Effaith Cymeriant Protein Isel yn ystod Cyfnod Ar Esgyniad MicroRNA yr Arennau Embryonig Ac yng Nghelloedd Epilydd Nephron y Ffetws Gwryw
Mar 08, 2022
Rhagymadrodd
Gall diffyg maetholion arwain at newidiadau signalau mewn llwybrau canolog yn ystod gwahanol gamau yn natblygiad y ffetws, a all achosi anhwylderau organau a system anwrthdroadwy pan fyddant yn oedolion [1]. Mae rhaglennu ffetws yn cyfeirio at unrhyw sarhad yn ystod datblygiad, sy'n achosi effeithiau hirdymor ar strwythur neu swyddogaeth organeb [2]. Mae tarfu ar raglennu ffetws yn arwain at bwysau geni isel, llai o neffronau, a risg uwch o cardiofasgwlaidd aarennolanhwylderau mewn oedolaeth [3-6]. Mae astudiaethau gan awduron eraill a ninnau wedi dangos pwysau geni is, 28 y cant yn llai o neffronau, wedi lleihauarennolysgarthiad halen, cronigmethiant arennol, a gorbwysedd arterial mewn cymeriant protein isel yn ystod beichiogrwydd (LP) o'i gymharu â epil cymeriant protein safonol (NP) pan fyddant yn oedolion [3-7]. Mae nephrogenesis yn cynnwys rheolaeth dynn ar fynegiant genynnau, synthesis protein, ac ailfodelu meinwe. Mae astudiaethau wedi dangos bod niferoedd neffron yn cael eu pennu gan y rhyngweithiadau rhwng celloedd blagur wreter (UB) a metanephros mesenchyme (MM) [8-10]. Mae signalau o MM yn achosi twf a ysgogir gan UB a changhennu'r system tiwbyn. Yn ei dro, mae amlhau a gwahaniaethu MM, sy'n gyfystyr â chap mesenchymal (CM), yn cael ei gyfryngu gan bennau UB [11].
BYDD CISTANCHE YN GWELLA CLEFYD YR ARREN/ARENAU
Bu diddordeb difrifol yn rôl newidiadau epigenetig, yn ymwneud ag effeithiau hirdymor straen cyn-geni, ar ddatblygiad y ffetws [12]. Mae microRNAs (miRNAs) yn RNAs bach di-godio wedi'u hamgodio gan genom o tua 22 niwcleotidau o hyd ac maent yn chwarae rhan hanfodol yn y rheoliad ôl-drawsysgrifol o fynegiant genynnau targed [13-16]. mae miRNAs yn rheoli mynegiant genynnau yn ôl-drawsysgrifol trwy reoleiddio cyfieithiad mRNA neu sefydlogrwydd yn y cytoplasm [17, 18]. Mae astudiaethau swyddogaethol yn dangos bod miRNAs yn cymryd rhan mewn prosesau biolegol hanfodol yn ystod datblygiad ac mewn ffisioleg celloedd [13, 16]. Gwelwyd newidiadau yn eu mynegiant mewn sawl patholeg [16, 19]. Felly, mae nodweddu miRNAs wedi helpu i ddeall rheoleiddio genynnau ac amlhau cellog, gwahaniaethu, ac apoptosis ac esbonio anhwylderau pathoffisioleg, gan gynnwysarenanhwylderau [20–22]. Mae astudiaethau wedi adrodd bod yn ystodarenmae miRNAs ontogeni yn anhepgor ar gyfer datblygiad neffron [23-26]. Ar ben hynny, mae tanfynegiant rhai NAs miR mewn celloedd epil MM yn lleihau amlhau celloedd, gan arwain at wahaniaethu cynnar, ac o ganlyniad, gostyngodd nifer y neffronau [27, 28]. Nodweddir y ffenomen hon gan apoptosis cynyddol a mynegiant Bim uchel mewn celloedd progenitor [27]. Felly, mae miRNAs yn modiwleiddio'r cydbwysedd rhwng apoptosis ac amlder y celloedd cynradd metaneffrig hyn [29].
Fe wnaethom ddamcaniaethu bod newidiadau epigenetig anhysbys a phroffilio mynegiant miRNA yn gysylltiedig â nhwarenanhwylderau datblygiadol mewn plant mamol â chyfyngiad protein. Felly, ein nod oedd gwerthuso patrymau miRNA a mynegiant genynnau a ragfynegwyd yn y ffetwsarenar 17 diwrnod ar ôl beichiogrwydd (17-DG) epil gwrywaidd â chyfyngiad protein i nodi llwybrau moleciwlaidd ac anhwylderau sy'n gysylltiedig âarennolamlhau celloedd a gwahaniaethu yn ystodarendatblygiad.
Geiriau allweddol:methiant arennol; tiwbaidd arennol; anhwylderau arennol; datblygiad yr arennau; aren
Deunydd a methodoleg
Anifeiliaid a dietCynhaliwyd yr arbrofion fel y disgrifiwyd yn fanwl yn flaenorol [5, 6] ar lygod mawr benywaidd a gwrywaidd o lygod mawr Wistar HanUnib sy’n cyfateb i’w hoedran (250–300 g) sy’n tarddu o stoc bridio a ddarparwyd gan CEMIB/UNICAMP , Campinas, SP, Brasil. Cyflwynodd yr amgylchedd a thai yr amodau cywir ar gyfer rheoli eu hiechyd a'u lles yn ystod y weithdrefn arbrofol. Yn syth ar ôl diddyfnu yn dair wythnos oed, roedd anifeiliaid yn cael eu cynnal o dan amodau tymheredd rheoledig (25˚C) ac amodau goleuo (07:00–19:00h) gyda mynediad am ddim i ddŵr tap a chow cnofilod labordy safonol (Purina Nuvital). , Curitiba, PR, Brasil: Na ynghyd â chynnwys: 135 ± 3μEq/g; K ynghyd â chynnwys: 293 ± 5μEq/g), am 12 wythnos cyn bridio. Cymeradwyodd y Pwyllgor Moeseg Sefydliadol ar Ddefnydd Anifeiliaid ym Mhrifysgol Talaith São Paulo (#{6CEUA/UNESP) y protocol arbrofol, a dilynwyd y canllawiau cyffredinol a sefydlwyd gan Goleg Arbrofi Anifeiliaid Brasil trwy gydol yr ymchwiliad. Fe'i dynodwyd yn ddiwrnod 1 o feichiogrwydd fel y diwrnod yr oedd ceg y groth yn arddangos sberm. Yna, cynhaliwyd argaeau ad libitum trwy gydol y beichiogrwydd cyfan ar chow labordy cnofilod isocalorig gyda chynnwys protein safonol [NP, n=36] (17 y cant o brotein) neu gynnwys protein isel [LP, n=51 ] (6 y cant o brotein). Pennwyd y defnydd o fwyd mamau NP ac LP bob dydd (yn dilyn hynny wedi'i normaleiddio ar gyfer pwysau'r corff), a chofnodwyd pwysau corff argaeau yn wythnosol yn y ddau grŵp. Ar 17 diwrnod o feichiogrwydd (17-DG), anestheteiddiwyd yr argaeau gan ketamine (75mg/kg) a xylazine (10mg/kg), a datgelwyd y groth. Tynnwyd y ffetysau a'u difa ar unwaith trwy ddiswyddo. Pwyswyd y ffetysau a chasglwyd y gynffon a'r coesau a'r breichiau i gael rhyw. Casglwyd y metaneffros ar gyfer dadansoddiadau Dilyniannu'r Genhedlaeth Nesaf (NGS), RT-qPCR, a immunohistochemistry.
BYDD CISTANCHE YN GWELLA METHIANT YR AREN/ARENAU
Penderfyniad rhywiolPerfformiwyd yr astudiaeth bresennol mewn epil DG 17- gwrywaidd yn unig, a phenderfynwyd ar y rhywio gan ddadansoddiad dilyniant PCR confensiynol Sry (Polymerase Chain Reaction). Echdynnwyd y DNA trwy lysis ensymatig gyda proteinas K a Phenol-Chloroform. Er mwyn ymateb, defnyddiwyd y Master Mix Colorless—Promega, gydag amodau beicio'r gwneuthurwr. Syntheseiddiodd y Technolegau DNA Integredig (IDT) y paent preimio gan ddilyn y dilyniannau isod: Ymlaen: 5'-TACAGCCTGAGGACATATTA-3'Cefn: 5'-GCACTTTAACCCTTCGATTAG-3'.
Cyfanswm echdynnu RNAEchdynnwyd RNA o NP (n=4) ac LP (n=4) yn gyfanarennaudefnyddio adweithydd Trizol (Invitrogen), yn unol â'r cyfarwyddiadau a bennir gan y gwneuthurwr. Pennwyd cyfanswm yr RNA gan yr amsugnedd ar 260 nm gan ddefnyddio sbectrophotometer nanoVue (GE Healthcare, UDA). Sicrhawyd uniondeb RNA trwy gael Rhif Uniondeb RNA - RIN> 8 gyda Biodadansoddwr Agilent 2100 (Agilent Technologies, yr Almaen) [30].
miRNA-Seq a dadansoddi dataPerfformiwyd dilyniannu ar lwyfan MiSeq (Illumina). Roedd y protocol yn dilyn cyfarwyddiadau'r gwneuthurwr a oedd ar gael ynYn gryno, mae'r dilyniant yn cynnwys adeiladu llyfrgell, a defnyddiwyd hwn 1ug cyfanswm RNA. Yn y cam hwn, mae'r addaswyr wedi'u cysylltu, y 3 'a 5'. Ar ôl clymu addaswyr, perfformiwyd adwaith trawsgrifio gwrthdro i greu cDNA. Yna cafodd ei chwyddo gan adwaith PCR safonol, sy'n defnyddio paent preimio sy'n cynnwys mynegai dilyniant ar gyfer adnabod sampl - y llyfrgell cDNA hon, sy'n destun electrofforesis gel agarose ar gyfer ynysu miRNA. Ar ôl meintioli, normaleiddiwyd crynodiad y llyfrgell i 2 nM gan ddefnyddio 10 nM Tris-HCl, pH 8.5, a pherfformiwyd dilyniant trawsgrifio gan MiSeq Reagent Kit v2 (50 cylch).
Perfformiwyd dadansoddiad data mewn cydweithrediad â Tao Chen, Ph.D. o'r Is-adran Gwenwynegol Genetig a Moleciwlaidd, y Ganolfan Genedlaethol ar gyfer Ymchwil Tocsicoleg, Jefferson, AR, UDA. Cynhyrchwyd y data o Dilyniannu'r Genhedlaeth Nesaf (NGS) o miRNAs ar ffurf FASTA a'u mewnforio i BaseSpace.com (Illumina, UDA). Gwerthuswyd ansawdd y data gan ddefnyddio meddalwedd CASAVA sy'n galw sylfaen a ddatblygwyd gan y gwneuthurwr (Illumina). Gwnaed y dadansoddiadau gan BaseSpace miRNA Analysis (o Brifysgol Torino, Canada) a mapio dilyniant o wahanol miRNAs gan Small RNA (Illumina, UDA) ar gyfer y genom llygod mawr. Dadansoddwyd yr astudiaeth miRNA a fynegwyd yn wahaniaethol gan ddefnyddio meddalwedd Dadansoddi Ingenuity Pathway (Ingenuity, USA).
dilysu mynegiant miRNADefnyddiwyd pedwar epil gwrywaidd o wahanol dorllwythi ym mhob grŵp ar gyfer y miRNA (miR{{{{{{{{{{0}}p, -144-3p, -298-5p, gadewch-7a{{). 4}}p, -181a-5p, -181c-3p, a -199a-5p) dadansoddiad mynegiant. Yn gryno, cafodd 450 ng RNA ei drawsgrifio i'r gwrthwyneb, heb ymhelaethu ymlaen llaw, gan ddefnyddio Pecyn Trawsgrifio Gwrthdroi Micro RNA TaqMan1, yn unol â chanllawiau'r gwneuthurwr. Cafodd DNA cyflenwol (cDNA) ei chwyddo gan ddefnyddio TaqMan MicroRNA Assays (Life Technologies, UDA) gyda TaqMan1 Universal PCR Master Mix, No AmpErase1 UNG (2x) ar System PCR Real-Time StepOnePlusTM (Cymhwysol BiosystemsTM), yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Perfformiwyd dadansoddiad data gan ddefnyddio mynegiant genynnau cymharol a werthuswyd gan ddefnyddio'r dull meintioli cymharol (Pfaffl, 2001). Yn seiliedig ar ddadansoddiad sefydlogrwydd, defnyddiwyd snRNA U6 a scaRNA U87 fel genyn cyfeirio. Gwerthuswyd yr holl feintoli cymharol gan ddefnyddio meddalwedd DataAssist, v 3.0, gan ddefnyddio'r dull ΔΔCT. mae data miRNA wedi'u cynhyrchu yn dilyn canllawiau MIQE [31].
BYDD CISTANCHE YN GWELLA SWYDDOGAETH YR AREN/ARRENAU
RT-qPCR o genynnau targed a ragwelirAr gyfer y synthesis cDNA, defnyddiwyd pecyn trawsgrifio cefn cDNA Capasiti Uchel (Life Technologies, UDA). Yr adweithiau RT-qPCR ar gyfer Bax, Bim, Caspase-3, Collagen 1, GDNF, PCNA, TGF -1, Bcl-2, Bcl-6, c-Myc, c Perfformiwyd -ret, cyclin A, Map2k2, PRDM1, Six-2, Ki-67, MTOR, -catenin, ZEB1, ZEB2, NOTCH1, ac IGF1 genyn gan SYBR Green Master Mix (Life Technologies, UDA) ) a ddarperir gan IDT1 Technolegau DNA Integredig (Tabl 1). Gwnaethpwyd yr adweithiau mewn cyfanswm cyfaint o 20 μL gan ddefnyddio 2 μL o cDNA (wedi'i wanhau 1:30), 10μL SYBER Green Master Mix (Life Technologies, USA), a 4 μL o bob paent preimio penodol (5 nM). Perfformiwyd ymhelaethu a chanfod gan ddefnyddio System PCR Amser Real StepOnePlusTM (Applied BiosystemsTM). Troswyd gwerthoedd Ct i werthoedd mynegiant cymharol gan ddefnyddio'r dull ΔΔCt gyda data metanephros epil wedi'i normaleiddio gyda GAPDH fel genyn cyfeirio [32].
Imiwnohistocemeg,Tynnwyd y ffetws (n {{0}} fesul grŵp) a'i osod ar unwaith mewn paraformaldehyde 4 y cant (ffosffad 0.1M, pH 7.4). Cafodd y deunyddiau eu dadhydradu, eu diaphanized, a'u cynnwys mewn paraplast, a thorrwyd y blociau yn adrannau trwch 5-μm. Cafodd adrannau histolegol eu dadbaraffinio a'u prosesu ar gyfer immunofluorescence a immunoperoxidase. Yr oedd yr adrannau
wedi'i ddeor â hydoddiant blocio (8 y cant o serwm buchol ffetws, 2.5 y cant o albwmin buchol, a 2 y cant o bowdr llaeth sgim yn PBS). Wedi hynny, wedi'i osod gyda'r prif wrthgorff (gwrth-Chwe-2) wedi'i wanhau mewn PBS sy'n cynnwys 1 y cant o laeth sgim dros nos o dan oergell. Ar ôl golchi gyda PBS, cafodd yr adrannau eu deor â gwrthgorff eilaidd penodol, wedi'i gyfuno â fflworoffor Alexa 488, wedi'i wanhau yn yr un byffer, yn cynnwys 1 y cant o laeth am 2 awr ar dymheredd yr ystafell. Ar ôl golchiadau olynol gyda PBS, gosodwyd y sleidiau gyda gorchuddion clawr gan ddefnyddio cyfrwng cydosod fflwroleuol Vectashield (Vector Laboratories, Inc. Burlingame). Canfuwyd y fflworoleuedd yn y sbesimen gan ficrosgopeg confocal laser. Cafwyd y delweddau gan ddefnyddio system Focus Imagecorder Plus. Ar gyfer y proteinau c-Myc, Ki-67, Bcl-2, TGF -1, - catenin, ZEB1, ZEB2, Caspase 3 hollt, cyclin A a WT1, perfformiwyd immunohistochemistry. Cafodd y sleidiau eu hydradu, ac ar ôl cael eu golchi yn PBS pH 7.2 am 5 munud, gwnaed yr adferiad antigenig gyda byffer citrate pH 6.0 am 25 munud yn y popty pwysau. Cafodd y sleidiau eu golchi mewn PBS. Yn dilyn hynny, perfformiwyd blocâd peroxidase mewndarddol gyda hydrogen perocsid a methanol am 10 munud yn y tywyllwch. Cafodd yr adrannau eu hail-olchi yn PBS. Yna dilynwyd blocio rhwymiad amhenodol, a deorwyd y sleidiau gyda hydoddiant blocio (powdr llaeth sgim 5 y cant, yn PBS) am 1 awr. Deorwyd yr adrannau gyda'r prif wrthgorff (Tabl 2), wedi'i wanhau mewn 1 y cant o BSA dros nos yn yr oergell. Ar ôl golchi gyda PBS, roedd yr adrannau'n agored i'r gwrthgorff eilaidd penodol am 2 awr ar dymheredd yr ystafell. Golchwyd y sleidiau gyda PBS. Datgelwyd y tafelli gyda DAB (3,3'- diaminobenzidine tetrahydrochloride, Sigma - Aldrich CO1, UDA). Ar ôl golchi dŵr rhedeg yn olynol, cafodd y sleidiau eu gwrth-staenio â hematocsilin, eu dadhydradu, a'u gosod â slip clawr, gan ddefnyddio Entellan1. Cafwyd y delweddau gan ddefnyddio'r ffotomicrosgop (Olympus BX51) neu confocal Zeiss LSM 780-NLO confocal ar ficrosgop Axio Observer Z.1 (Carl Zeiss AG, yr Almaen) gan y Sefydliad Cenedlaethol Gwyddoniaeth a Thechnoleg ar Ffotoneg Cymhwysol i Gell Bioleg (INFABIC) ym Mhrifysgol Talaith Campinas.
Meintioli morffolegParaffin 5 μmarendadansoddwyd adrannau gan ddefnyddio meddalwedd CellSens Dimension o ffotomicrosgop (Olympus BX51). Mae'rarencyrchwyd tafelli i ganfod yr ardal neffrogenig, CM ac UB protein a rhif cell, hematocsilin-eosin wedi'i staenio yn 17-ffetws DG LP(n=5) o'i gymharu â epil NP sy'n cyfateb i oedran (n=5) }}) o wahanol famau. Fe wnaethom feintioli'r holl CM ac UB o bob metaneffros a ddadansoddwyd (4NP a 4LP o wahanol famau), a pherfformiwyd dadansoddiad ystadegol trwy brawf-t, a mynegwyd y gwerthoedd fel cymedrig ± SD. Ystyriwyd y p�0.05 yn arwyddocaol. Defnyddiwyd GraphPad Prism v01 Software, Inc., UDA, ar gyfer dadansoddi ystadegol ac adeiladu ffigurau.
Dadansoddiad ystadegolDefnyddiwyd y prawf-t, a mynegwyd y gwerthoedd fel cymedr ± gwyriad safonol (SD). Ystyriwyd p�0.05 yn arwyddocaol. Defnyddiwyd meddalwedd GraphPad Prisma v. 01 (GraphPad Software, Inc., USA) ar gyfer dadansoddi ystadegol ac adeiladu ffigurau.
Canlyniadau
Mynegiad o miRNAs gan miRNA-SeqDeall y newidiadau microRNA sy'n gysylltiedig â phrotein isel yn y famarennolrhaglennu, gwnaethom berfformio dadansoddiad proffilio miRNA byd-eang. Nodwyd 44 miRNAs wedi'u dadreoleiddio (p � 0.05), ac roedd 19 a 25 miRNAs, yn y drefn honno, wedi'u rheoleiddio i fyny neu i lawr (Tabl 3). Nodwyd y miRNAs a fynegwyd uchaf a'u swyddogaethau, llwybrau, a rhwydweithiau gan ddefnyddio Meddalwedd Dyfeisgarwch (Tabl 4).
Dilysu mynegiant miRNAYn anifeiliaid y grŵp LP, cafodd Let{0}}a-5p, miR-181a-5p, miR-181c-3p eu huwchreoleiddio, tra bod y miR{6}}p, miR-144-3p, a miR-199a-5p wedi'u hisreoli o gymharu ag anifeiliaid NP. Nid yw'r canlyniadau'n dangos unrhyw wahaniaeth mewn mynegiant miR-298, gan gymharu'r ddau grŵp (Ffig 1). Datgelodd Tabl 5 y gwerthoedd a gafwyd trwy ddilyniannu miRNAs gyda'r data dilysu RT-qPCR. Er y gwelwyd gwahaniaeth mynegiant miRNA sylweddol mewn LP o'i gymharu â epil NP, roedd newid plyg (FC) y miRNAs dilysedig yn debyg i'r ddwy dechneg.
targedau miRNA-genyn
Nid oedd genynnau mynegiant targedau rhagfynegedig miRNA gwahanol megis Six-2, Bcl-2, PRDM1, cyclin A, PCNA, GDNF, Collagen 1, Caspase 3, a Bim yn LP yn wahanol iawn i NP ffetws. Fodd bynnag, cafodd mynegiant genynnau Bax, TGF -1 Bcl-6, c-ret, Map2k2, Ki-67, mTOR, -catenin, ZEB1, ZEB2, ac IGF1 eu huwchreoleiddio yn y mynegiant genynnau {{15} }}Grŵp DG LP o'i gymharu â rheolyddion sy'n cyfateb i oedran. I'r gwrthwyneb, roedd c-Myc, a NOTHC1 wedi'u hisreoli mewn epil mamol â chyfyngiad protein (Ffig 2).
Màs corff y ffetws a morffometreg metaneffrosNid oedd màs y corff 17-DG LP yn wahanol i'r epil NP sy'n cyfateb i oedran. Fodd bynnag, dangosodd metanephros mesenchyme LP ardal lai o 7.6 y cant a gostyngiad o 29 y cant yn nhrwch y cortecs na grŵp NP (Ffig 3).ImiwnohistocemegYn yr astudiaeth bresennol, dangosodd ffetws LP ostyngiad sylweddol (tua 69 y cant ) o fflworoleuedd cap Chwe -2 nag epil NP (Ffig 4).
Dangosodd y dadansoddiad imiwnoperoxidase Six{0}} ostyngiad yn nifer y celloedd (14 y cant ) yn LP CM o'i gymharu â 28 y cant gostyngedig Chwe-2 a chelloedd o'i gymharu ag ardal y cap o'i gymharu ag epil NP (Ffig 4). Mae'r astudiaeth bresennol hefyd yn dangos gostyngiad sylweddol y cant o c-Myc CM a chelloedd imiwnedd UB (llai 14 y cant) mewn LP o'i gymharu â epil NP (Ffig 4). Yn ogystal, roedd canran yr ardal â label Ki-67 yn CM 48 y cant yn llai mewn LP o'i gymharu â ffetws NP, tra nad oedd imiwn-adweithedd Bcl-2 a caspase holltedig-3 yn wahanol i'r ddau grŵp (Ffigs 5 a 6). Mae'r astudiaeth bresennol hefyd yn dangos gostyngiad sylweddol y cant o c-Myc CM a chelloedd imiwnedd UB (llai 14 y cant) mewn LP o'i gymharu â epil NP (Ffig 4). Yn ogystal, roedd canran arwynebedd Ki-67 wedi'i labelu yn CM 48 y cant yn llai mewn LP o'i gymharu â ffetws NP, tra nad oedd imiwn-adweithedd Bcl-2 a caspase holltedig-3 yn wahanol i'r ddau grŵp (Ffigs 5 a 6). Ar y llaw arall, yn LP, roedd yr ardaloedd â label CM ac UB -catenin wedi'u codi 154 a 85 y cant, yn y drefn honno, o'i gymharu â'r hyn sydd ar gael yn epil NP (Ffig 7). Ar yr un pryd, roedd dosbarthiad imiwn-adweithedd mTOR hefyd yn meddiannu ardal sylweddol fwy helaeth yn LP CM (139 y cant) ac UB (104 y cant) nag yn ffetws y NP (Ffig 7). Yn yr epil LP, cynyddodd y TGF -1 mewn staenio celloedd UBS (tua 30 y cant ), tra yn y CM, nid oedd y celloedd imiwnogaidd yn wahanol yn gysylltiedig â'r grŵp NP (Ffig 8). Gwellodd y metaneffros-staen ZEB1, a leolir yn y celloedd niwclei CM, 30 y cant yn LP o'i gymharu â ffetws NP (Ffig 8). Ar yr un pryd, roedd y immunofluorescence ZEB2, er ei fod yn bresennol mewn strwythurau metaneffros cyfan, yn debyg yn y ddau grŵp arbrofol (Ffig 8). Mae'r astudiaeth gyfredol, gan gymryd i ystyriaeth miRNA a mynegiant mRNA a phroteinau
Trafodaeth
Mae gwybodaeth am fecanweithiau cellog a moleciwlaidd nephrogenesis wedi cynyddu [33-37]. Fodd bynnag, mae llawer o ffactorau rheoleiddio a llwybrau signalau yn ymwneud â nhwarennolmae ontogenesis yn parhau i fod yn aneglur [38]. Mae miRNAs yn chwarae rhan hanfodol wrth reoleiddio mynegiant genynnau yn ystodarennoldatblygiad [25, 39–41]. Hyd y gwyddom, nid yw dadansoddiadau mynegiant miRNA ac mRNA mewn cymeriant LP mamol 17-gelloedd mesenchyme gwrywaidd DG wedi'u perfformio. Rydym yn cynnig mecanwaith moleciwlaidd newydd sy'n ymwneud ag atal nephrogenesis cynnar, gan arwain at lai o neffronau. Defnyddiasom NGS i werthuso mynegiant miRNA a chanfuwyd bod 19 miRNA wedi'u huwchraddio a 25 wedi'u dadreoleiddio yn 17-DG LP o gymharu â metaneffros NP. Ymhlith y 10 miRNAs dadreoleiddio uchaf, rydym yn dewis 7 miRNAs gyda thargedau biolegol sy'n ymwneud ag amlhau, gwahaniaethu, a apoptosis cellog. Datgelodd dadansoddiad data miRNA-Seq a TaqMan newidiadau cyson a phenodol mewn mynegiant miRNA mewn anifeiliaid LP o'i gymharu â rheoli anifeiliaid NP sy'n cyfateb i oedran.
Mae'r teulu miR{0}} yn cynnwys pedwar aelod tra chadwedig, sef miR-181a, miR-181b, miR-181c, a miR-181d [ 42]. Mewn celloedd neoplastig, mae miR-181a yn gweithredu fel atalydd tiwmor, gan atal ymlediad celloedd a mudo ac achosi apoptosis cellog [43]. Datgelodd yr astudiaeth hon fynegiad cynyddol o miR-181a{-5p yn 17-DG LP o gymharu â epil NP sy'n cyfateb i oedran. Er bod mynegiant mRNA caspase heb ei newid, mae cynnydd deublyg yn y gymhareb mRNA Bax/ Bcl-2 mewn LP o gymharu ag epil NP yn awgrymu bod mwy o apoptosis yn y CM, gan nodi bod apoptosis yn cael ei reoleiddio ar ôl trawsgrifio. Mae astudiaethau wedi dangos bod y teulu BCL yn hyrwyddo rhyddhau cytochrome o'r mitocondria ac yna'n atal actifadu Casp3, a thrwy hynny atal apoptosis cellog [44]. Mae Li et al. defnyddio model anaf i'r ysgyfaint acíwt i ddatgelu bod gorfynegiant miR-181a yn gysylltiedig â gostyngiad yn lefel protein Bcl-2; i'r gwrthwyneb, miR{19}}amhariad wedi cynyddu lefelau Bcl-2 [45]. Cadarnhaodd yr astudiaeth hon ganlyniadau Lv et al., a ddangosodd fod miR-181c yn rheoleiddio mynegiant mynegiant Six{-2 ac amlhau celloedd yn negyddol, yn gyfochrog â cholli ffenoteip celloedd mesenchymal yn ystodarendatblygiad yn LP 17-DG epil [25].
Mae Xiang et al. dangos bod mynegiant miR{0}} cynyddol yn atalarennolymlediad carsinoma, gan arwain at gyfnod G2/M byrrach. Ar ben hynny, mae Xiang et al. datgelwyd bod gorfynegiant miR-144 yn atal mynegiant genynnau mTOR a phrotein [46]. Nijland et al. dangos bod cynnydd mewn signalau mTOR yn hanfodol ar gyfer pennu nifer y neffronau mewn embryonau yr oedd eu mamau yn destun cyfyngiad maetholion [47]. Mae targed mamalaidd o gymhleth rapamycin 1 (mTORC1) yn hanfodol ar gyfer datblygiad embryo; fodd bynnag, mae sut mae'r cymhleth hwn yn rheoleiddio'r cydbwysedd rhwng twf a autophagy o dan amodau ffisiolegol a straen amgylcheddol yn parhau i fod yn anhysbys [48]. Felly, gall signalau mTOR fod yn gysylltiedig ag ymatebion cellog mewn anifeiliaid sy'n agored i gymeriant LP yn ystod beichiogrwydd; yn y canfyddiad, sefydlu, a therfynu autophagy; ac mewn ymateb i argaeledd maetholion mewngellol [46]. Yn ddamcaniaethol, yn ystod cyfyngiad protein difrifol, gall mynegiant llai o miR-144-3p fod yn gysylltiedig â mynegiant mTOR cynyddol, tua 139 y cant a 104 y cant mewn celloedd CM ac UB, yn y drefn honno, i wneud iawn am golli neffronau yn y {{{{). 11}} epil DG LP Chen et al. diffiniwyd miR-127 fel rheolydd newydd o heneiddedd celloedd trwy Bcl-6 [49]. Pan et al. adrodd bod tanfynegiant miR-127 yn cyd-fynd â chynnydd yn nifer y celloedd yng nghelloedd yr afu [50]. Dangosodd yr astudiaeth hon ostyngiad mewn amlhau celloedd a gostyngiad sylweddol yn nifer y celloedd sydd wedi'u labelu'n gadarnhaol ar gyfer Ki-67 yn CM anifeiliaid â chyfyngiad protein. Ar ben hynny, gwelwyd gostyngiad yn ardal neffrogenig a chynnydd mewn epil LP, a oedd yn gyson â chanlyniadau Menendez-Castro et al. mewn 8.4 y cant o epil â chyfyngiad protein [51, 52]. Felly, gallai mynegiad mRNA uwch Ki-67 a Bcl-6, ynghyd â mynegiant miR-127-3p llai yng nghap DG LP 17- fod yn gysylltiedig â mecanweithiau gwrth-reoleiddio i gynnal a chadw amlhau.
Mae Sun et al. dangos bod gorfynegiant miR-199a{{-5p yn lleihau amlhau celloedd systig ac yn achosi apoptosis, yn ogystal â rheoli'r gylchred gell [53]. Yn yr astudiaeth hon, mae mynegiant miR-199a-5p yn cael ei leihau yn 17-Mae DG LP yn cyd-fynd â thrawsgrifiad cynyddol Ki-67, marciwr amlhau cellog, a Map2k2 yn gysylltiedig ag adweithedd Ki-67 gostyngol yn LP 17-DG metanephros. Felly, mae diffyg maeth yn ystod beichiogrwydd yn hyrwyddo gwahaniaethu trwy fecanwaith ôl-drawsysgrifol. Yn nodedig, mae ein canlyniadau'n datgelu rôl ormesol blwch homeobox 1 rhwymo sinc-bys E (ZEB1), inducer EMT, sy'n cynnal lluosogrwydd bôn-gelloedd yn ystod gwahaniaethu bôn-gelloedd embryonig. -catenin yn hysbys i actifadu trawsgrifiad ZEB1 niwclear gan arwain at fynegiant ZEB1 [34]. Gall llwybr signalau TGF, un o'r llwybrau a astudiwyd orau, gymell EMT yn ystod datblygiad embryonig. Mae angen sawl ligand tebyg i TGF ar gyfer datblygiad embryonig. Fodd bynnag, nid yw holl effeithiau cyfryngol TGF ar EMT yn dibynnu ar ZEB1/2, gall celloedd taro allan ysgogi mynegiant y genynnau mesenchymal fibronectin a N-cadherin. Fodd bynnag, nid yw E-cadherin bellach yn cael ei isreoleiddio, ac mae ffibrau actin hefyd yn cael eu ffurfio [54]. Mae Karner et al. adrodd bod yn ystodarennoldatblygiad, y Wnt9b/ -catenin
Mae angen llwybr signalau, a fynegir yn yr UB a CM, ar gyfer adnewyddu a gwahaniaethu celloedd neffron progenitor, gan fod yn hanfodol ar gyfer ffurfio neffronau yn ystod embryogenesis [55]. Mae'r llwybr Wnt9b/ -catenin sydd wedi'i warchod yn esblygiadol yn chwarae rhan hanfodol wrth ddatblygu organau, meinweoedd, ac atgyweirio anafiadau mewn organebau plwrgellog. Dangosodd astudiaeth fod c-Myc yn darged trawsgrifiadol o -catenin, sy'n rheoleiddio amlder a gwahaniaethuarennolepitheliwm tiwbaidd [56]. Cynyddodd mynegiant -catenin ar lefel genyn a phrotein yn ystod y cyfnodau a astudiwyd oarennoldatblygiad yn 17-ffetws DG LP. Pan et al. adroddodd bod Myc yn cydweithredu â -catenin i hyrwyddo adnewyddu celloedd neffron progenitor [10]. Yma o'i gymharu â epil NP sy'n cyfateb i oedran, dangosodd LP fynegiant c-Myc is. Felly, efallai y bydd gan yr anifeiliaid hyn gronfa wrth gefn is o gelloedd adnewyddadwy sy'n angenrheidiol ar gyfer amlhau a goroesi a gallant adlewyrchu'r nifer llai o neffronau yn y model LP. Ar ben hynny,
Gall llwybrau signalau Wnt/ -catenin a Notch gydlynu rheoleiddio mynegiant Six-2 ac maent yn rhan o is-reoleiddio mynegiant Six-2 yng nghelloedd echdynnydd neffron. Mae astudiaethau wedi dangos y gallai fod angen lefelau isel o -catenin i gynnal mynegiant Chwe-2 a chelloedd epilydd CM yn y cyflwr diwahaniaeth; ar ben hynny, mae lefelau uchel o - catenin yn pennu tynged celloedd nephron progenitor [57, 58]. Felly, rydym yn damcaniaethu bod llai o signalau cMyc a Notch, ynghyd â mwy o fynegiant -catenin, wedi lleihau mynegiant Six-2 28 y cant yn epil 17-DG LP ac yn cydberthyn â gwahaniaethu celloedd CM cynnar a llai o fôn-gelloedd a rhif neffron yn oedolyn. Ar ben hynny, gall ein data gynnal, mewn celloedd MM epil LP, y gallai'r mynegiant Let-7a-5p a -catenin cynyddol a signal Notch gostyngol fodiwleiddio c-Myc, Six{-2, a mynegiant Ki{-67, gan arwain at leihad mewn hunan-adnewyddu celloedd epil. Mae disbyddiad y celloedd CM sy'n weddill yn arwain at ostyngiad yn niferoedd y neffron a datblygiad gorbwysedd arterial aarennolanhwylderau pan fyddant yn oedolion (Ffig 10). Yn gyson â chanlyniadau Boivin et al., mae ein canlyniadau'n dangos bod mwy o CM -catenin yn amharu ar dwf UB a nephrogenesis [59]. Mae astudiaethau wedi dangos bod ffactor twf ffactor niwrotroffig sy'n deillio o glial (GDNF), rheolydd hanfodol twf UB, yn signalau trwy'r derbynnydd tyrosine kinase c-Ret a chyd-dderbynnydd Gfra1 [60, 61]. Yn 17-Epil DG LP, arwyddocaol
byddai cynnydd mewn mRNA codio derbynyddion c-Ret yn ddamcaniaethol yn arwain at gynnydd mewn twf UB. Fodd bynnag, yn yr astudiaeth hon, nid oedd mynegiant GDNF wedi newid, sy'n awgrymu, er gwaethaf cynnydd mewn cRet mRNA, bod canghennog UB wedi'i leihau. Yn flaenorol, gwelsom ostyngiad o 28.3 y cant mewn canghennau blagur wreterig ar ôl 14.5 diwrnod o gyfyngiad protein yn ystod beichiogrwydd [4], a allai fod yn gysylltiedig â gostyngiad o 28 y cant mewn chwe -2 labelu celloedd MM, er gwaethaf dim newid yn GDNF trawsgrifiad. -catenin mae'n debyg yn rhyngweithio â'r derbynnydd c-ret ac yn cael ei gludo i gnewyllyn y gell UB, gan hyrwyddo mynegiant TGF -1 mewn celloedd epithelial, atal canghennu UB ac achosi gwahaniaethu cynamserol o gell epiliwr CM, fel y gwelir yn {{11} }Epil DG LP [62– 64]. Felly, efallai na fydd GDNF yn hanfodol wrth gyfryngu signalau mesenchymal i'r blaguryn wreterig; fodd bynnag, erys y mecanwaith i'w egluro. Yn wir, rydym wedi dangos bod MM o epil 17-DG LP wedi dangos cynnydd penodol mewn mynegiant Let-7 miRNA, gan arwain at nam sylweddolarendatblygiad, a thrwy hynny gadarnhau rôl fodiwlaidd y genynnau hyn yn amseriad datblygiadol nephrogenesis [65].
Mewn astudiaethau cychwynnol ffactor twf tebyg i inswlin (IGF), amlygwyd prif rolau IGF-1 a -2 mewn twf ffetws gan dystiolaeth helaeth, ond anuniongyrchol yn bennaf. Canfuwyd bod IGFs yn gweithredu fel ffactorau amlhau a gwahaniaethu mewn celloedd ffetws diwylliedig ac embryonau rhagblaniad. Ar ben hynny, canfuwyd bod IGFs yn cael eu cyfrinachu gan gelloedd ffetws diwylliedig ac ecsborion in vitro [66]. Gall ffactorau twf, gan gynnwys IGF, achosi trawsnewidiad epithelial-mesenchymal rhannol neu lawn. Mae actifadu llwybrau IGF yn arwain at uwchreoleiddio EMT trwy gymell mynegiant ZEB1 [67]. Er bod nifer o ffactorau twf ymgeiswyr yn gysylltiedig âarendatblygiad, ni wyddys a ydynt yn ymwneud â nephrogenesis. Efallai y bydd angen gwahanol ffactorau twf ar wahanol adegau. Gall rhai ffactorau twf fod yn ddiangen yn y cyd-destun hwn. Yn ystod datblygiad embryonig, mae angen rowndiau dilyniannol o EMT a MET i wahaniaethu rhwng mathau arbenigol o gelloedd a chreu strwythur tri dimensiwn. Yn yr astudiaeth hon, canfuwyd bod rhyng-droseddedd mesenchymal-epithelial yn cynnal plastigrwydd celloedd, gan awgrymu presenoldeb system anwythol iawn mewn amodau LP ar gyfer yr embryo. Mae mynegiant teulu Let-7 miRNA wedi'i astudio'n helaeth mewn meinweoedd ffetws amrywiol. Mae'r cynnydd mewn mynegiant Let-7 miRNA yn gysylltiedig â llai o amlhau a chynnydd cynnar o wahaniaethu celloedd MM, ac o ganlyniad, gostyngiad yn niferoedd neffron [27, 15, 68-71]. Mae mynegiant Let Higher-7 wedi'i ddangos mewn organebau uwch yn ystod cam olaf embryogenesis cerebral mewn cnofilod [72, 73]. Mae Nagalakshmi et al. datgelodd bod mynegiant Let-7 miRNA wedi newid tynged cell epithelial UB o ragflaenydd i gyflwr gwahaniaethol [71]. Mewn cyferbyniad, mae Yermalovich et al. dangos bod gorfynegiant Lin28b, protein sy'n rhwymo RNA, yn gysylltiedig â miRNAs Let-7 ataliol. Er bod lin28 a Let-7 yn rheolyddion amseru ontogenig mewn infertebratau, ni ddeellir rôl y rhain yn natblygiad organau mamaliaid [65]. Yn yr astudiaeth hon, gallai'r cynnydd mewn mynegiant Let-7a{-5p{-5p{-5p miRNA) yn y ffetws LP fod yn gysylltiedig â llai o ymlediad celloedd CM, gan beryglu nephrogenesis o'i gymharu â'r grŵp NP. Felly, rydym yn damcaniaethu y gall ataliad amlhau celloedd CM a rhoi'r gorau i nephrogenesis yn gynnar a achosir gan gynnydd mewn Let-7 miRNA ddigwydd yn uniongyrchol neu'n anuniongyrchol trwy fynegiant byrhoedlog Lin28b yn 17-DG LP. Gall yr effaith hon amharu'n sylweddolarendatblygiad yn 17-DG LP, gan gadarnhau bod y genyn hwn yn rheoleiddio amseriad datblygiadol yn ystod nephrogenesis. Yn yr astudiaeth hon, mae mwy o fynegiad Let-7a-5p miRNA yn cyd-fynd â gostyngiad mewn mynegiant c-Myc. Mae Myc yn ymwneud ag amlhau, twf, apoptosis, a gwahaniaethu celloedd yn ystodarennolorganogenesis [74-76]. Yn yr epil LP 17-DG, gostyngwyd mynegiant genynnau MM c-Myc, ac roedd ardal imiwn-adweithedd CM c-Myc 14 y cant yn llai o'i gymharu â'r ardal yn yr epil NP. Ar yr un pryd, sylwyd bod gostyngiad o 14 y cant yn nifer celloedd CM yn gostwng 48 y cant o imiwn-adweithedd Ki-67 mewn LP o'i gymharu â'r epil NP. Yn gyson, mae astudiaethau wedi dangos bod c-Myc yn chwarae rhan bwysig yng nghyfnod olaf canghennog UB ac wrth ysgogi amlhau celloedd progenitor CM [74].
BYDD CISTANCHE YN GWELLA HEINTIAD YR AREN/ARENAU
lefel is mewn bôn-gelloedd, gan eu cadw mewn cyflwr diwahaniaeth. Fodd bynnag, yn yr astudiaeth hon, mae mynegiant cryf o Let-7a-5p miRNA yn y mynegiant c-Myc wedi'i isreoleiddio CM, a thrwy hynny'n lleihau amlhau celloedd epil a gwahaniaethu celloedd cynnar yn y LP 17-DG epil (Ffig 10). Astudiaethau ar yarennauo lygod trawsgenig c-Myc datgelodd ostyngiad ar yr un pryd mewn celloedd CM imiwnopositif c-Myc a S-ix-2 sy'n gysylltiedig â llai o ymlediad bôn-gelloedd [74]. Mae'r astudiaeth hon yn dangos gostyngiad sylweddol (28 y cant ) mewn Chwe-2 cell bositif, penodolarennolmarciwr bôn-gelloedd, fel y gostyngiad a welwyd mewn niferoedd neffron, yn CM epil 17-DG LP o'i gymharu â'r epil NP. Yn 2009, roedd Fogelgren et al. dangos bod mynegiant genynnau Chwe-2 yn cael ei leihau yn ystod ontogenesis ffetws pan yn gysylltiedig â gostyngiad yn niferoedd neffron, gorbwysedd, a chronigmethiant arennol[77]. Felly, mae mynegiant genynnau llai o Chwe-2 mewn celloedd epilydd CM yn nodi ataliad gwahaniaethu a achosir gan signal yn ystodarennoldatblygiad yn yr epil 17-DG LP. Serch hynny, dylid bod yn ofalus wrth ddiswyddo - gall diffygion cynnil mewn nephrogenesis ddod i'r amlwg gyda dadansoddiad manylach neu o dan amodau gwahanol. Roedd lefelau mRNA IGF1 ar eu huchaf yn ystod y cyfnod cychwynnol o ddatblygiad metaneffrig, gyda thrawsgrifiadau'n cael eu canfod trwy'r MM, tra bod eu lefelau wedi gostwng yn ystod datblygiad pellach. Fodd bynnag, yn ystodarenembryogenesis, cydbwysedd cain rhwng ffactorau twf hwyluso neffron (IGF1) a ffactorau twf ataliol (TGF -1) yn rheoleiddio canghennog UB.
Casgliad
Er bod sawl awdur wedi astudio nephrogenesis [34, 37, 78], ychydig a wyddys am y mecanweithiau sy'n pennu niferoedd neffron. Mae'r astudiaeth hon yn dangos bod llawer o miRNAs celloedd epil MM, mRNAs, a phroteinau yn cael eu newid yn epil 17- DG LP, sy'n arwain at lai o amlhau a gwahaniaethu celloedd cynnar (Ffig 11). Mae'r cydbwysedd cain hwn rhwng adnewyddu epil neffron a gwahaniaethu yn hanfodol ar gyferarendatblygiad oherwydd bod methu â chyflawni niferoedd digonol o neffronau yn ffactor risg ar gyfer cronigarennolanhrefn.