Sut Mae Trawsnewid Ffactor Twf B1(TGF 1) yn Effeithio Ffibrosis yr Arennau

am ragor o wybodaeth:ali.ma@wecistanche.com

Mae atal trawsnewid signalau ffactor twf b1 mewn celloedd rhyng-stitaidd preswyl yn gwanhau mynegiant genynnau probrotig ac yn cadw cynhyrchiad erythropoietin yn ystod ffibrosis yr arennau arbrofol mewn llygod

Michaela AA Fuchs, Katharina AE Broeker & et al.

Ffibrosis yr arennauyn cael ei nodweddu gan ddatblygiad myofibroblasts sy'n tarddu o arennau preswyl a chelloedd mewnfudo. Mae ffurfio myofibroblast a chynhyrchu matrics allgellog yn ystod niwed i'r arennau yn cael eu sbarduno gan amrywiol cytocinau. Ymhlith y rhain,trawsnewid ffactor twf B1(TGF 1) yn cael ei ystyried yn sbardun canolog ar gyferffibrosis yr arennau. Daethom o hyd i fynegiad hynod o uwch-reoledig o TGF 1(trawsnewid ffactor twf B1)a mRNAs derbynnydd TGF 2 (TGF -R2) mewn celloedd interstitial arennau mewn arbrofolffibrosis. Yma, buom yn ymchwilio i gyfraniad TGF 1(trawsnewid ffactor twf B1) signalau yng nghelloedd rhyng-raniadol yr arennau preswyl i ffibrosis yr organau gan ddefnyddio modelau neffropathi a achosir gan adenin ac achludiad wreterol unochrog mewn llygod. I'r perwyl hwn amharwyd ar signalau TGFB1 gan ddileu anwythadwy o'r genyn TGF -R2 mewn celloedd rhyng-ranol sy'n mynegi'r marciwr ffibroblast, ffactor twf sy'n deillio o blatennau derbynnydd-B. Gwanhawyd mynegiant genynnau probrotig hyd at 50 y cant mewn arennau heb TGF -R2 mewn celloedd positif ar gyfer derbynnydd ffactor twf sy'n deillio o blatennau-B. Yn ogystal, roedd dileu TGF -R2 yn atal dirywiad cynhyrchiad erythropoietin mewn arennau wedi'u clymu â wreter. Yn nodedig, ni newidiwyd mynegiant sy'n gysylltiedig â ffibrosis o actin cyhyr x-llyfn fel marciwr myofibroblast a dyddodion o golagenau allgellog mewn llygod gan ddileu TGF -R2 wedi'i dargedu. Felly, mae ein canfyddiadau yn awgrymu effaith gynyddol TGF 1(trawsnewid ffactor twf B1)signalau mewn celloedd rhyng-raniadol preswyl sy'n cyfrannu at fynegiant genynnau probrotig a dadreoleiddio cynhyrchiad erythropoietin ond nid at ddatblygiad myofibroblastau yn ystodffibrosis yr arennau.

Cliciwch i fuddion iechyd powdr cistanche ar gyfer clefyd yr arennau

Mae datblygiad a dilyniantffibrosis yr arennauyn nodwedd o glefyd cronig yn yr arennau. Mae'n cael ei ystyried yn gyffredin o ganlyniad i fwy o gynhyrchu a dyddodiad o broteinau matrics allgellog (ECM) fel colagenau, ffibronectin, neu denascinau. Parhausffibrosis yr arennauyn arwain at ddirywiad cynyddol o swyddogaeth glomerwlaidd a thiwbaidd a hefyd yn cyfyngu ar swyddogaethau endocrin yr arennau gan arwain at gynhyrchu erythropoietin (EPO) yn annigonol gan arwain at anemia.-y

Ymhlith y cytocinau a'r ffactorau signalau sy'n gysylltiedig â chlefyd yr arennau affibrosisdilyniant,trawsnewid ffactor twf 1(TGF 1) wedi'i astudio mewn model amrywiol.6.0-1 TGF 1(trawsnewid ffactor twf B1)yn clymu i dderbynnydd TGF 2 (TGF -R2). Mae ffurfio cymhleth heteromerig gyda derbynnydd TGF 1 yn hanfodol ar gyfer actifadu mewngellol y rhaeadru signalau SMAD. i.1-18 Mewn arennau wedi'u difrodi, mynegiant cynyddol o TGF 1(trawsnewid ffactor twf B1)mRNA mewn gwahanol fathau o gelloedd arennau wedi'i adrodd.1517,19-2lRôl bwysigTGF 1 ynarenffibrosishefyd wedi'i amlinellu o'r canfyddiadau bod gweinyddu TGF alldarddol 1(trawsnewid ffactor twf B1)yn gallu cymellffibrosis yr arennaua bod TGF 1(trawsnewid ffactor twf B1)gall gwrthgyrff wanhau a achosir gan arbrawfffibrosis,10.22-24Yn ogystal, mae dileu genetig Smad2 neu 3, yr effeithyddion mewngellol ar gyfer TGF -R2, wedi dangos effeithiau cadarnhaol ar ddatblygiadffibrosis.1,1

Mae mynegiant TGF -R2 wedi'i adrodd mewn llawer o fathau o gelloedd, gan gyfyngu ar union werth addysgiadol y canfyddiadau a gafwyd gydag ymyrraeth gyffredinol TGF 1 byd-eang(trawsnewid ffactor twf B1)signalau. Gall hyn hefyd esbonio rhai o'r adroddiadau dadleuol yn y blynyddoedd diwethaf.1.1.2 TGF 1(trawsnewid ffactor twf B1)hefyd wedi cael ei adrodd i hyrwyddoaren ffibrosistrwy wella ymdreiddiad macroffagau, a all drawswahaniaethu i myofibroblasts.

Fodd bynnag, rôl ganolog TGF 1(trawsnewid ffactor twf B1)mewnarenffibrosisei herio yn ddiweddar gan y canfyddiad bodarenffibrosisnid yw'n cael ei leihau trwy rwystro TGF 1(trawsnewid ffactor twf B1)signalau mewn celloedd sy'n cynhyrchu proteinau matrics yn weithredol. Mae wedi'i hen sefydlu bod y cynhyrchiad cynyddol o broteinau matrics yn deillio'n bennaf o myofibroblastau, a all drawswahaniaethu o sawl math o gelloedd gan gynnwys ffibroblastau, monocytes, pericytes, a chelloedd tiwbaidd ac endothelaidd.6,10,2-32 Cyfraniad cymharol gall y mathau hyn o gelloedd i'r boblogaeth myofibroblast amrywio yn dibynnu ar y model arbrofol. Serch hynny, y consensws cynyddol yw mai ffibroblastau preswyl, pericytes, a chelloedd sy'n deillio o fêr esgyrn yw'r prif ragflaenwyr myofibroblasts yn yr aren ac yn cyfrannu atarenffibrosismewn cyfran debyg..102933-35 Mae ffibroblastau preswyl a phericytes yn mynegi'r derbynnydd ffactor twf sy'n deillio o blatennau (PDGFR- ) ac maent yn un o'r rhai mwyaf,31,36. Mae astudiaeth ddiweddar hefyd nifer o fathau o gelloedd yn yr aren. cadarnhau celloedd PDGFR- f fel y prif ragflaenwyr ar gyfer myofibroblastau mewn arennau dynol. Mae'r celloedd PDGFR- f hyn hefyd yn cynnwys yr holl gelloedd arennau sy'n gallu cynhyrchu EPOs,-9

Arennau ffibrosisyn gysylltiedig â gallu llai o'r arennau i gynhyrchu EPO.-,3,0 Er nad yw'r rhesymau dros hyn wedi'u datrys yn glir, credir bod trawsnewid celloedd PDGFR-plws interstitial yn myofibroblastau yn mynd yn ei flaen. law yn llaw â cholli eu gallu i gynhyrchu EPO. Yn wyneb rôl fawr celloedd PDGFR-B rhyngosodol fel cynhyrchwyr EPO brodorol ac fel rhagflaenwyr myofibroblasts, roedd gennym ddiddordeb mewn diffinio rôl TGF 1(trawsnewid ffactor twf B1)signalau yn y boblogaeth gell hon.

I'r nod hwn, gwnaethom gynhyrchu model llygoden gyda dileu TGF -R2 mewn celloedd PDGFR-plws y gellir ei thamoxifen (PDGFR- CeERT7 ynghyd â TGF -R2 /, y cyfeirir atynt o hyn ymlaen fel llygod TGF -R2ko). Ar ôl dileu TGF(trawsnewid ffactor twf)-R2 yn PDGFR- ynghyd â chelloedd mewn llygod llawndwf, astudiwyd anifeiliaid mewn 2 fodel arbrofolarenffibrosis: achludiad wreterol unochrog (UUO) a neffropathi a achosir gan adenin (AN). Mae neffropathi a achosir gan adenin yn fodel difrod cronig gyda thebygrwydd cryf â phatholegau a achosir gan grisialau dynol, tra bod UUO yn fodel difrod acíwt ar gyfer straen mecanyddol.2933,42- Gan ddefnyddio'r dull hybrideiddio RNAscope in situ hynod benodol, caniatawyd cydleoli mRNAs targed a marciwr i lawr i gydraniad un gell. Yn y modelau patholegol hyn, archwiliwyd effeithiau dileu TGFB-R2 mewn PDGFR- fcells ar fynegiant cyhyr d-llyfn actin (a-SMA) fel marciwr ar gyfer ffurfio myofibroblast. Ymhellach, fe wnaethom ymchwilio i fynegiant genynnau probrotig a dyddodiad ECM. Gallu'r arennau i gynhyrchu EPO mewn cyflwr arbrofolaren ffibrosisei werthuso gan fesuriadau o lefelau EPO plasma a nifer a lleoleiddio celloedd EPO-mynegi mRNA mewn arennau wedi'u difrodi.

DULLIAU

Anifeiliaid

Cynhyrchwyd llygod TGF -R2lo gan lygod croesfridio PDGFR- cexr2 (mynegiad Cre recombinase tamoxifen-inducible o dan reolaeth hyrwyddwr PDGFR-; stoc JAX #029684) a mic gyda TGF â ffranc loxP6- alelau R2 (stoc IAX #012603) mewn cefndir cymysg C57BJ/6 a 129S1/SvmJ."Ar gyfer olrhain llinach, dehonglir gohebydd fflworoleuol dwbl mT/mG(B6129(G)-Gt(ROSA)26Sorm4AcCTB-dromute.IGFLm/); Cafodd stoc JAX #007676) ei fridio i mewn i lygod TGF -R2ko.Cyflawnwyd genoteipio gan ddefnyddio'r paent preimio a restrir yn Nhabl 1. Defnyddiwyd Littermau negatif ar gyfer Cre fel anifeiliaid rheoli.Cadw anifeiliaid ar gow cnofilod safonol (0.6 y cant NaCl; Ssniff)yn rhad ac am ddim mynediad i ddŵr tap Perfformiwyd yr holl arbrofion anifeiliaid yn unol â'r Canllaw ar Ofal a Defnyddio Anifeiliaid Labordy a gyhoeddwyd gan Sefydliadau Iechyd Cenedlaethol yr Unol Daleithiau ac a gymeradwywyd gan y pwyllgor moeseg lleol.

Triniaeth tamoxifen

Ysgogwyd ailgyfuniad cre trwy fwydo diet yn cynnwys 400 mg o tamoxifen sitrad fesul cilogram (A115T00404, Sniff) am 4 wythnos ac yna cyfnod o 3-wythnos gyda chow safonol. Cadarnhawyd toriad y genyn TGF-R2 wedi'i flocio gan adwaith cadwyn polymeras,

Neffropathi a achosir gan adenin

Adenine a achosirffibrosisei gynhyrchu mewn llygod oedolion. Ar ôl triniaeth tamoxifen a'r cyfnod gorffwys canlynol, cafodd llygod gwrywaidd eu bwydo â diet yn cynnwys adenin (0.2 y cant) yn barhaus am 3 wythnos. Perfformiwyd arbrofion ar ôl union 3 wythnos (3-wythnos adenine).

Croesrywio yn y fan a'r lle trwy RNAscope

Astudiwyd lleoleiddio mynegiant mRNA gyda'r pecyn RNAscope Multiplex Fluorescent v2 (Advanced Cell Diagnostics ACD) yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Roedd yr arennau'n cael eu gosod ar ddalifiad gyda hydoddiant fformalin wedi'i glustogi o 10 y cant, wedi'i ddadhydradu mewn cyfres ethanol, ac wedi'i fewnosod mewn paraffin. Canfuwyd signalau hybrideiddio ar waddodion meinwe 5-μm gan ddefnyddio fflworofforau TSA Plus Cy3 a Cy5(PerkinElmer). Cafodd tafelli eu gosod gyda ProLong Gold Antifade Mountant (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) a'u gweld gyda microsgop Axio Observer Z1 (Zeiss). Roedd rheolaethau cadarnhaol a negyddol yn cael eu hamgáu fel mater o drefn. Mae stilwyr RNAsape wedi'u rhestru yn Nhabl 2

Tabl 1|Dilyniannau primer a ddefnyddir ar gyfer genoteipio llygod

CANLYNIADAU

TGF 1(trawsnewid ffactor twf B1)a TGF(trawsnewid ffactor twf)-R2 mynegiant mewn celloedd interstitial yn cael ei wella yn ystod clefyd yr arennau arbrofol

Lleoli mynegiant mRNA TGFB1 a TGFB-R2 yn yr aren o dan amodau gwaelodol ac yn ystod arbrofolffibrosisei pherfformio gan RNAscope hybridization in situ. O dan amodau gwaelodol, canfuwyd mynegiant mRNA TGFB-R2 mewn celloedd PDGFR-B tubulointerstitial ar draws yr holl barthau plentyndod ac mewn celloedd mesangial glomerwlaidd (Ffigur 1, chwith). Canfuwyd TGF -R2 hefyd mewn tiwbiau procsimol; roedd mynegiant mewn segmentau tiwbaidd eraill yn is (Ffigurau Atodol S1 ac S2).

Tabl 2|chwilwyr RNAscope a ddefnyddir ar gyfer hybrideiddio in situ

TGFb1(trawsnewid ffactor twf B1)lleolwyd mRNA mewn celloedd PDGFR-bþ rhyng-ranogol ar draws pob parth arennau ac mewn celloedd mesangial glomerwlaidd (Ffigur 1). Roedd tiwbiau'n ymddangos yn negyddol ar gyfer TGFb1 mRNA. Mae hyn yn awgrymu celloedd PDGFR-plws fel y prif safle mynegiant ar gyfer TGF 1(trawsnewid ffactor twf B1)yn yr aren o dan amodau gwaelodol.

Tabl 3|Dilyniannau primer a ddefnyddir ar gyfer adwaith cadwynol polymeras meintiol

Ar ôl 3 wythnos ar ddeiet adenin(AN) neu 5-diwrnod UUO, TGF arennol 1(trawsnewid ffactor twf B1)a chynyddwyd lefelau mynegiant mRNA TGF -R2 yn gryf mewn llygod rheoli (Ffigur 2).

Mynegiant cynyddol o TGF 1(trawsnewid ffactor twf B1)a TGF -R2 ar ôl i AN neu UUO gael ei leoleiddio gan RNAscope. Trwy gydleoli marcwyr math-benodol o gelloedd, gallem nodi mathau o gelloedd arennau sy'n dangos upregulation TGF -R2 yn ystod niwed i'r arennau (Ffigur 3; Ffigurau Atodol S2 a S3). ynghyd â chelloedd mewn ardaloedd ffibrotig (Ffigur 3a). Ymddangosodd tiwbiau wedi'u difrodi gyda mynegiant TGF -R2 uchel gydag epithelial gwastad ac wedi'u hamgylchynu gan gelloedd PDGFR-plws gyda TGF -R2 a TGF 1 cryf(trawsnewid ffactor twf B1)signalau mRNA (Ffigur 3a ac c, saethau; Ffigur Atodol S2). Dangosodd tiwbiau gyda mwy o signalau TGF -R2 de novo TGF 1(trawsnewid ffactor twf B1)mynegiant mRNA (Ffigur 3c; Ffigur Atodol S3).

Mewn arennau UUO, canfuwyd y signalau cynyddol ar gyfer TGF -R2 mRNA yng nghelloedd rhyng-raniadol y medwla allanol sy'n weddill (Ffigur 3b) a'r cortecs (Ffigur Atodol S2). Roedd y celloedd PDGFR-plws hyn hefyd yn dangos mwy o signalau ar gyfer TGF 1(trawsnewid ffactor twf B1)(Ffigur 3d).

I grynhoi, roedd y canfyddiadau hyn yn awgrymu gweithrediad cadarn o TGF 1(trawsnewid ffactor twf B1)signalau rhwng celloedd PDGFR-plws interstitial a thiwbiau wedi'u difrodi yn ystod difrod arbrofol i'r arennau.

Ffigur 1|Mynegiant gwaelodol o (chwith) trawsnewid ffactor twf b derbynnydd 2 (TGFb-R2) a (dde) trawsnewid ffactor twf b1 (TGFb1) mRNA ar adrannau arennau llygod math gwyllt.

Mae dileu anwythol TGF -R2 mewn celloedd PDGFR-plws yn gwanhau mynegiant genynnau profbrotig yn ystod clefyd yr arennau arbrofol

I ddadansoddi perthnasedd TGF 1(trawsnewid ffactor twf B1)signalau ar gyfer swyddogaeth PDGFR-plws celloedd, rydym yn archwilio oedolion TGF -R2ko llygod. Mynegiant gwaelodol o TGF 1(trawsnewid ffactor twf B1)heb ei newid ar ôl dileu TGF -R2 yng nghelloedd rhyng-raniadol yr aren (Ffigur 2). Lleihawyd mynegiant TGF -R2 mRNA yn sylweddol mewn anifeiliaid cnocio (Ffigur 2). Roedd y mynegiant gweddilliol o ganlyniad i fynegiant tiwbaidd o TGF -R2 (Ffigur 1). Nid oedd morffoleg yr arennau yn wahanol mewn llygod TGF -R2ko am hyd at 8 wythnos ar ôl dileu TGF -R2.

Gostyngwyd y cynnydd a welwyd mewn mynegiant TGF -R2 yn ystod AN ac UUO yn sylweddol mewn arennau TGF -R2ko o gymharu ag arennau rheoli (Ffigur 2). TGF 1(trawsnewid ffactor twf B1)mynegiant ei leihau'n sylweddol dim ond ar ôl AN.

Dangosodd astudiaeth histolegol o SMAD3 ffosfforyleiddiedig lai o drawsleoliad o'r ffactor trawsgrifio i gnewyllyn celloedd interstitial a-SMAþ mewn anifeiliaid TGFb-R2ko, gan ddangos tarfu ar signalau TGFb1 ar ôl dileu TGFb-R2 trwy gyfryngu Cre yn llwyddiannus (Ffigur 4).

Ffigur 2|Trawsnewid ffactor twf b1 (TGFb1) a derbynnydd TGFb 2 (TGFb-R2) digonedd mRNA yn yr arennau a'r arennau rheoli gyda dileu tamoxifen-anwythol o TGFb-R2 mewn celloedd b-positif derbynnydd ffactor twf sy'n deillio o blatennau (TGFb-R2ko) o dan waelodol ac amodau patholegol.

Mae dileu anwythol TGFb-R2 mewn celloedd PDGFR-bD yn gwanhau mynegiant genynnau profbrotig yn ystod clefyd yr arennau arbrofol

Yn ystodffibrosis, mae cynhyrchu cydrannau matrics yn cael ei wella, gan arwain at ddyddodiad helaeth o ECM a ffurfio craith. Asesu rôl bosibl TGF 1(trawsnewid ffactor twf B1)signalau mewn celloedd PDGFR-Bf preswyl ar gyfer y cynhyrchiad matrics, gwnaethom gymharu mynegiant genynnau marcwyr ffibrotig rhwng rheolaeth a llygod TGF -R2ko.

Arweiniodd bwydo adenin ac UUO at -25-gynnydd mwy o mRNA Collal mewn arennau rheoli. Tra yn arennau TGF -R2ko, gostyngwyd codiadau mRNA coler gan -50 y cant o gymharu â rheolyddion (Ffigur 5). Arweiniodd bwydo adenin ac UUO hefyd at gynnydd amlwg mewn mRNAs colagen 3al a ffibronectin. Roedd cynnydd y ddau mRNA hefyd wedi'u gwanhau'n sylweddol mewn arennau TGF -R2ko.

CLICIWCH YMA I RAN Ⅱ

CYFEIRIADAU

1. Schimdf C. Duffield JS.Mechanisms offfibrosis: roc y pericyte. Curr Opin Nephrol Hoertens.2011:20297-305.

2. Neelisetty S, Aford C Reynalds K, et aL. Arennolffibrosisyn cael ei leihau gan rwystro trawsnewid ffactor twf- signalau yn y matrics-gynhyrchu celloedd interstitial. Arennau Int. 201588:503-514.

3. Bülow RD, Boor P.Extracellularmatrix ynffibrosis yr arennau: mwy na sgaffald yn unig. J Histochem Cytochem. 2019;67643-661.

4. Humphreys BD.Mecanweithiau ffibrosis arennol.Annu Rey PhysioL201880: 309-326.

5. Maxwell PH, Ferguson DJP, Nicholls LG, et al. Mae'r ymateb interstitial i anaf arennol celloedd tebyg i ffibroblast yn dangos newidiadau ffenotypig ac wedi lleihau'r potensial ar gyfer mynegiant genynnau erythropoietin. Arennau Int. 1997; 52.715-724.

6. Souma T, Yamazaki S, MoriguchiT, a holl blastigrwydd celloedd sy'n cynhyrchu erythropoietin arennol yn llywodraethuffibrosis. J Am Soc Nephrol, 2013; 24:1599-1616.

7. Babit儿L, Lin HY.Mechanisms of anemia in CKD.JAm Soc Nephrol. 2012:23:1631-1634.

8. Eschbach JW, Adamson JW.Anemia o glefyd arennol diwedd cyfnod (ESRD). Arennau Int. 1985; 28:1-5.

9. Broeker KAE, Fuchs MAA, Schrank J, et al Mae isboblogaethau gwahanol o gelloedd rhyng-raniadol yr arennau yn cynhyrchu erythropoietin a ffactorau sy'n cefnogi ocsigeniad meinwe mewn ymateb i hypocsia yn Vivo.Kidney Int. 2020; 98:918-931.

10. Falke LL, Gholizadeh S, Goldschmedinq R et al Tarddiad amrywiol y myofibroblast - goblygiadau iffibrosis yr arennau. Nat Rey Nephrol. 2015;11:233-244.

Sylwch: nid yw'r uchod yn rhestr gyfeirio lawn