Mewn Dyluniad Silico O Frechlyn Aml-epitope Chimerig Anlwg yn Erbyn Mycobacterium Twbercwlosis Rhan 2

 2.15. Trosolwg o ddyluniad brechlyn aml-epitope

Mae Ffig. 1 yn crynhoi cysyniad cyffredinol y cynllun brechlyn aml-epitope hwn. Yn fyr, dadansoddwyd antigenigedd proteinau twbercwlosis M. a gafwyd o IEDB a dewiswyd wyth ymgeisydd antigenig ar gyfer adeiladu brechlyn aml-epitope, gan ystyried eu dosbarthiad swyddogaethol a'u lleoleiddio isgellog. Yna, gwnaethom ragfynegi epitopau antigenig yr wyth protein hyn a dewiswyd 15 epitop CTL, 16 epitopes HTL, a 10 epitopau celloedd B, a oedd wedi'u cysylltu ymhellach â HBHA adjuvant a PADRE trwy gysylltwyr addas. At hynny, gwnaethom ragweld antigenigedd, alergenedd, priodweddau ffisiocemegol, a phroffil imiwnogenaidd y brechlyn aml-epitope a ddyluniwyd. Yn y cyfamser, gwnaethom hefyd ragweld strwythurau eilaidd a thrydyddol y brechlyn a dadansoddi ei ryngweithiad posibl â derbynnydd imiwnedd TLR4.

Mae mycobacterium tuberculosis yn bathogen cyffredin sy'n achosi twbercwlosis. Protein twbercwlosis mycobacterium yw un o brif gydrannau Mycobacterium tuberculosis, sy'n hanfodol iawn ar gyfer swyddogaeth y system imiwnedd ddynol.

Gall protein mycobacterium twbercwlosis actifadu'r system imiwnedd ddynol a gwella imiwnedd y corff. Pan fydd y corff wedi'i heintio gan Mycobacterium tuberculosis, bydd y system imiwnedd ddynol yn cynhyrchu cyfres o ymatebion imiwn, gan gynnwys actifadu ac amlhau celloedd T penodol a chelloedd B. Gall y celloedd hyn ryddhau amrywiaeth o ffactorau imiwnedd, megis interferon, interleukin, ac ati, yn ogystal â gwrthgyrff i helpu'r corff i wrthsefyll y Mycobacterium twbercwlosis goresgynnol.

Yn ogystal, gall y protein Mycobacterium tuberculosis hefyd reoleiddio cydbwysedd y system imiwnedd ac osgoi difrod imiwn a achosir gan activation gormodol o ymateb imiwnedd y corff. Yn ystod y blynyddoedd diwethaf, mae ymchwil a datblygu brechlynnau twbercwlosis hefyd wedi canolbwyntio'n bennaf ar gymhwyso protein twbercwlosis Mycobacterium, a all wella imiwnedd y system imiwnedd ddynol trwy frechu ac atal twbercwlosis rhag digwydd a lledaenu'n effeithiol.

Felly, mae'r protein Mycobacterium tuberculosis yn bwysig iawn ar gyfer effaith imiwnedd dynol. Trwy gryfhau'r system imiwnedd yn weithredol, trwy ymarfer corff priodol a maethiad rhesymol, gallwch chi atal twbercwlosis a chlefydau heintus eraill yn well a chynnal iechyd da. O'r safbwynt hwn, mae angen inni wella ein himiwnedd. Gall Cistanche wella imiwnedd yn sylweddol oherwydd gall y polysacaridau mewn cig reoleiddio ymateb imiwnedd y system imiwnedd ddynol, gwella gallu straen celloedd imiwnedd, a gwella imiwnedd celloedd imiwnedd. Effaith bactericidal.

Cliciwch atodiad cistanche deserticola

3. Canlyniadau

3.1. Adalw proteinau twbercwlosis M. ar gyfer adeiladu brechlyn aml-epitope

Er mwyn llunio brechlyn aml-epitope yn erbyn TB, dadansoddwyd yn gyntaf antigenigedd proteinau mewn M. twbercwlosis H37Rv. Cafwyd cyfanswm o 492 o broteinau gyda phriodweddau imiwnolegol dilys o gronfa ddata IEDB, a rhagfynegwyd bod 402 o broteinau (81.70 y cant) yn antigenig. Ar gyfer nodweddu swyddogaethol y 492 o broteinau hyn, cyfoethogwyd 353 yng nghronfa ddata DAVID, tra nad oedd 139. Dangosodd dadansoddiad lleoleiddio fod 97 o'r 353 o broteinau wedi'u cyfoethogi wedi'u lleoleiddio yn yr adran allgellog, y gofod y tu allan i wyneb y gell. Mae proteinau sydd wedi'u lleoli yn yr adran allgellog yn cynnwys proteinau pilen allanol a phroteinau wedi'u secretu.

Ymhlith y 97 o broteinau, mae 49 yn broteinau secretion. Datgelodd cyfoethogi pellach o 49 o broteinau wedi'u secretu fod pum protein wedi'u secretu i'r gofod allgellog a bod angen pump ar gyfer pathogenesis (a ddilyswyd yn arbrofol gan BioCyc) [48]. At hynny, pan oedd y deg protein hyn wedi'u halinio â chyfanswm proteinau H. sapiens, roedd dau brotein (Mpt83 a Mpt70) yn debyg iawn i broteinau H. sapiens. Felly, ystyriwyd yr wyth protein arall nad oeddent yn debyg i broteinau H. sapiens (Tabl 1) yn ymgeiswyr terfynol ar gyfer adeiladu brechlyn aml-epitope.

3.2. Rhagfynegi epitopau celloedd T a chell B o broteinau ymgeisiol

Cyn rhagfynegiad epitope, nodwyd peptidau signal a'u dileu o broteinau ymgeiswyr. Rhagfynegwyd cyfanswm o 623 o epitopau CTL o wyth ymgeisydd o broteinau gyda 135 o rwymwyr cryf (16 o A1, 40 o A2, 22 o A3, 19 o A24, a 38 o uwchdeipiau B7 o MHC dosbarth I) gan y NetMHCpan{{12} }.1 gweinydd (Ffig. 2A, B). Ymhlith y 135 o rwymwyr cryf, roedd 36 yn antigenig ac yn imiwnogenig. Yn olaf, dewiswyd 15 allan o 36 o epitopau CTL yn unol â'r meini prawf canlynol: tri epitop i bob uwchdeip ac o leiaf un i bob ymgeisydd protein (Nodyn: Nid oedd gan EsxA rhwymwr cryf a oedd yn antigenig ac yn imiwnogenig) (Tabl 2).

Ar ben hynny, rydym yn rhagweld eu epitopes HTL (MHC dosbarth II epitopes). {{0}}mer epitopau o bedwar alel (HLA_DRB, HLA_DP, HLA_DQ, a H-2-I) ag a safle canrannol Llai na neu'n hafal i 2. Ystyriwyd 0 yn rwymwyr cryf ac fe'u graddiwyd o'r sgôr isaf i'r sgôr uchaf. Yr alelau HLA-DR oedd â'r nifer uchaf o rwymwyr MHC II (2990), tra bod gan yr HLA-DP y lleiaf (601) (Ffig. 2 C, D). Dylid nodi bod yr ymateb imiwn mewn anhwylderau granulomatous fel twbercwlosis, y gwahanglwyf, a sarcoidosis yn cael ei ddominyddu gan gelloedd cynorthwyydd T sy'n cynhyrchu IFN-1 (Th1) [97]. Yn ogystal, datgelodd adroddiadau blaenorol fod mynegiant cytocinau Th1 (IFN- ac IL2) wedi gostwng mewn cleifion twbercwlosis [98]. Felly, er mwyn ysgogi celloedd Th1, gwnaethom ragweld 15-mer IFN- -yn achosi peptidau o'r proteinau hyn. Rhagwelwyd cyfanswm o 534 o epitopau gyda gweithgaredd ysgogi IFN gan ddefnyddio NetMHCIIpan 4.0, ac mae 315 o'r epitopau yn antigenig. O'r 315 o epitopau hyn, dangosodd 103 weithgarwch rhwymo cryf i o leiaf un alel HLA.

Hefyd, mae polymorffedd mewn alelau HLA yn arwain at amrywiad alelig, gan arwain at nodweddion rhwymo peptid sy'n wahanol iawn [55]. O ganlyniad, fe ddewison ni un epitope gyda'r gweithgaredd rhwymo cryfaf (yr epitop mwyaf amlbwrpas) o bob un o'r wyth proteinau ymgeisydd. Yn ogystal, graddiwyd y 95 epitop sy'n weddill yn seiliedig ar gryfder rhwymo, ac yna dewiswyd wyth epitop ychwanegol, gydag uchafswm o ddau epitopes fesul ymgeisydd protein. Yn olaf, dewiswyd 16 allan o 103 o epitopau HTL yn unol â'r meini prawf canlynol: o leiaf un epitope ac uchafswm o dri epitopes fesul ymgeisydd protein, gweithgaredd rhwymo cryfaf fesul protein ymgeisydd, a'r rhan fwyaf o antigenig ac IFN- cymell. Yna fe wnaethon ni eu defnyddio i adeiladu'r brechlyn aml-epitope hwn (Tabl 2).

O ran rhagfynegiad epitope cell B llinol, defnyddiwyd dau weinydd (BepiPred2.0 ac ABCpred) a chafwyd 166 o epitopau. Fe wnaethom ragweld antigenigedd y pum epitopes uchaf ar gyfer pob protein ac yna dewiswyd deg epitop antigenig (16-mer, o leiaf un o bob ymgeisydd protein) (Tabl 2).

3.3. Adeiladu brechlyn aml-epitope

Ar gyfer adeiladu brechlyn aml-epitope, cysylltwyd HBHA, PADRE, 16 HTL (15-mer), 15 CTL, a 10 epitop cell B llinol (16-mer) trwy ddolenwyr priodol a'u cynffonio gan His. × 6 tag (Ffig. 3). Mae cynorthwywyr yn gydrannau pwysig o frechlynnau a all roi hwb i ymatebion imiwnedd cynhenid ​​ac addasol [99]. Mae gan lawer o broteinau o M. twbercwlosis briodweddau cynorthwyol ac fe'u defnyddiwyd i ddylunio brechlynnau [17,27,87,100-105]. Un o'r rhai a ddefnyddir fwyaf yw HBHA [100-105], sy'n imiwnogydd cryf sy'n cymell aeddfedu celloedd dendritig (DCs) trwy brosesu TLR4 [105,106]. Canfuwyd bod DCs sy'n cael eu trin â HBHA yn actifadu celloedd T naïf, yn polareiddio celloedd CD4 a mwy a CD8 plws T i secretu IFN- a chymell sytowenwyndra wedi'i gyfryngu gan gelloedd T [47].

Yn yr astudiaeth hon, fe wnaethom osod HBHA fel cynorthwyydd protein yn y N-terminus oherwydd ei fod yn addas cychwyn synthesis lluniad brechlyn o HBHA, protein sy'n digwydd yn naturiol. Mae HBHA wedi'i osod yn flaenorol ar derfynfa N rhai brechlynnau aml-epitop fel cynorthwyydd [105,107]. Yn ogystal â chynorthwywyr, gall PADRE, sy'n ddiogel i fodau dynol, wella imiwnogenigrwydd brechlyn yn sylweddol oherwydd ei fod yn clymu ag affinedd uchel i alelau lluosog llygoden ac MHC-II dynol gydag affinedd uchel i gymell ymatebion trwy gyfrwng celloedd Th [47,62]. Cysylltwyd HBHA a PADRE gan gysylltydd PEAK helical, sy'n darparu anhyblygedd wrth wahanu'r ddwy gydran protein i wella effeithlonrwydd a lleihau ymyrraeth. Ymhellach, sefydlogodd pont halen Glu-Lys a ffurfiwyd o fewn y segmentau y cysylltydd.

Gan y gall PADRE wella gweithgaredd epitopau HTL y brechlyn [54], fe wnaethom osod yr 16 epitopes HTL ar ôl PADRE. Defnyddiwyd y cysylltydd GPGPG i gysylltu epitopau HTL â'i gilydd ac â PADRE gan ei fod yn hwyluso dilyniant celloedd imiwnedd a chyflwyniad epitope [108,109]. Ar ben hynny, mae GPGPG yn ysgogi ymateb imiwn HTL, a all amharu ar imiwnogenigrwydd cyffordd ac adfer imiwnogenigrwydd epitopau unigol ar ôl prosesu [108].

Ar gyfer yr epitopau 15 CTL, ymunodd cysylltydd AAY â'r epitope unigol, sy'n helpu'r epitope i gynhyrchu safleoedd addas i rwymo i'r cludwr TAP a gwella cyflwyniad epitope [47]. Ymhellach, roedd yr is-uned epitope CTL gyfan yn gysylltiedig â'r epitopau HTL i fyny'r afon trwy'r cysylltydd HEYGAEALERAG sy'n meddu ar bum gwefan holltiad priodol (A{7-L8, A5-E6, Y3-G4, R 10-A11, ac L8-E9) yn hanfodol ar gyfer systemau diraddio proteasomaidd a lysosomaidd ewcaryotig. Mewn ewcaryotau, proteasomau a lysosomau yw'r peiriannau proteolytig pwysicaf, sy'n defnyddio'r system ubiquitin-proteasome (UPS) a'r llwybr autophagy, yn y drefn honno [110].

Defnyddiwyd cysylltydd HEYGAEALERAG hefyd i gysylltu'r is-uned epitope CTL â'r 10 epitop llinellol B-gelloedd wedi'u cysylltu â'i gilydd gan gysylltwyr KK. Yn ôl astudiaethau blaenorol, mae'r cysylltydd KK yn atal anwythiad gwrthgyrff i'r dilyniant asid amino sy'n deillio o'r cyfuniad o'r ddau peptid, a thrwy hynny hwyluso arddangosiad penodol pob peptid i'r gwrthgorff [111]. Yn olaf, cafodd tag Ei × 6 ei gysylltu â therminws C yr epitope cell B llinol olaf ar gyfer puro a nodweddu'r brechlyn yn ddiweddarach (Ffig. 3).

Mae'r protein chimerig terfynol yn cynnwys 933 o weddillion asid amino, gan ddechrau gyda HBHA adjuvant, ddilyn gan 41 epitopes, ac yn gorffen gyda His × 6 tag (Ffig. 3). Gan fod y protein cimerig hwn yn cynnwys antigenau aml-epitope o wyth protein, fe wnaethom ei enwi MTBV8, y Brechlyn TB Aml-epitope sy'n deillio o 8 protein ymgeisydd.

3.4. Dadansoddiad o baramedrau antigenigity, alergenedd, a ffisiocemegol MTBV8

Mae astudiaethau blaenorol wedi dangos bod angen antigenicity er mwyn i frechlynnau dynol ennyn ymatebion imiwnedd humoral, gan arwain at gynhyrchu celloedd cof wedi'u cyfeirio yn erbyn epitopau asiantau heintus [112]. Felly, gwnaethom ragfynegi antigenigedd y brechlyn aml-epitope MTBV8 gan ddefnyddio'r gweinydd VaxiJen 2.0 a chawsom antigenigedd o 0.97, sy'n sylweddol uwch na'r gwerth trothwy ({{7}) }.4) [45,46] i brotein bacteriol gael ei ystyried yn antigenig. Yn nodedig, roedd MTBV8 yn fwy antigenig na'r holl broteinau cydrannol (Ffig. 4), gan awgrymu y gallai ysgogi ymatebion imiwnedd gwesteiwr yn effeithiol

Ar ben hynny, adroddwyd bod gan lawer o macromoleciwlau microbaidd y potensial i gymell adweithiau gorsensitifrwydd mewn pobl [113]. I ddadansoddi mater gorsensitifrwydd MTBV8 a'r wyth protein cyfansoddol, gwnaethom ragfynegi eu halergenedd gan ddefnyddio'r gweinydd AllerTOP 2.0. Rhagwelwyd bod dau o'r wyth protein cydran (LprA ac EspC) yn alergenau (Tabl 1). Dylid nodi, er bod y brechlyn aml-epitope cynlluniedig (MTBV8) yn cynnwys deg epitop a gafwyd o'r ddau brotein hwn, rhagwelwyd na fyddai'n alergedd, sy'n dangos bod y brechlyn hwn yn ddiogel.

Er mwyn nodweddu MTBV8 ymhellach, dadansoddwyd ei briodweddau ffisiocemegol trwy weinydd ExPASy ProtParam. Mae gan y protein ailgyfunol bwysau moleciwlaidd o 94.84 kDa a phwynt isoelectric o 8.91. Ar ben hynny, ystyriwyd bod y protein yn sefydlog gyda mynegai ansefydlogrwydd wedi'i gyfrifo (II) o 26.44 (ystyriwyd bod proteinau â mynegai ansefydlogrwydd> 40 yn ansefydlog) [64]. Amcangyfrifir mai hanner oes in vitro yw 30 h mewn reticulocytes mamalaidd, yn hwy nag in vivo 2{84 h mewn burum, ac in vivo 10 h mewn E. coli. Yn ogystal, mynegai aliffatig MTBV8 oedd 71.91, a gwerth cyfartalog cyffredinol hydrophilicity (GRAVY) oedd - 0.32, sy'n nodi bod y protein ailgyfunol yn hydroffilig. Yn olaf, roedd y gwerth hydoddedd cyfrannol ar gyfer MTBV8 (0.54) yn fwy na'r cyfartaledd ar gyfer y set ddata poblogaeth (0.45), gan nodi bod yr ymgeisydd brechlyn yn fwy hydawdd na hanner y proteinau E. coli [114]. Dangosodd y canlyniadau uchod fod gan MTBV8 briodweddau ffisegol a chemegol da a'i fod yn addas i'w ddefnyddio fel brechlyn.

3.5. Proffil imiwnogenig o MTBV8

I asesu proffil imiwnogenedd MTBV8, dadansoddwyd yr ymatebion imiwn yn silico trwy weinydd imiwn C-IMMSIM. Fel y dangosir yn Ffig. 5A, cynyddwyd y titers IgM ac IgG1 yn sylweddol ar ôl ysgogiad imiwnedd eilaidd gan MTBV8. Ar ben hynny, cynyddodd lefel y celloedd B gweithredol ac arhosodd ar lefel uchel ar ôl pob imiwneiddiad (Ffig. 5 B). Hyd yn oed ar gyfer celloedd B mewn plasma, roedd yr isoteipiau B IgM ac IgG1 yn parhau'n uchel ar ôl imiwneiddio (Ffig Atodol 1A, B). O ran yr effaith ar gelloedd T, cynyddodd lefelau celloedd cof Th (y2) (Ffig Atodol 1C) a chelloedd Th gweithredol (Ffig. 5C) yn gyflym ar ôl imiwneiddio cynradd a chawsant hwb sylweddol ar ôl imiwneiddio eilaidd. Roedd celloedd T Rheoleiddio (celloedd gweithredol yn bennaf) yn cael eu hysgogi ar imiwneiddiad cychwynnol ac yna'n dirywio'n gyflym (Ffig Atodol 1 D). Yn ddiddorol, cynyddodd lefel y celloedd T sytotocsig gweithredol (Tc) yn gyflym ar ôl imiwneiddio cynradd, arhosodd yn uchel yn yr ail imiwneiddiad, ac yna dirywiodd yn gyson, tra bod gorffwys celloedd Tc yn dangos y duedd wrthdroi i gelloedd Tc gweithredol (Ffig. 5 D). Mewn cyferbyniad, arhosodd lefelau celloedd Tc anergig (y2) (Ffig. 5D) a chelloedd Tc cof (Ffig Atodol 1E) heb eu newid ar imiwneiddio. Yn ogystal, dylid nodi bod lefelau'r ffactorau imiwnedd IFN- ac IL-2 sy'n cael eu secretu gan gelloedd T sy'n hanfodol ar gyfer yr ymateb imiwn yn erbyn twbercwlosis M. [115] hefyd wedi cynyddu'n sylweddol ar ôl imiwneiddio MTBV8 (Ffig. 5E).

Ar ben hynny, rydym yn rhagweld effaith y brechiad MTBV8 ar boblogaethau celloedd imiwnedd cynhenid ​​(Ffig. 5 F a Atodol Ffig. 1FH). Cynyddodd celloedd cyflwyno-2 mewn DCs a macroffagau yn gyflym ar yr imiwneiddiad cyntaf, ond dim ond cynnydd bach a welwyd ar ôl yr ail imiwneiddiad (Ffig. 5F a Ffig Atodol 1G). Yn ogystal, mewn macrophages, arweiniodd yr imiwneiddiad cyntaf at gynnydd neu ostyngiad ar yr un pryd mewn macroffagau gweithredol a gorffwys. Ychydig wythnosau ar ôl yr ail imiwneiddiad, gostyngodd macroffagau gweithredol yn gyflym tra bod macroffagau gorffwys yn cynyddu'n gyflym. (Ffig Atodol. 1G). Yn nodedig, dangosodd celloedd lladd naturiol a phoblogaethau celloedd epithelial gweithredol batrwm gweddol gyson ar imiwneiddio. (Ffig Atodol 1F, H). Gyda'i gilydd, roedd y rhagfynegiadau hyn yn awgrymu y gall MTBV8 ysgogi ymatebion imiwnedd cynhenid ​​​​ac addasol, gan ei wneud yn ymgeisydd brechlyn effeithiol posibl.

3.6. Strwythurau eilaidd a thrydyddol a ragwelir o MTBV8

Er mwyn nodweddu MTBV8 yn well, gwnaethom ragweld ei strwythurau eilaidd a thrydyddol, ac yna mireinio ei strwythur trydyddol. Roedd strwythur uwchradd MTBV8 yn cynnwys helis 42.12 y cant, 11.79 llinyn y cant, a 46.09 coiliau y cant (Ffig Atodol. 2). Yn ôl rhagfynegiadau DISOPRED3, roedd 27.11 y cant o weddillion asid amino yn anhrefnus.

Rhagwelwyd strwythur trydyddol MTBV8 gan weinydd I-TASSER, a chafwyd 5 model gyda sgorau C da. Mae'r sgôr C rhwng −5.0 a 2.0 ac mae'n gymesur â dibynadwyedd y rhagfynegiad. Bu'r modelau hyn yn destun dadansoddiad ProSA-we a dewiswyd model 4 oherwydd y nodweddion canlynol; Sgôr C=−3.8, sgôr Z=−4.4. Dangosodd dadansoddiad plot Ramachandran o'r strwythur trydyddol hwn fod llai na 70.0 y cant o'r gweddillion yn y rhanbarthau a ffefrir, felly mae angen mireinio'r strwythur trydyddol ymhellach.

Mireiniwyd y strwythur trydyddol a gafwyd gan I-TASSER gan weinydd ModRefiner, ac yna'r gweinydd GalaxyRefine i gynhyrchu pum model. Ymhlith y pum model mireinio, model 2 oedd â'r strwythur gorau wrth ystyried y paramedrau canlynol: Prawf pellter byd-eang cywirdeb uchel (0.89), RMSD (0.58), MolProbity (2.31), gwrthdaro sgôr (14.8), sgôr rotamer gwael ({{10}}.80) a sgôr llain Ramachandran (86.5 y cant) (Ffig. 6A). Datgelodd dadansoddiad plot Ramachandran o'r strwythur hwn gan ddefnyddio PROCHECK, o'r 753 o weddillion nad ydynt yn glycin, nad ydynt yn proline, ac nad ydynt yn derfynell, fod 78.9 y cant ohonynt yn y rhanbarth mwyaf ffafriol [A, B, L], roedd 17.3 y cant yn y rhanbarth a ganiateir yn ychwanegol [a, b, l, p], a 1.5 y cant yn y rhanbarth a ganiateir yn gyffredinol [∼a, ∼b, ∼l, ∼p], gyda dim ond 2.4 y cant yn y rhanbarth nas caniateir (Ffig. 6 B). Wrth ddadansoddi llain Ramachandran o'r strwythur mireinio gan ddefnyddio Molprobity, canfuom fod 86.5 y cant o'r gweddillion asid amino wedi'u lleoli yn y rhanbarth ffafriol, a oedd yr un peth ag a gafwyd gan y gweinydd GalaxyRefine (Ffig. 6C) . Ar ben hynny, roedd 98.0 y cant o'r gweddillion yn y rhanbarth a ganiateir, tra bod 19 o weddillion yn allgleifion (phi, psi) (Ffig. 6 C). Er bod gan y model mireinio fwy o weddillion yn y rhanbarth a ffefrir o gymharu â'r model a gynhyrchwyd gan I-TASSER, mae angen ei ddilysu ymhellach.

Mae dilysu modelau yn gam allweddol yn y broses adeiladu model oherwydd gall nodi gwallau posibl mewn modelau 3D a ragwelir [116]. Er mwyn dilysu'r model wedi'i fireinio o ddadansoddiadau MTBV8, ProSA-web, ac ERRAT. Dangosodd dadansoddiad ProSA-we sgôr Z o - 5.76 ar gyfer MTBV8 (Ffig. 6D), a oedd ychydig y tu allan i'r ystod o sgoriau a bennwyd yn arbrofol ar gyfer proteinau o faint tebyg. Fodd bynnag, dangosodd dadansoddiad ERRAT ffactor ansawdd cyffredinol o 70.94 ar gyfer MTBV8 mireinio. Gan fod sgôr ERRAT o fwy na 50 yn cynrychioli model o ansawdd da [117], nododd sgôr o 70.94 fod gennym hyder uchel yn y strwythur wedi'i fodelu ar gyfer dadansoddiad dilynol.

3.7. Tocio moleciwlaidd MTBV8 gyda derbynyddion celloedd imiwnedd

Mae affinedd cryf brechlynnau ar gyfer derbynyddion celloedd imiwnedd yn cynhyrchu ymateb imiwn sefydlog [118]. Er mwyn cael mewnwelediad i'r rhyngweithiadau posibl rhwng MTBV8 a derbynyddion celloedd imiwnedd, gwnaethom docio moleciwlaidd rhwng MTBV8 a'r derbynnydd imiwnedd TLR4 (Ffig. 7A a B). Mae astudiaethau blaenorol wedi dangos y gall ligandau TLR4 actifadu DCs, sydd yn eu tro yn actifadu celloedd T naïf, yn polareiddio celloedd T (CD4 plus a chelloedd CD8 plws) yn effeithiol i secretu IFN- a chymell cytotoxicity cell-mediated-T [106]. Byddai'r prosesau hyn yn arwain at gynnydd yn y gronfa o gelloedd cof effeithydd [119]. Gan fod rhyngweithio TLR4 â pheptidau antigenig yn arwain at ymatebion yn erbyn haint TB, fe wnaethom ganolbwyntio ar y rhyngweithio rhwng MTBV8 a TLR4 (Ffig. 7A). Dangosodd canlyniadau tocio moleciwlaidd gan Firedock fod gan y model mireinio mwyaf poblogaidd egni byd-eang o − 40.28, egni deniadol van der Waals (aVdW) o − 19.86, egni gwrthyrru (coch) o 2.19, egni cyswllt atomig o 4.70 a chyfraniad bond hydrogen (HB) o − 1.03 (Ffig. 7B). Yn ogystal, rhagwelodd Prodigy egni rhwymol rhwng TLR4 a MTBV8 o − 8.6 kcal/mol. Dangosodd y canlyniadau uchod fod gan MTBV8 gysylltiad cryf â TLR4, gan ei alluogi i gynhyrchu ymateb imiwn sefydlog.

3.8. Efelychiad deinameg moleciwlaidd

Defnyddiwyd yr efelychiad deinamig moleciwlaidd i ddadansoddi symudiad atomau yn y brechlyn [120]. Mae anffurfiad prif gadwyn yn datgelu i ba raddau y gall moleciwl anffurfio ym mhob gweddillion cyfansoddol. Roedd rhanbarthau o anffurfiad uchel yn nodi lleoliad y gadwyn "colfach" (Ffig. 7C), a chafwyd y ffactor B arbrofol o'r gronfa ddata PDB cyfatebol tra bod y cyfrifiad yn cael ei wneud trwy luosi symudedd yr NMA â 8pi^2 (Ffig. 7D ). Mae'r gwerth eigen a neilltuwyd i bob modd arferol yn fesur o anystwythder symud, sy'n uniongyrchol gysylltiedig ag egni dadffurfiad y strwythur cyfan. Mae'r gwerth eigen mewn cyfrannedd union â rhwyddineb dadffurfiad (Ffig. 7E). Mae amrywiant pob modd normal mewn cyfrannedd gwrthdro â'r gwerth eigen. Mae amrywiannau unigol wedi'u lliwio'n frown tra bod amrywiannau cronnol wedi'u lliwio'n wyrdd) (Ffig. 7F). Yn y matrics covariance, mae cyplu rhwng parau o weddillion, ac arddangoswyd cynigion cydberthyn (coch), anghydberthynol (gwyn), a gwrth-gydberthyn (glas) (Ffig. 7 G). Roedd y rhwydwaith elastigedd yn cynrychioli parau o atomau wedi'u cysylltu gan ffynhonnau, ac roedd pob dot yn cynrychioli sbring rhwng parau cyfatebol o atomau. Yr oedd lliw y dotiau yn arwyddocau eu hanystwythder ; mae dotiau llwyd tywyllach yn dangos ffynhonnau anystwythach ac i'r gwrthwyneb (Ffig. 7H). Awgrymodd efelychiadau deinameg moleciwlaidd gan ddefnyddio gweinydd iMODS fod y cyfadeilad docio rhwng MTBV8 a TLR4 yn sefydlog.

3.9. Yn silico optimeiddio a chlonio MTBV8

Mae synthesis protein yn rhagofyniad ar gyfer ei weithgaredd [121]. Yn unol â hyn, mae angen mwy o effeithlonrwydd trawsgrifio a throsiadol o'r brechlyn ar gyfer ei orfynegiant mewn celloedd E. coli trwy plasmid hunan-ddyblygu pET28a( plws ) [103]. Cyflawnwyd ei optimeiddio ohono gan Fynegai Addasu Codon (CAI) o 0.99, a chynnwys GC (54.81 y cant) rhwng 30 y cant a 70 y cant , a ystyrir yn gyffredinol yn ffafriol ar gyfer mynegiant protein yn y gwesteiwr. Gallai'r darn DNA o mtbv8 gael ei glonio i fector pET-28a( plus ) rhwng safleoedd cyfyngu NcoI a XhoI gan ddefnyddio SnapGene i gynhyrchu pET-28a ( plws )-mtbv8 plasmid ailgyfunol (Ffig Atodol .3).

4. Trafodaeth

4.1. Ymddangosiad brechlynnau aml-epitope yn erbyn twbercwlosis

Brechu yw'r ffordd fwyaf dibynadwy o frwydro yn erbyn haint twbercwlosis. Ers blynyddoedd lawer, mae gwyddonwyr wedi nodi nifer o ymgeiswyr brechlyn addawol a allai ddisodli BCG, yr unig frechlyn TB cymeradwy [8100,122-125]. Yn ddiweddar, mae brechlynnau TB ailgyfunol wedi cael sylw cynyddol. Mae sawl brechlyn ailgyfunol wedi dangos effeithiolrwydd mewn treialon cyn-glinigol a chlinigol, gan gynnwys yr ID93 / GLA-SE sy'n cynnwys pedwar ymgeisydd brechlyn Rv2608 (teulu PE / PPE), Rv1813 (a fynegir dan straen / hypocsia), ESXV, ac ESXW, sy'n addawol yn treial cyn-glinigol llygod [122]. Ar gyfer treialon clinigol, roedd GamTBvac, a gafwyd trwy asio Ag85a ac ESAT6-CFP10, yn llwyddiannus mewn treialon cam I [125], tra bod M72, a oedd yn cynnwys dau ymgeisydd [Mtb39A (PPE18) a Mtb32A], yn esgor ar nerth sylweddol yn y cyfnod II treialon [123].

Mae treialon llwyddiannus o'r brechlynnau ailgyfunol hyn yn dangos cryfder mwy brechlynnau sy'n seiliedig ar epitope sy'n syml yn ymgorffori priodweddau imiwnolegol gwahanol broteinau ymgeisydd mewn protein synthetig [124]. Yn nodedig, mae sawl brechlyn is-uned TB wedi deillio o nifer fawr o ymgeiswyr brechlyn, ac maent wedi dod i'r amlwg fel ymgeiswyr a allai fod yn ddeniadol mewn astudiaethau model anifeiliaid [100]. Er enghraifft, mae MP3RT, ymgeisydd brechlyn peptid aml-epitope sy'n cynnwys chwe peptid HTL imiwnogenig, wedi achosi lefelau sylweddol uwch o lymffocytau IFN- a CD3 ynghyd ag IFN-plws T ac unedau ffurfio cytrefi is (CFUs) yn ysgyfaint a dueg llygod dynol na llygod tebyg i wyllt [8]. Yn y dyfodol, mae'r ymchwil ar gyfer mwy o nerth yn y brechlynnau hyn wedi arwain at gyfoethogi ymgeiswyr protein posibl.

Ymhellach, mae proteinau sy'n cael eu secretu gan M. twbercwlosis hefyd wedi'u hystyried wrth ddylunio MTBV8 (Tabl 1), oherwydd eu bod yn bwysig ar gyfer pathogenesis a ffyrnigrwydd TB [126]. Yn ogystal, gall rhai proteinau wedi'u secretu o haenau allanol celloedd twbercwlosis M. wasanaethu fel antigenau defnyddiol. Er enghraifft, mae EsxA ac EsxB wedi'u puro o'r capsiwl o M. tuberculosis [127] ac mae cadw EsxA yn y capsiwl wedi'i gysylltu â sytowenwyndra [128]. Yn ogystal, mae angen EsxA ar gyfer cyfanrwydd cellfur bacteriol [129]. Ar y cyfan, mae gan broteinau wedi'u secretu arwynebau digon agored fel eu bod yn dargedau o ymatebion imiwn lletyol [130,131].

4.2. Ysgogiad posibl y system imiwnedd gynhenid ​​gan MTBV8

Mae sgrinio ar gyfer epitop mewn proteinau ymgeisydd yn cynnwys actifadu'r system imiwnedd gynhenid ​​​​ac yna adnabyddiaeth antigen gan lymffocytau oherwydd bod angen y ddau ffactor ar gyfer actifadu'r system imiwnedd addasol wedi hynny [50]. Ar gyfer yr ymateb cynhenid, mae ffurfio cymhleth sefydlog rhwng MTBV8 (gyda chymorth yr ysgogydd TLR4 HBHA fel cynorthwyol) a TLR4 o DCs (Ffig. 5F) yn bwysig oherwydd gall ligandau TLR4 actifadu DCs a gall DCau actifadu, yn eu tro, actifadu celloedd T naïf, yn polareiddio celloedd CD4 plus a CD8 plus T yn effeithiol i secretu IFN- , a chymell cytotoxicity cell-mediated [106] ac wedi hynny cronfa gynyddol o gelloedd cof effeithydd [119].

Mae'r cymhleth hwn yn debygol o gyfrannu at y cynnydd yn y boblogaeth celloedd cof (y2) yn lymffocytau B (Ffig Atodol 1 A) a lymffocytau Th (Ffig Atodol 1 C) o'i gymharu â chelloedd di-gof. Mae ysgogiad imiwnedd gan MTBV8 yn debyg i'r hyn a gafwyd gyda brechlynnau amlepitop eraill yn erbyn TB [33,37,39] a chlefydau eraill [27,62,107,124,132]. Roedd hyn yn awgrymu cysondeb y mecanwaith brechlyn aml-epitope.

4.3. Ysgogiad posibl i system imiwnedd addasol gan MTBV8

Lymffocytau B a T yw'r prif gelloedd effaith sy'n cydlynu ymatebion imiwn addasol trwy imiwnedd humoral neu gell-gyfryngol trwy adnabod rhannau o bathogenau goresgynnol, y cyfeirir atynt fel antigenau [50]. Er mwyn ysgogi ymateb imiwn addasol doniol, fe wnaethom ymgorffori epitopau celloedd B â sgôr uchel (Tabl 2) i'w hadnabod a'u dinistrio gan wrthgyrff a fynegir ac a gyfrinachwyd gan lymffocytau B [50,133]. Gall ysgogiad trwy frechlyn o lymffocytau B gweithredol (Ffig. 5B), yn bennaf IgM- ac IgG1-yn cuddio celloedd B (Ffig Atodol. 1A), arwain at secretion gormodol o IgM ac IgG1 (Ffig. 5A).

Efallai y bydd gan antigenigrwydd uchel y brechlyn (Ffig. 4) oblygiadau pwysig ar gyfer gwella ymatebion gwrthgyrff (Ffig. 5A). Yn wir, mae ymatebion imiwnedd cell-gyfryngol yn dibynnu'n fawr ar allu celloedd T i adnabod antigenau [134]. Er mwyn cyflawni hyn, gwnaethom ddewis epitopau CTL a HTL antigenig cryf a chryf sy'n rhwymo MHC (Tabl 2), a oedd yn gwella sefydlogrwydd peptid: cymhleth MHC (pMHC), sef y ffactor allweddol sy'n rheoli imiwnogenigrwydd peptid MHC [135] ac sy'n chwarae rhan mewn preimio celloedd T CD8 plws a CD4 plws gan DCs, gan arwain at ymatebion lymffocyt T (Ffig. 5C, Ffig Atodol 1C) [136].

Gallai ymgorffori cysylltwyr priodol ac oligopeptidau synthetig (PADRE a HEYGAEALERAG) a lleoliad manwl gywir pob cydran hwyluso gorymdaith a chyflwyniad epitope (Ffig. 3). Oherwydd amrywiad alel ymhlith bodau dynol, fe ddewison ni epitopau CTL yn seiliedig ar gydnabyddiaeth o alelau MHC-I o brif hiliau dynol Tabl Atodol 1 (Tabl 2), a dewiswyd epitopau HTL amlrywiol ar ôl sgrinio ar gyfer priodweddau ysgogi IFN ac antigenigedd.

4.4. Rhagolygon datblygu MTBV8

Mae hwn yng nghynllun brechlyn silico yn ddangosydd perthnasol yn y cyfnodau sgrinio o ran synthesis ac effeithiolrwydd brechlynnau ymgeisiol. Ar gyfer synthesis, datgelodd ein rhagfynegiadau y gellir ei syntheseiddio yn y system E. coli, fodd bynnag, gellid ystyried systemau eraill fel celloedd pryfed a mamaliaid hefyd os yw systemau E. coli yn cyflwyno anawsterau. Dilysu labordy gwlyb yw'r cam nesaf wrth gadarnhau ymgeiswyr brechlyn ar ôl mewn astudiaethau silico. Mae'r dull hwn mewn gwirionedd wedi'i ddefnyddio'n effeithiol mewn rhai ymgeiswyr brechlyn, a ddyluniwyd hefyd yn gyntaf yn silico ac yn ddiweddarach a brofodd yn effeithiol yn y cyfnod arbrofol [137].

5. Casgliad

Un o gefnogaeth allweddol Nod Datblygu Cynaliadwy Sefydliad Iechyd y Byd ar gyfer dileu TB yn llwyr yw mynediad at frechlyn cryf i atal haint M. twbercwlosis. Mae astudiaethau blaenorol wedi dangos y gall brechlynnau aml-epitop chimerig fanteisio ar briodweddau imiwn/antigenig rhai proteinau i wella effeithiolrwydd imiwnedd. Yn yr astudiaeth hon, fe wnaethom ddefnyddio dull in silico i ddylunio brechlyn chimerig (MTBV8) trwy integreiddio 41 epitopau amlddewis sy'n deillio o wyth protein antigenig a gyfrinachwyd gan M. tuberculosis H37Rv. Rhagwelwyd y byddai MTBV8 yn sefydlog, hydawdd, yn ddiogel, yn antigenig iawn, ac yn imiwnogenig.

Dangosodd dadansoddiad imiwno-wybodeg fod MTBV8 yn dangos affinedd da â'r prif dderbynnydd celloedd imiwnedd TLR4. Yn bwysig, gallai ysgogiad brechu MTBV8 gynyddu'n sylweddol lefelau celloedd B, celloedd T, a phoblogaethau celloedd imiwnedd cynhenid ​​​​ac ysgogi cynhyrchu imiwnoglobwlinau (IgG1, IgM, ac ati) yn ogystal â ffactorau imiwnedd (IFN- , IL{{6) }}, etc). Gyda'i gilydd, mae'r brechlyn aml-epitope MTBV8 yn ddangosydd perthnasol yng nghyfnod dylunio brechlynnau gwrth-TB a gallai ddod yn gonglfaen posibl wrth wireddu'r 'Strategaeth Dileu TB'.

Datganiad cyfraniad awdur credyd

Binda T. Andongma: Cysyniadoli, Methodoleg, Meddalwedd, Ysgrifennu – drafft gwreiddiol. Yazheng Huang: Curadu data, Meddalwedd. Fang Chen: Meddalwedd, Delweddu. Qing Tang: Curadu data, Dadansoddiad ffurfiol. Min Yang: Meddalwedd, Delweddu. Shan-Ho Chou: Ysgrifennu – adolygu a golygu. Xinfeng Li: Cysyniadoli, Methodoleg, Meddalwedd, Caffael Ariannu. Jin He: Goruchwylio, Ysgrifennu - adolygu a golygu, Caffael cyllid.

Datganiad o Ddiddordeb Cystadleuol

Mae'r awduron yn datgan nad oes ganddynt unrhyw fuddiannau ariannol cystadleuol hysbys neu berthnasoedd personol a allai ymddangos i ddylanwadu ar y gwaith a adroddir yn y papur hwn.

Diolchiadau

Cefnogwyd y gwaith hwn gan Sefydliad Cenedlaethol Gwyddoniaeth Naturiol Tsieina (32200026, 31900057), cronfeydd agored Labordy Allweddol Microbioleg Amaethyddol y Wladwriaeth (AMLKF202108), a Sefydliad Gwyddoniaeth Ôl-ddoethurol Tsieina (2019M662654).

Atodiad A. Gwybodaeth ategol

Gellir dod o hyd i ddata atodol sy'n gysylltiedig â'r erthygl hon yn y fersiwn ar-lein yn doi:10.1016/j.csbj.2023.01.019.

Cyfeiriadau

[1] Boineau R, Domanski M, Troutman C, Anderson J, Johnson G, Mcnulty SE, Clappchanning N, Davidson-ray LD, Fraulo ES, Fishbein DP, et al. Amiodarone neu diffibriliwr cardioverter y gellir ei fewnblannu ar gyfer methiant gorlenwad y galon. Engl J Med Newydd 2005; 352(3):225–37.

[2] Khoshnood S, Heidary M, Haeili M, Drancourt M, Darban-sarokhalil D, Nasiri MJ, Lohrasbi V. Ymgeiswyr brechlyn nofel yn erbyn Mycobacterium tuberculosis. Int J Biol Macromol 2018; 120(Pt A):180–8.

[3] Kyu HH, Maddison ER, Henry NJ, Ledesma JR, Wiens KE, Reiner R, et al. Baich twbercwlosis byd-eang, rhanbarthol a chenedlaethol, 1990-2016: canlyniadau astudiaeth 2016 o faich byd-eang clefydau, anafiadau a ffactorau risg. Lancet Infect Dis 2018;18(12):1329–49.

[4] Sefydliad Iechyd y Byd (2022). Adroddiad Twbercwlosis Byd-eang. 〈 https://www. Sefydliad Iechyd y Byd. int/publications/i/item/9789240061729〉.

[5] Mirzayev F, Viney K, Linh NN, Gonzalez-Angulo L, Gegia M, Jaramillo E, Zignol M, Kasaeva T. Argymhellion Sefydliad Iechyd y Byd ar drin twbercwlosis sy'n gwrthsefyll cyffuriau, diweddariad 2020. Eur Respir J 2021; 57(6): 2003300.

[6] Ahmad Khan F, Llwynog G, Menzies D. Twbercwlosis sy'n gwrthsefyll cyffuriau. Efrog Newydd: Handbook of Antimicrobial Resistance Springer; 2017. t. 263–86.

[7] Mitchison D, Davies G. Cemotherapi twbercwlosis: gorffennol, presennol a dyfodol . Int J Tube Lung Dis 2012; 16(6):724–32.

[8] Gong W, Liang Y, Mi J, Jia Z, Xue Y, Wang J, Wang L, Zhou Y, Sul S, Wu X. brechlyn seiliedig ar peptidau MP3RT ysgogwyd imiwnedd amddiffynnol yn erbyn haint Mycobacterium twbercwlosis mewn model llygoden humanized . Immunol blaen 2021; 12: 1-19.

[9] Lange C, Aaby P, Behr MA, Donald PR, Kaufmann SHE, Netea MG, Mandalakas AC. 100 mlynedd o Mycobacterium bovis bacille Calmette-Guérin. Lancet Infect Dis 2022;22(1):e2–12.

[10] Glaziou P, Floyd K, Raviglione MC. Epidemioleg fyd-eang twbercwlosis. Crit Gofal Semin Respir Med 2018; 39(3):271–85.

[11] Ernst JD. Mecanweithiau osgoi imiwnedd M. twbercwlosis fel heriau i ddylunio brechlyn TB. Microb Gwesteiwr Cell 2018; 24(1): 34-42.

[12] Mae Li X, Chen F, Liu X, Xiao J, Andongma BT, Tang Q, Cao X, Chou SH, Galperin MY, He J. Clp protease a RNA antisense yn cyd-reoleiddio'r rheolydd byd-eang CarD i gyfryngu ymateb newyn mycobacteriaidd. eFywyd 2022; 11:1-22.

[13] Liu CH, Liu H, Ge B. Imiwnedd cynhenid ​​mewn twbercwlosis: amddiffyniad gwesteiwr yn erbyn osgoi talu pathogen. Cell Mol Immunol 2017; 14(12):963–75.

[14] Elvang T, Christensen JP, Billeskov R, Hoang TTKT, Holst P, Thomsen AR, Andersen P, Dietrich J. CD4, a CD8 T cell ymatebion i'r twbercwlosis M. Ag85B-TB10.4 hyrwyddo gan is-uned adjuvanted, adenovector neu frechiad hwb heterologaidd. PLoS ONE 2009; 4(4): e5139.

[15] Rossjohn J, Gras S, Miles JJ, Turner SJ, Godfrey DI, McCluskey J. T cydnabyddiaeth derbynnydd antigen cell o antigen-gyflwyno moleciwlau. Annu Parch Immunol 2015; 33:169-200.

For more information:1950477648nn@gmail.com