Mae Awtophag Dibynnol ATG16L Nam yn Hyrwyddo Ffibrosis Interstitaidd Arennol mewn Camweithrediad Graft Arennol Cronig Trwy Ysgogi EndMT Trwy Lwybr Signalau NF-kB

Zeping Gui^1,2†, Chuanjian Suo^1†, Zijie Wang ^1†, Ming Zheng¹, Shuang Fei¹, Hao Chen¹, Li Haul¹, Zhijian Han¹, Mehefin Tao¹, Xiaobin Ju¹, Haiwei Yang¹, Min Gu^2*a Ruoyun Tan^1*

Cronigarennolcamweithrediad impiad (CAD) cael ei achosi gan ffactorau lluosog, gan gynnwys sglerosis glomerwlaidd, llid, ffibrosis rhyng-ranol, ac atroffi tiwbaidd (IF/TA). Fodd bynnag, mae'r elfennau amlycaf oCADyn IF/TA. Mae ein hastudiaethau wedi cadarnhau bod trawsnewid endothelaidd- mesenchymal (EndMT) yn ffynhonnell bwysig i allograft IF/TA. Nodwedd EndMT yw colli marciwr endothelaidd a chaffael ffenoteipiau mesenchymal neu ffibroblastig. Mae awtophagi yn llwybr diraddio mewngellol sy'n cael ei reoleiddio gan broteinau sy'n gysylltiedig ag awtophagi ac sy'n chwarae rhan hanfodol mewn llawer o gyflyrau ffibrotig. Fodd bynnag, p'un a yw awtophagi yn cyfrannu at ffibrosis oarennolmae allografft a sut mae mecanwaith o'r fath yn digwydd yn parhau i fod yn aneglur. Mae genyn tebyg i awtophagi 16 tebyg (ATG16L) yn enyn hanfodol sy'n gysylltiedig ag awtophagi (ARG) sy'n angenrheidiol ar gyfer ffurfio awtoffagosom. Yma, fe wnaethom ddadansoddi’n gyntaf feinweoedd cleifion trawsblaniad aren o setiau data Gene Expression Omnibws (GEO) a 60 o gleifion trawsblannu o’n canolfan. Diffiniwyd derbynwyr â swyddogaeth arennau sefydlog fel rhai nad ydynt ynCADgrŵp a phob claf yn yCADy grŵp wedi cael diagnosis histopatholegolCAD. Dangosodd canlyniadau fod ATG16L, fel un ARG gwahaniaethol arwyddocaol, wedi'i fynegi'n llai yn yCADgrŵp o'i gymharu â'r grŵp nad yw'n CAD. Ar ben hynny, canfuom fod llai o awtoffagosomau ac awtolysosomau mewn arennau wedi'u trawsblannuCADcleifion, ac mae is-reoleiddio awtophagy yn ffactor prognostig gwael. In vitro, fe wnaethom ddarganfod bod dymchwel ATG16L wedi gwella'r broses EndMT mewn dynolarennolcelloedd endothelaidd glomerwlaidd (HRGECs). Yn vivo, canfuwyd newidiadau EndMT a fflwcs awtoffagic mewn llygod mawrarennolmodelau trawsblannu oCAD. Fe wnaethom ddangos bod EndMT yn digwydd a nodi bod y doreth o ATG16L yn cyd-fynd â'r newid fflwcs awtoffagig deinamig ar hyd gwahanol gamau o drawsblannu aren. Yn fecanyddol, fe wnaeth dymchwel ATG16L, yn benodol mewn celloedd endothelaidd, leihau diraddiad NF-kB ac ysgarthu cytocinau llidiol (IL-1b, IL{-6, a TNF-a), a allai hwyluso EndMT. I gloi, dangosodd fflwcs awtophagig sy'n ddibynnol ar ATG16L a achoswyd gan drawsblaniad gynnydd cynyddol mewn colled dros amser.

Roedd cytocinau llidiol o'r broses hon yn hybu EndMT, a thrwy hynny'n arwain at ddatblygiadCAD. Gwasanaethodd ATG16L fel rheolydd negyddol EndMT a datblygiadarennolgellir archwilio ffibrosis impiad, ac awtophagi fel targed therapiwtig posibl ar gyfer camweithrediad impiad arennol cronig.

Geiriau allweddol:camweithrediad impiad arennol cronig, arennolffibrosis interstitial, ATG16L, awtophagi, EndMT, cytocinau llidiol

Am ragor o wybodaeth:ali.ma@wecistanche.com

RHAGARWEINIAD

Arennautrawsblaniadyw un o'r triniaethau gorau posibl ar gyfer cleifion ag wremia oherwydd ei fod yn gwella ansawdd eu bywyd yn sylweddol (1). Fodd bynnag, mae nifer gymharol uchel o gamweithrediad alografft arennol ar ôl trawsblannu oherwydd dirywiad cynyddol cronig swyddogaeth arennol, sy'n ffactor allweddol sy'n effeithio ar oroesiad hirdymor arennau wedi'u trawsblannu (2). Mae camweithrediad impiad arennol cronig (CAD), a elwid gynt yn neffropathi alografft cronig, yn gyflwr aml-ffactor sy'n gysylltiedig â ffibrosis rhyng-raniadol arennol cynyddol. Mae'n hysbys bod ffactorau amrywiol yn cyfrannu at golli swyddogaeth alografft arennol, gan gynnwys, ond heb fod yn gyfyngedig i, wrthodiad acíwt a chronig, isgemia ac atlifiad proses ailadeiladu llidiol a meinwe, a neffrowenwyndra sy'n gysylltiedig â chyffuriau (3).

CADyn cael ei nodweddu'n forffolegol gan lid, ffibrosis interstitaidd cynyddol ac atroffi tiwbaidd (IF/TA), a sglerosis glomerwlaidd (4). Yn eu plith, mae IF / TA yn ffactor allweddol sy'n pennu swyddogaeth alografft arennol, ond nid yw'r mecanweithiau y mae'n digwydd yn hysbys o hyd. Mae sawl ffactor wedi'u nodi i gyfrannu at y gyfran uchel o golled alografft arennol. Yn ein hastudiaeth flaenorol, fe wnaethom hefyd gadarnhau mai prif broses patholegol CAD oedd alografft arennol IF / TA, sy'n cael ei nodweddu gan ddyddodiad gormodol o fatrics allgellog mewn meinwe tiwbaidd arennol a rhyng-raniadol wedi'i drawsblannu (5). Mae astudiaethau wedi cadarnhau bod colagenau'n cael eu secretu'n bennaf gan myoffibroblastau, ac mae secretiad colagenau yn arwain at waddodiad matrics allgellog ac wedyn trawsblannu aren IF/TA. Mae pedair prif gell yn ymwneud â ffurfio myoffibroblastau: celloedd epithelial, celloedd endothelaidd, ffibroblastiau sy'n deillio o fêr esgyrn, a phericytes microfasgwlaidd (6, 7). Maent yn chwarae rhan hanfodol wrth atgyweirio a diogelu cyfanrwydd meinwe'r arennau. Yn eu plith, mae ysgogiadau allanol yn galluogi gwahaniaethu celloedd arennau cynhenid ​​​​fel celloedd epithelial i myoffibroblasts, a all gynhyrchu matrics allgellog. Gelwir y broses hon yn pontio epithelial-i-mesenchymal (EMT). Roedd EMT fel arfer yn cynnwys tri math: (I) embryogenesis, (II) atgyweirio meinwe a ffibrosis, (III) metastasis (8). Mae nifer o astudiaethau wedi'u gwneud i egluro'r mecanweithiau moleciwlaidd a chellog math II EMT mewn ffibrosis organau (9, 10), fodd bynnag, mae rolau EMT mewn gwahanol brosesau cynhyrchu ffibroblast cynradd yn ystod dilyniant CAD yn dal yn amhendant.

Gyda thrawsblannu aren, mae tebygolrwydd cynyddol bob amser o niwed i'r macro-fasgwlaidd alografft, oherwydd lleoliad ffisegol yr endotheliwm alografft sy'n ei wneud yn darged cychwynnol o ddewis ar gyfer anaf alografft (11). Mae alograffau yn gweithredu fel targedau posibl ar gyfer ymateb imiwn wedi'i gyfryngu gan nifer sylweddol o sytocinau llidiol serwm. Dangosodd astudiaethau fod llawer o cytocinau llidiol yn ymwneud â'rCADproses (12) a chelloedd endothelaidd ar safleoedd alografftau arennol nid yn unig yn gyfranogwyr mewn llid ond hefyd yn rheoleiddwyr llid (11). Datgelodd ein hymchwil blaenorol fod TNF‐a wedi’i fynegi’n uwch yn yCADgrŵp na'r grŵp nad yw'n CAD. Hwylusodd TNF-a hefyd y broses EMT mewn celloedd tiwbaidd procsimol dynol (HK2) (13). O ystyried y cyswllt agos rhwng celloedd endothelaidd a gwaed, bydd celloedd llidiol sy'n cylchredeg a sytocinau yn ymosod yn gyntaf ar yr endotheliwm alografft. Mae ysgogiad cronig o cytocinau llidiol yn arwain at gelloedd endothelaidd yn dioddef anhwylderau o strwythur celloedd a'r amgylchedd mewnol, sy'n arwain at anaf endothelaidd. Mae astudiaethau sy'n dod i'r amlwg yn awgrymu bod anaf endothelaidd yn cyfrannu at ddyddodiad matrics allgellog ac yn chwarae rhan allweddol mewn clefydau ffibrosis organau. Yn ddiweddar, mae trawsnewid Endothelaidd-i-mesenchymal (EndMT) yn cael ei ystyried fel prif achos anaf endothelaidd ac mae'n hyrwyddo cynnydd IF / TA yn ystod clefyd ffibrosis arennol (5, 9). Mae EndMT yn fath nodedig o EMT. Fe'i nodweddir gan gelloedd sy'n colli marcwyr endothelaidd yn raddol, fel CD31 a CD34, ac sy'n ennill ffenoteip mesenchymal neu myoffibroblastig, fel actin cyhyrog a-llyfn (a-SMA), colagen I, a ffibroctin (FN). Mae'r mecanwaith rheoleiddio ar gyfer EndMT yn parhau i fod yn fater cymhleth. Gallai nifer o ffactorau fel straen ocsideiddiol, hypocsig, ac anafiadau amrywiol effeithio ar ddigwyddiad EndMT (14, 15). Ond mae bron pob un o'r ffactorau rheoleiddio hyn yn dod at ei gilydd yn y pen draw mewn un weithred uniongyrchol, sef cytocinau llidiol. Yn ein hastudiaethau blaenorol, gwnaethom ddangos bod yr EndMT yn ffactor pwysig yn pathogenesis IF/TA a CAD trwy lwybrau signalau TGF-b/Smad (5). Yn ogystal, awgrymodd ysgolheigion eraill o hyd fod mynegiant TGF-b yn cael ei uwch-reoleiddio gan TNF-a (16). Felly, gall cytocinau llidiol fel TNF-a hefyd fod yn ffactor pathogenig pwysig mewn anaf endothelaidd fasgwlaidd sy'n nodweddu dilyniant CAD. Er bod ffactorau cychwynnol EndMT yn wahanol mewn microamgylcheddau amrywiol, roedd y canlyniad terfynol yr un fath. Felly, roedd yn ddigon damcaniaethu bod yn rhaid cael mecanwaith rheoleiddio canolog wrth gynhyrchu cytocinau llidiol a dilyniant EndMT.

Mae autophagy yn llwybr cellog sy'n gyfrifol am ddiraddio protein ac organelle (17). Gelwir y broses o awtophagi hefyd yn fflwcs awtophagig, ac mae cryfder y broses hon yn aml yn cynrychioli graddfa actifadu awtophagi. Mae awtoffagy yn ymwneud â gwahanol brosesau pathoffisiolegol arennol, gan gynnwys glomerulosclerosis, neffropathi diabetig, a chlefyd yr arennau systig (18). Nododd rhai astudiaethau fod awtoffagi yn broses sytoprotective. Mae amddiffyniad clasurol ar gyfer y rhagdybiaeth hon fel y gwelir mewn llygod â dileu tiwbyn procsimol ATG5 lle roedd y dileu yn hyrwyddo ffibrosis arennol mwy difrifol oherwydd awtophag amhariad (19). Mae astudiaethau eraill hefyd wedi canfod bod celloedd epithelial tiwbyn procsimol yn cael eu dymchwel yn amodol ATG5 wedi gwaethygu anaf acíwt i'r arennau yn y cyfnod cynnar, ond wedi arafu datblygiad ffibrosis yr arennau yn y broses adfer neu atgyweirio (20). Fodd bynnag, mae'r rhyngweithio penodol rhwng awtoffagy ac EMT neu EndMT ar glefyd ffibrosis yn dal yn ddadleuol. Awgrymodd sawl astudiaeth y gallai ataliad awtophagi gymell EMT a ffibrosis trwy effeithio ar y groes-siarad epithelial-ffibroblast aberrant mewn ffibrosis idiopathig yr ysgyfaint (21). Dangosodd eraill fod Rapamycin yn hyrwyddo EndMT trwy actifadu awtoffagy yn ystod heneiddedd cynamserol (22). Mae genyn ATG16L yn bennaf yn cynnwys ATG16L1 ac ATG16L2. ATG16L2 homo- a hetero-oligomerizes gyda ATG16L1. Ond mae gan ATG16L2 lai o gysylltiad ag awtophagi (23). Mae ATG16L1 wedi'i nodi fel genyn pwysig sy'n gysylltiedig â awtoffagy, yn hyrwyddo ffurfiant awtoffagosome yn y bilen plasma, ac yn chwarae rhan hanfodol yn ffurf lipidedig LC3 (23). Yma, cyfeirir at ATG16L1 gyda'i gilydd fel ATG16L. Fel ffactor allweddol mewn awtoffagi, adroddwyd unwaith bod ATG16L yn gysylltiedig â pathogenesis sawl clefyd llidiol. Er enghraifft, rhoddodd treiglad ATG16L ragdueddiad cryf i ddatblygiad clefyd Crohn (24). Fodd bynnag, nid yw mecanwaith gweithredu ATG16L ac awtophagi wedi'u hastudio'n dda eto mewn ymagwedd wedi'i thargedu megis rheoli a phrognostigeiddio trawsblaniadau aren. Felly mae'n rhaid i rôl ddeinamig fflwcs awtoffagic ac awtoffagi sy'n ddibynnol ar ATG16L fod yn ffocws ymchwil ar gyfer therapiwteg bosibl mewn dilyniant CAD.

Yn yr astudiaeth hon, fe wnaethom archwilio rôl bosibl awtophagi dibynnol ATG16L mewn dilyniant CAD. Fe wnaethom ddatgelu bod colli ATG16L ac awtophagi yn gysylltiedig â digwyddiad EndMT mewn cleifion CAD clinigol a llygod mawr wedi'u trawsblannu arennau. Yna canfuom fod lefelau EndMT a ffibrosis rhyng-ranol alografft arennol wedi'u gwella ar ôl newid gweithgaredd awtoffagi trwy ddymchwel y genyn ATG16L. Yn ogystal, archwiliwyd mecanweithiau sylfaenol posibl hefyd trwy ddilyniannu RNA, canfuom fod nam ar ATG16L wedi cyfrannu at actifadu llwybr ffactor niwclear-kB (NF-kB) a'r secretion cytocinau llidiol, ac yna'n hyrwyddo dilyniant EndMT.

DEUNYDDIAU A DULLIAU

Datganiad Moeseg

Roedd protocolau'r astudiaeth yn cydymffurfio â Datganiad Helsinki ac Istanbul. Archwiliwyd ac awdurdodwyd astudiaethau dynol gan bwyllgor moeseg lleol Ysbyty Cysylltiedig Cyntaf Prifysgol Feddygol Nanjing (ID: IACUC-2010020). Cafwyd caniatâd gwybodus gan yr holl dderbynwyr trawsblaniadau yn ogystal â chleifion neffrectomi a gafodd eu cynnwys yn yr ymchwil hwn.

Cafodd yr astudiaethau yn ymwneud â llygod mawr eu harchwilio a'u hawdurdodi gan bwyllgor moeseg lleol Ysbyty Cysylltiedig Cyntaf Prifysgol Feddygol Nanjing (ID: IACUC-2010020). Rhoddir caniatâd gwybodus ysgrifenedig gan y perchnogion ar gyfer cyfranogiad eu hanifeiliaid yn yr ymchwil hwn.

Casgliad Sampl

Sixty of adults who had received living or deceased donor kidney transplants started to be followed up from January 2010 to December 2017 at First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University. Patients with serum creatinine level consistently < 141.46 mmol/L (1.6 mg/dl) for at least 12 months after kidney transplantation and no other complications such as episodes of significant rejection, drug toxicity injury, and infection were assigned to the non-CAD group. Patients in the CAD group were defined as elevated serum creatinine greater than or equal to 141.46 mmol/L (1.6 mg/dl) for at least three months, and they were diagnosed by two independent pathology experts combined with biopsy results, laboratory indexes, and imaging features. Adjacent normal kidney tissues were obtained from regions outside the tumor margin (>5cm) mewn cleifion â llawdriniaeth neffrectomi radical. Cafwyd samplau gwaed ar ôl i gleifion roi caniatâd gwybodus. Gellir cyfeirio at y cam penodol yn ein hastudiaethau blaenorol (5). Roedd nodweddion gwaelodlin cleifion yn y grŵp CAD a'r grŵp nad yw'n CAD fel y dangosir yn Nhabl 1.

Modelau Llygod Mawr ac Anifeiliaid

Cafwyd llygod mawr gwrywaidd F344 a Lewis sy'n oedolion (Pwysau 250 ± 10.3 g) gan Charles River Laboratories (Beijing, Tsieina) a dilynwyd canllawiau'r Pwyllgor Gofal a Defnydd Anifeiliaid Sefydliadol ym Mhrifysgol Feddygol Nanjing. Cafodd yr anifeiliaid eu trin yn unol â normau Prifysgol Feddygol Nanjing a'r canllawiau a gyhoeddwyd gan Sefydliadau Iechyd Cenedlaethol yr UD.

Profodd yr holl anifeiliaid hyn drawsblaniad aren chwith orthotopig. Defnyddiwyd llygod mawr Lewis fel derbynwyr a rhoddwyr syngeneig (grŵp Syn), llygod mawr F344 fel rhoddwyr allogeneig (grŵp Allo). Cafodd yr aren dde ei thorri ar yr un pryd. Roedd amser cyfartalog isgemia oer yn llai nag 20 munud ac roedd isgemia cynnes yn llai na 35 munud. Defnyddiwyd Cyclosporine A (5 mg / kg, QD, IP; Neoral, Novartis, y Swistir) am 14 diwrnod i osgoi gwrthodiad acíwt,

Triniaeth Fferyllol a Chynhaeaf Meinwe

Cafodd yr arennau trawsblaniad o lygod mawr eu cynaeafu yn wythnosau 4, 8, 12, ac 16 ar ôl llawdriniaeth. Cafwyd sbesimenau meinwe alografft arennol wedi'u mewnosod mewn paraffîn fformalin-sefydlog (10 y cant o fformalin niwtral) ar gyfer staenio histolegol a IHC/IF. Yr aren sy'n weddill wedi'i storio mewn oergelloedd − 80 gradd ar gyfer canfod RNA a phrotein.

AU a Masson Trichrome Staening Assay

Gellir cyfeirio at brotocolau assay staen trichrome AU a Masson yn ein hastudiaethau blaenorol (5). Er mwyn nodi difrifoldeb CAD a maint yr ardal ffibrotig, cafodd ardal ffibrosis alografft arennol ei feintioli â staen trichrome Masson. Ar gyfer pob darn, dewiswyd pum maes gweledol ar hap o dan × 400 microsgop. Mesurwyd ardal bositif ar gyfer Masson trichrome gan ddau batholegydd a ddaliwyd i'r dyluniad arbrofol gan ddefnyddio'r Image-Pro Plus (Media Cybernetics, Rockville, MD).

Assay Stainging Immunohistochemistry

Torrwyd meinweoedd arennau wedi'u gosod gyda fformalin yn adrannau paraffin 3 mm o drwch. Roedd y broses o ddadbaraffinio, hydradu, ac adalw antigen yn gyson â'n hastudiaethau blaenorol (5). Yr gwrthgyrff [gwrth-ATG16L (1:1{00; Abcam, UDA), gwrth-a‐SMA (1:200; Abcam, UDA), gwrth-Fibronectin (1:100; Abcam, UDA) a gwrth-CD31 (1:100; CST, UDA)] wedi'u deor dros nos ar 4 gradd ar ôl i adrannau gael eu blocio â serwm asyn arferol o 10 y cant. Perfformiwyd y camau nesaf hefyd fel y disgrifiwyd yn gynharach gydag IgG gwrth-lygoden / cwningen gafr biotinylated (0.5 mg / mL;

Abcam) a swbstrad 3-amino-9-ethyl carbazole neu 3,3′

diaminobenzidine (Labordai Vector, Burlingame, CA). Tynnwyd llun y sleidiau lliw gan ddefnyddio microsgop Nikon Eclipse 80i gyda chamera digidol (DS-Ri1, Nikon, Shanghai, Tsieina).

Assay Stainging Immunofluorescence

Ar ôl gosod hydoddiant fformaldehyd 4 y cant, treiddiwyd adrannau alograft arennol a thaflenni dringo celloedd gyda 0.1 y cant Triton X-100 am 1 h, yna eu rhwystro â serwm gafr 5 y cant am 1 h. Wedi hynny, deorwyd adrannau a thaflenni dringo celloedd gyda'r gwrth-NF-kB p65 (1:200; Abcam, UDA) ar 4 gradd dros nos. Gall amodau deori gwrthgyrff eilaidd Dapi gyfeirio at ein hastudiaethau blaenorol (5). Edrychwyd ar sleidiau gyda microsgop fflworoleuedd Nikon Eclipse 80i (DS-Ri1, Nikon, Shanghai, China).

Canfod Fflwcs Awtoffagic

Chwistrellwyd AAV-mRFP-GFP-LC3 (Hanbio, Shanghai, China) yn stereotactig i aren chwith llygod mawr Lewis (3 mL) 14 diwrnod cyn trawsblannu. Tynnwyd yr aren yn 4, 8, 12, 16 wythnos ar ôl trawsblannu a'i gosod gyda 4 y cant o baraformaldehyd am 24 awr. Edrychwyd ar sleidiau (30 mm) gyda microsgop fflworoleuedd Nikon Eclipse 80i (DS-Ri1, Nikon, Shanghai, China). Mae smotiau melyn yn dynodi awtoffagosomau ac mae smotiau coch yn dynodi autolysosomau. Pan fydd y signal coch yn gryfach na'r signal melyn cynrychioli mae fflwcs awtoffagic yn cael ei actifadu. Pan fydd mwy o signalau melyn na signalau coch yn cynrychioli mae fflwcs awtoffagic yn cael ei amharu.

Microsgopeg Electron

Gosodwyd y samplau â glutaraldehyde oer-iâ (3 y cant yn 0.1 M byffer cacodylate, pH 7.4) a'u prosesu ymhellach gan y Cyfleuster Craidd (Gwasanaeth, Wuhan, Tsieina). Perfformiwyd yr arsylwad ar ficrosgop trawsyrru electronau JEOL JEM{-2100.

Canfod Swyddogaeth Arennol

Defnyddiwyd Pecyn Assay Creatinine QuantiChrom Llygoden Fawr a Phecyn Assay Wrea QuantiChrom (Jiancheng, Beijing, Tsieina) i ganfod crynodiadau creatinin gwaed llygod mawr a nitrogen wrea yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr.

Canfod Protein Uria

Casglwyd y samplau wrin 24 awr gan ddefnyddio cewyll metabolig, a phrofwyd ysgarthiad protein wrinol gyda'r pecyn masnachol (Mlbio, Shanghai, China) yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr.

Asesiad PCR Amser Real

Yn fyr, purwyd cyfanswm RNA o HRGECs gan ddefnyddio'r citiau echdynnu RNA (TIANGEN, Beijing, Tsieina). cDNA (cDNA) wedi'i syntheseiddio fel y disgrifiwyd yn flaenorol (5). Mesurwyd mynegiant genynnau gan assay PCR amser real (Vazyme) a System Engine Opticon 2 DNA (Labordai BioRad, Hercules, CA). Disgrifiwyd y dilyniannau paent preimio fel a ganlyn:

IL-1 b: 5′‐ TTCCTGTTGTCTACACCAATGC‐3′ (F) 5′‐CGGGCTTTAAGTGAGTAGGAGA‐3′(R);

IL-6: 5′‐TTCTCCGCAAGACTTCCA‐3′ (F)

5′‐ ATACTGGTCTGTTGGGTGG‐3′ (R);

TNF-a: 5′‐ CCTCTCTCTAATCAGCCCTCTG‐3′(F)5′‐ GAGGACCTGGGAGTAGATGAG ‐3′(R);

Actin: 5′‐ TGACGGTGGACATCCGCAAAG‐3′ (F) 5′‐ CTGGAAGGTGGACAGCGAGG‐3′(R);

Western Blot ac Elisa Assay

Yn fyr, echdynnwyd proteinau o gelloedd a meinweoedd mewn byffer RIPA (Thermo ScientificTM, Chelmsford, MA, UDA) sy'n cynnwys coctels atalyddion ffosffatas a phroteasau (Sigma, St Louis, MO, UDA). Trosglwyddwyd proteinau (20 mg) i bilen PVDF (Millipore, IPVH00010, Massachusetts, UDA) yn dilyn SDS-PAGE. Deorwyd y sleidiau mewn toddiant blocio (5 y cant o laeth di-fraster) am 60 munud, ac yna deorwyd y bilen PVDF â gwrthgorff cynradd heb olchi mewn ystafell oer dros nos. Ar ôl hynny, roedd y broses o olchi pilen PVDF gan glustogiad halwynog-tween tris (TBST), wedi'i ddeor gan wrthgorff eilaidd, tabledi ECL, ac yn agored yn gyson â'n hastudiaethau blaenorol (5). Rhestrwyd y prif wrthgyrff fel a ganlyn: gwrth-GAPDH (1:1000; CST, UDA), gwrth-CD31 (1:1000; CST, UDA), gwrth-a-SMA (1:1000;

Abcam, UDA), gwrth-fibronectin (1:1000; BD Biowyddorau, UDA),

gwrth-LC3 (1:1000; CST, UDA), gwrth-ATG16L (1:1000; CST, UDA),

gwrth‐NF-kB t65 (1:1000; CST, UDA), gwrth‐Phospho-NF-kB t65 (1:1000; CST, UDA). Perfformiwyd meintioli trwy fesur dwyster y signalau gyda chymorth meddalwedd dadansoddi delweddau NIH. Canfuwyd MAP1LC3 gan ddefnyddio pecyn ELISA (ml000829, Mlbio, Tsieina) yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr.

Diwylliant Cell, Triniaeth, a Thrawsnewidiad ShRNA

Cafodd celloedd endothelaidd glomerwlaidd arennol dynol (HRGECs) eu meithrin mewn cyfrwng celloedd Endothelaidd (ECM, Labordai Ymchwil ScienCell Carlsbad, CA, UDA) sy'n cynnwys 5 y cant o serwm buchol ffetws. Gosod Offer CO2 Deori Diwylliant HRGECs mewn awyrgylch llaith yn cynnwys 5 y cant o CO2 ar 37 gradd . Cadwyd celloedd endothelaidd mewn cyfrwng di-serwm dros nos ac yna eu trin ag IL-1b, IL-6, a TNF-a am oriau gwahanol neu grynodiadau gwahanol.

Adeiladwyd gorfynegiant sefydlog HRGECs ATG16L ac ATG16L gan ddefnyddio'r lentivirus (Jikai, Shanghai, China). Trosglwyddwyd HRGECs yn gyntaf gyda'r lipofectamine 2000, yna trosglwyddwyd hwy â firysau shRNA 1.5 mL ATG16L neu 2.0 mL ATG16L yn gorfynegi firysau yn unol â phrotocol y gwneuthurwr. Yna trosglwyddwyd y celloedd endothelaidd i ECM yn cynnwys polybren 2.0 ml a'u deor am 6 awr ychwanegol. Fe wnaethom ganfod cyfradd heintio firysau gyda microsgop fflworoleuedd Nikon Eclipse 80i (DS-Ri1, Nikon, Shanghai, China). Defnyddiwyd Puromycin (2 µg/mL; Gibco, Thermo Fisher Scientific) i ddewis celloedd sefydlog wedi'u heintio â firws. Wedi hynny, casglwyd HRGECs ar gyfer arbrofion pellach.

Dadansoddiad Ystadegol

Defnyddiwyd GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, UDA) ar gyfer dadansoddiad ystadegol. Mynegwyd canlyniadau fel cymedr ± SD (cymedr ± SD) o o leiaf dri arbrawf annibynnol. Perfformiwyd cymhariaeth rhwng ac o fewn grwpiau lluosog gan ddefnyddio dadansoddiad un ffordd o amrywiant a ddilynwyd gan brawf Student-Newman-Keuls. gwerthoedd P o<0.05 were="" considered="">

CANLYNIADAU

Newidiadau mewn Histomorffoleg a Phatholeg mewn Meinweoedd Arennau O'r Cleifion Di-CAD a CAD

Yn yr astudiaeth hon, dangosodd archwiliad histolegol gyda hematoxylin-eosin (HE) a staen trichrome Masson allografft arennol sylweddol IF/TA mewn meinweoedd cleifion CAD (n=4) o'i gymharu â'r cleifion a drawsblannwyd arennau â swyddogaeth arennol sefydlog o'n canolfan ( grŵp nad yw'n grŵp CAD, n=4) (Ffigurau 1A, B). Casgliad enghreifftiol o ddeunyddiau a dulliau ac mae Tabl 1 yn disgrifio'r wybodaeth grwpio fanwl ar gyfer y nodweddion gwreiddiol. Roedd staenio imiwnohistocemeg (IHC) o samplau biopsi arennol dynol yn dangos mynegiant uwch o a-SMA, a ffibronectin (FN), a mynegiant sylweddol llai o CD31 yn y grŵp CAD (Ffigurau 1C-H). Mae CD31 yn brotein marciwr o gelloedd endothelaidd, a chollodd celloedd endothelaidd eu nodwedd CD31 ond cawsant nodweddion mesenchymal fel a-SMA, FN pan fydd EndMT yn digwydd. Roedd y canlyniadau hyn yn dangos bod mynegiadau marcwyr EndMT yn sylweddol uwch yn y grwpiau CAD o gymharu â'r grŵp nad yw'n CAD.

ATG16L wedi'i Ddyrchafu ar ôl Trawsblannu Arennau, ond Cafodd ATG16L ei Is-reoleiddio mewn Cleifion CAD o'i Gymharu â Chleifion Nad Ydynt yn CAD

Lawrlwythwyd data RNA-seq a chlinigol o 25 sampl CAD a 21 o samplau meinwe biopsi arennol cleifion nad ydynt yn CAD o GSE9493. Cofrestrwyd gwybodaeth cleifion yn y gronfa ddata yn Sefydliadau Novartis ar gyfer Ymchwil Biofeddygol, y Swistir, a'i phrosesu ar gyfer histopatholeg. Diagnosis histolegol a dosbarthiad biopsi yn seiliedig ar feini prawf Banff '05. Darperir data demograffig a chlinigol yng nghronfa ddata GEO (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc= GSE9493). Roedd y diagram sgematig o lif y dadansoddiadau fel y dangosir yn Ffigur 2A. Echdynnwyd 1463 o enynnau gwahaniaethol arwyddocaol gyda gwerth P<0.05. using="" the="" criteria="" for="" [log2="" fold="" change="" (log2fc)]=""> 1, we selected 92 up-regulated and 115 down-regulated differential genes from the CAD group compared to the non-CAD group (Figure 2B). Then we searched genes associated with autophagy in the GeneCards database. A total of 149 ARGs with a relevance score >Dewiswyd 7. Roedd 14 ARG wedi'u cynnwys yn ARGs cleifion CAD ac eraill. Yn eu plith, canfuom fod yr ATG16L a gafodd y genyn sgôr perthnasedd uchaf wedi'i isreoleiddio mewn samplau CAD (Ffigur 2C).

Er mwyn osgoi'r effaith swp a gwahaniaethau poblogaeth, fe wnaethom gynnal cyfres o arbrofion gan ddefnyddio sbesimenau dynol o'n canol i gadarnhau canlyniadau cronfa ddata gyhoeddus. Yn y set gyntaf, gwnaethom staenio rhannau o samplau arennol arferol, nad ydynt yn CAD, a CAD gyda gwrthgorff gwrth-ATG16L, a dangoswyd bod mynegiant ATG16L wedi'i leihau'n sylweddol mewn cleifion CAD o'i gymharu â'r grŵp nad yw'n CAD (Ffigur 2E) . Daethpwyd i'r un casgliad gan yr assay blot gorllewinol (WB). Roedd y cynnydd mewn FN yn cynrychioli lefel ffibrosis gwaethygol o arennau trawsblannu ac un o ddangosyddion CAD. Roedd tueddiad WB ATG16L yn gyson â chanlyniadau ein gwiriad staen IHC ac yn gyson â'r canlyniadau yn GEO (Ffigur 2D). Roedd y rhain yn awgrymu bod mynegiant ATG16L yn cael ei leihau yn lle hynny gyda dilyniant CAD. Wrth berfformio dadansoddiad cydberthynas Pearson, canfuom fod gan ATG16L gydberthynas negyddol gref ym mhatrwm mynegiant a‐SMA, proteinau FN a chydberthynas gadarnhaol â mynegiant CD31. Mae 'r' yn cynrychioli gwerth cydberthynas Pearson ac mae gwerthoedd P yn dynodi arwyddocâd cydberthynas (Ffigurau 2F–I).

Roedd Autophagy wedi'i Is-reoleiddio mewn Cleifion CAD, a Rhagreoleiddio Rhagfynegedig Gwael MAP1LC3 mewn Cleifion CAD

Yn yr arbrawf blaenorol, nodwyd nifer o ARGs sy'n rheoleiddio awtophagy o gronfa ddata GEO. Yn eu plith, mae ATG16L yn ymwneud â cham cynnar yr awtoffagy, rydym yn dyfalu am y posibilrwydd y gallai awtoffagy fod yn rhan o CAD. I archwilio'r lefelau o awtoffagi mewn meinweoedd alografft arennol dynol, canfuom yn gyntaf lai o wagolau awtoffagig yn y grŵp CAD trwy ficrosgop electron trawsyrru (TEM), o'i gymharu â'r grŵp nad yw'n CAD (Ffigurau 3A, B). Heblaw am y safon aur TEM ar gyfer monitro awtophagi, mae lefelau is o SQSTM1 a chynnydd mynegiant LC3-II yn adlewyrchu'r cynnydd mewn awtophagi. Dilyswyd tueddiadau tebyg mewn lefelau mynegiant protein o LC3-I (di-lipidation LC3), LC3-II (lipidation LC3), a SQSTM1 yn y grŵp CAD gan assay WB fel y dangosir yn Ffigurau Mae 3C, D. P62/SQSTM1 (SQSTM1) yn dderbynnydd awtophagi dethol ac yn cael ei ddiraddio gan awtophagi. Mae awtoffagosomau yn gysylltiedig â lipidation ffurf sytosolig LC3 a ffurfio LC3-II. Felly, roedd canlyniadau WB hefyd yn awgrymu bod awtophagi yn digwydd.

Mae rhai astudiaethau wedi dangos bod gwahaniaethau o ARGs yn serwm cleifion trawsblaniad aren; lefel serwm LC3 yn ôl pob tebyg oedd y dangosydd prognostig cydberthynas â difrifoldeb y clefyd (25, 26). Er mwyn ymchwilio ymhellach i rôl awtophagi mewn gorymdaith CAD, archwiliwyd y crynodiad serwm LC3 o 30 o gleifion nad ydynt yn CAD a 30 o gleifion CAD drwy assay imiwnosorbent sy'n gysylltiedig ag ensymau (ELISA). Roedd y data demograffig sy'n cyflwyno nodweddion sylfaenol y cleifion yn Nhabl 1. Dangoswyd dosbarthiad nifer yr achosion, rhyw y claf, oedran y claf, gwrthgyrff adweithiol y panel (PRA), regimen gwrthimiwnedd, swyddogaeth arennol y grwpiau nad ydynt yn CAD a CAD. yn Nhabl 1. Ni ddangosodd rhyw, oedran, a PRA unrhyw wahaniaethau mawr. Roedd gwahaniaeth sylweddol mewn creatinin serwm a nitrogen wrea gwaed (BUN) rhwng y ddau grŵp. Yna, gwnaethom geisio pennu gwerth prognostig awtoffagy mewn cleifion CAD. Trwy ganlyniadau serwm ELISA, canfuom fod y mynegiant LC3 yn is yn y grŵp CAD. Roedd yna hefyd CAD cynyddol a gostyngiad cydamserol yn lefel LC3 (Ffigur 3E). Yn ogystal, fe wnaethom rannu LC3 yn grwpiau mynegiant uchel ac isel yn seiliedig ar y canolrif, dadansoddiad goroesi, datgelodd y canlyniadau fod gan grŵp mynegiant isel LC3 amser camweithrediad alografft byrrach (Ffigur 3F). Yn gyffredinol, fe wnaethom ddyfalu bod gan ddiffyg awtophagi gysylltiad arwyddocaol â dilyniant CAD.

Is-reoleiddio ATG16L Llai o Autophagy a Dilyniant Hyrwyddedig EndMT

Er mwyn penderfynu a yw ATG16L yn ymwneud â newid awtophagi, yn gyntaf fe wnaethom drosglwyddo HRGECs gyda RNA pin gwallt byr ATG16L (shRNA). Defnyddiwyd TEM i ddangos yn uniongyrchol ffurfiant gwagolau awtoffagig a chanfuom fod llai o wagolau awtoffagic mewn celloedd a drawsnewidiwyd ATG16L shRNA o'u cymharu â'r rhai a drawsnewidiwyd â shNC sgramblo (Ffigurau 4A, B). Roedd mynegiant protein ATG16L a gweithgaredd awtophagi hefyd wedi'u hisreoli wrth ddymchwel y grŵp ATG16L o'i gymharu â grŵp shNC (Ffigur 4C).

Yna ymchwiliwyd i rôl awtoffagi dibynnol ATG16L yn natblygiad EndMT. Trawsnewidiwyd HRGECs â shRNA ATG16L neu shNC. Dangosodd Ffigur 4D y gallai trawsffurfiad shRNA ATG16L hwyluso mynegiadau FN ac a-SMA yn sylweddol a lleihau mynegiant CD31 o'i gymharu â HRGECs sgramblo a drosglwyddir gan shNC. Mewn cyferbyniad, pan gafodd yr ATG16L ei or-fynegi mewn HRGECs, ni wnaeth dilyniant EndMT hyrwyddo'n arwyddocaol (Ffigur 4E). Roedd canlyniadau staenio IHC hefyd yn cadarnhau tueddiadau WB ar gyfer mynegiadau CD31 ac a-SMA mewn HRGECs (Ffigur 4F).

Newidiadau mewn Ffibrosis Interstitaidd Arennol, Protein Wrin, Gweithrediad Arennol a Chynnydd Dibynnol ar Amser yn EndMT mewn Model Llygoden Fawr Gwrthod Cronig

Nesaf, gwnaethom ymchwilio i'r newidiadau mewn ffibrosis rhyng-ranol arennol, protein wrin, swyddogaeth arennol, ac EndMT in vivo. Sefydlwyd modelau o wrthodiad cronig a drawsblannwyd gan arennau llygod mawr trwy drawsblannu aren o lygod mawr F344 i lygod mawr Lewis. Cymerwyd alografftiau arennol yn wythnosau 8, 12, ac 16 ar ôl trawsblannu aren. Roedd profion staenio HE a staenio Masson yn nodi graddau amrywiol o ymdreiddiad celloedd llidiol, glomerwlosclerosis, atroffi tiwbaidd, a ffibrosis interstitial ar ôl trawsblannu aren. Dangosodd canlyniadau staenio Masson hefyd lawer iawn o ffibrau colagen lliw glas yn y interstitiwm glomerwlaidd ac arennol yn wythnosau 8, 12, 16 ar ôl trawsblannu aren, o'i gymharu â'r grŵp syn (Ffigurau 5A-C). Er mwyn profi swyddogaeth arennol llygod mawr â thrawsblaniad allogeneig, cafodd yr arennau dde brodorol eu halltudio yn ystod y trawsblaniad aren. Pedair wythnos ar ôl echdoriad yr aren dde, dirywiodd protein wrin 24 awr a swyddogaethau arennol gan gynnwys y creatinin serwm a BUN yn raddol ym mhob grŵp hyd at eu marwolaeth (Ffigur 5D). Datgelodd canlyniadau'r asesiad IHC fynegiadau uchel o FN ac a-SMA tra bod mynegiant CD31 wedi lleihau ym mhob grŵp ar ôl 16 wythnos (Ffigur 5E). Cadarnhaodd assay blot gorllewinol ganlyniadau'r asesiad imiwn-histocemeg a dangosodd fod dilyniant EndMT wedi'i ddwysáu gyda'r estyniad i'r amser ar ôl trawsblannu aren (Ffigur 5F).

Autophagy wedi'i Ysgogi gan Drawsblannu Arennau ond â Nam Awtoffagic Flux yng Nghyfnod Diwedd y Model Llygoden Fawr Gwrthod Cronig

Mae LC3, sy'n cael ei ystyried yn farciwr diffiniedig ar gyfer awtoffagi, yn hanfodol ar gyfer ffurfio awtoffagosom ac actifadu fflwcs awtoffagic. Chwistrellwyd firws sy'n gysylltiedig ag adeno (AAV)-mRFP-GFP-LC3 i mewn i'r alografft arennol llygod mawr in vivo yn stereotactig. Rydym yn creu model mRFP-GFP-LC3 er mwyn monitro gweithgarwch awtoffagic wrth drawsblannu aren. Mae AAV- mRFP-GFP-LC3 yn cael ei ddefnyddio fel arfer i fonitro llif awtoffagic in vivo. Mae gan signal GFP sensitifrwydd uwch i amodau asidig lumen lysosomaidd na mRFP. Felly, dangosodd awtopagosomau fflworoleuedd melyn oherwydd cydleoli GFP a fflworoleuedd mRFP a dangosodd awtolysosomau fflworoleuedd coch. Roedd cynnydd mewn fflworoleuedd coch yn dynodi croniad o awtolysosomau ac actifadu awtophagi yn yr aren. Cynyddodd meysydd positif fflworoleuedd coch yn sylweddol yn wythnosau 4, 8,12, ac 16 yn y grwp alo o gymharu â'r grwp syn. Fodd bynnag, gwanhaodd y puncta coch yn gyflym ar ôl cyrraedd yr uchafbwynt yn 8 a 12 wythnos. Gwelwyd newidiadau yn lefel y autophagy yn bennaf yn y llongau bach glomerwlaidd ac ymylol, yn hytrach nag yn y tiwbiau distal neu'r dwythell gasglu (Ffigurau 6A, B). Datgelodd y canlyniadau hyn fod awtophagi wedi'i actifadu yn ystod camau cynnar trawsblannu aren ond nid yn y camau hwyr, ac amharwyd ar glirio awtoffagosom ar ôl tua 8 wythnos. Dangosodd asesiad imiwnohistocemeg fod mynegiant ATG16L yn uwch mewn 8 wythnos nag 16 wythnos (Ffigur 6C). Dangosodd canlyniadau blot gorllewinol hefyd fod lefelau LC3-II ac ATG16L wedi cyrraedd uchafbwynt ar 8 wythnos, ac yna wedi gostwng yn raddol tan 16 wythnos mewn arennau alografft llygod mawr ar ôl trawsblannu (Ffigur 6D).

Cafodd Llwybr NF-kB ei Weithredu a'i Hyrwyddwyd EndMT Ar ôl Diswyddo Mynegiant ATG16L

Yng ngoleuni'r cysylltiad rhwng is-reoleiddio ATG16L ac EndMT mewn model llygod mawr gwrthod cronig a chlefyd CAD, gwnaethom ragdybio y gallai colli ATG16L arwain yn uniongyrchol at ddilyniant EndMT. Er mwyn archwilio ymhellach y mecanwaith posibl ar gyfer y dilyniant hwn, fe wnaethom berfformio dilyniannu trawsgrifiad cyflawn (RNA-seq) yn gyntaf mewn HRGECs gyda ShNC neu ShATG16L. Cafwyd cyfanswm o 453 o enynnau gwahaniaethol (DEGs) rhwng y ddau grŵp. Yn eu plith, cafodd 358 DEG eu huwchreoleiddio a chafodd 95 eu is-reoleiddio (Ffigur 7A). Yna dewiswyd 20 llwybr yn arwyddocaol gan gyfoethogi KEGG. Canfuom fod y llwybr NF-kB yn un o'r llwybrau a weithredwyd yn sylweddol (Ffigur 7B). Cadarnhawyd ailreoleiddio genynnau llwybr NF-kB hefyd gan ddadansoddiad cyfoethogi set Genynnau (GSEA) (Ffigur 7C).

Mae NF-kB yn un o'r ffactorau trawsgrifio hanfodol ar gyfer llwybrau signalau llidiol, a bydd NF-kB yn trawsleoli o cytoplasm i gnewyllyn pan gaiff ei actifadu. Er mwyn cadarnhau actifadu NF-kB a thrawsleoli niwclear, gwnaethom gyflawni'r assay staenio imiwn-fflworoleuedd gan ddefnyddio gwrthgorff gwrth-p65 a chanfod p65 a chafodd y llifyn niwclear ei gydleoli a oedd yn nodi trawsleoli niwclear (Ffigur 7D). Yn ogystal, canfuom fod QNZ, atalydd llwybr signalau NF-kB, yn atal mynegiant NF-kB yn y cnewyllyn yn sylweddol, ac wedi gwrthdroi ymadroddion proteinau cysylltiedig ag EndMT a achosir gan ddymchwel ATG16L (Ffigur 7E).

Cynhaliwyd assay WB hefyd i wirio mecanwaith penodol actifadu llwybr NF-kB. Fe wnaethom ganfod meintioliad o p65 (cyfanswm NF-kB) a p-p65 (NF-kB ffosfforylaidd) mewn HRGECs. Dangosodd canlyniadau WB fod y lefel p65 wedi'i gynyddu yn ShATG16Lgroup o'i gymharu â'r grŵp ShNC, tra bod p-p65 yn dilyn tueddiad cynyddol tebyg (Ffigur 7F). Ynghyd â'r cynnydd yn lefel p-p65 mewn HRGECs ar ôl dymchwel ATG16L, cafwyd cynnydd yng nghyfanswm mynegiant protein p65, a oedd yn debygol o adlewyrchu effaith ychwanegol ar fynegiant p65 mewn HRGECs. Er mwyn canfod a yw sefydlogi NF-kB yn ganlyniad i ddiraddiad is neu fwy o synthesis, ychwanegwyd atalydd synthesis protein cycloheximide (CHX) at y celloedd i atal synthesis protein a dadansoddwyd lefel protein NF-kB. Dangosodd canlyniadau blot y gorllewin fod mynegiant parhaus o brotein p65 ym mhresenoldeb CHX (Ffigur 7G). Yn y cyfamser, nid oedd lefelau mRNA NF-kB wedi'u newid yn sylweddol eto gan ShATG16L. Dangoswyd y data meintiol ar gyfer lefelau mRNA NF-kB ar ffurf graff yn Ffigur 7H. Roedd hyn yn awgrymu bod trawsleoli niwclear NF-kB o ganlyniad i lai o ddiraddio, nid mwy o synthesis ar ôl dymchwel ATG16L mewn HRGECs. Er mwyn cadarnhau ymhellach fynegiant NF-kB mewn meinwe dynol, fe wnaethom berfformio assay staenio imiwnfflworoleuedd ar feinweoedd alografft arennol dynol a gyflawnwyd a chanfod lefel mynegiant o gynnydd sylweddol p65 mewn allografftiau arennol claf CAD (Ffigurau 7I, J).

Cyfrinach Sytocinau Wedi'i Ysgogi gan Actifadu Llwybr NF-kB, Yn eu plith IL-1b, IL-6, a TNF-a Gallai Ysgogi Dilyniant EndMT mewn HRGECs

Mae signalau NF-kB yn brif reoleiddiwr yr ymateb llidiol. Yna fe wnaethom archwilio'r ffactorau hydawdd sy'n gyfrifol am EndMT a achosir gan shATG16L gan RT-PCR. Ymhlith y nifer o cytocinau sy'n berthnasol i'r namau awtoffagy ac ymateb llidiol, IL-1b, IL-6, a TNF-a, roedd y ffactorau ymfflamychol nodweddiadol i lawr yr afon a achosir gan y llwybr NF-kB, yn arwyddocaol. yn uwch o'i gymharu â HRGECs a drosglwyddwyd gan shNC yn ystod amhariad ar weithgarwch awtoffagi (Ffigur 8A). Mae hyn yn unol â'n canfyddiadau blaenorol o ffactorau llidiol fel TNF - cynnydd yn y serwm llygod mawr â gwrthodiad cronig (27).

Er mwyn ymchwilio i bathogenesis EndMT a ysgogwyd gan IL{{{{{{{0}}b, IL-6, a TNF-a, fe wnaethom drin yr HRGECs â chrynodiadau gwahanol o IL-1b ({{-6b) 7}}~20 ng/mL), IL-6 (0~200 ng/mL) a

TNF‐a ({{{0}}~20 ng/mL) am 24 awr. Gallai pob un o IL-1b, IL-6, a TNF-a uwchreoleiddio lefel protein FN ac a-SMA gyda dirywiad dos-ddibynnol yn y marcwyr celloedd endothelaidd CD31 ar yr un pryd. Cyrhaeddodd yr effeithiau hyn eu huchafbwynt pan gafodd HRGECs eu trin â 10 ng/mL IL-1b, 200 ng/mL IL-6, neu 10 ng/mL TNF‐a, yn y drefn honno (Ffigur 8B). Perfformiwyd arbrofion dibyniaethau amser hefyd i ddilysu mynegiadau cysylltiedig EndMT. Fel y dangosir yn Ffigur 8B, gallai IL-1b, IL-6 neu driniaeth TNF-a ar gyfer 0~48 h achosi mynegiadau FN ac a-SMA yn rhyfeddol ac arwain at golli CD31 mewn HRGECs fel y amser ysgogiad yn cynyddu. Er mwyn profi effeithiau IL-1b, IL-6, a TNF-a ar driniaeth EndMT, Anakinra, Tocilizumab, ac Infliximab, cychwynnwyd wrth ddymchwel ATG16L. Mae Anakinra yn wrthwynebydd derbynnydd interleukin{-1 (IL-1R). Mae Tocilizumab yn wrthgorff niwtraleiddio IL-6R sy'n rhwystro IL-6 rhag rhwymo i IL-6R. Mae infliximab yn wrthgorff monoclonaidd IgG1 sy'n rhwymo'n benodol i TNF-a ac mae'n atalydd TNF-a sydd wedi'i ddefnyddio'n llwyddiannus i reoli clefyd llidiol y coluddyn. Dangosodd canlyniadau WB y gallai Anakinra ac Iniximab leihau'r EndMT yn amlycach (Ffigur 8C). Roedd y canlyniadau hyn yn awgrymu bod colli ATG16L nid yn unig yn llai o weithgaredd awtophagig ond hefyd yn hyrwyddo secretion cytocinau llidiol IL-1b, IL-6, a TNF-a trwy atal diraddiad p65 i actifadu'r NF- llwybr kB (Ffigur 8D).

TRAFODAETH

Yn yr astudiaeth bresennol hon, dangoswyd bod trawsblaniad aren yn amharu ar y fflwcs awtoffagig, a oedd yn gysylltiedig â chynnydd yn yr ymateb llidiol, EndMT, a difrifoldeb ffibrosis rhyng-raniadol alografftau arennol. Er bod gweithgarwch awtoffagic wedi'i gynyddu dros dro yn ystod camau cynnar trawsblannu alografft, gostyngodd yn raddol oherwydd colli ATG16L. Gallai awtoffagi sy'n ddibynnol ar ATG16L, fel proses sytoprotective, wanhau ffibrosis rhyngosodol yr arennau a drawsblannwyd trwy reoleiddio'r EndMT a achosir gan IL-1b, IL-6, a TNF-a. Hyd eithaf ein gwybodaeth, dyma'r astudiaeth gyntaf sy'n egluro rôl a newid deinamig fflwcs awtoffagig mewn trawsblannu aren. Yn yr astudiaeth hon, buom hefyd yn ymchwilio i'r manylion pathoffisiolegol moleciwlaidd sy'n sail i'r ffordd y mae amhariad ar lif awtoffagig yn arwain at EndMT a ffibrosis interstitial alografft arennol.

Er bod llawer o fathau o ymchwil wedi nodi bod awtoffagy yn ymwneud â ffurfio a dilyniant ffibrosis rhyng-ranol arennol, nid yw ARGs wedi'u dadansoddi'n gynhwysfawr i archwilio eu gwerth clinigol yn natblygiad gwrthodiad impiad arennol cronig. Mae cannoedd o broteinau yn gysylltiedig â'r broses o awtophagi. O ystyried pwysigrwydd awtophagi wrth drawsblannu aren, mae'n rhesymol dyfalu bod gan ARG addewid mawr o ran rhagfynegi prognostig a thargedau therapiwtig. Er mwyn archwilio ffactorau pathogenetig gwreiddiol CAD, fe wnaethom broffilio mynegiadau mRNA o 149 ARGs yn y garfan GSE9493 a dadansoddi'n bendant 14 ARG, a oedd yn fwyaf cysylltiedig ag awtoffagy rhwng CAD a chleifion nad ydynt yn CAD. Ymhlith yr ARGs is-reoledig yn y grŵp CAD, roedd genynnau rheoleiddio negyddol awtophagy, megis Raptor a MAPK3 (28, 29), wedi'u hisreoleiddio yn y grŵp CAD. Ar y llaw arall, roedd ATG16L fel ARG wedi'i reoleiddio i fyny yn sgaffald ar gyfer lipidation LC3 trwy leoleiddio'n ddeinamig i'r pilenni ffynhonnell tybiedig a hyrwyddo ffurfiad gwagolyn awtoffagic (30). Fodd bynnag, mae rhai astudiaethau wedi dangos nad oedd angen ATG16L ar gyfer ymestyn y bilen ynysu (23). Felly, astudiwyd y cysylltiad rhwng rôl awtophagi-annibynnol neu awtophagi-ddibynnol ATG16L ac EndMT.

Er mwyn ymchwilio i'r cysylltiad rhwng ATG16L, awtophagy, ac EndMT yn yr arennau a drawsblannwyd, fe wnaethom ni ddymchwel ATG16L gan shRNA mewn HRGECs. Datgelodd ein canfyddiadau y gallai shATG16L leihau lefelau awtoffagy a chymell EndMT. Yn yr un modd, datgelodd ymchwil in vivo a samplau clinigol hefyd fod actifadu ATG16L a fflwcs awtoffagic yng nghyfnod cynnar trawsblaniad aren, fflwcs awtoffagic wedi dirywio mewn ystod ddeinamig wrth i'r newidiadau ffibrotig gynyddu. Gellir dod i'r casgliad mai'r rheswm dros ddilyniant EndMT fwy na thebyg yw gostyngiad yn y fflwcs awtoffagig, ac mae awtoffagi sy'n ddibynnol ar ATG16L yn chwarae rhan amddiffynnol yn natblygiad EndMT a ffibrosis interstitaidd alografft arennol. Fodd bynnag, dangosodd rhai canfyddiadau fod awtophagi a achosir gan rapamycin wedi arwain at actifadu EndMT mewn HCAECs o dan amodau anocsig (22). Mae'n ymddangos bod y rhain yn wahanol i'n canlyniadau. Rydym yn ystyried y gallai rôl awtophagi fod yn wahanol mewn mathau amrywiol o gelloedd. Gallai fod yn ddibynnol ar gyd-destun cellog a ffactorau rheoleiddio i fyny'r afon. O ystyried bod awtoffagi dibynnol ATG16L yn fodd o hunan-amddiffyn pan fo EndMT yn digwydd yn CAD, mae'n ystyrlon pennu mecanwaith penodol EndMT a achosir gan shaTG16L.

Fe wnaethom berfformio dilyniant cenhedlaeth nesaf o'r grŵp o grŵp dymchwel a rheoli ATG16L mewn HRGECs. Datgelodd llwybrau KEGG a dadansoddiad GSEA fod y llwybr NF-kB yn un o'r llwybrau a gyfoethogwyd fwyaf arwyddocaol. Mae NF-kB fel arfer yn clymu i IkB, sy'n sefydlogi NF-kB yn y cytoplasm. Pan fydd y llwybr NF-kB yn cael ei actifadu, mae heterodimer p65 NF-kB yn trawsleoli i'r cnewyllyn ac yn clymu i'w hyrwyddwr penodol (31). Un o'r llwybrau canonaidd (clasurol) ar gyfer trawsleoli niwclear NF-kB yw ffosfforyleiddiad p65. Fodd bynnag, adroddwyd bod cynnydd yn nifer y llwybrau nad ydynt yn ganonaidd mewn gwahanol glefydau. Adroddwyd hefyd y gallai'r awtoffagi dethol cyfryngol p62/SQSTM a ataliwyd leihau diraddiad lysosomaidd llwybr NF-kB (32), mae diffyg awtoffagi hefyd yn arwain at actifadu NF-kB oherwydd mynegiant SQSTM1 parhaus, sydd yn ei dro yn hyrwyddo tumorigenesis mewn modelau llygoden (33). Yn ein hastudiaeth, gwelsom gynnydd mewn lefelau protein p65 a p-p65 tra nad oedd y lefelau mRNA wedi newid. Ym mhresenoldeb atalydd synthesis protein CHX, mae cronni'r protein p65 yn parhau o gymharu ag absenoldeb atalydd. Roeddem, felly, wedi dyfalu bod actifadu NF-kB a achoswyd gan ddymchwel ATG16L yn deillio o lai o ddiraddio protein ac y gallai’r broses hon fod yn ataliad diraddio dibynnol awtoffagic.

Mae llid yn gwbl gydgysylltiedig â chanlyniadau pwysig trawsblaniadau aren ar lefelau clinigol a therapiwtig (34). Yr NF-kB p65 yw'r ffactor trawsgrifio pwysicaf wrth reoleiddio ffactorau llidiol cellog. Yn yr astudiaeth hon, canfuom hefyd fod dymchwel ATG16L wedi cynyddu cytocin IL-1b, IL-6, a TNF-a drwy'r llwybr NF-kB. Mae hwn a chanfyddiadau eraill yn cytuno â'r astudiaethau niferus eraill megis y rhai a ddaeth i'r casgliad bod colli cynhyrchiant IL a achosir gan endotocsin uwch (35) a TNFAIP3/A20 ATG16L yn rhwymo ATG16L1 i reoli'r ymateb awtoffagic, NF-kB actifadu (36). Ymhellach, mae rôl cytocinau llidiol ar EndMT wedi'i adrodd mewn rhai astudiaethau cynharach. Serch hynny, mae'n debygol bod y cytocinau llidiol hyn yn chwarae rhan amrywiol yn dibynnu ar y patholeg sylfaenol a'i lefelau amgylchynol. Mewn model llygoden gordewdra a achosir gan ddeiet, mae diffyg awtoffagy endothelaidd wedi'i achosi gan IL6-dibynnol EndMT (37). Mewn clefyd calcheiddio fasgwlaidd, IL{-1b a TNF-a ysgogwyd EndMT mewn celloedd endothelaidd aortig sylfaenol dynol (38). Roedd ein canlyniadau'n sgrinio ac yn nodi IL-1b, IL{-6, a TNF-a fel cytocinau llidiol hyrwyddo EndMT mewn amgylcheddau patholegol CAD. Gyda hyn, ymchwiliwyd i'r perthnasoedd dwyochrog rhwng colli ATG16L a cytocinau llidiol i danlinellu'r targedau therapiwtig posibl i reoli colled ATG16L mewn dilyniant CAD.

Mae gan ein hymchwil nifer o gyfyngiadau. Dim ond mewn model llinell gell dymchwel y cynhaliwyd y dilysiad presennol o effeithiau ATG16L ar EndMT a dilyniant ffibrosis, go brin y gellir dynwared cymhlethdod newidiadau awtophagi yn vivo ac yn natblygiad CAD ac mae'n tanlinellu'r angen am lygod cnocio amodol endothelaidd ATG16L. . Byddwn yn sefydlu model trawsblaniad arennol llygoden knockout ATG16L ar gyfer astudiaeth mecanwaith pellach. Dangosodd ein canlyniadau fod colli ATG16L ac awtoffagy yn hyrwyddo EndMT, QNZ yn atal actifadu NF-kB, ac roedd IL-1b, TNF-a gwrthgorff monoclonaidd yn gwrthgyrff derbynyddion penodol a thrwy hynny arafu'r broses ffibrotig alografft, ond ni allai'n llwyr gwrthdroi'r canlyniad hwn. Ni wyddys a oedd mecanweithiau eraill yn chwarae rôl debyg. Yn ogystal, yn ogystal â chelloedd endothelaidd, mae ffynhonnell myoffibroblasts yn cynnwys amrywiaeth o gelloedd, gan gynnwys epithelial, ffibroblastiau, a phericytes (39). Mae p'un a yw colli ATG16L a diffyg autophagy yn effeithio ar y celloedd hyn yn dal yn amhendant.

I gloi, profodd yr astudiaethau cyfredol fod dymchwel ATG16L yn hanfodol ar gyfer amhariad ar fflwcs awtoffagig a ffurfiant EndMT a achosir gan IL-1b, IL-6, a TNF-a yn natblygiad ffibrosis rhyng-ranol arennol trawsblanedig. . Cyfryngwyd y swyddogaeth hon gan NF-kB gan leihau diraddio a gweithrediad llwybr. I grynhoi, mae canlyniadau ein hastudiaeth yn rhoi mewnwelediad newydd i berthynas ddeinamig fflwcs awtoffagic ac EndMT. Gallai atal colled ATG16L ac ataliad fflwcs awtophagi fod yn opsiwn newydd ar gyfer trin ac atal dilyniant ffibrosis rhyng-ranol arennol a CAD mewn derbynwyr trawsblaniad aren.

Mae coesyn Cistanche yn atal clefyd yr arennau, cliciwch yma i gael y sampl

DATGANIAD ARGAELEDD DATA

Bydd y data crai sy'n cefnogi casgliadau'r erthygl hon ar gael gan yr awduron, heb unrhyw amheuaeth.

DATGANIAD MOESEG

Cafodd yr astudiaethau yn cynnwys cyfranogwyr dynol eu hadolygu a'u cymeradwyo gan bwyllgor moeseg lleol Ysbyty Cysylltiedig Cyntaf Prifysgol Feddygol Nanjing. Darparodd y cleifion/cyfranogwyr eu caniatâd gwybodus ysgrifenedig i gymryd rhan yn yr astudiaeth hon. Adolygwyd a chymeradwywyd yr astudiaeth anifeiliaid gan bwyllgor moeseg lleol Ysbyty Cysylltiedig Cyntaf Prifysgol Feddygol Nanjing. Cafwyd caniatâd gwybodus ysgrifenedig gan y perchnogion ar gyfer cyfranogiad eu hanifeiliaid yn yr astudiaeth hon.

CYFRANIADAU AWDUR

Bu RT a MG yn goruchwylio ac yn llunio'r prosiect. Dyluniodd a chynhaliodd ZG, CS, a ZW y rhan fwyaf o'r arbrofion. Casglodd MZ a SF y samplau o lygod mawr. Dadansoddodd LS, HC, ZH, JT, XJ, a HY y data. Gwnaeth ZG a ZW y ffigurau. Drafftiodd a diwygiwyd y papur gan ZG ac RT. Cyfrannodd pob awdur at yr erthygl a chymeradwyo'r fersiwn a gyflwynwyd.

CYLLID

Mae'r gwaith hwn wedi'i gefnogi gan Sefydliad Cenedlaethol Gwyddoniaeth Naturiol Tsieina [rhifau grant 82070769, 81870512, 81770751, 81570676, 81470981, 81100532].

CYFEIRIADAU

1. Carney EF. Trawsblannu: Budd goroesi o dderbyn aren rhoddwr diabetig ymadawedig. Nat Parch Nephrol (2017) 13(8):444. DOI: 10.1038/nrneph.2017.88

2. El-Husseini A, Aghil A, Ramirez J, Sawaya B, Rajagopalan N, Baz M, et al. Deilliant trawsblaniad aren mewn trawsblannu organau solet cynradd, ailadroddus ac aren ar ôl anarenol: 15-dadansoddiad blwyddyn o gronfa ddata UNOS ddiweddar. Trawsblannu Clin (2017) 31(11). DOI: 10.1111/ctr.13108

3. Schinstock CA, Stegall M, Cosio F. Mewnwelediadau newydd ynghylch gwrthodiad cronig wedi'i gyfryngu gan wrthgyrff a'i ddilyniant i glomerwlopathi trawsblannu. Curr Opin Nephrol Hypertens (2014) 23(6):611–8. doi: 10.1097/MNH. 000000000000070

4. Goldberg RJ, Weng FL, Kandula P. Camweithrediad Allograft Aciwt a Chronig mewn Derbynwyr Trawsblannu Arennau. Med Clin North Am (2016) 100(3):487–503. doi: 10.1016/j.mcna.2016.01.002

5. Wang Z, Han Z, Tao J, Wang J, Liu X, Zhou W, et al. Rōl trawsnewid endothelaidd-i- mesenchymal a achosir gan TGF-beta1 mewn ffibrosis rhyngosodol trawsblannu arennau. J Cell Mol Med (2017) 21(10):2359–69. doi: 10.1111/ naid.13157

6. An C, Jia L, Wen J, Wang Y. Targedu Ffibroblastau sy'n Deillio o Fêr Esgyrn ar gyfer Ffibrosis Arennol. Adv Exp Med Biol (2019) 1165:305–22. doi: 10.1007/978-981- 13-8871-2_14

7. Cruz-Solbes AS, Youker K. Pontio Epithelial i Mesenchymal (EMT) ac Endothelaidd i Bontio Mesenchymal (EndMT): Rôl a Goblygiadau mewn Ffibrosis Arennau. Canlyniadau Probl Cell Differ (2017) 60:345–72. doi: 10.1007/978- 3-319-51436-9_13

8. Yang J, Antin P, Berx G, Blanpain C, Brabletz T, Bronner M, et al. Canllawiau a diffiniadau ar gyfer ymchwil ar bontio epithelial-mesenchymal. Nat Parch Mol Cell Biol (2020) 21(6):341–52. doi: 10.1038/s41580-020-0237-9

9. Zeisberg EM, Potenta SE, Sugimoto H, Zeisberg M, Kalluri R. Mae ffibroblastiau mewn ffibrosis yr arennau yn dod i'r amlwg trwy bontio endothelaidd-i-mesenchymal. J Am Soc Nephrol (2008) 19(12):2282–7. doi: 10.1681/ASN.2008050513

10. Di Gregorio J, Robuffo I, Spalletta S, Giambuzzi G, De Iuliis V, Toniato E, et al. Y Pontio Epithelial-i-Mesenchymal fel Targed Therapiwtig Posibl mewn Anhwylderau Ffibrotic. Cell Blaen Dev Biol (2020) 8:607483. doi: 10.3389/ syrthiodd.2020.607483

11.Cardinal H, Dieude M, Hebert MJ. Camweithrediad Endothelaidd mewn Trawsblannu Arennau. Blaen Immunol (2018) 9:1130. DOI: 10.3389/fimmu.2018. 01130

12. Zhao Y, Cooper DKC, Wang H, Chen P, He C, Cai Z, et al. Rôl patholegol bosibl cytocinau pro-lid (IL-6, TNF-alpha, ac IL-17) mewn senotrawsblaniadau. Senodrawsblaniad (2019) 26(3): e12502. doi: 10.1111/Xen.12502

13. Zhao C, Xu Z, Wang Z, Suo C, Tao J, Han Z, et al. Rôl ffactor-alffa necrosis tiwmor mewn pontio epithelial-i-mesenchymal mewn celloedd arennau wedi'u trawsblannu mewn derbynwyr â chamweithrediad alografft cronig. Gene (2018) 642:483–90. DOI: 10.1016/j.gene.2017.11.059

14. Zhang B, Niu W, Dong HY, Liu ML, Luo Y, Li ZC. Mae hypocsia yn achosi trawsnewid mesenchymal endothelaidd mewn ailfodelu fasgwlaidd ysgyfeiniol. Int J Mol Med (2018) 42(1):270–8. doi: 10.3892/ijmm.2018.3584

15. Li J, Zhang Q, Ren C, Wu X, Zhang Y, Bai X, et al. Mae Uwchsain Pwls Dwysedd Isel yn Atal y Trawsnewid Endothelaidd-Mesenchymal Endothelaidd a Achosir gan Straen Ocsidiol mewn Celloedd Endothelaidd Aortig Dynol. Biocemeg Cell Ffisiol (2018) 45 (4):1350–65. doi: 10.1159/000487561

16. Guan Q, Nguan CY, Du C. Mynegiant o drawsnewid twf ffactor-beta1 yn cyfyngu ar anaf arennol isgemia-reperfusion. Trawsblannu (2010) 89(11):1320– 7. doi: 10.1097/TP.0b013e3181d8e9dc

17. Levine B, Kroemer G. Swyddogaethau Biolegol Genynnau Autophagy: Safbwynt Clefyd. Cell (2019) 176(1-2):11–42. DOI: 10.1016/j.cell.2018.09.048

18.De Rechter S, Decuypere JP, Ivanova E, van den Heuvel LP, De Smedt H,

Levtchenko E, et al. Autophagy mewn clefydau arennol. Pediatr Nephrol (2016) 31 (5):737–52. doi: 10.1007/s00467-015-3134-2

19. Li H, Peng X, Wang Y, Cao S, Xiong L, Fan J, et al. Atg5-diffyg awtophagi cyfryngol mewn tiwbiau procsimol yn hyrwyddo arestiad cylchred celloedd G2/M a ffibrosis arennol. Autophagy (2016) 12(9):1472–86. doi: 10.1080/ 15548627.2016.1190071

Baisantry A, Bhayana S, Rong S, Ermeling E, Wrede C, Hermann J, et al. Mae Autophagy yn Cymell Newidiadau Prosenaidd mewn Segmentau Tiwbaidd Procsimol S3. J Am Soc Nephrol (2016) 27(6):1609–16. doi: 10.1681/ASN.2014111059