Adnabod Lipocalin sy'n Gysylltiedig â Neutrophil Gelatinase Fel Biomarcwr Troethol Cynnar Newydd ar gyfer Anafiad Arennol Isgemig

Cyswllt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

JAYA MISHRA,* QING MA,* ANNE PRADA,* MARK MITSNEFES,* KAMYAR ZAHEDI,* MEHEFIN YANG, † JONATHAN BARASCH,†, a PRASAD DEVARAJAN*

*Neffroleg a Gorbwysedd, Canolfan Feddygol Ysbyty Plant Cincinnati, Cincinnati, Ohio; a † Neffroleg, Coleg y Meddygon a'r Llawfeddygon, Prifysgol Columbia, Efrog Newydd, Efrog Newydd

Haniaethol.

Aciwtarennolmae methiant (ARF) eilaidd i anaf isgemig yn parhau i fod yn broblem gyffredin a allai fod yn ddinistriol. Defnyddiwyd strategaeth holi trawsgrifiad cyfan i nodi genynnau arennol sy'n cael eu hysgogi'n gynnar iawn ar ôl isgemia arennol, y gallai eu cynhyrchion protein fod yn biofarcwyr newydd ar gyfer ARF. Nodwyd saith genyn sy'n cael eu huwchreoleiddio ynghyd â - 10-plyg, ac adroddwyd yn ddiweddar bod un ohonynt (Cyr61) wedi'i achosi ar ôl isgemia arennol. Yn annisgwyl, roedd sefydlu'r chwe thrawsgrifiad arall yn newydd i faes ARF. Yn yr astudiaeth hon, nodweddwyd un o'r genynnau hyn nas cydnabuwyd o'r blaen ymhellach, sef lipocalin sy'n gysylltiedig â neutrophil gelatinase (NGAL), oherwydd ei fod yn polypeptid bach wedi'i gyfrinachu sy'n gallu gwrthsefyll proteas ac o ganlyniad y gellir ei ganfod yn hawdd yn yr wrin. Mae'r upregulation amlwg o NGAL mRNA a lefelau protein yn y llygoden postisgemig cynnararenei gadarnhau. Canfuwyd mynegiant protein NGAL yn bennaf wrth amlhau celloedd tiwbyn procsimol antigen-positif niwclear celloedd, mewn dosbarthiad cytoplasmig atalnodi a oedd yn cyd-leoli â marcwyr endosomau hwyr. Canfuwyd NGAL yn hawdd yn yr wrin yn yr allbwn wrin cyntaf un ar ôl isgemia mewn modelau llygoden a llygod mawr o ARF. Roedd ymddangosiad NGAL yn yr wrin yn gysylltiedig â dos a hyd y cyffurarennolisgemia ac yn rhagflaenu ymddangosiad marcwyr wrinol eraill megis N-acetyl- -D-glucosaminidase a 2-microglobwlin. Cadarnhawyd tarddiad NGAL o gelloedd tiwbyn mewn celloedd tiwbyn procsimol dynol diwylliedig a oedd yn destun anaf isgemia in vitro, lle ysgogwyd mRNA NGAL yn gyflym yn y celloedd a phrotein NGAL yn hawdd ei ganfod yn y cyfrwng diwylliant o fewn 1 awr i ddisbyddiad ATP ysgafn. Roedd NGAL hefyd yn hawdd ei ganfod yn wrin llygod â neffrowenwyndra a achosir gan cisplatin, unwaith eto cyn ymddangosiad N-acetyl- -D-glucosaminidase a 2-microglobwlin. Mae'r canlyniadau'n dangos y gall NGAL gynrychioli biomarcwr wrinol cynnar, sensitif, anfewnwthiol ar gyfer isgemig a neffrotocsig.arennolanaf.

Llysieuyn Cistancheyn gallu trin anaf arennol

Cael mwy o wybodaeth am gynhyrchion sy'n gysylltiedig â Cistanche

Aciwtarennolmethiant(ARF) eilaidd i isgemia neu anaf neffrotocsig yn parhau i fod yn broblem gyffredin a allai fod yn ddinistriol mewn neffroleg glinigol, gyda chyfradd uchel parhaus o farwolaethau er gwaethaf datblygiadau sylweddol mewn gofal cefnogol (1-4). Mae astudiaethau arloesol dros sawl degawd wedi amlygu rolau fasoconstriction parhaus, rhwystr tiwbaidd, newidiadau strwythurol a metabolaidd cellog, a'r ymateb llidiol yn pathogenesis ARF (4-7). Er bod yr astudiaethau hyn wedi paratoi'r ffordd ar gyfer dulliau therapiwtig llwyddiannus mewn modelau anifeiliaid, mae ymdrechion ymchwil trosiadol mewn bodau dynol wedi esgor ar ganlyniadau siomedig (2-4). Gall y rhesymau am hyn gynnwys ymateb amlochrog yr aren i isgemia a nephrotocsinau a phrinder marcwyr cynnar ar gyfer methiant arennol acíwt ac oedi o ganlyniad i gychwyn therapi (4-8).

Ymdrechion i ddatod sail foleciwlaidd y myrdd hyn yn gynnararennolmae ymatebion wedi'u hwyluso gan ddatblygiadau diweddar mewn genomeg swyddogaethol sydd wedi esgor ar offer newydd ar gyfer dadansoddiad genom-eang o brosesau biolegol cymhleth fel ARF isgemig (8-11). Mae'r dulliau microarray cDNA yn darparu proffiliau mynegiant cyfochrog a meintiol o filoedd o enynnau, a all o'u cyfuno ag offer biowybodeg adnabod genynnau mewn llwybr biolegol, nodweddu swyddogaeth genynnau newydd, a chanfod is-ddosbarthiadau afiechyd (9). Gan ddefnyddio'r dechneg sgrinio hon, rydym wedi nodi is-set o saith genyn y mae eu mynegiant wedi'i uwchreoleiddio 0-plyg o fewn yr ychydig oriau cyntaf ar ôl isgemiaarennolanafmewn model llygoden. Yn ddiweddar iawn, cadarnhawyd bod un o'r trawsgrifiadau hyn, protein llawn cystein 61 (Cyr61), wedi'i achosi gan isgemia arennol (8), ond mae ymddygiad y chwe genyn arall a fynegir yn wahaniaethol yn newydd i lenyddiaeth ARF. Yn yr astudiaeth hon, dewisom nodweddu un o'r genynnau hyn nad oedd wedi'u hadnabod o'r blaen ymhellach, sef lipocalin sy'n gysylltiedig â neutrophil gelatinase (NGAL), oherwydd ei fod yn polypeptid bach wedi'i gyfrinachu y gellir ei ganfod yn yr wrin, yn arbennig oherwydd ei fod yn gallu gwrthsefyll proteas. Dengys ein canlyniadau y gall NGAL gynrychioli biomarcwr wrinol cynnar newydd ar gyfer isgemia a neffrotocsigarennolanaf.

Defnyddiau a Dulliau

Modelau Llygoden o Isgemia Arennol - Anafiadau Atgyfnerthu

Fe wnaethom ddefnyddio modelau murine sefydledig lle mae canlyniadau strwythurol a swyddogaethol cyfnodau byr oarennolmae isgemia wedi'u dogfennu'n flaenorol (11-15). Yn gryno, roedd llygod gwrywaidd Swisaidd-Webster (Taconic Farms, Germantown, NY) yn pwyso 25 i 35 g yn cael eu cartrefu gyda 12:12-h golau: cylch tywyll a chawsant fynediad am ddim i fwyd a dŵr. Anestheteiddiwyd yr anifeiliaid â sodiwm pentobarbital (50 mg/kg yn fewnberitoneol) a'u gosod ar fwrdd cynhesu i gynnal tymheredd rhefrol o 37 gradd . Defnyddiwyd tri phrotocol ar wahân: (1) isgemia unochrog heb ARF, (2) isgemia dwyochrog gydag ARF, a (3) isgemia isgemia dwyochrog ysgafn. Ar gyfer yr arbrofion isgemia unochrog, cafodd y pedicle arennol chwith ei guddio â chlamp fasgwlaidd an-drawmatig am 45 munud, ac yn ystod yr amser hwnnw cadwyd yr aren yn gynnes ac yn llaith. Yna tynnwyd y clamp, sylwyd ar yr aren i ddychwelyd llif y gwaed, a chafodd y toriad ei bwytho. Caniatawyd i'r llygod wella mewn cawell wedi'i gynhesu, a chafwyd casgliadau wrin wedi'u hamseru. Ar ôl 0, 3, 12, neu 24 h o atlifiad, cafodd yr anifeiliaid eu hail-anestheteiddio, agorwyd ceudod yr abdomen, a chafwyd gwaed trwy dyllu'r vena cava israddol i fesur creatinin serwm trwy becyn asesu lliwimetrig meintiol (Sigma, St. Louis, MO). Lladdwyd y llygod, cafodd yr arennau eu gosod yn y fan a'r lle gyda 4 y cant o baraformaldehyde yn PBS, a chynaeafwyd y ddwy aren (roedd yr aren dde yn rheolydd ar gyfer pob anifail). Archwiliwyd o leiaf dri anifail ar wahân ym mhob un o'r cyfnodau ail-lifo. Cafodd hanner pob aren ei rewi mewn nitrogen hylifol a'i storio ar 70 gradd nes ei brosesu ymhellach; gosodwyd sampl mewn fformalin, wedi'i fewnosod â pharaffin, ac wedi'i dorri'n adrannau (4 m). Cafodd darnau paraffin eu staenio â hematoxylin-eosin a'u harchwilio'n histolegol. Roedd yr arennau wedi'u clampio yn dangos y newidiadau morffolegol nodweddiadol sy'n deillio o anafiadau isgemia-atlifiad, fel y cyhoeddwyd yn flaenorol gan eraill (12-14) a ni (11). Roedd hanner arall pob aren wedi'i fewnosod yn y cyfansoddyn OCT (Tissue-Tek), a chafwyd adrannau wedi'u rhewi (4 m) ar gyfer immunohistochemistry. Ar gyfer yr isgemia dwyochrog gydag arbrofion ARF, cafodd y ddwy aren eu clampio am 30 munud a'u harchwilio ar wahanol gyfnodau ail-lif fel y manylir uchod. Dyluniwyd y grŵp hwn o wyth anifail i gynrychioli methiant arennol acíwt clinigol a dangosodd ddrychiad sylweddol mewn creatinin serwm ar 24 awr ar ôl yr anaf. Ar gyfer yr arbrofion isgemia isgemia isglinigol ysgafn dwyochrog, cafodd y ddwy aren eu clampio am 5, 10, neu 20 munud yn unig a'u harchwilio ar wahanol gyfnodau atglifiad fel uchod. Dyluniwyd y raddfa ysgafn hon o anaf i efelychu isgemia arennol isglinigol, ac ni ddangosodd llygod yn y grŵp hwn unrhyw ddrychiadau mewn creatinin serwm a fesurwyd ar 24 h ar ôl yr anaf.

Model Llygoden Fawr o Isgemia Arennol - Anaf Atdlifiad

Fe wnaethon ni ddefnyddio modelau cnofilod sefydledig oarennolanaf isgemia-atlif (10). Yn gryno, anestheteiddiwyd llygod mawr Sprague-Dawley gwrywaidd a oedd yn pwyso 200 i 250 g (Ffermydd Taconic) â ketamine (150 g/g) a xylazine (3 g/g) a buont yn agored i gyfyngiad rhydweli arennol dwyochrog gyda chlampiau microfasgwlaidd am 30 munud fel y nodir yn protocol y llygoden. Cafwyd casgliadau wrin wedi'u hamseru yn 3, 6, 9, 12, a 24 h o atglifiad, a chasglwyd gwaed ar gyfer mesur creatinin ar adeg ei ladd (24 h).

Model Llygoden o Anaf Arennol a Achosir gan Cisplatin

Fe wnaethom ddefnyddio modelau murine sydd wedi'u hen sefydlu lle mae canlyniadau strwythurol a swyddogaethol gweinyddu cisplatin wedi'u dogfennu'n flaenorol (16-18). Yn gryno, rhoddwyd un pigiad mewnperitoneol o cisplatin (20 mg/kg body wt) i lygod. Mae hyn yn arwain at necrosis celloedd tiwbyn ac apoptosis a nitrogen urea gwaed uchel o fewn 3 d ar ôl y pigiad cisplatin (16-18). Câi anifeiliaid eu cadw mewn cewyll metabolaidd, a chafwyd casgliadau wrin yn ddyddiol.

Arwahanrwydd RNA

Amharwyd ar feinweoedd arennau cyfan y llygoden (neu gelloedd tiwbyn procsimol dynol diwylliedig; gweler isod) gan Derfysgaeth Meinwe (Biospec Products, Racine, WI). Cafodd cyfanswm yr RNA o reolaeth ac arennau isgemig ei ynysu gan ddefnyddio'r Pecyn Bach RNeasy (Qiagen, Valencia, CA) a'i feintioli gan sbectroffotometreg.

Gweithdrefnau Microarray

Mae disgrifiadau manwl o galedwedd a gweithdrefnau micro-arae wedi'u cyhoeddi'n flaenorol (11). Yn gryno, ar gyfer pob arbrawf, cafodd 100 g o RNA aren llygoden gyfan wedi'i buro ei drawsgrifio o chwith gyda thrawsgrifiad gwrthdro Superscript II (Life Technologies, Rockville, MD) ym mhresenoldeb Cy3-dUTP (Amersham, Piscataway, NJ) ar gyfer rheolyddion a Cy5-dUTP ar gyfer samplau isgemig. Cafodd y samplau cDNA eu puro gan ddefnyddio hidlydd Microcon YM-50 (Millipore, Madison, WI) a'u croesrywio i sleidiau micro-arae yn cynnwys 8979 o stilwyr llygoden unigryw a ddilyswyd gan ddilyniant (11). Archwiliwyd tri anifail ar wahân ar gyfer pob un o'r cyfnodau ail-lifo, a chynhaliwyd o leiaf ddau arbrawf micro-arae annibynnol ar gyfer pob un o'r anifeiliaid. Cafodd y sleidiau arae eu sganio gan ddefnyddio sganiwr micro-arae (GenePix 4000B; Axon Instruments, Foster City, CA) i gael delweddau TIFF ar wahân ar gyfer fflworoleuedd Cy3 a Cy5. Penderfynwyd ar ddwyster y signal ar gyfer Cy3 a Cy5 ar gyfer genynnau unigol gan ddefnyddio meddalwedd echdynnu data GenePix Pro 3.0 (Axon Instruments). Cwblhawyd rheoli ansawdd a dadansoddi data fel y disgrifiwyd yn flaenorol (11).

planhigyn cistanche ar gyfer yr aren

Trawsgrifiad Gwrthdro Lledfeintiol - PCR

Cafodd swm cyfartal (1 plws - g) o gyfanswm RNA o reolaeth ac arennau llygoden arbrofol ei drawsgrifio i'r gwrthwyneb gyda thrawsgrifiad gwrthdro Superscript II (Life Technologies) ym mhresenoldeb hexamers ar hap yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Cyflawnwyd PCR gan ddefnyddio cit (Roche, Indianapolis, IN) a'r paent preimio canlynol: llygoden synnwyr NGAL 5'-CACCACGGACTACAACCAGT TCGC-3', llygoden NGAL antisense 5'-TCAGTTGTCAATGCATTG GTCGGTG-3', NGAL dynol synnwyr 5'-TCAGCCGTCGATACACT GGTC-3', a Human NGAL antisense 5'-CCTCGTCCGAGTGG TGAGCAC-3'. Cafwyd parau premer ar gyfer llygoden a dynol -actin a glyseraldehyde-3- ffosffad dehydrogenase (GAPDH) gan Clontech (La Jolla, CA). Roedd adweithiau ffug heb cDNA yn rheolaethau negyddol. Dadansoddwyd cynhyrchion PCR gan electrofforesis gel agarose ac yna staenio â bromid ethidium a chawsant eu meintioli gan densitometreg. Mynegwyd newidiadau plyg mewn mynegiant mRNA NGAL mewn arennau isgemig yn erbyn rheolaeth ar ôl normaleiddio ar gyfer ymhelaethiad -actin neu GAPDH.

Microsgopeg

Ar gyfer canfod NGAL, cafodd adrannau wedi'u rhewi eu treiddio â {{{0}}.2 y cant Triton X-100 yn PBS am 10 munud, eu rhwystro â serwm gafr am 1 awr, a'u deor â gwrthgorff cynradd i NGAL ( 1:500 gwanhau) am 1 h. Yna cafodd sleidiau eu hamlygu am 30 munud yn y tywyllwch i wrthgyrff eilaidd wedi'u cyfuno â Cy5 (Amersham, Arlington Heights, IL) a'u delweddu â microsgop fflworoleuedd (Zeiss Axiophot) gyda hidlwyr rhodamine. Ar gyfer cyd-leoli NGAL â Rab11, deorwyd adrannau cyfresol yn gyntaf â gwrthgorff NGAL neu wrthgorff monoclonaidd i Rab11 (gwanhad 1:500; Transduction Laboratories), yna gyda gwrthgyrff eilaidd wedi'u cyfuno â naill ai Cy5 (ar gyfer NGAL) neu Cy3 (ar gyfer Rab11). ) a'u delweddu gyda ffilterau rhodamine neu fflworoleuedd, yn y drefn honno. Ar gyfer cyd-leoli NGAL ag antigen niwclear celloedd lluosog (PCNA), cafodd adrannau eu deor ar y cyd â gwrthgorff NGAL a gwrthgorff monoclonaidd i PCNA (gwanhad 1: 500; Upstate), a chafodd ei ganfod gan staenio imiwnoperoxidase (System Lliwio ImmunoCruz, Biotechnoleg Santa Cruz). Ar gyfer assay TUNEL, fe wnaethom ddefnyddio Pecyn Assay Darnio DNA ApoAlert (Clontech). Cafodd adrannau paraffin eu dadbaraffinio trwy xylene a graddau disgynnol o ethanol, wedi'u gosod gyda 4 y cant o fformaldehyd / PBS am 30 munud ar 4 gradd, wedi'i dreiddio â phroteinas K ar dymheredd ystafell am 15 munud a 0.2 y cant Triton X-100/PBS am 15 min ar 4 gradd , a'i ddeor â chymysgedd o niwcleotidau ac ensym TdT am 60 munud ar 37 gradd . Terfynwyd yr adwaith gyda 2 SSC, a golchwyd yr adrannau â PBS a'u gosod â Crystal / mount (Biomed, Foster City, CA). Canfuwyd niwclysau apoptotig TUNEL-positif trwy ddelweddu gyda microsgop fflworoleuedd.

Casgliad Wrin

Rhoddwyd llygod neu lygod mawr mewn cewyll metabolig (Nalgene, Rochester, NY), a chasglwyd wrin cyn a phob awr ar ôl hynny.arennolocclusion rhydweli. Cafodd samplau wrin eu hallgyrchu ar 5000 g i gael gwared ar falurion, a dadansoddwyd y supernatant gan blotio Gorllewinol. Mesurwyd creatinin wrinol gan becyn asesu lliwimetrig meintiol (Sigma) i normaleiddio samplau ar gyfer penderfyniad NGAL wrinol. Cafwyd pecyn profi lliwimetrig ar gyfer canfod N-acetyl -D-glucosaminidase (NAG) yn yr wrin gan Roche.

Diwylliant Cell

Dynolarennolcafwyd celloedd epithelial tiwbaidd procsimol (RPTEC) gan Clonetics (San Diego, CA). Tyfwyd celloedd i mewnarennolcyfrwng gwaelodol celloedd epithelial wedi'i ategu âArennolCymhlyg Twf Celloedd Epithelial Canolig (REGM) ({{0}}.5 l/ml hydrocortisone, 10 pg/ml hEGF, 0.5 - g/ml epineffrîn, 6.5 pg/ml triiodothyronine, 10 plws - g/ml transferrin, 5 - g/ml inswlin, 1 -g/ml sylffad gentamicin, a 2 y cant FBS), fel yr argymhellir gan y gwneuthurwr.

Disbyddiad Mân ATP o Gelloedd Diwylliedig

Fe wnaethom addasu protocolau a ddisgrifiwyd yn flaenorol o isgemia in vitro trwy ddisbyddiad ATP gydag atalyddion ffosfforyleiddiad ocsideiddiol (19,20). Ar yr ail ddiwrnod ar ôl cydlifiad, deorwyd celloedd RPTEC ag 1 m o antimycin A (Sigma) am gyfnodau amrywiol o amser hyd at 6 h. Rydym wedi dangos yn flaenorol bod hyn yn arwain at ddisbyddu ATP rhannol gildroadwy ysgafn a dim colli hyfywedd celloedd mewn mathau eraill o gelloedd epithelial arennol diwylliedig fel celloedd MDCK (19) a 786-O (20). Cafodd lefelau ATP eu monitro gan ddefnyddio pecyn assay seiliedig ar luciferase (Sigma) a'u mynegi fel canran o werthoedd rheoli. Cynaeafwyd celloedd ar wahanol adegau o ddisbyddu ATP a'u dadansoddi ar gyfer mynegiant mRNA NGAL trwy drawsgrifio cefn - PCR (RT-PCR) a mynegiant protein NGAL trwy ddadansoddiad y Gorllewin. Cafodd secretiad NGAL i'r cyfrwng diwylliant hefyd ei fonitro.

Defnyddiau a Dulliau Eraill

Prynwyd yr holl gemegau gan Sigma oni nodir yn wahanol. Ar gyfer blotio Gorllewinol, pennwyd crynodiadau protein gan assay Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA), a llwythwyd symiau cyfartal o gyfanswm protein ym mhob lôn. Defnyddiwyd gwrthgorff monoclonaidd i- -diwbwlin (Sigma) am 1:10,000 gwanhau i gadarnhau llwyth protein cyfartal, a defnyddiwyd gwrthgorff polyclonaidd i NGAL am 1:500 (21). Defnyddiwyd gwrthgorff monoclonaidd i 2-microglobwlin am 1:500 (Sigma). Cyflawnwyd imiwnonodi proteinau a drosglwyddwyd gan ddefnyddio cemiluminescence uwch (Amersham).

Canlyniadau

Nodweddu'r Modelau Anifeiliaid o Isgemia Arennol Cynnar - Anafiadau Atgyfnerthu

Fe wnaethom ddefnyddio modelau murine lle mae canlyniadau strwythurol a swyddogaethol cyfnodau byr o isgemia arennol wedi'u dogfennu (11-15). Roedd nodweddion histopathologig nodweddiadol anafiadau isgemig yn amlwg iawn yn y samplau atgyfnerthiad 24-h ar ôl isgemia unochrog (45 munud) a dwyochrog (30 munud). Roedd y rhain yn cynnwys colli pilenni ymyl brwsh, ymlediad tiwbaidd, epitheliwm tiwbaidd gwastad, malurion goleuol, ac ymdreiddiadau rhyngosodol (Ffigur 1). Gwnaethom ddogfennu presenoldeb celloedd apoptotig gan ddefnyddio assay TUNEL. Lleolwyd apoptosis yn bennaf i gelloedd tiwbaidd distal ac aelod esgynnol dolen Henle, mewn celloedd datgysylltiedig o fewn y lwmen yn ogystal â chelloedd ynghlwm. Roedd celloedd tiwbaidd procsimol achlysurol hefyd yn apoptotig, ond yn y bôn roedd y glomeruli yn amddifad o apoptosis. Ni chanfuwyd unrhyw gelloedd TUNEL-positif yn yr arennau rheoli nac yn y samplau isgemig lle cafodd TdT ei hepgor (heb ei ddangos). Roedd y newidiadau histologig ac apoptotig uchod yn absennol o arennau a oedd yn destun graddau mwynach o isgemia (5, 10, neu 20 munud o isgemia dwyochrog; heb ei ddangos). Roedd y lefelau creatinin serwm yn adlewyrchu'r newidiadau histopathologig a welwyd. Felly, roedd llygod ag isgemia arennol unochrog neu raddau ysgafn o isgemia dwyochrog isglinigol yn dangos lefelau creatinin serwm nad oedd modd eu gwahaniaethu oddi wrth anifeiliaid rheoli, tra bod llygod ag isgemia dwyochrog am 30 munud yn dangos uchder sylweddol o creatinin serwm (Ffigur 1).

Ffigur 1. Nodweddu model y llygoden o isgemiaarennolanaf. Mae paneli chwith yn dangos canlyniadau staenio hematoxylin ac eosin (brig) a staenio TUNEL (gwaelod) adrannau arennau o lygod rheoli neu ar ôl 24 h o isgemia-atlifiad (IRI). (Dde) Canlyniadau penderfyniadau creatinin serwm mewn llygod rheoli (Con), ar ôl isgemia unochrog am 45 munud (U45), neu ar ôl isgemia dwyochrog am wahanol gyfnodau fel y dangosir. *P 0.05 yn erbyn rheolaeth. Mae niferoedd o fewn bariau yn dynodi nifer o anifeiliaid.

Mae mRNA NGAL yn cael ei Anwytho'n Sylweddol yn yr Arennau Ôl-isgemig Cynnar

Trwy ddadansoddiad microarray o lygod gydag unochrogarennolcanfuwyd bod isgemia, NGAL wedi'i ysgogi'n gyson (3.2 plws - 0.5-plyg, 11.1 plws - 1.2-plyg, a 4.3 plws {{1{{30}) }}}.6-plyg ar 3, 12, a 24 h o atlifiad) yn aren y llygoden isgemia o'i gymharu â'r arennau rheoli o'r un anifail (cymedr plws - SD o dri anifail ar bob pwynt amser). Cadarnhawyd y canfyddiad hwn gan RT-PCR lled feintiol, gan ddefnyddio protocol normaleiddio gyda plus -actin a GAPDH. Ni nodwyd unrhyw newidiadau sylweddol mewn mynegiant mRNA o naill ai plws-actin neu GAPDH yn unrhyw un o'r cyfnodau ail-lifiad a archwiliwyd, fel y disgrifiwyd yn flaenorol (11). Fodd bynnag, gan ddefnyddio paent preimio sy'n benodol i lygoden, fe wnaethom ganfod dadreoleiddiad sylweddol o fynegiad mRNA NGAL (4.1 plws -0.5-plyg, 9 plws -0.6-plyg, a 4.2 plws 0.4-plyg ar 3, 12, a 24 h o atlifiad, yn y drefn honno, lle mae gwerthoedd yn cynrychioli plws - SD o dri anifail ar wahân). Dangosir y canlyniadau hyn yn Ffigur 2 ac maent yn cytuno'n gyffredinol â'r newidiadau a ganfuwyd gan ddadansoddiad trawsgrifio.

Ffigur 2. Ymsefydlu mRNA arennau llygoden neutrophil sy'n gysylltiedig â gelatinase (NGAL) ar ôl isgemia. (Uchaf) Trawsgrifiad gwrthdro cynrychioladol-PCR (RT-PCR) gyda paent preimio ar gyfer actin llygoden a NGAL, gan ddefnyddio RNA a dynnwyd o arennau rheoli (C) llygod neu ar ôl cyfnodau atglifiad amrywiol fel y dangosir (oriau). Mae Lôn M yn cynnwys ysgol DNA 100-bp. (Gwaelod) Cynnydd plyg mewn mynegiant mRNA NGAL ar wahanol adegau o reolaeth (CON). Mae gwerthoedd a geir trwy ficro-arae (llinell solet) yn erbyn RT-PCR (llinell ddotiog) yn gymedrau SD o dri arbrawf ar bob pwynt amser.

Mae Protein NGAL wedi'i Orfynegi'n Sylweddol yn Nhiwbiau Procsimol Arennau Llygoden Isgemia Cynnar

Y diddordeb nesaf oedd penderfynu a yw mynegiant postisgemig protein NGAL yn yr aren yn debyg i fynegiant yr mRNA. Yn ôl dadansoddiad y Gorllewin, roedd NGAL i'w weld fel peptid imiwn-adweithiol 25-kD wrth reoli arennau llygoden. Sefydlwyd hunaniaeth y band hwn fel NGAL mewn set ar wahân o arbrofion, lle roedd rhagdeoriad y gwrthgorff cynradd â lipocalin llygoden ailgyfunol yn rhwystro'r imiwn-adweithedd hwn yn llwyr (heb ei ddangos). Yn yr arbrofion isgemia unochrog, ysgogwyd mynegiant NGAL deirgwaith i bedair gwaith gan densitometreg yn yr aren isgemig o bum anifail ar wahân o fewn 3 h o anaf, fel y dangosir yn Ffigur 3. Gwellwyd yr ymateb hwn yn ddramatig yn yr arbrofion isgemia dwyochrog o wyth anifail ar wahân. . Anwythwyd NGAL yn y llygod hyn yn driphlyg ar ôl 3 h o atlifiad, cyrhaeddodd uchafbwynt o 12-plygiad yn 24-h samplau, a gostyngodd i lefelau normal erbyn y 72-cyfnod adfer (Ffigur 3) .

Ffigur 3. Sefydlu protein NGAL aren llygoden ar ôl isgemia unochrog neu ddwyochrog. (Uchaf) Cynrychiolwr yn blotio'r Gorllewin gyda samplau arennau cyfan a gafwyd o lygod rheoli (Con) neu ar ôl cyfnodau atglifiad fel y dangosir (oriau), wedi'u harchwilio â gwrthgorff polyclonaidd i NGAL neu wrthgorff monoclonaidd i diwbwlin (i ddangos llwyth protein cyfartal). Mae marcwyr pwysau moleciwlaidd i'r chwith. (Gwaelod) Cynnydd plyg mewn mynegiant protein NGAL ar wahanol adegau o reolaeth (CON). Y gwerthoedd a geir trwy ddensitometreg yw cymedrau DC o bum anifail ar gyfer isgemia unochrog ac wyth anifail ar gyfer isgemia dwyochrog

Gan ddefnyddio technegau imiwn-histocemegol, gwnaethom ddangos nesaf mai prin y gellir canfod protein NGAL mewn arennau llygoden rheoli ond ei fod wedi'i uwchreoleiddio'n bennaf mewn tiwbiau procsimol o fewn 3 h i isgemia fel y dangosir yn Ffigur 4. Seiliwyd adnabod tiwbiau procsimol yn yr adrannau hyn ar bresenoldeb brwsh bilen ffin, y gymhareb o niwclear i faint celloedd, a morffoleg cellog. Ymddangosodd y NGAL anwythol mewn dosraniad cytoplasmig punctate o fewn celloedd tiwbyn procsimol, sy'n atgoffa rhywun o brotein wedi'i secretu. Roedd y patrwm mynegiant hwn yn union yr un fath mewn modelau unochrog a dwyochrog o anafiadau isgemia-atlifiad ac roedd yn gyson amlwg ym mhob anifail a astudiwyd. Roedd y glomeruli yn amddifad o fynegiant NGAL, ac nid oedd unrhyw niwtroffiliau a fynegai NGAL yn amlwg. Oherwydd bod NGAL wedi'i ddangos mewn celloedd arennau tiwmor Wilms diwylliedig i gyd-leoli o leiaf yn rhannol ag endosomau (21), fe wnaethom archwilio mewn adrannau cyfresol ddosbarthiad NGAL a Rab11 (marciwr o endosomau ailgylchu hwyr). Roedd delweddau cyfun yn dangos cyd-leoliad sylweddol o NGAL gyda Rab11 (Ffigur 4). Er mwyn archwilio arwyddocâd swyddogaethol mynegiant NGAL gwell ar ôl isgemia, fe wnaethom archwilio adrannau aren cyfresol ar gyfer mynegiant NGAL, niwclysau TUNEL-positif, neu niwclysau PCNA-positif. Tra nad oedd celloedd tiwbyn a oedd yn gorfynegi NGAL yn TUNEL-positif (ni ddangosir), roedd cyd-leoliad sylweddol o NGAL a PCNA yn amlwg yn y celloedd amlhau ac adfywio yn y cyfnod ail-lifo 48-h (Ffigur 4).

Ffigur 4. Sefydlu protein NGAL aren llygoden ar ôl isgemia. (Uchaf) Canlyniadau imiwn-histocemeg cynrychioliadol ar rannau wedi'u rhewi o arennau llygoden a gafwyd o lygod rheoli neu ar ôl cyfnodau amrywiol o ail-lifo fel y dangosir (oriau), wedi'u harchwilio â gwrthgorff polyclonaidd i NGAL. G, glomerwlws. Mae'r panel sydd wedi'i labelu â HP yn chwyddhad pŵer uchel 100 plws, ac mae'r paneli eraill yn 20. (Gwaelod) Mae'r ddau banel chwith yn dangos tiwbyn ar ôl 3 h o atlifiad, gan fynegi NGAL (coch) neu Rab11 (gwyrdd). Mae'r trydydd panel yn dangos delwedd gyfun, sy'n nodi cydleoli mewn melyn. Mae'r panel ar y dde eithafol yn dangos cyd-leoli NGAL ag antigen niwclear celloedd amlhau mewn tiwbiau ar ôl 48 h o ail-lif.

Mae Protein NGAL yn cael ei Ganfod yn Hawdd yn yr Wrin Yn syth ar ôl Sefydlu ARF mewn Llygod

Y peth nesaf oedd o ddiddordeb sylweddol oedd penderfynu a ellid canfod mynegiant postisgemig protein NGAL yn yr wrin, a thrwy hynny awgrymu ei ddefnyddioldeb fel biomarcwr anfewnwthiol cynnar o isgemig.arennolanaf. Gyda'r defnydd o grynodiadau creatinin wrinol i gydraddoli ar gyfer llwytho sampl, roedd NGAL yn absennol o'r wrin cyn isgemia. Mewn cyferbyniad trawiadol, roedd NGAL yn amlwg fel band 25-kD o fewn 2 h i'r anaf (yn yr allbwn wrin cyntaf un ar ôl isgemia) ym mhob anifail a archwiliwyd (pump ag unochrog ac wyth ag isgemia dwyochrog), fel y dangosir yn Ffigur 5. Sefydlwyd hunaniaeth y band hwn fel NGAL mewn set ar wahân o arbrofion, lle rhwystrodd rhagdeoriad y gwrthgorff cynradd â lipocalin llygoden ailgyfunol yr imiwn-adweithedd hwn yn llwyr (heb ei ddangos). Yn rhyfeddol, roedd NGAL yn hawdd ei ganfod mewn cyn lleied ag 1 l o wrin heb ei brosesu trwy ddadansoddiad Gorllewinol a pharhaodd am y cyfnod cyfan a archwiliwyd (24 awr o atlifiad). Yna fe wnaethom gymharu ysgarthiad NGAL wrinol â marcwyr anaf a sefydlwyd yn flaenorol, megis 2-micro globulin a NAG. Tra bod NGAL wrinol yn amlwg o fewn 2 h o isgemia, 2-canfyddwyd microglobwlin yn yr un samplau wrinol dim ond ar ôl 12 h o isgemia unochrog ac 8 h o isgemia dwyochrog (Ffigur 5). Yn yr un modd, cynyddwyd ysgarthiad NAG wrinol yn sylweddol dim ond ar ôl 12 h o isgemia unochrog ac 8 h o isgemia dwyochrog o'i gymharu ag anifeiliaid rheoli annisgemig (Ffigur 5).

Ffigur 5. Canfod protein NGAL yn gynnar yn yr wrin mewn llygod ag isgemig aciwtarennolmethiant (ARF). (Uchaf) Cafwyd blotiau Gorllewinol cynrychiolydd o samplau wrin heb eu prosesu (1 i 2 plws - l fesul lôn, wedi'i normaleiddio ar gyfer cynnwys creatinin) ar gyfnodau atglifiad fel y dangosir (oriau), ar ôl unochrog neu ddwyochrogarennolclampio rhydweli. Dangosir marcwyr pwysau moleciwlaidd ar y chwith. Cafodd blotiau eu harchwilio â NGAL (brig) neu {{0}}microglobulin (Beta2-M; canol). (Gwaelod) N-acetyl- - D-glucosaminidase wrinol (NAG) penderfyniadau ar wahanol gyfnodau atglifiad fel y nodir, o bum anifail ar gyfer isgemia unochrog ac wyth anifail ar gyfer isgemia dwyochrog. DC cymedrig yw gwerthoedd. * P 0.05 yn erbyn rheolaeth ar bob pwynt amser, ANOVA.

Mae Protein NGAL yn Cael ei Ganfod yn Hawdd yn yr Wrin Hyd yn oed ar ôl Isgemia Arennol Ysgafn mewn Llygod

Er mwyn pennu sensitifrwydd canfod NGAL wrinol yn absenoldeb ARF amlwg, gwnaethom ddefnyddio protocolau lle'r oedd setiau ar wahân o lygod yn destun dim ond 5, 10, neu 20 munud o ddwyochrogarennolocclusion rhydweli. Cynlluniwyd yr astudiaethau hyn i asesu ysgarthiad NGAL wrinol ar ôl isgemia arennol isglinigol ysgafn. Roedd creatinin serwm a fesurwyd ar ôl 24 h o ail-lif o fewn terfynau arferol ym mhob un o'r llygod hyn (Ffigur 1). Yn drawiadol, canfuwyd NGAL yn hawdd mewn cyn lleied ag 1 l o wrin heb ei brosesu yn yr anifeiliaid hyn (Ffigur 6), er bod ei ymddangosiad wedi'i ohirio rhywfaint o'i gymharu ag anifeiliaid ag ARF amlwg. Felly, tra bod 30 munud o isgemia dwyochrog wedi arwain at ysgarthu NGAL wrinol o fewn 2 awr (Ffigur 5), roedd llygod ag isgemia dwyochrog yn amlygu NGAL wrinol ar ôl 4 awr yn unig a'r rhai ag isgemia 5 munud yn ysgarthu NGAL ar ôl 6 awr yn unig. Ffigur 6). Felly, mae ymddangosiad NGAL yn yr wrin yn cyd-fynd â dos a hyd isgemia arennol.

Mae Protein NGAL yn cael ei Ganfod yn Hawdd yn yr Wrin Yn syth ar ôl Sefydlu ARF mewn llygod mawr

Ffigur 6. Canfod protein NGAL yn yr wrin mewn llygod ag isgemia arennol isglinigol. Cynrychiolydd Western blot o samplau wrin heb eu prosesu (1 i 2 l fesul lôn, normaleiddio ar gyfer cynnwys creatinin) a gafwyd yn ystod cyfnodau atglifiad fel y dangosir (oriau), ar ôl 5, 10, neu 20 munud o clampio rhydweli arennol dwyochrog. Dangosir marcwyr pwysau moleciwlaidd ar y chwith. Roedd yr anifeiliaid hyn yn arddangos creatinin serwm arferol ar 24 awr o ail-lif.

Oherwydd bod dadl yn bodoli ynghylch gwahaniaethau rhywogaethau yn yr ymatebion i achludiad rhydwelïau arennol (22), fe wnaethom archwilio ymddygiad NGAL mewn model anifeiliaid gwahanol, sef model llygod mawr sydd wedi'i hen sefydlu o anaf arennol isgemia-atlifiad. Gyda'r defnydd o grynodiadau creatinin wrinol i gydraddoli ar gyfer llwytho sampl, roedd NGAL yn absennol o'r wrin cyn isgemia. Mewn cyferbyniad amlwg, roedd NGAL yn amlwg fel peptid imiwn-adweithiol 25-kD o fewn 3 h i'r anaf (yn yr allbwn wrin cyntaf ar ôl isgemia), fel y dangosir yn Ffigur 7. Mewn cymhariaeth, mae'r creatinin serwm yn y model hwn o dim ond ar ôl 24 awr o atlifiad (heb ei ddangos) y codwyd anaf isgemig. Unwaith eto, canfuwyd NGAL mewn 1 l o wrin heb ei brosesu a pharhaodd am y cyfnod cyfan a archwiliwyd (24 awr o atlifiad).

Ffigur 7. Canfod protein NGAL yn gynnar yn yr wrin mewn llygod mawr ag ARF isgemig. Cynrychiolydd Western blot o samplau wrin heb eu prosesu (1 i 2 l y lôn, normaleiddio ar gyfer cynnwys creatinin) a gafwyd yn ystod cyfnodau atlifiad fel y dangosir (oriau), ar ôl 30 munud o glampio rhydweli arennol dwyochrog mewn llygod mawr. Dangosir marcwyr pwysau moleciwlaidd ar y chwith. Dangosodd yr anifeiliaid hyn gynnydd sylweddol mewn creatinin serwm ar 24 awr o ail-lif.

Mae mRNA NGAL yn cael ei Chwythu mewn Celloedd Tiwbwl Procsimol Dynol Diwylliedig ar ôl Isgemia Ysgafn Cynnar

I gadarnhau tarddiad NGAL o gelloedd tiwbyn procsimol isgemig, fe wnaethom addasu protocolau a ddisgrifiwyd yn flaenorol o isgemia in vitro trwy ddisbyddu ATP mewn celloedd tiwbyn procsimol dynol diwylliedig (RPTEC). Arweiniodd deori 1-m o antimycin at ddisbyddiad rhannol ATP ysgafn i tua 83 ynghyd â 3 y cant o reolaeth o fewn 1 awr, gyda gostyngiad mwy graddol i tua 75 a {5}} y cant o reolaeth o 6 h ( cymedr-SD o bedwar arbrawf). Nid oedd unrhyw ganlyniadau morffolegol i'r disbyddiad ATP ysgafn hwn i'w gweld. Roedd mRNA NGAL i'w ganfod mewn celloedd gorffwys. Fodd bynnag, ar ôl dihysbyddiad rhannol ATP, roedd ymsefydlu mRNA NGAL yn gyflym ac yn ddibynnol ar hyd yn amlwg gan RT-PCR, fel y dangosir yn Ffigur 8.

Mae Protein NGAL yn Cael ei Ganfod yn Hawdd yn y Canolig ar ôl Isgemia Cynnar In Vitro

Nesaf, fe wnaethom archwilio mynegiant protein NGAL mewn celloedd RPTEC a'r cyfrwng diwylliant ar ôl disbyddiad ATP ysgafn. Roedd modd canfod protein NGAL mewn celloedd RPTEC rheoli, a chynyddodd ei fynegiant ar ôl disbyddu ATP mewn modd sy'n dibynnu ar hyd, fel y dangosir yn Ffigur 8. Ni ddarganfuwyd unrhyw brotein imiwn-adweithiol NGAL yn y cyfrwng diwylliant o gelloedd rheoli, ond roedd NGAL yn hawdd ei ganfod o fewn 1 h o ddisbyddiad ATP ysgafn (Ffigur 8). Nodwyd cynnydd pellach yn helaethrwydd protein NGAL yn ymwneud â hyd disbyddiad ATP. Mae'r canlyniadau hyn yn awgrymu bod y protein NGAL anwythol yn cael ei gyfrinachu'n gyflym i'r cyfrwng, sy'n cyfateb i ymddangosiad cyflym NGAL yn yr wrin ar ôl isgemia arennol in vivo.

Ffigur 8. Sefydlu mRNA NGAL ar ôl isgemia in vitro. (Uchaf) Cynrychiolydd RT-PCR gyda paent preimio ar gyfer NGAL dynol, gan ddefnyddio RNA a dynnwyd o gelloedd epithelial tiwbaidd procsimol arennol (RPTEC) ar ôl cyfnodau amrywiol o ddisbyddu ATP rhannol fel y dangosir (oriau). Mae Lôn M yn cynnwys ysgol DNA 100-bp. (Canol) Cynnydd plyg mewn mynegiant mRNA NGAL ar wahanol adegau o reolaeth (0), wedi'i normaleiddio ar gyfer mynegiant dehydrogenas glyseraldehyde-3-ffosffad. Y gwerthoedd a ddangosir yw cymedrau DC o dri arbrawf ar bob pwynt amser. Cynrychiolydd (Gwaelod) Chwythu'r Gorllewin gyda samplau RPTEC ar ôl cyfnodau amrywiol o ddisbyddu ATP rhannol fel y dangosir (oriau), a gafwyd o symiau cyfartal o belenni cell (Pel) neu'r cyfrwng meithrin (Sup), wedi'u harchwilio â gwrthgorff polyclonal i NGAL. Mae marcwyr pwysau moleciwlaidd i'r chwith. Mae'r ffigur yn cynrychioli tri arbrawf ar wahân.

Mae Protein NGAL yn Cael ei Ganfod yn Hawdd yn yr Wrin yn Gynnar ar ôl Anwytho Neffrowenwyndra a Achosir gan Cisplatin

Nesaf roeddem am benderfynu a allai NGAL gael ei ganfod yn yr wrin ar ôl mathau eraill o anaf celloedd tiwbyn. Mewn model llygoden sefydledig o nephrotoxicity cisplatin, canfuwyd NGAL yn hawdd yn yr wrin o fewn 1 d o weinyddu cisplatin (Ffigur 9). Mewn cyferbyniad, prin oedd modd canfod microglobwlin 2- wrinol ar ôl 2 d ac ni ellid ei ganfod yn ddibynadwy tan ddiwrnod 4 i 5 ar ôl cisplatin. Yn yr un modd, nid oedd mwy o ysgarthu NAG wrinol yn amlwg tan ddiwrnodau 4 a 5 ar ôl rhoi cisplatin (Ffigur 9).

Ffigur 9. Canfod protein NGAL yn gynnar yn yr wrin mewn llygod ag anaf a achosir gan cisplatin. (A) Blotiau Gorllewinol cynrychiolydd ar samplau wrin heb eu prosesu (1 i 2 l fesul lôn, wedi'i normaleiddio ar gyfer cynnwys creatinin) a gafwyd ar ddyddiau fel y dangosir ar ôl rhoi cisplatin, wedi'i archwilio â gwrthgorff i 2-microglobwlin neu NGAL. Dangosir marcwyr pwysau moleciwlaidd ar y chwith. (B) Penderfyniadau NAG wrinol ar wahanol ddyddiau ar ôl gweinyddu cisplatin (n 4). Gwerthoedd cymedrig plws -SD. *P 0.05 yn erbyn diwrnod 0.

Trafodaeth

Fe wnaethom ddefnyddio strategaeth holi trawsgrifiad cyfan i nodi genynnau arennol a achosir yn gynnar ar ôl isgemia arennol, y gallai eu cynhyrchion protein wasanaethu fel biofarcwyr newydd ar gyfer ARF. Fe wnaethom nodi saith genyn sydd wedi'u huwchreoleiddio 10-plyg, ac adroddwyd yn ddiweddar bod un ohonynt (Cyr61) wedi'i achosi ar ôl isgemia arennol (8). Yn annisgwyl, roedd sefydlu'r chwe thrawsgrifiad arall yn newydd i faes ARF. Yn yr astudiaeth hon, dewisom nodweddu ymhellach un o'r genynnau hyn nas cydnabuwyd yn flaenorol, sef NGAL.

Mae NGAL yn perthyn i'r superfamily lipocalin o - 20 proteinau secretu sy'n gysylltiedig â strwythurol y credir eu bod yn cludo amrywiaeth o ligandau o fewn calycs-baril (23). Dynodwyd NGAL dynol yn wreiddiol fel protein 25-kD wedi'i rwymo'n cofalent i gelatinase o niwtroffiliau dynol, lle mae'n cynrychioli un o'r proteinau gronynnog eilaidd neutrophil (24,25). Mae astudiaethau clonio moleciwlaidd wedi datgelu bod NGAL dynol yn debyg i'r genyn llygoden 24p3 ​​a nodwyd gyntaf mewn diwylliannau sylfaenol arennau'r llygoden a ysgogwyd i amlhau (26). Mynegir NGAL ar lefelau isel iawn mewn meinweoedd dynol eraill, gan gynnwys yr aren, y tracea, yr ysgyfaint, y stumog a'r colon (27). Mae mynegiant NGAL yn cael ei ysgogi'n sylweddol mewn epithelia wedi'i ysgogi. Er enghraifft, mae'n cael ei uwch-reoleiddio mewn celloedd epithelial colonig mewn ardaloedd o lid neu neoplasia ond mae'n absennol o feysydd nad ydynt yn ymwneud â hwy nac o fewn briwiau metastatig (28). Mae crynodiadau NGAL yn uwch yn serwm cleifion â heintiau bacteriol acíwt (29), sbwtwm pobl ag asthma neu glefyd rhwystrol cronig yr ysgyfaint (30), a'r hylif bronciol o'r ysgyfaint emffysematous (31). Ym mhob un o'r achosion hyn, mae ymsefydlu NGAL yn cael ei ragdybio i fod yn ganlyniad i ryngweithio rhwng celloedd llidiol a'r leinin epithelial, gyda upregulation mynegiant NGAL yn amlwg yn y ddau neutrophils a'r epitheliwm (28-32).

Nid yw dadreoleiddio NGAL yn yr aren aeddfed wedi'i ddisgrifio hyd yma. Mae sawl llinell o dystiolaeth a gasglwyd o'n hastudiaeth yn awgrymu bod yr anwythiad NGAL a ganfuwyd yn cynrychioli ymateb cynhenid ​​​​newydd o gelloedd tiwbyn procsimol yr arennau i anaf isgemig ac nad yw'n deillio o niwtroffiliau actifedig yn unig. Yn gyntaf, mae'r ymateb yn hynod gyflym, gyda NGAL yn ymddangos yn yr wrin o fewn 2 h i'r anaf (yn yr allbwn wrin cyntaf ar ôl achludiad rhydweli arennol), a chroniad niwtroffil arennol yn y model hwn o ARF isgemig fel arfer yn cael ei nodi gyntaf am 4 h. ar ôl anaf (33-35). Yn ail, mae patrymau amser sefydlu NGAL a chroniad niwtroffil yn wahanol. NGAL mRNA a mynegiant protein ei nodi i'r eithaf ar 12 h o reflow, tra bod cronni neutrophil copaon ar 24 h (33-35), ac erbyn hynny mynegiant NGAL wedi gostwng yn sylweddol. Yn drydydd, ni chanfuwyd unrhyw niwtroffiliau sy'n mynegi NGAL gan imiwnfflworoleuedd yn y samplau arennau a archwiliwyd (Ffigur 4). Yn bedwerydd a'r mwyaf perswadiol, dogfennwyd bod mRNA NGAL ac anwythiad protein yn digwydd mewn celloedd tiwbyn procsimol dynol diwylliedig ar ôl isgemia in vitro, gyda NGAL wedi'i secretu i'r cyfrwng diwylliant o fewn 1 awr i ddisbyddiad ATP, mewn system lle mae niwtroffiliau yn gwbl absennol. Fodd bynnag, nid yw ein hastudiaethau in vivo yn caniatáu inni eithrio'n gyfan gwbl rywfaint o gyfraniad rhag ymdreiddio i niwtroffiliau actifedig i'r dadreoleiddiad NGAL a arsylwyd. Yn wir, mae'n bosibl y gallai rhyddhau cytocinau o niwtroffiliau sydd wedi'u dal yn y microgylchrediad yn gynnar ar ôl anaf isgemig achosi i uwch-reoleiddio NGAL mewn celloedd tiwbyn arennol gael ei achosi.

Beth yw cistanche? Cistancheyn gallu trinarennolanaf

Bu diffyg esboniad digonol ar gyfer sefydlu NGAL gan epithelia wedi'i ysgogi, ac mae'n aneglur a yw NGAL yn amddiffynnol neu'n agos at anaf neu hyd yn oed wyliwr diniwed. Mae tystiolaeth ddiweddar yn awgrymu, o leiaf mewn is-set o fathau o gelloedd, y gall NGAL gynrychioli moleciwl proapoptotig (36-38). Yn llinell gell lymffosytig pro-B y llygoden, arweiniodd tynnu cytocin yn ôl at anwythiad amlwg o NGAL yn ogystal â dyfodiad apoptosis (36,37). Mae NGAL hefyd wedi'i gysylltu ag apoptosis mewn meinweoedd atgenhedlu. Mae celloedd epithelial y chwarren famari a'r groth involuting yn mynegi lefelau uchel o NGAL, gan gyd-fynd dros dro â chyfnod o apoptosis mwyaf posibl (38). Mae'n debygol bod NGAL yn rheoleiddio is-set o boblogaethau celloedd trwy ysgogi apoptosis. Gall epithelia ysgogol ddadreoleiddio NGAL i gymell apoptosis o niwtroffiliau ymdreiddio, a thrwy hynny ganiatáu i'r celloedd preswyl oroesi difrod yr ymateb llidiol. Fel arall, gall celloedd epithelial ddefnyddio'r mecanwaith hwn i reoli eu tranc eu hunain. Fodd bynnag, mae'n ddiddorol nodi yn ein hastudiaethau bod ymsefydlu NGAL ar ôl yr anaf isgemia-atlifiad arennol cynnar yn digwydd yn bennaf mewn celloedd tiwbyn cyfagos nad oeddent yn arddangos niwclysau TUNEL-positif.

Mae astudiaethau diweddar eraill wedi datgelu bod NGAL yn gwella'r ffenoteip epithelial. Mynegir NGAL gan y blagur wreterig treiddiol ac mae'n sbarduno nephrogenesis trwy ysgogi trosi celloedd mesenchymal yn epithelia arennau (21). Dangoswyd bod lipocalin arall, glycodelin, yn ysgogi ffenoteip epithelial o'i fynegi mewn celloedd carcinoma'r fron dynol (40). Mae'r canfyddiadau hyn yn arbennig o berthnasol i'r aren aeddfed, ac un o'r ymatebion sydd wedi'u dogfennu'n dda i anaf isgemig yw ymddangosiad rhyfeddol celloedd epithelial dadwahaniaethol sy'n leinio'r tiwbiau procsimol (41). Agwedd bwysig ar adfywio ac atgyweirio arennol ar ôl anaf isgemig yw ad-ennill y ffenoteip epithelial, proses sy'n ailadrodd sawl agwedd ar ddatblygiad arferol (42). Mae hyn yn awgrymu y gall NGAL gael ei fynegi gan y tiwbyn wedi'i ddifrodi i gymell ail-epithelialization. Mae cefnogaeth i'r syniad hwn yn deillio o nodi NGAL yn ddiweddar fel protein sy'n cludo haearn sy'n ategu trosglwyddiadrin yn ystod nephrogenesis (21). Mae'n hysbys bod trosglwyddo haearn i gelloedd yn hanfodol ar gyfer twf a datblygiad celloedd, ac mae'n debyg bod hyn yn hollbwysig i adfywiad arennol ôl-isgemig yn union fel y mae yn ystod ontogeni. Oherwydd ei bod yn ymddangos bod NGAL yn rhwymo ac yn cludo haearn (21), mae'n debygol hefyd y gall NGAL wasanaethu fel sinc ar gyfer haearn sy'n cael ei sied o gelloedd epithelial tiwbyn procsimol sydd wedi'u difrodi. Oherwydd y gall NGAL gael ei endocytosed gan y tiwbyn procsimol (K. Mori a J. Barasch, arsylwadau heb eu cyhoeddi), gallai'r protein o bosibl ailgylchu haearn i gelloedd hyfyw. Gallai hyn ysgogi twf a datblygiad, yn ogystal â thynnu haearn, moleciwl adweithiol, o safle anaf i feinwe, a thrwy hynny gyfyngu ar sytowenwyndra haearn-gyfryngol. Mae ein canlyniadau'n dangos bod cyd-leoli NGAL mewn PCNA-positif yn adfywio ac yn amlhau celloedd tiwbyn yn rhoi cefnogaeth bellach i'r ddamcaniaeth hon.

Mae un o oblygiadau mawr ein canfyddiadau yn ymwneud â'r posibilrwydd y gallai NGAL fod yn fiomarcwr wrinol newydd ar gyfer isgemia.arennolanafsy'n cymharu'n ffafriol â biofarcwyr eraill sydd wedi'u disgrifio. Efallai mai'r enghraifft a astudiwyd orau yw moleciwl anaf i'r arennau-1 (KIM-1), moleciwl adlyniad tybiedig sy'n ymwneud ag adfywiad arennol (43,44). Mewn model llygod mawr o anaf isgemia-atlifiad, canfuwyd bod KIM-1 wedi'i uwchreoleiddio 24 i 48 h ar ôl y sarhad cychwynnol, gan ei wneud yn farciwr dibynadwy ond braidd yn hwyr o ddifrod celloedd tiwbaidd. Mae astudiaethau cain diweddar wedi dangos y gellir canfod KIM-1 yn y biopsi arennau ac wrin cleifion â necrosis tiwbaidd acíwt isgemig (45). Fodd bynnag, cofnodwyd y canfyddiad hwn mewn cleifion â niwed arennol isgemia sefydledig, ac nid yw defnyddioldeb mesuriad wrinol KIM ar gyfer canfod anafiadau isglinigol cynnar wedi'i ddilysu hyd yma. Mewn enghraifft ddiweddar arall, canfuwyd bod Cyr61 yn brotein llawn cystein wedi'i gyfrinachu y gellir ei ganfod yn yr wrin 3 i 6 h ar ôl anaf arennol isgemig (8). Fodd bynnag, roedd y canfyddiad hwn yn gofyn am gam puro bioafinity gyda gleiniau heparin-Sepharose, a hyd yn oed ar ôl puro o'r fath, roedd sawl peptid croes-adweithiol yn amlwg. Mewn cyferbyniad, mae ein hastudiaeth yn dangos bod NGAL wedi'i ganfod yn hawdd ac yn gyflym fel peptidau imiwn-adweithiol cymharol lân mewn blots Gorllewinol gyda chyn lleied ag 1 l o'r allbwn wrin heb ei brosesu cyntaf un ar ôl isgemia arennol mewn llygod a llygod mawr. Yn ogystal, roedd NGAL wrinol yn amlwg hyd yn oed ar ôl isgemia arennol "isglinigol" ysgafn iawn, er gwaethaf lefelau creatinin serwm arferol. Ymhellach, roedd canfod NGAL wrinol ymhell cyn ymddangosiad marcwyr traddodiadol yn yr wrin, gan gynnwys 2- microglobulin a NAG.

Yn olaf, mae'n werth nodi bod NGAL hefyd i'w ganfod yn yr wrin yn gynnar ar ôl rhoi cisplatin, ar adeg pan oedd dangosyddion morffolegol a biocemegol eraill oarennolanafyn absennol. Felly, gall dadreoleiddio ac ysgarthu wrinol NGAL gynrychioli ymateb cyflym o gelloedd tiwbyn arennol i amrywiaeth o sarhad, a gall canfod NGAL yn yr wrin gynrychioli offeryn clinigol anfewnwthiol sy'n berthnasol yn eang ar gyfer diagnosis cynnar o anaf celloedd tiwbyn.

I grynhoi, mae ein data yn dangos bod NGAL yn cynrychioli biomarcwr wrinol newydd, sensitif, anfewnwthiol ar gyfer isgemia arennol. Bydd yn bwysig mewn gwaith trosiadol yn y dyfodol archwilio mynegiant NGAL yn wrin cleifion â ffurfiau ysgafn a cynnar o isgemia.arennolanaf. Y gobaith yw y bydd canfod mor gynnar â hyn yn galluogi clinigwyr i sefydlu ymdrechion ymyriadol amserol mewn methiant arennol acíwt, cyflwr sy'n dal i fod yn gysylltiedig â phrognosis digalon y mae dirfawr angen therapïau newydd ar ei gyfer. At hynny, y gobaith yw y bydd canfod NGAL wrinol mor gyflym a syml mewn cleifion ag isgemia cynnil, isglinigol.arennolanaf(ee, trawsblaniadau aren sy'n gysylltiedig â byw, llawdriniaeth fasgwlaidd, digwyddiadau cardiofasgwlaidd) neu ddifrod neffrotocsig isglinigol (ee, defnyddio cyfryngau gwrthgyferbyniol ac aminoglycosidau) yn rhybuddio'r clinigwr i gychwyn symudiadau gyda'r nod o atal dilyniant i ARF amlwg.

Diolchiadau

Cefnogwyd y gwaith hwn gan grantiau gan y Sefydliadau Iechyd Cenedlaethol/Sefydliad Cenedlaethol Diabetes a Chlefydau Treulio ac Arennau i PD (DK53289, DK52612) a JB (DK55388 a DK58872).

Cistanche tubulosayn gallu trinanaf arennol

Cyfeiriadau
1. Thadani R, Pascual M, Bonventre JV: Methiant arennol acíwt. N Eng J Med 334: 1448–1460, 1996
2. Seren RA: Trin aciwtarennolmethiant. Arennau Int 54: 1817–1831, 1998
3. Liaño F, Pascual J: Ffactorau rhagfynegi a sgorio. Yn: Methiant Arennol Acíwt, golygwyd gan Molitoris BA, a Finn WF, Philadelphia, WB Saunders, 2001, tt 507–518
4. Molitoris BA: Trosglwyddo i therapi mewn methiant arennol acíwt isgemig. J Am Soc Nephrol 14:265–267, 2003
5. Brady HR, Brenner BM, Clarkson MR, Lieberthal W: Methiant arennol acíwt. Yn: The Kidney, 6th Ed., golygwyd gan Brenner BM, Philadelphia, WB Saunders, 2000, tt 1201–1262
6. Sutton TA, Molitoris BA: Mecanweithiau anaf cellog mewn methiant arennol acíwt isgemig. Semin Nephrol 18:490–497, 1998
7. Sheridan AC, Bonventre JV: Bioleg celloedd a mecanweithiau moleciwlaidd anaf mewn isgemig aciwtarennolmethiant. Curr Opin Nephrol Hypertens 9:327–334, 2000
8. Muramatsu Y, Tsujie M, Kohda Y, Pham B, Perantoni AO, Zhao H, Jo SK, Yuen PST, Craig L, Hu X, Star RA: Canfod protein llawn cystein yn gynnar 61 (CYR61, CCN1) mewn wrin yn dilyn anaf arennol isgemia-atlifiad. Arennau Int 62: 1601–1610, 2002

9. Kurella M, Hsiao LL, Yishida T, Randall JD, Chow G, Sarang SS, Jensen RV, Gullans SR: dadansoddiad microarray DNA o brosesau biolegol cymhleth. J Am Soc Nephrol 12:1072–1078, 2001

10. Yoshida T, Kurelia M, Beato F, Min H, Ingelfinger JR, Stears RL, Swinford RD, Gullans SR, Tang SS: Monitro newidiadau mewn mynegiant genynnau mewn isgemia arennol-atlifiad yn y llygoden fawr. Arennau Int 61: 1646–1654, 2002

11. Supavekin S, Zhanh W, Kucherlapati R, Kaskel FJ, Moore LC, Devarajan P: Mynegiant genynnau gwahaniaethol yn dilyn isgemia arennol cynnar/atlifiad. Arennau Int 63: 1714–1724, 2003
12. Nogae S, Miyazaki M, Kobayashi N, Saito T, Abe K, Saito H, Nakane PK, Nakanishi Y, Koji T: Sefydlu apoptosis mewn model isgemia-atlifiad aren y llygoden: Ymgyfraniad posibl Fas. J Am Soc Nephrol 9:620–631, 1998
13. Daemen MARC, Van de Ven MWCM, Heineman E, Buurman WA: Ymwneud interleukin mewndarddol-10 a ffactor necrosis tiwmor- mewn anaf arennol isgemia-atlifiad. Trawsblannu 67:792–800, 1999
14. Kelly KJ, Plotkin Z, Dagher PC: Mae atodiad Guanosine yn lleihau apoptosis ac yn amddiffynarennolswyddogaeth wrth osod anaf isgemig. J Clin Buddsoddi 108: 1291–1298, 2001
15. Burne NJ, Rabb H: Cyfraniadau pathoffisiolegol ffycosyltransferases mewn anaf arennol isgemia-atlifiad. J Immunol 169: 2648–2652, 2002
16. Megyesi J, Safirstein RL, Price PM: Mae sefydlu p21WAF1/CIP/SD1 mewn celloedd tiwbyn arennau yn effeithio ar gwrs acíwt a achosir gan cisplatinarennolmethiant. J Clin Buddsoddi 101: 777–782, 1998
17. Shiraishi F, Curtis LM, Truong L, Poss K, Visner GA, Madsen K, Nick HS, Agarwal A: Mae abladiad neu fynegiant genyn Heme oxygenase-1 yn modylu apoptosis tiwbaidd arennol a achosir gan cisplatin. Am J Physiol 278: F726–F736, 2000
18. Ramesh G, Reeves WB: TNF- cyfryngu mynegiant cemocin a cytocin aarennolanafmewn nephrotoxicity cisplatin. J Clin Invest 110: 835–842, 2002
19. Feldenberg LR, Thevananther S, del Rio M, De Leon M, Devarajan P: Mae disbyddiad rhannol ATP yn achosi apoptosis cyfryngol Fas- a caspase mewn celloedd MDCK. Am J Physiol 276: F837–F846, 1999
20. Devarajan P, De Leon M, Talasazan F, Schoenfeld AR, Davidowitz EJ, Burk RD: Mae cynnyrch genynnau von Hippel-Lindau yn atal apoptosis celloedd arennol trwy lwybrau dibynnol Bcl. J Biol Chem 276: 40599–40605, 2001
21. Yang J, Goetz D, Li JY, Wand W, Mori K, Setlik D, Du T, ErdjumentBromage H, Tempst P, R Cryf, Barasch J: Llwybr cyflenwi haearn wedi'i gyfryngu gan lipocalin. Cell Mol 10: 1045–1056, 2002
22. Molitoris BA, Weinberg JM, Venkatachalam MA, Zager RA, Nath KA, Goligorsky MS: Methiant arennol acíwt II. Modelau arbrofol o fethiant arennol acíwt: Amherffaith ond anhepgor. Am J Physiol 278: F1–F12, 2000
23. Blodau DR, Gogledd AC, Sansom CE: Y teulu protein lipocalin: trosolwg strwythurol a dilyniant. Acta Bioffys Biochim 1482: 9–24, 2000
24. Kjeldsen L, Cowland JB, Borregaard N: Lipocalin sy'n gysylltiedig â neutrophil gelatinase dynol a phroteinau homologaidd mewn llygod mawr a llygoden. Acta Bioffys Biochim 1482: 272–283, 2000
25. Xu S, Venge P: Lipocalinau fel marcwyr biocemegol o glefyd. Acta Bioffys Biochim 1482: 298–307, 2000
26. Hraba-Renevey S, Turler H, Kress M, Salomon C, Weil R: SV40-mynegiant ysgogedig o genyn llygoden 24p3 ​​yn cynnwys mecanwaith ôl-dysgrifio. Oncogene 4: 601–608, 1989
27. Cowland JB, Borregaard N: Nodweddiad moleciwlaidd a phatrwm mynegiant meinwe'r genyn ar gyfer lipocalin sy'n gysylltiedig â neutrophil gelatinase gan bobl. Genomeg 45:17–23, 1997
28. Nielson BS, Borregaard N, Bundgaard JR, Timshel S, Sehested M, Kjeldsen L: Sefydlu synthesis NGAL mewn celloedd epithelial neoplasia colorectol dynol a chlefydau coluddyn llidiol. Perfedd 38:414–420, 1996
29. Xu SY, Pauksen K, Venge P: Mae mesuriadau serwm o lipocalin neutrophil dynol (HNL) yn gwahaniaethu rhwng heintiau bacteriol a firaol acíwt. Scand J Clin Lab Invest 55: 125–131, 1995
30. Keatings VM, Barnes PJ: Marcwyr actifadu granulocyte mewn sbwtwm anwythol o'i gymharu rhwng clefyd rhwystrol cronig yr ysgyfaint, asthma, a phynciau arferol. Am J Respir Crit Care Med 155: 449–453, 1997
31. Betsuyaky T, Nishimura M, Takeyabu K, Tanino M, Venge P, Xu S, Kawakami Y: proteinau granule Neutrophil mewn hylif lavage broncoalfeolar o bynciau ag emffysema isglinigol. Am J Respir Crit Care Med 159: 1985–1991, 1999
32. Carlson M, Raab Y, Severus L, Xu S, Hallgren R, Venge P: Mae lipocalin neutrophil dynol yn farciwr unigryw o lid neutrophil mewn colitis briwiol a phroctitis. Perfedd 50:501–506, 2002
33. Chiao H, Kohda Y, McLeroy P, Craig L, Tai I, Seren RA: -Melanocyte-ysgogol hormon yn amddiffyn yn erbynarennolanafar ôl isgemia mewn llygod a llygod mawr. J Clin Buddsoddi 99: 1165–1172, 1997
34. Rabb H, Ramirez G, Saba SR, Reynolds D, Xu J, Flavell R, Antonia S: Anaf arennol isgemia-atlifiad mewn llygod L-selectin-ddiffygiol. Am J Physiol 271: F408–F13, 1996
35. Rabb H, Seren R: Ymateb llidiol a'i ganlyniadau mewn acíwtarennolmethiant. Yn: Methiant Arennol Acíwt, golygwyd gan Molitoris BA, a Finn WF, Philadelphia, WB Saunders, 2001, tt 89 –100
36. Devireddy LR, Teodoro JG, Richard FA, Green MR: Sefydlu apoptosis gan lipocalin cudd sy'n cael ei reoleiddio'n drawsgrifiadol gan amddifadedd IL-3. Gwyddoniaeth 293: 829–834, 2001
37. Persengiev SP, Devireddy LR, Gwyrdd MR: Atal apoptosis gan ATFx: Rôl newydd i aelod o deulu ATF/CREB o ffactorau trawsgrifio bZIP mamalaidd. Genes Dev 16: 1806–1814, 2002
38. Ryon J, Bendickson L, Nilsen-Hamilton M: Mynegiant uchel wrth gynnwys meinweoedd atgenhedlu uterocalin/24p3, lipocalin a phrotein cyfnod acíwt. Biochem J 367: 271–277, 2002
39. Wedi ei ddileu yn brawf.
40. Kamarainen M, Seppala M, Virtanen I, Andersson LC: Mae mynegi glycodelin yng nghelloedd canser y fron MCF-7 yn cymell gwahaniaethu i'r epitheliwm acinar trefniadol. Lab Invest 77:565–573, 1997
41. Witzgall R, Brown D, Schwarz C, Bonventre JV: Lleoli antigen niwclear celloedd lluosog, vimentin, c-fos, a chlwstwr yn yr aren postischemig: Tystiolaeth ar gyfer ymateb genetig heterogenaidd ymhlith segmentau neffron, a chronfa fawr o gelloedd mitotaidd celloedd gweithredol a diwahaniaeth. J Clin Buddsoddi 93: 2175–2188, 1994
42. Hammerman MR: Ailddangos ffylogeni gan ontoneg mewn neffroleg. Arennau Int 57: 742–755, 2000
43. Ichimura T, Bonventre JV, Bailly V, Wei H, Hession CA, Cate RL, Sanicola M: Moleciwl anaf i'r arennau-1 (KIM-1), moleciwl adlyniad cell epithelial tybiedig sy'n cynnwys imiwnoglobwlin newydd parth, yn cael ei uwch-reoleiddio mewn celloedd arennol ar ôl anaf. J Biol Chem 271: 4135–4142, 1998
44. Bailly V, Zhang Z, Meier W, Cate R, Sanicola M, Bonventre JV: Colli moleciwl anaf i'r arennau -1, protein adlyniad tybiedig sy'n ymwneud ag adfywiad arennol. J Biol Chem 277: 39739– 39748, 2002
45. Han WK, Bailly V, Abichandani R, Thadani R, Bonventre JV: Moleciwl anaf i'r arennau-1 (KIM-1): Biomarcwr newydd ar gyfer anaf tiwbyn procsimol arennol dynol. Arennau Int 62: 237–244, 2002