweddol mewn unrhyw grŵp arbrofol yn ystod yr arbrawf (p=0.938). Gwerth cymedrig cynnwys MT yn yr afu (Ffigur 6C) yr anifeiliaid arbrofol ar ddechrau'r arbrawf oedd 17.15 nmol/g. Ar ôl 14 diwrnod, cynyddodd y cynnwys MT ychydig ym mhob grŵp arbrofol ac roedd y gwahaniaethau o'r grŵp rheoli yn arwyddocaol ar gyfer y grŵp Cd-yn-unig a'r grŵp GSE-yn-unig (p=0.008 a p=0 .046, yn y drefn honno). Ar ôl 28 diwrnod, dychwelodd y cynnwys MT yn y grŵp GSE i werth y grŵp rheoli, tra bod y cynnwys MT yn y grŵp Cd wedi aros yn cynyddu ac yn wahanol i'r grŵp rheoli a'r grŵp GSE (p=0.046 a p=0.035, yn y drefn honno). Yn y grŵp sy'n derbyn GSE ynghyd â chadmiwm, nid oedd y cynnwys MT yn wahanol iawn i reolaeth - a oedd yn cyd-fynd â'r cynnwys cadmiwm is a geir yn iau y grŵp hwn - o'i gymharu â'r grŵp Cd-yn-unig (roedd y gwahaniaeth yn sylweddol ar ôl 28 diwrnod o'r arbrawf).
Ar y cyfan, dim ond yn yr afu y gwelwyd newidiadau ystadegol arwyddocaol yn y cynnwys MT a achoswyd gan Cd. Yn flaenorol, adroddwyd am gynnydd MT yng ngwaed anifeiliaid arbrofol sy'n derbyn cadmiwm [34]. Yn yr achos hwn, mae'r canlyniadau'n awgrymu y gallai dadwenwyno Cd trwy MT ddigwydd yn yr afu.
3. Defnyddiau a Dulliau
3.1. Dylunio ArbrawfRhannwyd llygod mawr brown o'r genws Wistar (wyth wythnos oed, 235 ± 3 g) yn bedwar grŵp o chwe unigolyn: A) grŵp rheoli o lygod mawr yn dilyn diet cyffredin (n=6); B) grŵp o lygod mawr yr ychwanegwyd GSE at eu diet (200 mg GSE/day) (n=6); C) grŵp sy'n cael cadmiwm (2 mg Cd/dydd - yn goncrid, CdCl2 wedi'i hydoddi mewn dŵr) (n=6); a D) grŵp y rhoddwyd diet iddo sy'n cynnwys cadmiwm (2 mg Cd/diwrnod) yr ychwanegwyd GSE ato (200 mg GSE/dydd) (n=6). Cymerwyd y dyfyniad o hadau amrywiaeth grawnwin Cerason; disgrifir ei baratoi a'i nodweddu yn Adran 3.2. (Detholiad Hadau Grapevine). Roedd y darn yn cael ei bwyso bob dydd ar ddogn o 200 mg, cyn ei roi i'r llygod mawr brown arbrofol (200 mg GSE i bob llygoden fawr; 0.85 g/L kg o fàs y corff). Gweinyddwyd y GSE â dŵr. Rhoddwyd cymysgeddau porthiant llaith a dŵr diniwed (babanod) ad libitum i'r llygod mawr. Unwaith yr wythnos, newidiwyd gwely'r anifeiliaid. Ar ôl 14 a 28 diwrnod arbrofol, cafodd tri anifail o bob grŵp eu ewthaneiddio a chasglwyd eu gwaed trwy bigiad calon. Cyn y casgliad, rhoddwyd Fraxiparin (0.01 mL/kg) i feddyginiaeth intraperitoneol ac, ar ôl hynny, rhoddwyd ether diethyl i'r anifeiliaid o dan anesthesia anadliad. Yna casglwyd sampl gwaed i mewn i diwbiau prawf micro wedi'u gorchuddio â heparin (neu diwbiau ag EDTA - ar gyfer dadansoddiadau o MT a chadmiwm; heb allgyrchu dilynol), a dilynwyd hyn gan allgyrchu ysgafn (800 g/10 mun) a chasglu gwaed plasma ar gyfer dadansoddiad pellach. Yr ae a iawnareneu tynnu i'w dadansoddi ymhellach. Cynhaliwyd yr astudiaeth yn unol â Datganiad Helsinki, a chymeradwywyd y protocol gan Gomisiwn Arbenigol ar gyfer Sicrhau Lles Anifeiliaid Arbrofol Prifysgol Mendel yn Brno (ar gyfer prosiect IGA-ZF/2016-AP011).
3.2. Detholiad Hadau Grapevine
Cafodd hadau grawnwin (amrywiaeth Cerason - Merlot × Seibel 13 666) eu didoli, eu glanhau, eu sychu a'u malu. Digwyddodd y didoli trwy'r marciau ar beiriant gwahanu, lle cafodd yr hadau eu gwahanu oddi wrth y croen. Yna cafodd yr hadau a wahanwyd yn y modd hwn eu rinsio, tynnwyd yr hadau gwag, a glanhawyd yr hadau sy'n weddill. Sychwyd yr hadau wedi'u glanhau a'u golchi mewn sychwr ar 50 ◦C am 12 h. Dilynwyd hyn gan falu'r hadau gan ddefnyddio grinder labordy Sylfaenol IKA MF 10 (IKA Werke, Staufen im Breisgau, yr Almaen). Echdynnwyd yr hadau daear mewn ethanol 75 y cant am 120 h (22 ◦C, wedi'i ysgwyd ar 50 RPM; IKA KS 260 Sylfaenol, gwneuthurwr: IKA Werke, Staufen im Breisgau, yr Almaen) mewn cymhareb o un rhan o hadau daear i ddeg rhan o ethanol (m/m). Ar ôl hyn, gosodwyd y darn mewn tiwbiau prawf 25 ml (Eppendorf, Hamburg, yr Almaen) a'i allgyrchu (Hettich MIKRO 220 Centrifuge; Hettich, Westphalia, yr Almaen) ar 4 ◦C a RCF 25,000 × g. Cymerwyd sampl centrifuged o'r tiwb prawf a'i drosglwyddo i fflasg distyllu anweddydd gwactod (ICA RV 10 digidol VC; IKA Werke, Staufen im Breisgau, yr Almaen), lle anweddodd yr ethanol. Digwyddodd yr anweddiad mewn gwactod ar 90 ◦C, a throsglwyddwyd y dyfyniad i ddysglau Petri a'i lyoffileiddio mewn gwactod ar 53 ◦C (lyophilizer Heto PowerDry PL 3000; Trigon-plus, Cestlice, Gweriniaeth Tsiec). Ar ôl ei baratoi, rhoddwyd y darn i'r anifeiliaid arbrofol.
BYDD CISTANCHE YN GWELLA HEINTIAD YR AREN/ARENAU
3.3. Pennu Gweithgaredd Gwrthocsidiol a Chyfanswm Cynnwys Polyphenolics
Er mwyn sicrhau gwrthrychedd y canlyniadau, defnyddiwyd pedwar dull sylfaenol gwahanol i bennu'r gweithgaredd gwrthocsidiol. Dadansoddwyd samplau ar sbectrophotometer awtomatig BS-400 (Mindray, Shenzen, Tsieina). Dadansoddwyd pob sampl yn driphlyg, gyda'r gwerth canlyniadol yn cyfateb i gyfartaledd y mesuriadau hyn. Perfformiwyd y dadansoddiadau hyn yn dilyn Sochor et al. [35].
3.3.1. Pennu Gweithgaredd Gwrthocsidiol Gan Ddefnyddio'r Dull ABTS
Paratowyd datrysiad ar gyfer pennu gweithgaredd gwrthocsidiol gan assay ABTS trwy gymysgu dau ddatrysiad - hydoddiant 1: 7 mM o ABTS a baratowyd trwy bwyso m=9.60 mg fesul 5 mL o ddŵr distyll; a datrysiad 2: 4.95 mM hydoddiant o persylffad potasiwm a baratowyd trwy bwyso m=1.67 mg fesul 5 mL o ddŵr distyll. Gwanhawyd yr ateb canlyniadol 1:10 gyda dŵr distyll a'i adael yn y tywyllwch ac oer am 12 h. Yna, cafodd 150 µL o adweithydd R1 (7 mM ABTS a 4.95 mM persulfate potasiwm) ei bibed i mewn i cuvettes plastig, ac yna ychwanegu 3 µL o'r sampl, a'i fesur mewn sbectroffotomedr (λ=660 nm) ar gyfer 12 min. Yn ôl y gromlin graddnodi, troswyd yr amsugnedd i gynnwys cyfatebol asid galig; cyfrifwyd y gweithgaredd gwrthocsidiol o'r gromlin raddnodi gan ddefnyddio asid galig fel safon (10–200 mg·L1), a mynegwyd y canlyniadau fel cywerthyddion asid galig.
3.3.2. Pennu Gweithgaredd Gwrthocsidiol Gan Ddefnyddio'r Dull DPPH
Yn gyntaf, cafodd m {{0}}.35 mg o DPPH radical ei bwyso. Trosglwyddwyd y swm hwn i fflasg gyfeintiol 250 ml a'i wneud â methanol. Yna, cafodd 150 µL o adweithydd R1 (0.095 mM DPPH) ei bibed i cuvettes plastig, ac yna ychwanegu 15 µL o'r sampl i'w fesur. Mae'r prawf DPPH yn seiliedig ar allu'r radical rhydd sefydlog 2,2-diphenyl{-1-picrylhydrazyl-1-i adweithio â rhoddwyr hydrogen. Mae DPPH yn dangos amsugno cryf yn y sbectrwm sbectrosgopeg uwchfioled (UV-VIS). Mesurwyd amsugnedd am 12 munud ar λ=505 nm. Yn ôl y gromlin graddnodi, cafodd yr amsugnedd ei drawsnewid i gynnwys asid galig cyfatebol.
3.3.3. Pennu Gweithgaredd Gwrthocsidiol Gan Ddefnyddio'r Dull Pŵer Lleihau Gwrthocsid Ferric
Defnyddiwyd tri datrysiad i bennu'r gweithgaredd gwrthocsidiol gan ddefnyddio'r dull pŵer gwrthocsidiol lleihau ferric (FRAP) - (1) datrysiad TPTZ: 10 mM TPTZ (m=78.02 mg) wedi'i hydoddi mewn 25 mL o 40 mM HCl; (2) Datrysiad FeCl3: 20 mM FeCl3 (m=135.13 mg) hydoddi mewn 25 mL o ddŵr distyll; a (3) toddiant byffer asetad: 0.02 M asetad byffer pH 3.6 (m=775 mg sodiwm asetad hydoddi mewn 250 mL o ddŵr distyll, pH addasu ag asid asetig). Cymysgwyd y tri datrysiad yn y gymhareb 1:1:10 (TPTZ: FeCl3: byffer asetad). Yna, pibedwyd 150 µL o adweithydd i mewn i cuvettes plastig ac ychwanegwyd 3 µL o'r sampl. Mesurwyd amsugnedd am 12 munud ar λ=605 nm. Cyfrifwyd actifedd gwrthocsidiol o'r gromlin raddnodi gan ddefnyddio asid galig fel safon (10–200 mg·L1). Mynegwyd canlyniadau fel asid galig cyfatebol.
3.3.4. Pennu Gweithgaredd Gwrthocsidiol Gan Ddefnyddio'r Dull Radical Rhydd o Chloroffylin
Cafodd cyfanswm o 200 µL o adweithydd R1 (0.1 M HCl, echdyniad cloroffyl, byffer adwaith, catalydd) ei bibed i cuvettes plastig ac yna ychwanegwyd 8 µL o'r sampl. Mae'r dull hwn yn defnyddio gallu cloroffyllin (halen sodiwm-copr cloroffyl) i dderbyn a rhoi electronau tra'n newid yr uchafswm amsugno yn sefydlog. Mae'r broses hon wedi'i chyflyru gan yr amgylchedd alcalïaidd ac ychwanegu catalydd. Mesurwyd amsugnedd am 12 munud ar λ=450 nm. Defnyddiwyd y gwerthoedd mesur diwethaf ar gyfer y cyfrifiad. Mynegwyd canlyniadau fel asid galig cyfatebol.
3.3.5. Penderfynu Crynodiad Polyphenol Cyfanswm
Defnyddiwyd y dull Folin-Ciocalteu i bennu cyfanswm y cyfansoddion polyphenolic. Dadansoddwyd pob sampl yn driphlyg, a chafwyd y gwerth canlyniadol fel cyfartaledd y mesuriadau hyn. Cafodd sampl 40 µL ei bibed i mewn i cuvette (3 mL) a'i wanhau â 1960 µL o ddŵr distyll. Yn dilyn hynny, ychwanegwyd 50 µL o adweithydd Folin-Ciocalteu at y cuvette. Ysgwyd y cymysgedd yn drylwyr ac, ar ôl 3 munud, ychwanegwyd 300 µL o hydoddiant decahydrate Na2CO3 20 y cant. Cafodd cymysgedd yr adwaith ei ysgwyd a'i ddeor ar 22 ◦C am 120 munud. Ar ôl yr amser hwn, mesurwyd yr amsugnedd (SPECORD 210; Carl-Zeiss, Jena, yr Almaen) ar λ=750 nm yn erbyn gwag. Mynegwyd canlyniadau fel asid galig cyfatebol.
3.4. Penderfynu Gwrthocsidyddion gan HPLC
Pennu Cydrannau Gwrthocsidiol Unigol gan Ddefnyddio Cromatograffaeth Hylif Perfformiad Uchel gyda sbectromedr màs. Cynhaliwyd dadansoddiadau o samplau a ddefnyddiwyd ar gyfer amcangyfrif flavonoids a proanthocyaninau mewn system gromatograffig Agilent Technologies 12{{10}0 (Jet Stream Technologies, Santa Clara, CA, UDA) sy'n cynnwys y dyfeisiau canlynol: cronfeydd dŵr cam symudol, degasser, pwmp deuaidd, cronfa sampl gydag awtosampler, a synhwyrydd màs gydag Agilent 6460 LC/MS Pedwarplyg Triphlyg (Jet Stream Technologies, Santa Clara, CA, UDA). Gwahanwyd samplau yng ngholofnau cromatograffig Zorbax SB C18 gyda dimensiynau 50 × 2.1 mm a maint y gronynnau 2.7 µm. Roedd y cyfnod dadansoddi bob amser yn 6 munud. Cyfradd gydradd y nwy cludo oedd 0.6 mL·min1. Cydran organig y cyfnod symudol oedd gradd graddiant methanol (toddydd B) ac roedd y cyfansoddyn dyfrllyd yn cynnwys 0.05 M o formate amoniwm (toddydd A). Roedd graddiant y cyfnod symud fel a ganlyn: amser 0 mun: 50 y cant o doddydd A a 50 y cant o doddydd B; amser 2.5 min: 100 y cant o doddydd A a 0 y cant o doddydd B; amser 5 mun: 50 y cant o doddydd A a 50 y cant o doddydd B. Addaswyd tymheredd y thermostat colofn i 45 ◦C.
BYDD CISTANCHE YN GWELLA POEN YN YR AREN/ARENIAD
3.5. Pennu Marcwyr Biocemegol Dethol
Marcwyr biocemegol yn y gwaed, plasma, afu, aareno'r anifeiliaid yn cael eu monitro i ganfod effaith amddiffynnol GSE yn erbyn effeithiau negyddol cadmiwm. Perfformiwyd y dadansoddiadau canlynol: (1) Dadansoddiadau plasma: cyfanswm gweithgaredd gwrthocsidiol plasma, creatinin, wrea, ALT, AST. (2) Dadansoddiadau gwaed: MT. (3) Dadansoddiadau afu: SOD, CAT, MT. (4)Arennaudadansoddiadau: MT.
3.5.1. Pennu Cyfanswm Gweithgaredd Gwrthocsidydd Plasma,Defnyddiwyd creatinin, wrea, ALT, ac AST A BS{{{0}} dadansoddwr biocemegol awtomataidd (Mindray, Shenzen, Tsieina) i ddadansoddi cyfanswm gweithgaredd gwrthocsidiol y plasma, creatinin, wrea, ALT, ac AST. Pennu Cyfanswm Gweithgaredd Gwrthocsidiol Plasma Defnyddiwyd y dull radical rhydd i bennu gweithgaredd gwrthocsidiol y plasma [35]. Mae'r dull hwn yn defnyddio gallu cloroffyllin (halen sodiwm-copr cloroffyl) i dderbyn a rhoi electronau tra'n newid yr uchafswm amsugno yn sefydlog. Mae'r broses hon wedi'i chyflyru gan yr amgylchedd alcalïaidd ac ychwanegu catalydd. Cafodd cyfanswm o 200 µL o adweithydd R1 (0.1 M HCl, echdyniad cloroffyllin, byffer adwaith, a chatalydd) ei bibed i cuvettes plastig, ac ar ôl hynny ychwanegwyd 8 µL o'r sampl. Mesurwyd yr amsugnedd am 12 munud ar λ=450 nm, a defnyddiwyd y gwerth mesur olaf ar gyfer y cyfrifiad. Cyfrifwyd gweithgaredd gwrthocsidiol o'r gromlin raddnodi gan ddefnyddio asid galig fel safon a mynegwyd y canlyniadau fel cywerth asid galig.
Pennu Cynnwys CreatininEgwyddor y dull yw penderfyniad ffotometrig o gymhleth lliw creatinin gyda picrate alcalïaidd, y mae ei gyfradd ffurfio yn gymesur â chrynodiad creatinin yn y sampl. Defnyddiwyd pecyn diagnostig o Greiner (Greiner GmbH, Pleidelsheim, yr Almaen) i bennu'r creatinin. Cafodd cyfanswm o 180 µL o adweithydd R1 (0.16 mM sodiwm hydrocsid) ei bibed i'r cuvette, ac yna ychwanegu 10 µL o'r sampl a 30 µL o'r adweithydd R2 (asid picrig 4 mM). Mesurwyd yr amsugnedd am chwe munud ar λ=505 nm. Defnyddiwyd gwerth amsugnedd yr adweithydd R1 yn unig gyda'r sampl a'r gwerth amsugnedd ar ôl deoriad 6 munud gydag adweithydd R2 ar gyfer y cyfrifiad.
Pennu Aminotransferase AlanineDefnyddiwyd pecyn diagnostig gan Greiner (Greiner GmbH, Pleidelsheim, yr Almaen) i bennu ALT. Yn gyntaf, cafodd 150 µL o adweithydd R1 (byffer Tris 100 mM pH 7.5; 500 mM L-alanin, 1200 U/L lactad dehydrogenas) a 15 µL o sampl plasma eu pibedu'n awtomatig i'r cuvettes. Yn dilyn hynny, cafodd 30 µL o adweithydd R2 (15 mM 2-ocsoglutarad, 0.18 mM NADH) ei bibed yn awtomatig a deorwyd y cymysgedd am 5 munud. Mesurwyd amsugnedd ar λ=340 nm. Defnyddiwyd gwerthoedd amsugnedd adweithydd R1 yn unig gyda'r sampl a'r gwerthoedd amsugnedd ar ôl deoriad 5 munud gyda'r sampl ar gyfer y cyfrifiad. Troswyd y canlyniad yn ôl y gromlin raddnodi i actifedd yr ensym mewn µkat/L.
Pennu Aspartate AminotransferaseDefnyddiwyd pecyn diagnostig gan Greiner (Greiner GmbH, Pleidelsheim, yr Almaen) i bennu AST. Yn gyntaf, cafodd 150 µL o adweithydd R1 (byffer Tris 80 mM pH 7.8, 240 mM L-aspartate, 1200 U/L dehydrogenas malate) a 15 µL o sampl plasma o anifeiliaid arbrofol eu pibellau'n awtomatig i'r cuvettes. Yn dilyn hynny, perfformiwyd cymysgu a deor ar 37 ◦C am 270 s. Nesaf, cafodd 30 µL o adweithydd R2 (15 mM 2-ocsoglutarad, 0.18 mM NADH) ei bibed yn awtomatig a deorwyd y cymysgedd am 5 munud. Mesurwyd amsugnedd ar λ=340 nm. Defnyddiwyd gwerthoedd amsugnedd adweithydd R1 yn unig gyda'r sampl a'r gwerthoedd amsugnedd ar ôl deoriad 5 munud gyda'r sampl ar gyfer y cyfrifiad. Troswyd y canlyniad yn ôl y gromlin raddnodi i actifedd yr ensym mewn µkat/L.
Penderfynu UreaDefnyddiwyd y weithdrefn ganlynol i bennu'r wrea: cafodd 200 µL o adweithydd R1 (PH byffer Tris 7.8, ADP, urease, a GLDH) a 200 µL o adweithydd R2 (2-oxoglutarate, NADH) eu pibedu'n awtomatig i cuvettes, yna sampl o gyfaint 4 µL, ac wedi hynny cymysgwyd y cymysgedd a'i ddeor ar 37 ◦C am 30 s. Yn dilyn hynny, mesurwyd yr amsugnedd yn λ=340 nm ac ar ôl 60 s arall, mesurwyd yr amsugnedd eto. Defnyddiwyd y gwerthoedd amsugnedd ar ôl 30 s ac ar ôl 60 s arall ar gyfer y cyfrifiad. Tynnwyd y gwerthoedd oddi wrth ei gilydd a throswyd y canlyniad yn ôl y gromlin graddnodi i'r cynnwys wrea.
Pennu Cyfanswm Proteinau Gan Ddefnyddio'r Dull BiuretDisgrifir penderfyniad cyfanswm proteinau gan y dull Biuret yn fanwl mewn cyhoeddiad arall [9]. Cafodd cyfanswm o 180 µL o adweithydd Biuret (tartrad sodiwm potasiwm 15 mM, 100 mM NaI, 5 mM KI, a 5 mM CuSO4) ei bibed i'r cuvette, ac yna 45 µL o'r sampl. Ar ôl deng munud o ddeori ar 37 ◦C, mesurwyd yr amsugnedd ar donfedd λ=546 nm. Yr egwyddor yma yw adwaith y bond peptid â Cu (II) mewn amgylchedd alcalïaidd, gyda ffurfio lliw glas-fioled. Defnyddiwyd gwerth amsugnedd yr adweithydd yn unig a'r gwerth amsugnedd ar ôl deng munud o ddeori gyda'r sampl ar gyfer y cyfrifiad.
3.5.2. Pennu Superoxide Dismutase (SOD) a Catalase (CAT) Pennu Gweithgaredd SOD, Defnyddiwyd pecyn masnachol (19160 SOD, Merck KGaA, Darmstadt, yr Almaen) i bennu gweithgaredd SOD (SOD, EC 1.15.1.1). Perfformiwyd y mesuriad mewn cuvette plastig ar ddadansoddwr awtomatig BS 400 (Mindray, Shenzen, Tsieina). Yn gyntaf, cafodd 200 µL o adweithydd R1 (hydoddiant WST gwanedig 20 × byffer) ei bibed i'r cuvette a deorwyd yr adweithydd ar 37 ◦C am 108 s (1 munud, 48 s). Yna, cafodd 20 µL o sampl ei bibed ac, ar 378 s (6 munud, 18 s), dechreuwyd yr adwaith trwy ychwanegu 20 µL o adweithydd R2 (hydoddiant ensymau gwanedig byffer 167 ×). Deorwyd y cymysgedd am 72 s (1 munud, 12 s) ac yna mesurwyd amsugnedd ar λ=450 nm. Mesurwyd cinetig yr adwaith am 180 s (3 munud) a darllenwyd yr amsugnedd bob naw eiliad. Cyfrifodd yr offeryn y cynnydd cyfartalog mewn amsugnedd y funud (∆A) a gweithgaredd SOD y samplau a fesurwyd, yn ôl yr hafaliad graddnodi. Mynegwyd y canlyniadau mewn U/mL a'u trosi wedyn i mg o brotein.
3.5.3. Penderfynu Cynnwys MetallothioneinMae pennu crynodiad metallothionein yn y gwaed, yr afu, aarennauo'r llygod mawr brown yn cael ei berfformio gan ddefnyddio'r dechneg stripio trosglwyddiad arsugniadol (AdTS) gyda foltammetreg pwls gwahaniaethol (DPV). Ar gyfer y dadansoddiad, cymerwyd 200 µL o'r uwchnatant a ddadansoddwyd a'i gymysgu ag 1 800 µL o adweithydd Brdiˇcka mewn llestr mesur, ac wedi hynny perfformiwyd y penderfyniad electrocemegol ei hun. Perfformiwyd yr assay yn unol â phrotocol a ddisgrifiwyd yn flaenorol [37]. Defnyddiwyd cysylltiad tair electrod clasurol. Roedd yr electrod gweithio yn electrod gollwng mercwri crog (HMDE) gydag arwynebedd gollwng o 0.4 mm2 , tra bod yr electrod cyfeirio yn Ag/AgCl/3 M KCl a'r electrod ategol yn electrod platinwm. Newidiwyd yr electrolyt sylfaen (1 mmol·L1 [CO(NH3)6) Cl3 ac 1 mol·L1 o glustogfa amoniwm; NH3(d) ynghyd â NH4Cl, pH 9.6) ar gyfer pob sampl a fesurwyd. Roedd y paramedrau DPV fel a ganlyn: potensial cychwynnol 0.7 V, potensial terfynol 1.75 V, byrlymu 5 s, amser dyddodiad 240 s, amser modiwleiddio 0.0 5 s, amser egwyl 0.25 s, cam posibl 0.00105 V, cyfradd sgan 0.0042 V/s, ac osgled modiwleiddio 0.02505 V. Perfformiwyd y penderfyniad MT ar ddyfais fesur yn cynnwys Autosampler 695 wedi'i gysylltu ag uned fesur VA Stand 693 a'i reoli gan uned reoli TraceAnalyser 693 VA (i gyd yn Metrohm, Herisau, y Swistir). Oeriwyd y system fesur gyfan i 4 ◦C gan ddefnyddio Julabo F25 (Julabo, Seelbach, yr Almaen). Allforiwyd y foltamogramau a gafwyd i raglen Cronfa Ddata VA 2.2 (Metrohm, Herisau, y Swistir), a chafodd y samplau a ddadansoddwyd eu dadocsigeneiddio gan fyrlymu gweithredol argon gyda phurdeb o 99.999 y cant.
3.5.4. Penderfynu Cynnwys Cadmium yn y Gwaed, yr Afu, a Dadelfeniad yr Arennau o Samplau Defnyddiwyd echdynnwr microdon Ethos One (Carreg Filltir, Sorisole, yr Eidal) i ddadelfennu'r afu aarensamplau, a defnyddiwyd Echdynnwr Microdon Amldon 3000 (Anton Paar Graz, Awstria) i ddadelfennu samplau gwaed. Digwyddodd mwynoli mewn ffordd wlyb, gan ddefnyddio 65 y cant o asid nitrig (HNO3 supra pur) (Merck KGaA, Darmstadt, yr Almaen) a 30 y cant hydrogen perocsid (H2O2 supra pur) (Merck KGaA, Darmstadt, yr Almaen) Cyfanswm o 0.4 g o ae ynteuarenpwyswyd y sampl i gyfres o gynwysyddion Teflflon, ac ychwanegwyd 5 ml o 65 y cant HNO3, 3 mL o 30 y cant H2O2, a 2 mL o Milli Q H2O at y sampl. Caewyd y cynwysyddion a dechreuodd yr offeryn yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Parhaodd y dadelfeniad microdon am 40 munud ar 210 ◦C. Yn dilyn hynny, cafodd y samplau eu hoeri am 45 munud a'u storio ar 4 ◦C mewn cynwysyddion AG. Cafodd cyfanswm o 0.01 g o sampl gwaed ei bwyso i gyfres o gynwysyddion gwydr, ac ychwanegwyd 300 µL o 65 y cant HNO3 a 200 µL o 30 y cant H2O2 at y sampl. Caewyd y cynwysyddion a dechreuodd yr offeryn yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Parhaodd y dadelfeniad microdon am 40 munud ar dymheredd o 140 ◦C. Yn dilyn hynny, cafodd y samplau eu hoeri am 45 munud a'u storio ar 4 ◦C nes i AAS benderfynu arnynt.
Pennu Cadmiwm trwy Sbectrometreg Amsugno AtomigPennwyd y cadmiwm ar ddyfais Agilent 280/240 Series AA Systems (Agilent Technologies). Yr afu aarendadansoddwyd samplau mewn fflam aer asetylen (Fa AAS), a'r samplau gwaed trwy atomization electrothermol (ETA AAS) ar donfedd o 228.8 nm. Paratowyd cyfres raddnodi gyda chrynodiadau o 0–20 µg·Lfor ar ddadansoddiadau ETA AAS a 0–10 mg·L1 ar gyfer Fa AAS o hydoddiant safonol o gadmiwm (Analytika Praha, Prag, Gweriniaeth Tsiec), gyda chrynodiad o 1.000 ± 0.002 g·L1. Dilynwyd hyn gan fesuriad o'r atebion cyfres graddnodi ac adeiladwaith y cromliniau graddnodi, ac ar ôl hynny mwyneiddiad y gwaed, yr afu, aarenmesurwyd samplau.
3.6. Dadansoddiad YstadegolPerfformiwyd yr holl fesuriadau yn driphlyg. Nodwyd gwerthoedd allanol gyda phrawf Grubbs a'u heithrio (darganfuwyd cyfanswm o ddau allgleifion). Cyn dadansoddiad ystadegol, cafodd y data eu trawsnewid gan drawsnewidiad logarithmig a'u dadansoddi gan ANOVA unffordd (pob pwynt amser ar wahân) gyda phrawf ôl-hoc Tukey HSD. Gosodwyd y trothwy ar gyfer arwyddocâd ystadegol fel p <>
4. Casgliadau
Bu tuedd fferyllol ac economaidd yn ddiweddar i chwilio am gyffuriau newydd ymhlith metabolion eilaidd planhigion, sef sylweddau a all helpu i amddiffyn rhag amrywiaeth o glefydau. Diolch i'r cydrannau biolegol weithgar pwysig y mae hadau grawnwin yn eu cynnwys yn eu matrics, gellir eu defnyddio (ac yn cael eu defnyddio eisoes) at ddibenion meddygol. Mae'n hysbys bod darnau hadau grawnwin yn amddiffyn meinweoedd rhag difrod ocsideiddiol sy'n gysylltiedig â straen a achosir gan y cadmiwm metel trwm gwenwynig. Mae'n debyg bod cyfansoddiad ffenolig yr hadau grawnwin a ddefnyddir yn dylanwadu ar yr amddiffyniad hwn. Yn yr astudiaeth hon, profwyd detholiad hadau grawnwin a baratowyd o'r amrywiaeth lled-wrthiannol Cerason gyda chynnwys ffenolig eithaf uchel am effeithiau amddiffynnol yn erbyn newidiadau a achosir gan gadmiwm. Roedd y GSE a astudiwyd yn gallu cynyddu gweithgaredd gwrthocsidiol plasma wrth ei weinyddu ar ei ben ei hun a lleihau cynnwys cadmiwm yn yr afu aarennauo'r llygod mawr pan yn cyd-weinyddu. Yn unol â hynny, mae'r cynnydd o ensym marciwr hepatig ALT aarenCafodd creatinin marcio a achosir gan gadmiwm eu harafu gan GSE. Ar ben hynny, cafodd y gostyngiadau yng ngweithgareddau ensymau gwrthocsidiol SOD a CAT a achosir gan gadmiwm eu harafu gan gyd-weinyddu GSE. Mae'r canlyniadau hyn yn dangos bod GSE yn gyfrwng amddiffynnol cryf yn erbyn effeithiau metelau trwm.
