Ymatebion Imiwnedd i Drawsblannu Binocwlaidd Dilyniannol O Gelloedd Epilydd Retinol Allogeneig I'r Ceudod Gwydraidd mewn Llygod

Crynodeb:

Mae trawsblaniad intravitreal o gelloedd progenitor retina dynol allogeneig (RPC) yn dal yn addewid fel triniaeth ar gyfer dallu dirywiad y retina. Mae gwaith blaenorol wedi dangos bod epilyddion niwral yn cael eu goddef yn dda fel alograffau yn dilyn pigiadau unigol; fodd bynnag, mae cyflenwad dilyniannol o gelloedd allogeneig yn codi'r risg bosibl o sensiteiddio gwesteiwr gyda gwrthodiad imiwnedd dilynol o impiadau. Cynlluniwyd yr astudiaeth bresennol i asesu a fyddai ymateb imiwn yn cael ei achosi gan drawsblaniadau mewnfireal dro ar ôl tro o RPCs allogeneig gan ddefnyddio'r model anifail llygoden. Fe wnaethom chwistrellu celloedd epilydd retinol murine (gmRPCs), a oedd yn deillio'n wreiddiol gan roddwyr â chefndir genetig C57BL/6, i lygod derbynnydd BALB/c er mwyn darparu data diogelwch ynghylch yr hyn y gellid ei ddisgwyl yn dilyn triniaeth dro ar ôl tro i gleifion â chynnyrch celloedd dynol allogeneig. . Roedd ymatebion imiwnedd i gmRPCs yn ysgafn, yn cynnwys celloedd T, celloedd B, neutrophils, a chelloedd lladd naturiol, gyda macroffagau yn amlwg yn bennaf. Ni ddangosodd anifeiliaid a gafodd eu trin â dosau amlroddadwy o gmRPCs dystiolaeth o sensiteiddio, ac ni chafodd yr impiadau eu dinistrio ar sail imiwnedd ychwaith. Er gwaethaf absenoldeb triniaethau gwrthimiwnedd, goroesodd impiadau gmRPC allogeneig ar ôl dosio dro ar ôl tro, a thrwy hynny ddarparu cefnogaeth ar gyfer yr arsylwad rhagarweiniol bod chwistrelliad ailadroddus o RPCs allogeneig i'r ceudod gwydrog yn cael ei oddef mewn cleifion â retinitis pigmentosa.

system imiwnedd sy'n cynyddu planhigion cistanche

Cliciwch yma i weld cynhyrchion Gwella Imiwnedd Cistanche

【Gofyn am fwy】 E-bost:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Geiriau allweddol: bôn-gelloedd; goddefgarwch imiwnedd; braint imiwnedd; gwrthod impiad; pigiad intravitreal

1. Rhagymadrodd

Mae retinitis pigmentosa (RP) yn cwmpasu dosbarth o ddirywiad genetig gwialen-côn ac yn arwain at nam cynyddol ar y golwg a dallineb yn y pen draw. Ar gyfer y mwyafrif helaeth o achosion, nid oes unrhyw fesurau therapiwtig profedig ar gael i gadw neu adfer golwg; fodd bynnag, un strategaeth ar gyfer mynd i'r afael â'r angen meddygol hwn sydd heb ei ddiwallu yw trawsblannu bôn-gelloedd. Mae ein grŵp ymchwil wedi archwilio chwistrelliad intravitreal o gelloedd epiliaid retinol dynol diwylliedig (RPC) fel ffordd o ymyrryd yn RP gyda'r nod therapiwtig o sefydlogi dilyniant neu efallai wrthdroi cwrs y clefyd. Gall RPGs ddeillio o retinas anaeddfed trwy roi meinwe neu, yn fwy diweddar, o linellau celloedd lluosog. Mae astudiaethau mewn modelau anifeiliaid wedi dangos bod y celloedd hyn yn gallu achub ffotodderbynyddion rhag dirywiad yn dilyn pigiad i'r llygad a'u bod hefyd yn gallu gwahaniaethu i ffotodderbynyddion gwialen yn llygad y gwesteiwr. Mae rhywfaint o dystiolaeth o astudiaethau anifeiliaid y gall hRPCs wedi'u chwistrellu ddod yn ffoto-dderbynyddion ymarferol, integredig a thrwy hynny o bosibl sefydlogi'r retina trwy ailosod celloedd sy'n marw yn uniongyrchol. Felly, gallai hRPCs wedi'u chwistrellu drin RP mewn modd niwrotroffig yn ogystal â thrwy fecanwaith ailosod celloedd. Y naill ffordd neu'r llall, mae'r dull hwn sy'n seiliedig ar gelloedd yn cynnig strategaeth resymegol ar gyfer trin cleifion sy'n dioddef o RP ac, o bosibl, afiechydon retinol eraill.

Priodoledd ffafriol arall RPCs, ac efallai epilyddion niwral yn gyffredinol, yw'r goddefgarwch cymharol a roddir i'r celloedd hyn ar ôl trawsblannu fel alograffau, yn enwedig pan gânt eu danfon i leoliad sy'n arddangos braint imiwn fel y retina [1,2]. Wedi dweud hynny, mae adolygiadau diweddar o dreialon clinigol a gynhaliwyd ym maes meddygaeth adfywiol yn parhau i adrodd am heriau eang a sylweddol yn ymwneud â llid a gwrthodiad imiwn [3,4], gan gynnwys ar gyfer ymyriadau sy'n targedu'r llygad fel therapïau genynnau retina [5], fel yn ogystal â rhai ond nid pob therapi celloedd [6]. Er ei fod yn fath o gell leol, nid yw'r gell epithelial pigment retinol (RPE) wedi'i eithrio rhag materion gwrthod [7-9]; felly, mae atal imiwnedd derbynwyr yn arfer safonol ar hyn o bryd [10,11]. Mae'n ymddangos bod RPCs dynol, ar y llaw arall, yn cael eu goddef yn rhyfeddol o dda fel allograftiau [6,12-16], er nad yw hyn yn ymestyn i'w defnyddio fel xenografftiau, lle mae angen ataliad imiwn [17]. Mae'r sail ar gyfer goroesiad parhaus RPCs allogeneig yn y llygad yn debygol o gynnwys nifer o ffactorau sy'n ymwneud â'r celloedd a ddefnyddir a'r safle derbyn [1,8,18,19]. Mewn gwaith blaenorol gan ddefnyddio cytometreg llif, rydym wedi dangos bod epilyddion niwral dynol, sy'n deillio o'r ymennydd ac yn deillio o retina, yn fynegiant dosbarth I, ond nid dosbarth II, antigenau histocompatibility mawr (MHC) [20,21]. Mae'r mecanwaith clasurol o wrthod impiad yn cynnwys adnabyddiaeth amhenodol o foleciwlau dosbarth II MHC tramor gan CD4+ lymffocytau lletyol [20–25]. Yn y modd hwnnw, gallai absenoldeb moleciwlau dosbarth II ganiatáu i gelloedd epilgar wedi'u himpio i osgoi gwrthodiad imiwn wedi'i gyfryngu trwy'r mecanwaith hwn. Fodd bynnag, nid yw statws ymddangosiadol "breintiedig imiwn" hRPCs a chwistrellir yn fewnweledol o reidrwydd yn absoliwt. Er nad yw ehedyddion y system nerfol ganolog (CNS) yn mynegi moleciwlau MHC dosbarth I neu ddosbarth II canfyddadwy ar waelodlin ac yn arddangos braint imiwnedd ymddangosiadol fel alografftiau [1,2,20], gall y celloedd hyn gael eu gwrthod imiwn o dan rai amgylchiadau. Mae astudiaethau wedi dangos y gellir ysgogi antigenau MHC trwy ysgogi epilyddion CNS ag interfferon-gamma (IFN ) [1,26]. Gellir gwrthod epilyddion CNS ar ôl sensiteiddio gwesteiwr a impiwyd yn flaenorol. Felly, mae celloedd epil CNS (gan gynnwys RPCs) yn mynegi alloantigens sy'n cael eu canfod gan y system imiwnedd letyol. Gyda'i gilydd, mae hyn yn awgrymu bod statws imiwnedd breintiedig celloedd epiliaid impiedig yn amodol ac yn destun modiwleiddio, ee gan cytocinau sy'n bresennol yn y micro-amgylchedd lleol, ac a all gael eu newid yn ystod dirywiad fel RP. Am yr holl resymau hyn, mae'n anodd rhagweld yr ymateb imiwn i chwistrelliadau RPC intravitreal lluosog a rhaid ei archwilio'n benodol.

cistanche tubulosa-gwella system imiwnedd

Os bydd triniaeth RPC yn llwyddiannus yn glinigol mewn RP, bydd cymhellion cryf ar gyfer trin y ddau lygad yn y clefyd dallu dwyochrog hwn. Am resymau diogelwch o leiaf, byddai triniaethau ysbienddrych fel arfer yn cael eu cynnal yn ddilyniannol, gydag oedi sylweddol rhwng y ddau bigiad. Mae'n werth nodi y gallai'r cyflenwad dilyniannol hwn o gelloedd allogeneig arwain at sensiteiddio gwesteiwr mewn ymateb i'r pigiad cyntaf, a allai sbarduno gwrthodiad imiwn mewn ymateb i'r ail chwistrelliad. Gallai hyn arwain at golli impiadau yn y ddau lygad. Roedd adroddiadau blaenorol a oedd yn archwilio dosiad subretinol sengl gyda hRPCs yn RP [27] neu ail-wneud ag epilyddion niwral dynol mewn anifeiliaid [28,29] yn ymgorffori ataliad imiwnedd. Felly, cynlluniwyd yr astudiaeth ganlynol fel ymchwiliad trosiadol o RPCs murine fel alografftiau dilyniannol mewn straen llygoden sy'n gymwys imiwn ac sydd â chefndir genetig gwahanol. Er nad oedd yn cynnwys cynhyrchion RPC dynol, perfformiwyd y gwaith hwn fel rhan o astudiaethau galluogi IND er mwyn darparu data anifeiliaid sy'n mynd i'r afael â diogelwch, hy, a fyddai ataliad imiwn yn angenrheidiol i gleifion sy'n derbyn triniaethau alografft RPC dro ar ôl tro mewn treialon a gofrestrwyd gan FDA.

2. Canlyniadau

I astudio canlyniadau imiwnolegol pigiad RPC dwyochrog mewn llygod allogeneig, chwistrellwyd gmRPCs (cefndir genetig C57BL/6) yn fewnwythiennol i un llygad derbynwyr BALB/c a chwistrellwyd ail ddos ​​o RPCs i'r llygad arall bythefnos yn ddiweddarach. Dewiswyd y 2-cyfwng amser wythnos i fod yn ddigon i ganiatáu i'r impiad cyntaf ysgogi ymatebion imiwn cynhenid ​​​​ac addasol. Ni dderbyniodd yr un o'r anifeiliaid arbrofol unrhyw driniaethau cyffuriau atal imiwnedd fel y gellid arsylwi ar yr ymatebion imiwn ffisiolegol naturiol.

2.1.Ni Datgelodd Arsylwi Clinigol ac Archwiliad Offthalmig Dim Annormaleddau

Mesurwyd pwysau anifeiliaid arbrofol ar adeg pob pigiad gmRPC. Dangosodd pob anifail arbrofol gynnydd pwysau rhwng y pigiad cyntaf a'r ail chwistrelliad, yn gyson ag iechyd da yn gyffredinol. Archwiliwyd anifeiliaid a derfynwyd ar ddiwrnod 14 a diwrnod 28 ± 1 ar ôl yr ail chwistrelliad gmRPC trwy'r microsgop llawfeddygol. Barnwyd bod segmentau blaen ac ôl y mwyafrif o'r llygaid a archwiliwyd "o fewn terfynau arferol" (WNL). Nid oedd unrhyw arwyddion o lid nac annormaleddau gweladwy eraill o fewn grwpiau heb eu trin, wedi'u trin â ffug, a grwpiau wedi'u trin â gmRPC, gan nodi nad oedd chwistrelliad mewnwythiennol gmRPC yn achosi ymatebion llidiol anghyfreithlon na difrod meinwe corfforol y gellir ei ganfod trwy'r dull hwn. Roedd clystyrau celloedd yn cynnwys yr impiad yn weladwy yn y gwydrog ar ddiwrnod 14 a diwrnod 28 ± 1 yn dilyn yr ail chwistrelliad gmRPC (Ffigur 1). Nid oedd pigiad dro ar ôl tro o gmRPCs yn achosi newidiadau amlwg ym maint y clystyrau celloedd, yn gyson â goroesiad parhaus celloedd rhoddwr. Gwerthuswyd patholeg gros hefyd ar bwynt terfyn y derfynell ac ni nodwyd unrhyw beli llygad chwyddedig (sy'n arwydd o ffurfio tiwmor) nac annormaleddau eraill.

Ffigur 1. GmRPCs wedi'u trawsblannu wedi'u delweddu in vivo trwy ffotograffiaeth fundus trwy ficrosgop llawfeddygol (pob=llygad chwith, OS). (A, B), anifeiliaid sy'n cael eu trin â ffug (sham/sham, S/S); (C, D), anifeiliaid rheoli â llygad dde wedi'i drin â ffuglen ac yna llygad chwith wedi'i drin â gmRPC (ffug/cell, S/C), ac anifeiliaid â'r ddau lygad a gafodd eu trin yn olynol â gmRPCs (cell/cell, C/C) yn arsylwi a delwedd trwy'r microsgop llawfeddygol. Mae'r panel uchaf (A, C, E) yn dangos delweddau o OS a gymerwyd ar Ddiwrnod 14 pigiad ôl-ail; mae'r panel isaf (B, D, F) yn dangos delweddau o OS a dynnwyd ar Ddiwrnod 28 ar ôl pigiad ail. Roedd alografftiau yn cael eu gweld fel clystyrau celloedd lliw golau (saethau) i'w gweld yng ngwydredd y llygaid chwith wedi'u chwistrellu â gell (S/C, C/C) ar y ddau bwynt amser (Diwrnod 14: (C, D); a Diwrnod 28: ( E, F)). Ar wahân i impiadau, ni welwyd llid amlwg nac annormaledd ychwanegol yn y segmentau blaen ac ôl, fel y'u gwelwyd yn echelinol yn y modd hwn.

2.2. Roedd Labelu Imiwnofflworoleuol yn Dangos Celloedd Imiwnedd yn y Gwydrol

Perfformiwyd labelu imiwnofflworoleuol ar gyfer pum prif fath o gelloedd imiwnedd (macrophages, neutrophils, celloedd lladd naturiol, celloedd T, a chelloedd B) ar y cryosections llygadol a datgelodd ymdreiddiad celloedd imiwnedd cadarnhaol yn y llygad yn dilyn pigiad gmRPC (Ffigur 2A-F). Roedd cell T (CD3), cell B (CD45R), neutrophil (Ly-6G), a chelloedd lladd naturiol (CD49b) yn arddangos presenoldeb cyfyngedig mewn llygaid wedi'u chwistrellu â gmRPCs, tra bod macroffagau wedi'u hactifadu (Iba-1 ) oedd y prif gelloedd imiwnedd a oedd yn ymateb i'r impiadau mewnfeitraidd. Nid oedd meinwe tebyg o anifeiliaid heb eu trin a ffug-drin yn dangos celloedd imiwn mewn cryosections llygad, sy'n awgrymu bod yr ymdreiddiad celloedd imiwnedd a welwyd yn ymateb i impiadau gmRPC. Yn gyson â'r arsylwi hwn, roedd y celloedd imiwnedd wedi'u lleoli yn yr ardal o amgylch y impiadau gmRPC neu o fewn y clystyrau gmRPC eu hunain.

Ffigur 2. Labelu imiwno-gelloedd ymdreiddio imiwn yn ôl grŵp triniaeth. Delweddau imiwnofflworoleuol o adrannau rheoli (A) (gwrthgorff eilaidd yn unig), (B) gwrth-Iba-1 (marciwr macroffag a microglia wedi'i actifadu), (C) gwrth-Ly-6G (marciwr niwtroffil), (D) gwrth-CD49b (marciwr cell lladd naturiol), (E) gwrthgyrff gwrth-CD3 (marciwr cell T), a (F) gwrth-CD45R (marciwr cell B) yn cael eu harddangos yn y ffigur. Mae'r signalau coch cyfyngedig sy'n bresennol yn nodi labelu gwrthgyrff positif ar gyfer marcwyr leucocyte, mae signalau gwyrdd yn nodi'r impiadau gmRPC ac mae signalau glas yn dynodi labelu niwclear DAPI. Mae melyn yn orgyffwrdd signalau amhenodol, yn fwyaf amlwg yn y segmentau allanol ffotoreceptor sy'n arddangos awtofflworoleuedd. Grwpiau triniaeth: heb eu trin (UT), y ddau lygad heb eu trin; S/S, y ddau lygad wedi'u trin â ffug (yn olynol) gyda'r cerbyd; S/C, llygad dde wedi'i chwistrellu â cherbyd ac yna llygad chwith gyda 50,000 gmRPCs a; C/C, y ddau lygad wedi'u chwistrellu â 50,000 gmRPCs (yn olynol) fesul atodlen yn Adran 4

Roedd niferoedd brig pob cell imiwnedd yn y llygad yn amrywio yn ôl math o gell (Ffigur 3A–E). Mewn cyferbyniad, ni ddatgelodd ANOVA dwy ffordd unrhyw wahaniaethau mewn ymdreiddiad celloedd imiwnedd wrth gymharu anifeiliaid a dderbyniodd pigiadau gmRPC sengl (sham/celloedd) â'r rhai a gafodd bigiadau dwyochrog (celloedd/celloedd). Roedd hyn yn wir am ymdreiddiad macroffagau (staenio gwrth-Iba-1) (Ffigur 3A), niwtroffiliau (staenio gwrth-Ly-6G) (Ffigur 3B), celloedd lladd naturiol (staenio CD49b) ( Ffigur 3C), celloedd T (staenio CD3) (Ffigur 3D), a chelloedd B (staenio CD45R) (Ffigur 3E).

2.3. Ni Ddangosodd ELISPOT Ymatebion Cofio Antigen

Mae ELISPOT yn ffordd o brofi actifadu celloedd T IFN sy'n benodol i antigen. Roedd triniaeth Phorbol 12-myristate 13-asetad (PMA) yn rheolaeth gadarnhaol gan ddynwared yr ail negesydd, DAG, i actifadu llwybr derbynnydd cell T ac, yn ei dro, achosi actifadu celloedd T. Yn Ffigur 4A-D, dangosodd grwpiau a gafodd driniaeth PMA gyfrifiadau sbot IFN llawer uwch o gymharu â grwpiau rheoli â chelloedd ymateb yn unig (hy, lymffocytau o CLNs, splenocytes o dueg). Pan gafodd y celloedd ymatebwr eu cyd-ddiwyllio â splenocytes C57BL / 6 (B6 SPL), roedd samplau diwrnod 14 yn debyg i'r grwpiau celloedd ymatebwr yn unig, gyda dim ond cyfrifiadau IFN ychydig yn uwch, gan nodi diffyg actifadu celloedd T (Ffigur 4A, B).

Ffigur 3. Meintioli ymdreiddiad celloedd imiwnedd yn dilyn trawsblaniad gmRPC. Cafodd celloedd imiwnedd wedi'u treiddio eu delweddu fel signalau fflwroleuol coch o fewn y maes delweddu yn dilyn pigiad gmRPC ar gyfer pob cyflwr arbrofol, eu cyfrif gan ddefnyddio ImageJ, a'u plotio mewn graffiau bar. Data o Iba-1 (marcwr macrophage a microglia wedi'i actifadu) (A), gwrth-Ly-6G (marciwr niwtroffiliau) (B), gwrth-CD49b (marciwr celloedd lladd naturiol) (C), gwrthgyrff gwrth-CD3 (marciwr celloedd T) (D), a gwrth CD45R (marciwr celloedd B) (E) yn cael eu harddangos yn y ffigur. Defnyddiwyd profion ANOVA dwy ffordd i brofi arwyddocâd rhwng y grwpiau ffug/cell a chell/cell; gwerthoedd p oedd: (A) p < {{10}}.4492, (B) p < 0.9376, (C) p < 0.119{{18 }}, (D) p < 0.6411, a (E) p < 0.7201 (nid oedd yr un yn arwyddocaol).

Wrth brofi celloedd rhoddwr allogenig gan ddefnyddio'r assay hwn, nid oedd gan y celloedd ymateb o'r anifeiliaid a chwistrellwyd yn fewnperitoneol â gmRPCs (grŵp IP) ymatebion antigen adalw gan nad oedd y samplau'n dangos mwy o actifadu celloedd T gan gyfrifiadau sbot IFN o gymharu â'r anifeiliaid ffug na ddatgelwyd erioed. i gmRPCs (ffug/sham). Ni ddangosodd yr anifeiliaid a gafodd eu chwistrellu'n fewnwythiennol â'r gmRPCs ychwaith, naill ai unwaith (ffug/cell) neu dro ar ôl tro (cell/cell) unrhyw ymatebion adalw antigen. Mewn un achos, roedd ymatebion i ddosio gmRPC ailadroddus yn ymddangos yn fwy tawel (Ffigur 4B). Gyda'i gilydd, roedd y canlyniadau hyn yn dangos bod gmRPCs yn arddangos antigenigedd isel iawn. Sylwch fod splenocytes C57BL/6 wedi'u paru â chefndir genetig y gmRPCs. Yn annisgwyl, cynyddodd y celloedd symbylydd amgen, gmRPCs, gyfrif sbot IFN yn yr holl grwpiau arbrofol o'i gymharu â'r grwpiau rheoli negyddol (Ffigur 4A-D). Eglurhad posibl fyddai'r gmRPCs sy'n achosi cefndir uchel yn yr asesiad hwn. Yn bwysig, nid oedd unrhyw wahaniaeth rhwng y pigiad gmRPC sengl heb ei drin, wedi'i drin â ffug, a grwpiau pigiad gmRPC dro ar ôl tro, a oedd unwaith eto'n nodi absenoldeb ymatebion adalw antigen.

Ffigur 4. Meintioliad ELISPOT yn dilyn trawsblaniad gmRPC. Gosodwyd profion ELISPOT fel y grwpiau canlynol: rheolaeth, celloedd ymateb yn unig (lymffocytau neu splenocytes sy'n cynnwys celloedd T wedi'u hynysu o nodau lymff ceg y groth (CLNs) neu dduegau (SPL)) yr anifeiliaid arbrofol; PMA, celloedd ymatebwr wedi'u trin â phorbol {{1} }myristate 13-asetad (PMA) a Ca ionophore; B6 SPL, celloedd ymatebydd wedi'u cymysgu â splenocytes wedi'u hynysu o anifeiliaid C57BL/6; gmRPCs, yr un celloedd ymatebydd wedi'u cymysgu â gmRPCs. (A), Y celloedd ymatebydd oedd y splenocytes o'r anifeiliaid arbrofol a aberthwyd ar ddiwrnod 14 ar ôl yr ail chwistrelliad gmRPCs (B) Y celloedd ymatebydd oedd y lymffocytau o CLNs yr anifeiliaid arbrofol a aberthwyd ar ddiwrnod 14 ar ôl yr ail chwistrelliad gmRPCs. (C) Y celloedd ymatebwr oedd y splenocytes o'r anifeiliaid arbrofol a aberthwyd ar ddiwrnod 29 ar ôl yr ail chwistrelliad gmRPCs (D) Y celloedd ymatebydd oedd y lymffocytau o CLNs yr anifeiliaid arbrofol a aberthwyd ar ddiwrnod 29 ar ôl yr ail chwistrelliad gmRPCs. Defnyddiwyd profion ANOVA dwy ffordd i brofi arwyddocâd (*) rhwng y grwpiau ffug/cell a chell/cell; gwerthoedd p oedd: (A) p < 0.5332, (B) p < 0.0001 (arwyddocaol), (C) p < 0.0207 ( arwyddocaol), a (D) p < 0.3355.

3. Trafodaeth 

Bu cryn ddiddordeb mewn technoleg bôn-gelloedd fel modd o drin clefydau dirywiol y retina ac mae ein grŵp wedi bod yn archwilio'r defnydd o hRPCs allogeneig mewn RP. Er mwyn casglu data sy'n mynd i'r afael â chanlyniadau imiwn posibl pan fydd mwy nag un dos o gynnyrch RPC dynol allogeneig yn cael ei roi trwy chwistrelliad intravitreal, fe wnaethom gynnal yr astudiaeth anifeiliaid bresennol gan ddefnyddio gmRPCs o gefndir C57BL/6 fel impiadau a llygod BALB/c fel gwesteiwyr. Defnyddiwyd y cefndiroedd genetig gwahanol hyn i fodelu triniaeth ddilyniannol gyda hRPCs allogeneig a darparu data diogelwch rhagarweiniol cyn profi mewn pobl.

Er mwyn gwerthuso ymatebion yn llawn, ni chafodd anifeiliaid lletyol unrhyw driniaeth gwrthimiwnedd. Gwnaethom gymharu'r ymatebion imiwn a gynhyrchir gan un pigiad gmRPC â dos dwyochrog dilyniannol yn unol â'r amserlen chwistrellu a ddisgrifiwyd. Ni ddatgelodd archwiliadau offthalmig llid nac unrhyw wahaniaethau nodedig eraill rhwng y grwpiau o anifeiliaid a gafodd 1 dos o gmRPCs neu 2 ddos ​​o gmRPCs, gan awgrymu naill ai nad oedd y derbynwyr wedi’u sensiteiddio gan y triniaethau gmRPC cychwynnol, neu fod y sensiteiddio yn gynnil. Datgelodd canlyniadau imiwnolabelu fod pob un o’r pum math o gelloedd imiwnedd a archwiliwyd, sef celloedd T (CD3), celloedd B (CD45R), macroffagau (Iba-1), neutrophils (Ly-6G), a chelloedd lladd naturiol ( CD49b), wedi ymdreiddio i'r llygad ac wedi targedu impiadau RPC ar ôl trawsblannu. Serch hynny, roedd yr ymdreiddiad hwn yn gymharol gymedrol ac, er bod modd canfod mathau eraill o gelloedd, roedd yn cynnwys macroffagau positif Iba-1 yn bennaf. Roedd nifer gyfyngedig iawn o gelloedd T, celloedd B, neutrophils, a chelloedd lladd naturiol yn bresennol. Yn ddiddorol, roedd y goroesiad a ddangoswyd gan impiadau RPC unigol ac ailadroddus yn gyfwerth, heb golli impiadau yn y naill achos neu'r llall, er gwaethaf presenoldeb macroffagau. Yn gyffredinol, mae hyn yn awgrymu bod ymatebion imiwn cynhenid ​​​​ac addasol i RPCs a oedd yn wahanol yn enetig yn gymedrol, er nad oedd ataliad imiwn yn cael ei ddefnyddio. At hynny, ni ddangosodd canlyniadau profion ELISPOT unrhyw ymatebion adalw antigen mewn grwpiau a driniwyd gan gmRPC, yn gyson â'r honiad nad yw celloedd T yn chwarae rhan bwysig wrth wrthod impiadau gmRPC o lygod C57BL/6. Unwaith eto, arsylwyd ymdreiddiad macrophage o impiadau gmRPC, er nad oedd hyn yn gysylltiedig â dinistrio impiad sylweddol o'r math sy'n gysylltiedig â gwrthodiad imiwnedd clasurol [22-24].

manteision cistanche ar gyfer dynion-cryfhau system imiwnedd

Gyda'i gilydd, mae'r arsylwadau hyn yn datgelu sefyllfa sy'n amlwg yn wahanol i'r mecanweithiau gwrthod trawsblaniad allogeneig cyfrwng T a B a gydnabyddir yn eang a welir mewn meinweoedd eraill. Gallai ffactorau lluosog gyfrannu at y sefyllfa hon. Ar y naill law, mae'r syniad o'r llygad fel safle "breintiedig imiwn", er bod y graddau y mae'r gwydrog yn rhannu nodweddion o'r fath â'r gornbilen a'r retina yn llai astudiedig ac efallai'n fwy dadleuol. Ar y llaw arall, mae'n ymddangos bod yr RPCs eu hunain yn dangos llai o imiwnogenigrwydd fel alografftiau, o'i gymharu â mathau o gelloedd a astudir yn amlach. Fel yr ydym wedi dangos yn flaenorol, nid oes gan RPCs gwallgof fynegiant llinell sylfaen o antigenau dosbarth I a dosbarth II MHC, er bod y rhain yn anwythol trwy ysgogiad cytocin. Gallai'r diffyg mynegiant MHC hwn gyfrannu at oroesiad y celloedd hyn ar ôl trawsblannu. Serch hynny, mae presenoldeb celloedd imiwn yn yr impiadau yn cefnogi'r cysyniad nad yw goddefgarwch impiad yn y lleoliad hwn yn oddefol a'i fod yn deillio o ffenomen imiwn-reoleiddio gweithredol. Yma, dylid pwysleisio bod yr un math o ymdreiddiad celloedd imiwn eisoes yn bresennol yn dilyn pigiadau sengl ac nad oedd wedi'i waethygu gan ddosio ailadroddus, gan danlinellu ein casgliad nad oedd ymdreiddiad celloedd imiwn o'r impiadau, yn enwedig gan macroffagau, yn ganlyniad blaenorol. sensiteiddio gwesteiwr. O fewn paramedrau'r arbrawf hwn, nid oedd yn ymddangos bod ail-ddosio yn lleihau hyfywedd impiad cyffredinol, a oedd yn gyson â'r posibilrwydd o effeithiolrwydd parhaus mewn cyd-destunau therapiwtig. Gallai paramedrau eraill, megis cyfnodau rhyng-chwistrelliad gwahanol, naill ai gynyddu neu leihau gweithgaredd celloedd imiwnedd i raddau a fyddai'n berthnasol i gymhwysiad clinigol. Mae'n aneglur a fyddai cyfansoddion cellog ymdreiddiadau, gan gynnwys goruchafiaeth macrophage, hefyd yn berthnasol i fodau dynol. At hynny, efallai na fydd goroesiad yr alografftiau hyn yn dibynnu ar retina arferol gyda rhwystr iach rhwng y gwaed a'r retina. Y derbynwyr BALB / c a ddefnyddir yma yw albinos ac maent yn agored i niwed ysgafn [30]. Ar ben hynny, gwelwyd goroesiad parhaus dro ar ôl tro mewn gwaith blaenorol gyda modelau amrywiol o ddirywiad y retin (ee, [31]).

O'i gymharu â goroesiad impiadau, mae hyfywedd celloedd o fewn y impiadau yn cyflwyno sefyllfa fwy cymhleth. Mae yna golled hysbys o gelloedd eginol CNS sy'n digwydd yn gyflym ar ôl trawsblannu, yn debygol o fod oherwydd ffactorau lluosog a allai gynnwys tynnu'n ôl yn sydyn oherwydd ffactorau twf. Unwaith y byddant wedi setlo yn y llygad, mae'r celloedd datgysylltiedig yn cyfuno'n agregau tebyg i sffêr, ac mae'n ymddangos bod eu canol yn darparu microamgylchedd is-optimaidd ar gyfer twf, efallai oherwydd diffyg fasgwlareiddio a heriau i dryledu maetholion. Gallai tropiaeth ymddangosiadol macroffagau ar gyfer impiadau RPC fod yn ymateb amhenodol i bresenoldeb y celloedd anhyfyw hyn y tu mewn i'r impiadau, gyda'r macrophages yn gweithredu yn eu rôl fel sborionwyr malurion cellog. Fel arall, gallai RPCs cwbl ddichonadwy ddenu'r macroffagau, ee, trwy fynegiant o sytocinau cemo-deniadol, a byddai'r celloedd lletyol yn dod ar draws malurion o gelloedd rhoddwyr anhyfyw yn ail. Yn bwysig, nid yw'n ymddangos bod graddfa'r ymdreiddiad macrophage a welir yn y lleoliadau penodol hyn yn cael canlyniadau negyddol i'r impiad na'r retina gwesteiwr, mewn cyferbyniad ag ymatebion i alografftiau cellog mewn safleoedd breintiedig nad ydynt yn imiwnedd [4]. Yn olaf, mae'n werth nodi y gallai'r canlyniadau a adroddir yma, er eu bod wedi'u cyfyngu i fodel murineaidd, fod â goblygiadau i waith bodau dynol. Yn wahanol i'r llygoden, gwyddom fod RPCs dynol diwylliedig yn mynegi lefelau cadarn o antigenau dosbarth I MHC ar waelodlin; felly, rhaid cyfaddef fod y gymhariaeth yn betrus. Serch hynny, mae'n ddiddorol nodi bod profion clinigol o impiadau hRPC isretinol gan grŵp yn Tsieina [13], yn ogystal â thrawsblaniad hRPC mewnfetrealaidd gan ein grŵp, wedi dangos bod yr alograffau wedi goroesi'n barhaus mewn cleifion nad ydynt yn cael eu hatal imiwneiddio â RP (JC). -01, [32], data heb ei gyhoeddi). Roedd hyn hefyd yn wir yn dilyn chwistrelliad dilyniannol o'r ddau lygad (JC-01 Estyniad, data heb ei gyhoeddi), sy'n cyfateb i'r gwaith a gyflwynir yma. Yn ogystal, gwelwyd goroesiad impiad mewn astudiaeth ddilynol ar JC-02 [33], lle rhoddwyd dosau ailadrodd dilyniannol i'r un llygad [34]. Gyda'i gilydd, mae'r canfyddiadau hyn yn dangos nad yw ataliad imiwnedd bob amser yn angenrheidiol wrth osod trawsblaniad epiliwr niwral, yn enwedig i'r llygad, er bod terfynau'r ffenomen hon a'r mecanweithiau rheoleiddio sylfaenol yn dal heb eu hegluro.

4. Defnyddiau a Dulliau

4.1. Diwylliant Cell

Dewiswyd gmRPCs a nodweddwyd yn flaenorol [31] fel celloedd rhoddwr ar gyfer yr astudiaeth allogeneig hon. Yn wreiddiol, roedd gmRPCs wedi'u hynysu o lygod C57BL/6 trawsgenig GFP a addaswyd yn enetig i fynegi protein fflwroleuol gwyrdd gwell (GFP). Roedd mynegiant protein GFP yn y gmRPCs o ddiddordeb gan ei fod yn caniatáu delweddu impiadau yn dilyn pigiad heb fod angen labelu ychwanegol. Ar gyfer yr astudiaeth gyfredol, cafodd gmRPCs eu meithrin mewn DMEM/F12 Uwch wedi'u hategu ag Atodiad N-2 (1:100, Life Technology, Carlsbad, CA, UDA), Glutamax-1 (1:100, Technoleg Bywyd , Carlsbad, CA, UDA), ac EGF (20 ng/mL, ailgyfunol, Dynol, Technolegau Bywyd, Carlsbad, CA, UDA) a deorwyd ar 37 ◦C a 5% CO2. Roedd y celloedd yn cael eu cadw mewn daliant cymysg/cytrefi wedi'u cysylltu'n rhydd mewn fflasgiau meithrin meinwe heb eu gorchuddio. Trosglwyddwyd y celloedd trwy drypsineiddio gyda TrypLE Select CTS (Life Technologies, Carlsbad, CA, UDA) wedi'i wanhau 1:5 yn PBS am funud a'i niwtraleiddio 10 gwaith y cyfaint o drypsin a ychwanegwyd. Cafodd y cymysgedd cell-trypsin ei allgyrchu ar 140 g am 2 funud ar dymheredd yr ystafell, tynnwyd y supernatant, ac ailddechreuodd y belen gell mewn cyfryngau ffres cyn hadu i fflasgiau diwylliant meinwe ar y crynodiad a ddymunir. Pennwyd crynodiad celloedd a hyfywedd trwy staenio glas trypan; perfformiwyd cyfrif gan Iarlles (Life Technologies, Carlsbad, CA, UDA) a hemocytometer.

Ar gyfer pigiadau intravitreal, cafodd y belen gell ei hailddarlledu ar gelloedd 50K / µL yn BSS PLUS®. Gwerthuswyd crynodiad celloedd a hyfywedd cyn ac ar ôl pigiadau. Y dos a chwistrellwyd oedd 50,000 cell y llygad fesul pigiad. Dewiswyd y dos a'r cerbyd yn seiliedig ar ein hastudiaethau blaenorol.

4.2. Anifeiliaid Arbrofol

Pwrpas yr astudiaeth gyfredol oedd ymchwilio i'r ymatebion imiwn allogeneig posibl a achosir trwy chwistrelliad mewnfireal dro ar ôl tro o RPCs allogeneig. Yr anifeiliaid derbyn oedd llygod BALB/c, sy'n wahanol yn enetig i'r llygod C57BL/6 yr oedd y gmRPCs wedi'u hynysu oddi wrthynt. Ystyriwyd bod angen defnyddio o leiaf dri anifail fesul grŵp arbrofol wedi’i drin ar gyfer pob pwynt amser er mwyn caniatáu ar gyfer gwerthuso arwyddocâd ystadegol rhwng grwpiau o ran newidynnau canlyniadau a cholledion anifeiliaid posibl yn ystod y cyfnod arbrofol. Ymhellach, o ystyried y llu o ffactorau ychwanegol a allai effeithio ar ganlyniad yr arbrawf, megis triniaeth chwistrellu celloedd aflwyddiannus neu athreuliad posibl o ganlyniad i ymladd anifeiliaid, perfformiwyd gweithdrefnau chwistrellu ar bum anifail fesul grŵp er mwyn sicrhau ymhellach eu bod yn bodloni'r niferoedd gofynnol ar gyfer dadansoddiad ystadegol.

cistanche tubulosa-gwella system imiwnedd

Mae Tabl 1 yn dangos y pedwar grŵp o anifeiliaid a baratowyd ar gyfer pob un o'r pwyntiau pedwar amser (4, 7, 14, a 28 diwrnod) lle byddai gwerthusiadau o histopatholeg, gan gynnwys imiwnfflworoleuedd, yn cael eu perfformio. Paratowyd dau grŵp ychwanegol o anifeiliaid a chwistrellwyd â 10ˆ6 gmRPC yn fewnberitoneol fel rheolaethau cadarnhaol ar gyfer pob un o'r ddau bwynt amser gwerthuso ELISPOT (14 a 28 diwrnod). Mae Tabl 2 yn crynhoi'r gwerthusiadau a drefnwyd ar gyfer pob grŵp.

Tabl 1. Grwpiau arbrofol.

Tabl 2. Pwyntiau amser gwerthuso.

4.3. Chwistrelliad Intravitreal

Roedd y gmRPCs yn cael eu rhoi trwy chwistrelliad mewnfireal. Ar ôl cael ei anestheteiddio, rhoddwyd Mydriacyl (toddiant offthalmig 1% Tropicamide) a Phenylephrine (hydoddiant offthalmig 2.5%) ar ddau lygad yr anifail i'w chwistrellu. Pan oedd mydriasis digonol wedi'i gyflawni, cafodd yr anifail ei atal â llaw a chylchdroi pen yr anifail i alinio echel ocwlar y llygad i'w chwistrellu ag opteg y microsgop llawfeddygol er mwyn delweddu'r segment ôl llygadol (hy, gwydrog a retina) . Cynigiwyd y llygad yn ysgafn â llaw trwy bwysau ar yr amrannau a defnyddiwyd nodwydd 31G ar chwistrell inswlin i dyllu'r sglera ger yr limbus yn y cwadrant trwynol israddol yn ysgafn. Cafodd blaen micropiped gwydr caboledig yn cynnwys celloedd rhoddwr (neu reolaeth cerbyd) ei ddatblygu trwy'r toriad i'r ceudod gwydrog o dan ddelweddu uniongyrchol. Cymerwyd gofal i beidio ag amharu ar gyfanrwydd y lens neu strwythurau segment ôl. Chwistrellwyd y celloedd neu'r cerbydau yn unig mewn cyfaint o 1 microliter. Ar ôl sawl eiliad o seibiant i ganiatáu cydbwysedd mewn pwysedd mewnocwlaidd, tynnwyd blaen y pibed yn raddol o'r llygad, i gyd o dan ddelweddu uniongyrchol. Nodwyd unrhyw waedu mewnocwlaidd, ynghyd â lleoliad. Yn dilyn y pigiad, rhoddwyd yr anifail mewn cawell glân wedi'i leinio â phad tafladwy ffres wedi'i gyfeiriannu ag ochr-i-fyny amsugnol/plastig ochr-i-lawr, i wella. Hwyluswyd adferiad gan ddefnyddio pad gwresogi ac fe'i gwiriwyd gan allu'r anifail i gerdded. Ar ôl deffro, trosglwyddwyd yr anifail i'r cawell ar ôl llawdriniaeth gyda mynediad ad libitum i ddŵr. Roedd anifeiliaid yn cael eu monitro'n weledol bob dydd ar ôl y llawdriniaeth. Arsylwyd ychydig iawn o arwyddion neu ddim arwyddion yn ymwneud â chwistrelliad intraocwlaidd.

Ar ôl y driniaeth, gwelwyd yr anifeiliaid yn rhwbio'r llygad a gafodd lawdriniaeth, ffwr crychlyd, neu syrthni parhaus, pob un ohonynt yn sail ar gyfer ewthanasia ar unwaith. Terfynwyd dau anifail o ganlyniad i glwyfau a gafwyd wrth ymladd. Terfynwyd yr holl anifeiliaid eraill yn y mannau terfyn a gynlluniwyd. Perfformiwyd ewthanasia trwy anadliad CO2.

4.4. Arholiad Offthalmig

A Leica Ultimate Red Reflex Surgical Microscope was used for ophthalmic examination and photography of experimental mice. Sedation was performed with a Ketamine Hydrochloride/Xylazine Hydrochloride mixture (50–100 mg/mL Ketamine, 5–10 mg/mL Xylazine) administered by intraperitoneal injection. After sedation, topical mydriatics (Tropicamide, Phenylephrine) were applied to the eye(s) to be imaged in 5 min intervals until adequate mydriasis was achieved, as determined via pupil diameter (>2.5 mm) ac ymateb i ysgogiad golau. Fel iawndal am golli amrantu, cymhwyswyd hydoddiant hypromellose (Gonak) yn topig yn ôl yr angen i'r ddau lygad er mwyn atal disychiad y gornbilen. Ar gyfer y weithdrefn ddelweddu, roedd anifeiliaid anestheteiddiedig yn cael eu rhoi ar bad gwresogi a'u gosod yn gorwedd yn y stumog. Ar ddiwedd y driniaeth, llwyddwyd i wrthdroi anesthesia yn rhannol trwy roi Atipamezole (0.1-1 mg/kg) trwy chwistrelliad mewnperitoneol.

4.5. Histopatholeg

Gwerthuswyd ymatebion imiwn mewn anifeiliaid a oedd yn derbyn dau impiad dilyniannol (un ym mhob llygad) trwy histopatholeg y ddau lygad ar ddiwrnod 4, diwrnod 7, diwrnod 14, a diwrnod 28 ± 1 yn dilyn pigiad yr ail lygad. Cafodd y llygod a gafodd eu trin yn unol â Thabl 1 eu terfynu ar sail yr atodlen a nodir yn Nhabl 2. Cafodd anifeiliaid eu ewthaneiddio gan ddefnyddio anadliad carbon deuocsid. Perfformiwyd darlifiadau cardiaidd ar yr anifeiliaid arbrofol gyda 2% o baraformaldehyd (PFA) mewn halwynog wedi'i glustogi â ffosffad (PBS). Yna, casglwyd yr holl beli llygaid a'u caniatáu i socian 2% PFA/PBS am 48 awr ar 4 ◦C. Proseswyd y peli llygad sefydlog trwy raddiant swcros (swcros 10% yn PBS am 1 awr ar dymheredd yr ystafell, swcros 20% yn PBS am 1 h ar dymheredd ystafell, a swcros 30% yn PBS ar 4 ◦C dros nos) cyn cael ei fewnosod yn Cyfryngau OCT ar gyfer cryosection. Cafodd cryosections (10 µm) o'r llygaid eu staenio â Harrison hematoxylin ac eosin (H&E) i ddelweddu microanatomeg y retina a lleoli'r celloedd rhoddwr chwistrellu.

Ar gyfer y grwpiau a gafodd eu trin gan gmRPC, gwerthuswyd cryosections gan ddefnyddio immunofluorescence ar gyfer celloedd GFP + (rhoddwr). Cyflawnwyd adnabyddiaeth o'r mathau o gelloedd imiwnedd penodol sy'n bresennol yn y llygaid trwy labelu â gwrthgyrff cynradd penodol ar gyfer y canlynol: CD3 (marciwr lymffocyt T) [35], CD45R (marciwr lymffocyt B) [36], Iba-1 (marcwr macrophage a microglia wedi'i actifadu) [37], Ly-6G (marciwr neutrophil) [38], a CD49b (marciwr cell lladd naturiol) [39]. Cafodd cryosections eu golchi mewn PBS deirgwaith ar dymheredd ystafell a'u rhwystro â 0.03% Triton X-100 a 10% o serwm gafr arferol yn PBS (NGS; Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, UDA) am 1 awr ar dymheredd ystafell. CD3 gwrth-lygoden llygod mawr (gwanedu 1:100, BD Biosciences, San Jose, CA, UDA), llygod mawr gwrth-lygoden CD45R (1:100, BD Biosciences, San Jose, CA, UDA), Iba gwrth-lygoden cwningen{{ 26}} (gwanhad 1:400, Wako Chemicals, Richmond, VA, UDA), llygod mawr gwrth-lygoden Ly-6G (gwanhad 1:100, BD Biosciences, San Jose, CA, UDA), a llygod mawr gwrth -cymhwyswyd llygoden CD49b (gwanhad 1:100, BD Biosciences, San Jose, CA, UDA) i samplau a'u deor dros nos ar 4 gradd. Golchwyd samplau eto yn PBS 3 gwaith ar dymheredd ystafell. Cafodd gwrthgyrff eilaidd cyfunedig Alexa-Fluor (gafr gwrth-llygoden fawr Alexa-Flour-568 a gwrth-gwningen gafr Alexa-Flour-568, Life Technologies, Carlsbad, CA, UDA) eu cymhwyso i samplau am 1 h. ar dymheredd ystafell. Yna golchwyd yr holl samplau mewn PBS deirgwaith arall ar dymheredd ystafell. Gosodwyd slipiau clawr gan ddefnyddio DAPI Fluoromount-G (Southern Biotech, Birmingham, AL, UDA), a gadawyd y sleidiau i sychu dros nos ar dymheredd ystafell.

4.6. Asesiadau ELISPOT ac MLR

Cafodd celloedd T cof penodol RPC eu monitro 2 a 4 wythnos ar ôl y lleoliad impiad cyntaf trwy assay spot imiwn-amsugnol cysylltiedig ag ensymau (ELISPOT). Sefydlwyd y grwpiau arbrofol fel y dangosir yn Nhablau 1 a 2 ar gyfer pob pwynt amser. Mae assay ELISPOT yn dal proteinau wedi'u secretu ar ficroplat penodol wedi'i orchuddio â gwrthgyrff a gellir ei ddefnyddio i bennu actifadu celloedd T cof trwy ganfod secretiad IFN cell T. Y darlleniad arbrofol yw nifer y smotiau IFN ar y microplate. Mae nifer y smotiau IFN sy'n bresennol yn arwydd o nifer y celloedd T sy'n cael eu gweithredu. Aseswyd amledd celloedd T alloreactive trwy berfformio adwaith leukocyte cymysg 48 h (MLR) ar blatiau Multiscreen-IP 96-wel (Millipore, Burlington, MA, UDA). Roedd celloedd ymatebwr yn lymffocytau / splenocytes yn cynnwys celloedd T wedi'u puro o nodau lymff ceg y groth (CLNs) a spleens yr anifeiliaid arbrofol, a chelloedd ysgogi oedd y gmRPCs a ddeilliodd yn wreiddiol o lygod C57BL/6. Cynhaliwyd profion ELISPOT yn seiliedig ar brotocol safonol. 96-wel Roedd platiau Multiscreen-IP wedi'u rhag-wlychu gyda 15 µL o 35% ethanol fesul ffynnon o dan amodau di-haint. Golchwyd y platiau â PBS di-haint dair gwaith cyn rhoi 100 µL o'r gwrthgorff dal IFN (clôn AN-18, eBioscience, San Diego, CA, UDA) wedi'i wanhau yn PBS (2 µg/mL) ar y platiau. Cafodd y platiau eu deor dros nos ar 4 gradd cyn i'r profion MLR gael eu cario ar y platiau. Cafodd y platiau dal wedi'u gorchuddio â gwrthgyrff eu golchi deirgwaith gyda PBS ac yna eu rhwystro â RPMI1640 am 2 awr ar 37 ◦C.

Roedd pob un o'r platiau assay yn cynnwys y rheolyddion canlynol: ffynhonnau yn cynnwys dim celloedd, ffynhonnau yn cynnwys y celloedd heb symbyliad, a ffynhonnau yn cynnwys y celloedd gyda thriniaethau myristad {{0}} myristate 13-asetad (PMA) a Ca ionophor fel rheolyddion positif. Mae triniaeth PMA yn gweithredu fel rheolaeth gadarnhaol trwy ddynwared yr ail negesydd, DAG, i actifadu llwybr derbynnydd celloedd T ac yn ei dro yn achosi actifadu celloedd T, gyda Ca ionophore yn hwyluso mynediad ïonau calsiwm i gelloedd. Deorwyd y platiau am 36 h ar 37 ◦C cyn yr adwaith lliw. Golchwyd y platiau gyda PBS yn cynnwys {{1{0}}.01% Tween 20 chwe gwaith ac yna gwrthgorff canfod 100 µL (clôn R64A2, eBioscience, San Diego, CA, UDA), wedi'i wanhau mewn PBS (0.5 µg/mL) yn cael ei roi ar bob ffynnon. Deorwyd y platiau ar 37 ◦C am 2 awr ychwanegol. Golchwyd platiau eto gyda 0.01% Tween 20 yn PBS. Rhoddwyd 100 µL o Streptavidin-AP (gwanhad 1:1000, Invitrogen) fesul ffynnon a deorwyd y platiau am 45 munud ar dymheredd ystafell. Cafodd yr holl blatiau eu golchi deirgwaith eto gyda 0.01% Tween 20 yn PBS a PBS yn unig am dair gwaith arall. Yn olaf, ychwanegwyd 100 µL BCIP/NBT (Sigma Aldrich, Munich, yr Almaen) at bob ffynnon ar gyfer lliwio. Cafodd yr holl blatiau eu golchi'n helaeth â dŵr tap a'u sychu cyn dadansoddi data.

cistanche tubulosa-gwella system imiwnedd

5. Casgliadau

Mae'r astudiaeth hon yn dangos nad yw impiadau binocwlaidd dilyniannol o RPCs allogeneig i'r ceudod gwydrog yn ysgogi gwrthodiad imiwnedd clasurol yn y llygoden. Er y cydnabyddir na ellid cynnal yr astudiaethau histolegol allogeneig hyn gyda chynnyrch clinigol RPC dynol, mae'r data'n ymddangos yn gyson â chanlyniadau astudiaeth diogelwch clinigol (jCyte, JC-01E, data heb ei gyhoeddi) lle mae cleifion â retinitis derbyniodd pigmentosa bigiadau dwyochrog heb fod yn gyfoes heb driniaethau gwrthimiwnedd. Er ei bod yn anodd cymharu'r ddwy astudiaeth yn uniongyrchol, mae'n werth nodi bod canlyniadau cyffredinol y ddwy yn dangos tebygrwydd o ran goroesiad alografft.

Cyfeiriadau

1. Hori, J. ; Ng, TF; Shatos, M.; Klassen, H.; Strelein, JW; Ifanc, MJ Mae diffyg imiwnogeneiddedd mewn celloedd ehedydd nerfol ac maent yn gwrthsefyll dinistr fel alografftau. Bôn-gelloedd 2003, 21, 405–416. [CrossRef] [PubMed]

2. Klassen, H.; Schwartz, PH; Ziaeian, B. ; Nethercott, H.; Young, MJ; Bragadottir, R.; Tullis, GE; Warfvinge, K. ; Narfstrom, K. Mae rhagflaenwyr niwral sydd wedi'u hynysu o'r ymennydd cath sy'n datblygu yn dangos integreiddio retina ar ôl trawsblannu i retina'r gath ddystroffig. milfeddyg. Offthalmol. 2007, 10, 245–253. [CrossRef] [PubMed]

3. Salado-Manzano, C.; Perpina, U.; Straccia, M.A.; Molina-Ruiz, FJ; Cozzi, E.; Rosser, AE; Camlesi, JM A yw'r Ymateb Imiwnolegol yn Dagfa ar gyfer Therapi Celloedd mewn Clefydau Niwro-ddirywiol? Blaen. Neurosci Cell. 2020, 14, 250. [CrossRef]

4. Petrus-Reurer, A.S.; Romano, M.; Howlett, A.S.; Jones, JL; Lombardi, G. ; Saeb-Parsy, K. Ystyriaethau a heriau imiwnolegol ar gyfer therapïau cellog adfywiol. Cymmun. Biol. 2021, 4, 798. [CrossRef]

5. Bucher, K. ; Rodriguez-Bocanegra, E.; Dauletbekov, D.; Fischer, MD Ymatebion imiwn i therapi genynnau retina gan ddefnyddio ade dim fectorau firaol cysylltiedig-Goblygiadau ar gyfer llwyddiant triniaeth a diogelwch. Prog. Retin. Llygad Res. 2021, 83, 100915. [CrossRef]

6. Singh, MS; Parc, SS; Albini, TA; Canto-Soler, MV; Klassen, H.; MacLaren, AG; Takahashi, M.; Nagiel, A. ; Schwartz, DC; Bharti, K. Trawsblannu bôn-gelloedd retinol: Cydbwyso diogelwch a photensial. Prog. Retin. Llygad Res. 2020, 75, 100779. [CrossRef]

7. Kamao, H.; Mandai, M.; Okamoto, S.; Sakai, N.; Suga, A. ; Sugita, S.; Kiryu, J.; Takahashi, M. Nodweddu taflenni celloedd epitheliwm pigment retinol pigment retinol a achosir gan fodau dynol lluosog sy'n anelu at gymhwyso clinigol. Cynrychiolydd Bôn-gelloedd 2014, 2, 205–218. [CrossRef]

8. Sugita, S.; Kamao, H.; Iwasaki, Y.; Okamoto, S.; Hashiguchi, T.; Iseki, K.; Hayashi, N.; Mandai, M.; Takahashi, M. Atal actifadu celloedd T gan gelloedd epithelial pigment retinol sy'n deillio o fôn-gelloedd lluosog ysgogedig. Ymchwilio. Offthalmol. Vis. Sci. 2015, 56, 1051–1062. [CrossRef]

9. McGill, TJ; Stoddard, J. ; Renner, LM; Messaoudi, I. ; Bharti, K.; Mitalipov, S.; Lauer, A. ; Wilson, DJ; Neuringer, M. Methiant Graft Celloedd RPE Allogeneig sy'n Deillio o iPSC yn dilyn Trawsblannu i'r Gofod Isretinol mewn Archesgobion Annynol. Ymchwilio. Offthalmol. Vis. Sci. 2018, 59, 1374–1383. [CrossRef]

10. Sugita, S.; Mandai, M.; Kamao, H.; Takahashi, M. Agweddau imiwnolegol ar drawsblannu celloedd RPE. Prog. Retin. Llygad Res. 2021, 84, 100950. [CrossRef]

11. Nair, DSR; Thomas, BB Strategaethau Triniaeth Seiliedig ar Bôn-gelloedd ar gyfer Clefydau Dirywiol y Retina. Curr. Bôn-gell Res. Mae yna. 2022, 17, 214–225. [CrossRef] [PubMed]

12. Martinez Velazquez, ALl; Ballios, BG Y Genhedlaeth Nesaf o Therapiwteg Foleciwlaidd a Cellog ar gyfer Clefyd Retinol Etifeddol. Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 11542. [CrossRef]

13. Liu, Y. ; Chen, SJ; Li, SY; Qu, LH; Meng, XH; Wang, Y.; Xu, HW; Liang, ZQ; Yin, ZQ Diogelwch hirdymor trawsblannu celloedd progenitor retinol dynol mewn cleifion retinitis pigmentosa. Bôn-gell Res. Mae yna. 2017, 8, 209. [CrossRef] [PubMed]

14. Wang, Y. ; Tang, Z. ; Gu, P. Trawsblannu bôn-gelloedd/epiliwr ar gyfer dirywiad y retina: Adolygiad o dreialon clinigol. Cell Marwolaeth Dis. 2020, 11, 793. [CrossRef] [PubMed]

15. Almaeneg, OL; Valles-Maurizi, H.; Soto, TB; Rotstein, NP; Politi, bôn-gelloedd LE Retina, gobeithion a rhwystrau. J. Bôn-gelloedd y Byd 2021, 13, 1446–1479. [CrossRef]

16. Karamali, F.; Behtaj, S.; Babaei-Abraki, S.; Hadady, H.; Atefi, A. ; Savoj, S.; Soroushzadeh, S.; Najafian, A.S.; Nasr Esfahani, MH; Klassen, H. Strategaethau therapiwtig posibl ar gyfer dirywiad ffotoreceptor: Y llwybr i adfer gweledigaeth. J. Cyfieithiad. Med. 2022, 20, 572. [CrossRef]

17. Semo, M. ; Haamedi, N.; Stevanato, L.; Carter, D.; Brooke, G.; Young, M.; Coffey, P.; Sinden, J.; Patel, S.; Vugler, A. Effeithiolrwydd a Diogelwch Celloedd Epilydd Retinol Dynol. Cyfieithiad. Vis. Sci. Technol. 2016, 5, 6. [CrossRef]

18. Mochizuki, M.; Sugita, S.; Kamoi, K. Homeostasis imiwnolegol y llygad. Prog. Retin. Llygad Res. 2013, 33, 10–27. [CrossRef]

19. Yamasaki, A.S.; Sugita, S.; Horiuchi, M.; Masuda, T. ; Fujii, S.; Makabe, K.; Kawasaki, A.; Hayashi, T.; Kuwahara, A.; Kishino, A.; et al. Imiwnogenigrwydd Isel a Phriodweddau Imiwno-ataliol Retinas sy'n Deillio o ESC ac iPSC Dynol. Cynrychiolydd Bôn-gell 2021, 16, 851–867. [CrossRef]

20. Klassen, H.; Schwartz, MR; Bailey, AH; Young, MJ Mae marcwyr arwyneb a fynegir gan gelloedd ehedydd niwral dynol a llygoden amlalluog yn cynnwys tetraspaninau ac epitopau di-brotein. Neurosci. Lett. 2001, 312, 180–182. [CrossRef]

21. Klassen, H. ; Ziaeian, B. ; Kirov, II; Young, MJ; Schwartz, PH Ynysu celloedd ehedydd y retina o feinwe dynol post-mortem a'u cymharu ag epilyddion ymennydd awtologaidd. J. Neurosci. Res. 2004, 77, 334–343. [CrossRef]

22. Ingulli, E. Mecanwaith gwrthod cellog wrth drawsblannu. Pediatr. Nephrol. 2010, 25, 61–74. [CrossRef]

23. Issa, F. ; Schiopu, A.; Pren, KJ Rôl celloedd T mewn gwrthod impiad a goddefgarwch trawsblannu. Arbenigwr Parch. Clin. Imiwnol. 2010, 6, 155–169. [CrossRef] [PubMed]

24. Nasr, M. ; Sigdel, T.; Sarwal, M. Datblygiadau mewn diagnosteg ar gyfer gwrthod trawsblaniad. Arbenigwr Parch. Mol. Diagn. 2016, 16, 1121–1132. [CrossRef] [PubMed]

25. Klassen, H.; Imfeld, KL; Ray, J.; Young, MJ; Gage, FH; Berman, MA Priodweddau imiwnolegol celloedd ehedydd hippocampal oedolion. Vis. Res. 2003, 43, 947–956. [CrossRef] [PubMed]

26. Weinger, JG; Weist, BM; Plaisted, WC; Klaus, SM; Walsh, CM; Mae diffyg cyfatebiaeth Lane, TE MHC yn arwain at wrthod celloedd epiladur niwral yn dilyn trawsblaniad llinyn asgwrn y cefn mewn model o ddadfyeliniad a achosir gan firaol. Bôn-gelloedd 2012, 30, 2584–2595. [CrossRef] [PubMed]

27. ReNeuron, L. Cyntaf-yn-Ddynol Cam I/IIa, Label Agored, Astudiaeth Arfaethedig o Ddiogelwch a Goddefgarwch Celloedd Epilydd Retinol Dynol a Drawsblannwyd yn Is-retinol (hRPC) mewn Cleifion â Retinitis Pigmentosa (RP). Treial Clinigol# NCT02464436. Ar gael ar-lein: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02464436 (cyrchwyd ar 27 Chwefror 2023).

28. Lu, B. ; Lin, Y.; Tsai, Y. ; Girman, S.; Adamus, G. ; Jones, MK; Shelley, B.; Svendsen, CN; Wang, S. Nid yw Ehedydd Niwral Dynol Dilynol Trawsblannu i'r Retina Dirywiedig yn Cyfaddawdu Goroesiad Graft Cychwynnol nac Effeithlonrwydd Therapiwtig. Cyfieithiad. Vis. Sci. Technol. 2015, 4, 7. [CrossRef] [PubMed]

29. Jones, MK; Lu, B. ; Girman, S.; Wang, S. Strategaethau therapiwtig sy'n seiliedig ar gelloedd ar gyfer amnewid a chadw mewn clefydau dirywiol y retina. Prog. Retin. Llygad Res. 2017, 58, 1–27. [CrossRef] [PubMed]

30. Bell, BA; Kaul, C. ; Bonilha, VL; Rayborn, ME; Shadrach, K. ; Hollyfield, JG Llygoden BALB/c: Effaith goleuadau vivarium safonol ar batholeg retinol yn ystod heneiddio. Exp. Llygad Res. 2015, 135, 192–205. [CrossRef]

31. Klassen, HJ; Ng, TF; Kurimoto, Y.; Kirov, I. ; Shatos, M.; Coffey, P.; Young, MJ Mae epilyddion retina aml-alluog yn mynegi marcwyr datblygiadol, yn gwahaniaethu i niwronau retina, ac yn cadw ymddygiad sy'n cael ei gyfryngu gan olau. Ymchwilio. Offthalmol. Vis. Sci. 2004, 45, 4167–4173. [CrossRef]

32. jCyte, Inc. Diogelwch Chwistrelliad Sengl, Intravitreal o Gelloedd Ehedydd Retinol Dynol (jCell) mewn Retinitis Pigmentosa. Treial Clinigol# NCT02320812. Ar gael ar-lein: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02320812 (cyrchwyd ar 24 Chwefror 2023).

33. jCyte, Inc. Diogelwch ac Effeithiolrwydd Chwistrelliad Intravitreal o Gelloedd Ehedydd Retinol Dynol mewn Oedolion â Retinitis Pigmentosa. Treial Clinigol# NCT03073733. Ar gael ar-lein: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03073733 (cyrchwyd ar 24 Chwefror 2023).

34. jCyte, Inc. Diogelwch Chwistrellu Ailadrodd Mewnvitreal o Gelloedd Ehedydd Retinol Dynol (cell) mewn Pynciau Oedolion â Retinitis Pigmentosa. Treial Clinigol# NCT04604899. Ar gael ar-lein: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT04604899 (cyrchwyd ar 24 Chwefror 2023).

35. Oudejans, JJ; van der Valk, P. Dosbarthiad imiwnohistocemegol o neoplasmau celloedd T a chelloedd NK. J. Clin. Pathol. 2002, 55, 892. [CrossRef] [PubMed]

36. Tostanoski, LH; Chiu, YC; Gamwn, JM; Simon, T.; Andorko, JI; Bromberg, JS; Jewell, CM Mae Ailraglennu'r Microamgylchedd Nodau Lymff Lleol yn Hyrwyddo Goddefgarwch Sy'n Benodol i Systemig ac Antigen. Cynrychiolydd Cell 2016, 16, 2940–2952. [CrossRef] [PubMed]

37. Jurga, AC; Paleczna, M.; Kuter, KZ Trosolwg o Farcwyr Cyffredinol a Gwahaniaethol o Ffenoteipiau Microglia Gwahaniaethol. Blaen. Neurosci Cell. 2020, 14, 198. [CrossRef] [PubMed]

38. Li, JC; Zou, XM; Yang, SF; Jin, JQ; Zhu, L.; Li, CJ; Yang, H.; Zhang, AG; Zhao, TQ; Mae trapiau allgellog Chen, CY Neutrophil yn cymryd rhan yn natblygiad thrombosis sy'n gysylltiedig â chanser mewn cleifion â chanser gastrig. Byd J. Gastroenterol. 2022, 28, 3132–3149. [CrossRef]

39. Kee, BL Datblygu Celloedd Lladd Naturiol ac ILC1. Encycl. Imiwnobiol. 2016, 1, 140–148.