Mae Detholiad Herba Cistanche yn Gwella Statws Glutathione Mitochondrial Ac Resbiradaeth mewn Calonnau Llygoden Fawr, Gyda Chynhyrchiad Posibl O Ddatgysylltu Proteinau

Rhagymadrodd

Mae atlifiad myocardiwm isgemig yn flaenorol yn achosi cyfres o newidiadau mitocondriaidd, gan gynnwys cynhyrchu mwy o rywogaethau ocsigen adweithiol (ROS), Ca2+gorlwytho, a dirywiad mewn cynhyrchu adenosine triphosphate (ATP), a gall pob un ohonynt arwain at farwolaeth celloedd trwy gyfrwng necrosis a/neu apoptosis (Redegeld et al., 1992; Lemasters et al., 1998). Gan fod mitocondria yn chwarae rhan hanfodol mewn penderfyniaethO ystyried tynged cardiomyocytes yn dilyn her isgemia/atlifiad (I/R), dylid felly targedu amddiffyniad rhag anaf I/R myocardaidd tuag at gadw cyfanrwydd adeileddol a swyddogaethol mitocondriaidd. Mae cynnal metaboledd egni mitocondriaidd ar ôl her I/R yn arbennig o bwysig oherwydd bod gweithrediad cyfangiad y galon bron yn gyfan gwbl yn dibynnu ar ATP a gynhyrchir gan mitocondria. Ychydig iawn o ddefnydd yw cardiomyocytes sy'n fyw ond nad ydynt yn crebachu.

TUBULOSA CISTANCHE NATURIOL AR GYFER GWELLA Imiwnedd PHGS75% ECH 30% DEDDF 12%

Herba Cistanche, y planhigyn sych cyfan oCistanche deserticolaMae YC Ma (Orobanchaceae), yn blanhigyn parasitig sy'n tyfu'n bennaf yn ardaloedd anialwch gogledd a gogledd-ddwyrain Tsieina. Mae Herba Cistanche, sydd wedi'i ddosbarthu fel perlysieuyn "Yang-fywiog" mewn meddygaeth Tsieineaidd, wedi'i ragnodi ar gyfer diffyg arennau, anffrwythlondeb benywaidd, a rhwymedd sy'n deillio o sychder y coluddyn mewn cleifion henaint (Chen, 1998). Mae astudiaethau blaenorol yn ein labordy wedi dangos bod methanoldetholiad o Herba Cistanchecynyddu capasiti cynhyrchu ATP myocardaidd (Leung & Ko, 2008) ac yn amddiffyn rhag anaf myocardaidd I/R mewn llygod mawr (Leung, 2006). Tra bod ysgogiad cynhwysedd cynhyrchu ATP yn gyfochrog â gwelliant mewn cludiant electronau mitocondriaidd (Leung & Ko, 2008), roedd amddiffyniad cardio rhag anaf I/R a roddwyd gan driniaeth Herba Cistanche yn gysylltiedig â gostyngiad mewn disbyddiad ATP myocardaidd (Leung, 2006). Yn yr astudiaeth bresennol, i ddiffinio rôl mitocondria yng ngweithrediad cardioprotective Herba Cistanche, fe wnaethom ymchwilio i effaith triniaeth Herba Cistanche ar statws glutathione mitocondriaidd, cynnwys Ca2+, potensial pilen, a chyfradd resbiradaeth, mewn calonnau llygod mawr. .

Defnyddiau a dulliau

Deunydd llysieuol

Prynwyd Herba Cistanche oddi wrth ddeliwr llysieuol lleol (yn seiliedig yn Hong Kong) (Lee Hoong Kee). Dilyswyd y perlysiau gan y cyflenwr a chafodd sbesimen taleb (HKUST00301) ei adneuo yn yr Adran Biocemeg, Prifysgol Gwyddoniaeth a Thechnoleg Hong Kong (HKUST). Cynhaliwyd echdyniad methanol o'r perlysiau, yn seiliedig ar astudiaethau blaenorol a ddangosodd fod echdyniad o'r fath yn gwella cenhedlaeth ATP mitocondriaidd ac yn amddiffyn rhag anaf I/R mewn calonnau llygod mawr (Leung, 2006; Leung & Ko, 2008). Yn gryno, cafodd Herba Cistanche (400 g) ei dorri'n ddarnau bach a'i dynnu trwy wresogi o dan adlif mewn 300mL o fethanol ar 60 gradd am 2 awr, fel y disgrifiwyd yn flaenorol (Leung & Ko, 2008). Ailadroddwyd y weithdrefn ddwywaith. Sychwyd y detholiad cyfun trwy anweddu'r toddydd dan bwysau llai; y cnwd oedd 42% (w/w) yn ymwneud â maint y llysieuyn crai. Roedd y darn yn cael ei storio ar 4 gradd nes ei ddefnyddio. Er bod perlysiau Tsieineaidd yn draddodiadol yn cael eu tynnu gan ddŵr i'w bwyta trwy'r geg, defnyddiwyd methanol yn ein hastudiaeth gynharach er hwylustod wrth brosesu a storio samplau (Yim & Ko, 2002), a chanfuom fod echdynnu methanol yn foddhaol ym mhob ffordd.

Gofal anifeiliaid a thriniaeth cyffuriau

Roedd llygod mawr Sprague-Dawley benywaidd llawndwf (8-10 wythnos oed; 200-230 g) yn cael eu cartrefu mewn ystafell a reolir gan leithder, gyda chylch tywyll / golau 12 awr, tua 22 gradd, ac yn caniatáu bwyd a dŵr ad libitum. Rhoddwyd anifeiliaid ar hap i wahanol grwpiau, gyda phum anifail ym mhob grŵp. Derbyniodd llygod mawr yDyfyniad Herba Cistancheyn fewngastrig ({{0}.2 g/mL mewn dŵr) ar 0.5g/kg neu 1.0 g/kg am 3 diwrnod yn olynol. Roedd anifeiliaid rheoledig (heb ei drin) yn derbyn dŵr yn unig. Pedair awr ar hugain ar ôl y dos olaf, cafwyd meinwe fentriglaidd y galon o anifeiliaid anestheteiddiedig ar gyfer dadansoddiad biocemegol. Cymeradwywyd pob protocol arbrofol gan y Pwyllgor Ymarfer Ymchwil, HKUST.

Paratoi ffracsiynau mitocondriaidd

Cafodd meinweoedd fentriglaidd briwgig y galon (~{{{0}}.6g) eu homogeneiddio mewn 10-plyg (w/v) gormodedd o glustogfa swcros oer-iâ [0.32M swcros, 1mM ethylene diamine asid tetraacetig (EDTA), 50mM Tris/HCl; pH 7.4] gan ddefnyddio homogenizer Teflon-gwydr, ar 4000 rpm, gyda 25-30 strôc. Paratowyd pelenni mitocondriaidd o homogenadau meinwe trwy allgyrchiad ar 800 × g ar 4 gradd am 30 munud, a phenderfynwyd purdeb trwy fesur gweithgareddau penodol cymharol succinate dehydrogenase a lactate dehydrogenase yn y supernatant a'r pelenni, yn y drefn honno, fel y disgrifiwyd yn flaenorol (Evans, 1992). Ataliwyd pelenni mitocondriaidd mewn 1ml o glustogiad homogeneiddio.

Roedd mesur mitocondriaidd yn lleihau lefelau glutathione a glutathione ocsidiedig

Pennwyd lefelau glutathione gostyngol mitocondriaidd (GSH) yn ensymatig gan ddefnyddio 5,59-dithiobis(2- asid nitrobenzoig) (DTNB) a glutathione reductase (GR), mewn protocol a addaswyd o Griffith (198{{17}). }). Cymysgwyd aliquot (210 µL) o'r ffracsiwn mitocondriaidd gyda 90 µL o 10 % (v/v) 5-asid sylffosalicylic (SSA) a'r canolwyd y gymysgedd ar 600 × g am 10 munud. I fesur lefelau glutathione ocsidiedig (GSSG), cymysgwyd symiau 100µL o supernatants SSA â 10 µL o 20% (w/v) 2-vinylpyridine a 10 µL 60% (v/v) triethanolamine mewn tiwbiau microfuge. Caniatawyd i bob tiwb sefyll ar dymheredd ystafell am o leiaf 1 awr. Cafodd cymysgedd adwaith sy'n cynnwys 0.63mM DTNB a 0.053mM NADPH (ffosffad dinucleotid adenine nicotinamid gostyngol) mewn byffer ffosffad (0.1M, gyda 5mM Na2 EDTA; pH7.5) ei ddeor ymlaen llaw ar 30 gradd am 2 funud. Ychwanegwyd aliquot (30 µL) o naill ai uwchnatydd sampl SSA (cyfanswm glutathione) neu sampl GSSG at ffynnon o 96-blat microtiter ffynnon, a 180 µL o gymysgedd adwaith wedi'i gynhesu ymlaen llaw, yn cynnwys 0.525U/ mL GR, ychwanegwyd nesaf. Cafodd newidiadau amsugno ar 412nm eu ​​monitro'n sbectroffotometrig am 5 munud. Amcangyfrifwyd y crynodiadau o GSH a GSSG o gromliniau graddnodi gan ddefnyddio GSH a GSSG [hydoddwyd mewn 3% (w/v) SSA] fel safonau a'u mynegi fel protein nmol/mg. Amcangyfrifwyd lefelau GSH trwy dynnu dwywaith swm y GSSG o gyfanswm GSH.

TUBULOSA CISTANCHE NATURIOL AR GYFER GWELLA SWYDDOGAETH RHYWIOL PHGS75% ECH 30% DEDDF 12%

Mesur cynnwys Ca2+ mitocondriaidd

Mesurwyd cynnwys Mitochondrial Ca{{{0}} gan ddefnyddio chwiliwr fflworoleuedd sensitif Ca2+-, Fluo-5ester N AM (Molecular Probes, Eugene, OR) sy'n defnyddio'r Rhifydd Aml-Label Victor2 (Model 1420; PerkinElmer, Turku, y Ffindir), fel y disgrifir yn Menze et al. (2005). Cafodd cysonion daduniad Ca2+ (gwerthoedd Kd) eu pennu gan ddefnyddio pecyn graddnodi Ca2+ sy'n ddilys yn yr ystod crynodiad 1–1000 µM; gwerthoedd Kd amcangyfrifedig oedd 90–100 µM, gyda dibynadwyedd uchel, yn ôl data gwneuthurwr y cit. Cymysgwyd aliquot (25µL) o'r ffracsiwn mitocondriaidd (crynodiad terfynol 0.5mg o brotein/mL) â byffer deor 25 µL {100mM KCl a MOPS 30mM [3-(N-morpholino)propanesulfonic acid]; pH7.2} mewn 96-plât microteitr du ffynnon. Deorwyd y gymysgedd ar 25 gradd am 15 munud; Yna ychwanegwyd 25 µL digitonin (50 µg/mL) a 25 µL Ffliw-5N AM ester (1 µM mewn 0.005% (w/v) Pluronig F-127). Trwy hwyluso treiddiad pilen, roedd digitonin yn cyfryngu mynediad mitochondrial o liw fflwroleuol. Gwelsom fod lefelau N ffliw mewn paratoadau mitocondriaidd calon llygod mawr wedi cynyddu 20-plyg ym mhresenoldeb digitonin. Deorwyd cymysgeddau adwaith ar 25 gradd am 30 munud, a mesurwyd darlleniadau fflworoleuedd ar donfedd cyffro o 488nm a thonfedd allyriadau o 532nm. Amcangyfrifwyd cynnwys Mitocondriaidd Ca2+ gan ddefnyddio cromlin raddnodi a'i fynegi fel protein µmol/mg.

Mesur potensial pilen mitocondriaidd

Aseswyd potensial bilen (ΔΨm) trwy ddull a addaswyd o ddull Bonavita et al. (2003). Cafodd aliwquots (50 µL) o ffracsiynau mitocondriaidd (wedi'u haddasu i 1mg o brotein/mL) eu deor ar 37 gradd gyda 50 µL o hydoddiant swbstrad (yn cynnwys pyrwfad 6mM a 6mM malate), 25 µL o hydoddiant adenosine diffosffad (ADP) wedi'i drin ymlaen llaw (ADP) 3 a 25 µL o 3 µM JC-1, yn y tywyllwch. Cafwyd y gwerthoedd ΔΨm trwy fesur fflworoleuedd ar 535nm (FL1) yn erbyn 580nm (FL2), gan ddefnyddio'r Cownter AmlLabel Victor2. Mae JC-1 yn ffurfio agregau mewn mitocondria, gan arwain at werthoedd fflworoleuedd FL2 uchel ac yn dynodi potensial mitocondriaidd arferol. Mae colli ΔΨm yn arwain at leihad mewn fflworoleuedd FL2 (cyfansymiau JC-1 i raddau llai) a chynnydd cydredol mewn fflworoleuedd FL1 (o fonomerau JC-1). Mynegwyd data fel cymarebau gwerthoedd fflworoleuedd FL1/FL2. Defnyddiwyd carbonyl cyanid m-clorophenylhydrazone (CCCP), asiant cwympo ΔΨm, i ddilysu'r assay.

Mesur resbiradaeth mitocondriaidd

Mesurwyd cyfradd resbiradaeth mitocondriaidd ar 37 gradd gan ddefnyddio offeryn Hansatech Oxygraph-Plus gyda electrod ocsigen tebyg i Clark (Sarasota, FL, UDA). Ataliwyd ffracsiynau mitocondriaidd (0.6mg protein/mL) mewn byffer resbiradaeth yn cynnwys 125mM KCl, 20mM MOPS, 10mM Tris, 0.5mM ethylene glycol asid tetraacetig (EGTA), a 2mM KH2 PO4; pH 7.2. Ar ôl deori ar 37 gradd am 2 funud, derbyniodd pob sampl hydoddiant swbstrad 50 µL (5mM pyruvate a 5mM malate). Mesurwyd cyfraddau resbiradaeth ym mhresenoldeb (Cyflwr 3) ADP 1mM ac ar ôl ffosfforyleiddiad o'r holl ADP i ATP (Cyflwr 4). Cymhareb cyfraddau resbiradaeth Talaith 3:State 4 yw'r mynegai rheolaeth resbiradol, sy'n dangos pa mor dynn yw'r cyplu rhwng resbiradaeth a ffosfforyleiddiad (Javadov et al., 2005; Kuwabara et al., 1997). Cyn ychwanegu datrysiad swbstrad, mesurwyd cyfradd resbiradaeth Gwladwriaeth 1 hyd nes cychwyn resbiradaeth y Wladwriaeth 2, ac amcangyfrifwyd cyfradd resbiradaeth Gwladwriaeth 2 cyn ychwanegu ADP.

Dadansoddiad ystadegol

Dadansoddwyd data trwy ddadansoddiad un ffordd o amrywiant (ANOVA) ar gyfer cymariaethau grŵp lluosog. Defnyddiwyd gwerthoedd gwahaniaeth lleiaf arwyddocaol (LSD) i nodi gwahaniaethau arwyddocaol rhwng y ddau grŵp pan oedd gwerthoedd p < 0.05.

TUBULOSA CISTANCHE NATURIOL AR GYFER GWELLA SWYDDOGAETH RHYWIOL PHGS75% ECH 30% DEDDF 12%

Canlyniadau

Fel y dangosir yn Ffigurau 1 a 2, triniaeth â methanoldetholiad o Herba Cistanche({{0}}.5 neu 1.0g/kg/day×3) gwella statws glutathione mitocondriaidd yn sylweddol mewn calonnau llygod mawr, fel y dangosir gan gynnydd dibynnol dos mewn lefelau GSH (11–30%) a gostyngiadau mewn Lefelau GSSG (31%).

Gostyngodd triniaeth Herba Cistanche lefelau Ca2+ mitocondriaidd yn ddibynnol ar ddosau mewn calonnau llygod mawr o gymharu â rheolyddion; roedd y gyfradd atal yn 41% ar ddogn o 1.0 g/kg (Ffigur 3).

Cynyddodd triniaeth Herba Cistanche ΔΨm mitocondriaidd, fel y dangosir gan ostyngiad (14-16%) yn y gymhareb FL1/FL2. Achosodd CCCP (100 µM) gwymp ΔΨm, fel y dangosir gan gynnydd yn y gymhareb FL1/FL2 (Ffigur 4).

Triniaeth Herba Cistancheresbiradaeth mitocondriaidd gwell, fel y dangosir gan gyfradd sylweddol uwch o resbiradaeth Cyflwr 3 (84%) mewn anifeiliaid prawf o gymharu â rheolaethau (Tabl 1). Cynyddwyd lefelau resbiradaeth Talaith 2 a Gwladwriaeth 4 47 a 80%, yn y drefn honno, ond cafodd ysgogiad resbiradaeth Gwladwriaeth 4 ei atal yn llwyr gan 1mM guanosine-5'-diphosphate, atalydd dadgyplu protein 2/3. Nid oedd triniaeth Herba Cistanche yn effeithio ar y mynegai rheolaeth resbiradol, fel yr amcangyfrifir gan gymhareb cyfraddau anadliad Talaith 3 / Talaith 4.

Trafodaeth

Roedd mitocondria wedi'i ynysu o galonnau llygod mawr a driniwyd gan Herba Cistanche yn dangos statws glutathione uwch, fel y nodir gan lefelau GSH uwch a lefelau GSSG gostyngol. Mae cynnal statws rhydocs mitocondriaidd glutathione yn hanfodol ar gyfer amddiffyniad cardio rhag anaf I/R (Chiu & Ko, 2003). Mae cynnwys Ca2+ Sytosolig yn cynyddu yn ystod isgemia myocardaidd, drwy dderbyniad gan uniporter y bilen fewnol Ca2+ (Ataka et al., 1992; Grover et al., 1990), gan arwain at Ca{{6} mitocondriaidd } croniad. Mae ein canlyniadau'n dangos bod triniaeth gyda detholiad Herba Cistanche wedi gwella statws rhydocs mitocondriaidd glutathione a gostwng lefel Ca2+ mitocondriaidd, a allai roi amddiffyniad rhag anaf I/R myocardaidd (Leung, 2006). Gall anallu triniaeth Herba Cistanche, ar ddogn uwch o 1.0 g/kg, i ostwng lefelau GSSG a Ca2+ ymhellach, fod yn gysylltiedig â bodolaeth mecanwaith rheoleiddio hunangyfyngol sy'n effeithio ar botensial rhydocs glutathione a statws calsiwm. mewn mitocondria.

Mae mitocondria yn cynhyrchu graddiant proton electrocemegol ar draws y bilen fewnol, trwy gludo electronau. Defnyddir y graddiant hwn gan ATP synthase i ffosfforyleiddio ADP i ATP. Mae potensial llai o bilen mitocondriaidd, fel yn achos hypocsia/reoxygenation ar ôl anafu cardiomyocytes diwylliedig (Chiu et al., 2008), yn arwain at ostyngiad yn y genhedlaeth ATP. Mae triniaeth Herba Cistanche, a all gynyddu potensial pilen mitocondriaidd myocardaidd, o bosibl yn gwella cenhedlaeth ATP, yn enwedig yn ystod atglifiad ôl-isgemig. Unwaith eto, gall bodolaeth mecanwaith rheoleiddio hunan-gyfyngol esbonio pam nad yw effeithiau triniaeth Herba Cistanche ar botensial pilen mitocondriaidd yn ddibynnol ar ddos.

Cynyddodd triniaeth Herba Cistanche gyfradd resbiradaeth Talaith 3 yn fawr mewn mitocondria calon llygod mawr, fel yr aseswyd gan y defnydd o ocsigen. Mae'r canfyddiad hwn yn gyson â chanlyniadau a gafwyd o fesuriadau in vitro a situ o gapasiti cynhyrchu ATP mitocondriaidd (Leung & Ko, 2008). Yn ddiddorol, er bod triniaeth Herba Cistanche wedi lleihau lefel cyflwr cyson ATP myocardaidd (data heb ei ddangos), fe wnaeth y driniaeth wella cenhedlaeth ATP mitocondriaidd. Gall cynnwys resbiradaeth heb ei gyplysu esbonio'r arsylwadau anghyson hyn. Mae ffosfforyleiddiad ocsideiddiol heb ei gyplu yn digwydd pan symudir protonau ar draws y bilen fewnol mitocondriaidd yn ôl i'r matrics mitocondriaidd, gan wasgaru potensial y bilen a ffurfiwyd gan y gadwyn cludo electronau. Mae hyn yn arwain at ostyngiad yn y grym proton-ysgogol sy'n gyrru ffurfiant ATP (Garvey, 2003). O ganlyniad, mae crynodiad Ca2+ a chynhyrchiad ROS mewn mitocondria wedi'u gwanhau'n sylweddol (Teshima et al., 2003). Mae'r awgrym hwn yn gyson â chanlyniadau'r astudiaeth bresennol, a ddangosodd ostyngiad yn lefelau Ca2+ mitocondriaidd mewn calonnau sy'n cael eu trin gan Herba Cistanche. O ran resbiradaeth heb ei gyplu, gall triniaeth Herba Cistanche achosi synthesis o broteinau dadgyplu (UCPs). Mae'n hysbys bod UCPs yn datgysylltu ffosfforyleiddiad ocsideiddiol, ac mae mynegiant UCP1 mewn calonnau llygod trawsenynnol wedi'i ddiogelu rhag niwed myocardaidd a achosir gan I/R (Hoerter et al., 2004). Ataliwyd effaith dadgyplu UCPs gan niwcleotid purin diffosffad a thriffosffadau (fel ADP, ATP, diphosphate guanosine (GDP), a GTP) (Echtay et al., 2002). Yn yr astudiaeth bresennol, mesurwyd paramedrau mitocondriaidd megis potensial pilen a chyfradd resbiradaeth ym mhresenoldeb ADP (fel swbstrad); roedd effaith datgysylltu UCPs felly yn cael ei atal. Fodd bynnag, pan fesurwyd cyfradd resbiradaeth Mitocondriaidd Gwladwriaeth 4 yn absenoldeb ADP, roedd y gyfradd hon yn uwch mewn mitocondria a baratowyd o galonnau wedi'u trin gan Herba Cistanche nag yng nghalonnau rheolyddion heb eu trin. Mae cyfradd resbiradaeth Cyflwr 4 yn adlewyrchu'r defnydd o ocsigen gan mitocondria pan fydd protonau'n gollwng yn ôl i'r matrics mitocondriaidd trwy fecanwaith nad yw'n cynnwys F1 F0 -ATPase (Garvey, 2003). Mae cyfranogiad posibl UCPs yn y cynnydd a achosir gan Herba Cistanche mewn resbiradaeth Cyflwr 4 yn cael ei gefnogi gan y canfyddiad bod y gwelliant hwn wedi’i atal gan GDP (Bento et al., 2007).

I gloi, gall triniaeth gyda Herba Cistanche wella statws glutathione mitocondriaidd, gostwng lefel Ca2+ mitocondriaidd, a chynyddu potensial pilen mitocondriaidd a chyfradd resbiradaeth mewn calonnau llygod mawr. Gall gwella statws glutathione mitocondriaidd a gallu swyddogaethol, ac ymsefydlu tybiedig UCPs, fod yn gysylltiedig â'r amddiffyniad cardio a roddir ganTriniaeth Herba Cistanchear ôl anaf I/R.

PLANHIGION CISTANCHE TUBULOSA NATURIOL DYFYNIAD CISTANCHE PHGS75% ECH 30% DEDDF 12%