Metabolaeth In Vitro Ac in Vivo o Detholiad Cistanche Tubulosa mewn Llygod Mawr Anrhagweladwy Normal A Chronig o Iselder a Achosir gan Straen

Cyswllt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-bost:audrey.hu@wecistanche.com

Yang Li, et al

ABSENOLDEB

Yn ddiweddar, cadarnhawyd bod gan Cistanche tubulosa, un rhywogaeth o Cistanches Herba, effeithiolrwydd gwrth-iselder llygod mawr straen anrhagweladwy incronig (CUS) trwy adfer homeostasis microbiota berfeddol. Yn y papur hwn, ein nod yw archwilio proffil metabolaidd C. tubulosa mewn llygod mawr model iselder arferol ac a achosir gan CUS in vitro ac in vivo. Gan ddefnyddio UPLC-Q-TOF-MS, y metaboledd gastroberfeddol in vitro oDyfyniad Cistanche tubulosa(CTE) ei werthuso mewn llygod mawr arferol a CUS. Ar yr un pryd, metaboledd in vivo o CTE(Dyfyniad Cistanche tubulosa)mewn llygod mawr normal ac isel eu hysbryd, hefyd yn cael ei ymchwilio mewn wrin llygod mawr a feces. Nodweddwyd cyfanswm o 20 a 26 metabolion o in vitro ac in vivometabolism mewn llygod mawr arferol a CUS, yn y drefn honno. CTE(Dyfyniad Cistanche tubulosa)ei fetaboli i aglycones a chynhyrchion diraddio ofphenylethanoid glycosides (PhGs) a glycosidau iridoid p'un ai drwy microbiota perfeddol llygod mawr arferol neu isel mewn vitro. Metabolion Cam II o aglycones a chynhyrchion diraddio PhGs a glycosidau iridoid oedd y prif fetabolion mewn wrin llygod mawr a feces. Yn ogystal, roedd y gallu metabolaidd i gynhyrchu glycosides ac aglycones eilaidd mewn microbiota coluddol llygod mawr iselhaol yn llawer gwannach na'r gallu mewn microbiota berfeddol llygod mawr arferol, a briodolwyd i'r hydrolasau glycosid anhrefnus a gynhyrchir gan ficrobiota coluddol mewn llygod mawr isel eu CUS. Gosododd canlyniadau'r astudiaeth hon y sylfaen ar gyfer deall proses metabolig a mecanwaith therapiwtig eiddo gwrth-iselder CTE.

Geiriau allweddol: Cistanche tubulosa, IselderMetaboledd, In vitro, In vivo, Microbiota Coluddol

1. Rhagymadrodd

Cofnodir Cistanches Herba yn swyddogol fel coesynnau suddlon sych Cistanche deserticola (YC Ma) a C. tubulosa (Schrenk), a ddefnyddir i drin diffyg arennau, analluedd, anffrwythlondeb benywaidd, morbidleucorrhea, metrorrhagia helaeth, a rhwymedd henaint [1]. Mae astudiaethau ffarmacolegol modern wedi dangos bod Cistanches Herba yn meddu ar weithgareddau biolegol amrywiol megis gwrth-niwroddirywiad, imiwn-reoleiddio, a gwrth-llid [2,3]. Mae ein hymchwiliadau blaenorol wedi cadarnhau hynnyDyfyniad Cistanche tubulosa(CTE), sy'n cynnwys 48.6 y cant o glycosidau ffenylethanoid (PhGs), 6.9 y cant o glycosidau iridoid, a 20.0 y cant o gyfanswm saccharidau, yn gallu lleddfu'n sylweddol symptomau iselder o straen anrhagweladwy cronig (CUS) llygod mawr iselder a achosir gan adfer homeostasis microbiota perfedd [4]. Mae astudiaethau diweddar yn dangos bod newidiadau yn y cyfansoddiad microbiota berfeddol yn gysylltiedig â datblygiad a dilyniant iselder [5,6]. Amharwyd yn sylweddol ar niferoedd cymharol y genera microbaidd mewn llygod mawr model CUSdepressive o gymharu â rheolaethau arferol [7]. Mewn cleifion ag iselder, cafodd amrywiaeth a chyfoeth microbiota berfeddol eu newid yn sylweddol hefyd [8]. Ar ben hynny, ystyriwyd bod cyfansoddion amrywiol gan gynnwys glycosidau ffenylethanoid (PhGs) a glycosidau iridoid yn brif gyfansoddion Cistanches Herba [2,3], a gafodd eu metaboli'n hawdd i'w glycosidau eilaidd ac aglyconau gan gynnwys hydroxytyrosol (HT), 3,4-dihydroxyphenethyl glycosid, asid geniposidig deglycosylated, ac ati gan ficrobiota perfedd dynol. Felly, credwn, yn ystod digwyddiad a datblygiad iselder, y bydd aflonyddwch strwythur microflora berfeddol yn anochel yn effeithio ar fetaboledd meddyginiaethau Tsieineaidd traddodiadol llafar (TCMs) yn y llwybr gastroberfeddol, yn ogystal ag effeithio ar gyflwr ffisiolegol y gwesteiwr. Daw'r rhan fwyaf o ddata metabolaidd presennol Cistanches Herba o astudiaethau metabolaidd ar anifeiliaid iach[12-15]. Felly, byddai'n fwy arwyddocaol yn glinigol ymchwilio i broffil metabolaidd CTE(Dyfyniad Cistanche tubulosa)yn y cyflwr patholegol wrth egluro ei gydrannau bioactif a deall y mecanwaith gweithredu ar gyfer ei effeithiolrwydd gwrth-iselder.

Yn yr astudiaeth gyfredol, ein nod yw nodweddu proffiliau metabolaidd CTE(Dyfyniad Cistanche tubulosa)mewn llygod mawr model iselder iach ac a achosir gan CUS gan sbectrometreg màs pedwarplyg cromatograffaeth hylif tra-perfformiad amser hedfan (UPLC-Q-TOF-MS). Mae sudd gastrig, hylif berfeddol, a microbiota llygod mawr patholegol normal ac iselder wedi'u defnyddio i efelychu proses metabolig CTE(Dyfyniad Cistanche tubulosa)yn y llwybr gastroberfeddol in vitro, yn annibynnol ac yn ddilyniannol. Mae metabolion in vivo hefyd yn cael eu hegluro ar ôl rhoi CTE ar lafar(Dyfyniad Cistanche tubulosa)mewn llygod mawr arferol a CUS. Mae'r astudiaeth hon yn rhoi mewnwelediadau newydd i fetabolion a metabolion gweithredol CTE(Dyfyniad Cistanche tubulosa)ar gyfer iselder.

2. Deunydd a dulliau

2.1. Deunydd

Casglwyd coesynnau sych o C. tubulosa o Hetian County (Xinjiang, Tsieina). Dilyswyd samplau sbesimen y daleb gan yr Athro Xiaobo Li a'u hadneuo yn llysieufa'r Ysgol Fferylliaeth, Prifysgol Shanghai Jiao Tong (Shanghai, Tsieina). Defnyddiwyd y dull echdynnu fel y nodwyd yn ein cyhoeddiad blaenorol [4]. Mae'rDyfyniad Cistanche tubulosa(CTE) cafodd samplau eu storio ar 4 gradd a'u hail-doddi â dŵr di-haint cyn eu defnyddio. Atebion dŵr di-haint y CTE(Dyfyniad Cistanche tubulosa)yna hidlwyd y sampl trwy bilen 0.22 μm, a chasglwyd yr hidlyddion mewn tiwbiau di-haint.

Darparwyd Echinacoside gan labordy Dr Pengfei Tu, PekingUniversity (Beijing, Tsieina). Prynwyd Acteoside, isoacteoside, 2′-acetylacteoside, a cistanoside A gan Sichuan Weikeqi BiologicalTechnology Co, Ltd (Chengdu, Tsieina). Prynwyd hydroxytyrosol, asid caffeic, 3,4-asid dihydroxybenzenepropionig, 3-asid hydroxyphenylpropionig, ac 3-asid ffenylpropionig gan Aladdin IndustrialInc. (Shanghai, Tsieina). Penderfynwyd mai purdeb pob cydran oedd > 95 y cant gan HPLC-UV. Prynwyd asetonitrile gradd HPLC gan Merck (Darmstadt, yr Almaen). Paratowyd dŵr deionized o ddŵr distyll gan ddefnyddio system puro dŵr Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, UDA). Roedd yr holl adweithyddion a chemegau eraill a ddefnyddiwyd o radd ddadansoddol.

2.2. Arbrofion anifeiliaid

Prynwyd llygod mawr gwrywaidd Sprague-Dawley (200 ± 20 g) gan Gwmni Technoleg Anifeiliaid Labordy Vital River Beijing (Beijing, Tsieina), a'u cartrefu yng Nghanolfan Anifeiliaid Labordy Prifysgol Shanghai JiaoTong (Shanghai, Tsieina). Roedd yr anifeiliaid yn cael eu cartrefu mewn grŵp o dan dymheredd ystafell reoledig (25 ± 2 gradd, 55 ± 10 y cant o leithder cymharol) gyda chylch tywyll-ysgafn 12:12 h. Caniatawyd mynediad am ddim i'r llygod mawr i gow a dŵr labordy rheolaidd am 1 wythnos. Cymeradwywyd y cyfleusterau a'r protocolau anifeiliaid gan Bwyllgor Moeseg Anifeiliaid Prifysgol Shanghai Jiao Tong (Shanghai, Tsieina).

Ar ôl acclimation am wythnos, rhannwyd deuddeg llygod mawr naïf ar hap yn ddau grŵp (n=6), y grŵp rheoli a'r grŵp straen anrhagweladwy cronig (CUS). Datblygwyd llygod mawr CUS fel yn ein hadroddiad blaenorol [4], a oedd yn destun amrywiaeth o straenwyr: swn gwyn (100 dB) am 1 h, goleuo strobosgopig dwysedd isel dros nos (120 fflach / mun), amddifadedd dŵr am 24 awr, gwag. poteli dŵr am 1 h (ar ôl amddifadedd dŵr), amddifadedd bwyd am 24 h, ataliaeth gorfforol (1−2 h), nofio gorfodol (5 munud), cawell budr am 24 h (200 ml o ddŵr mewn 100 g o sarn blawd llif), pinsiad cynffon ( 1 munud), sioc am 30 munud, gogwydd cawell 45 gradd am 24 h, a goleuo dros nos (12 h). Cafodd straenwyr eu cymhwyso'n barhaus ac ar hap am 4 wythnos, disgrifir y trefniant manwl yn Nhabl S1. Ar ôl 4 wythnos o straen, perfformiwyd y prawf dewis swcros, y prawf maes agored, a'r prawf bwydo wedi'i atal newydd-deb fel y disgrifiwyd yn flaenorol [4]. Dangosir amlinelliad o'r CUS a'r prawf ymddygiad yn Ffig. S1. Ar ôl profion ymddygiad, cafwyd o leiaf 4 fecalpelen gan bob llygoden fawr a'u rhoi mewn tiwbiau conigol di-haint ar gyfer dadansoddiad in vitro o CTE(Dyfyniad Cistanche tubulosa)metaboledd.

2.3. Metaboledd gastroberfeddol CTE(Dyfyniad Cistanche tubulosa)yn ôl arfer a llygoden fawr CUS in vitro

2.3.1. Metabolaeth CTE(Dyfyniad Cistanche tubulosa)mewn sudd gastrig a berfeddol efelychiedig

Hanner can miligram o CTE(Dyfyniad Cistanche tubulosa)eu hychwanegu at 10 ml o sudd gastrig efelychiad a sudd berfeddol, yn y drefn honno. Yna CTE(Dyfyniad Cistanche tubulosa)ei ddeor ar 37 gradd am 4 h mewn sudd gastrig a 6 h mewn sudd berfeddol. Cafodd y cymysgedd diwylliedig (1 mL) ei ddiffodd â 3 ml o n-butanol dirlawn â dŵr ar unwaith ar 0 a 4 h mewn sudd gastrig, ac ar 0 a 6 h mewn sudd berfeddol. Roedd dull prosesu'r sampl a ddefnyddiwyd fel y disgrifiwyd yn flaenorol [9].

2.3.2. Metabolaeth CTE(Dyfyniad Cistanche tubulosa)gan normal a CUS microbiota berfeddol llygod mawr

Yn gyntaf, cymysgwyd samplau fecal ffres normal a CUS o lygod mawr gyda andhomogenized gyda 25 gwaith cyfaint y cawl GAM. Cafodd gwaddodion eu tynnu trwy hidlo trwy dri darn o rwystr. Yna deorwyd yr ataliad ar 37 gradd mewn deorydd anaerobig lle disodlwyd yr aer gan gymysgedd nwy (H{ {2}} y cant , CO { { }} y cant , N { { }} y cant ). Ychwanegwyd 50 miligram o CTE at 5 mL normal ac ataliad fecal llygod mawr CUS ar wahân, a deorwyd yr ataliad ar 37 gradd am 48 h. Tynnwyd y cymysgedd wedi'i feithrin a'i dynnu â dŵr-dirlawn n butanol yn 0, 12, 24, a 48 h. Disgrifiwyd y dull prosesu sampl yn flaenorol [9].

2.3.3. Metaboledd dilyniannol CTE(Dyfyniad Cistanche tubulosa)gan y sudd gastrig, sudd berfeddol, normal a CUS microbiota berfeddol llygod mawr

Yn gyntaf, 100 mg o CTE(Dyfyniad Cistanche tubulosa)ei ychwanegu at 1{{10}} mL sudd gastrig efelychiedig a'i ddeor ar 37 gradd am 4 awr. Cafodd yr adwaith cyfan ei ddiffodd gan 3 gwaith cyfaint yr n-butanol dirlawn â dŵr, a'i allgyrchu ar 3000 rpm am 15 munud, ac yna anweddu'r uwchnatydd o dan lif nitrogen nwy ar 37 gradd. Yn ail, ail-doddwyd y gweddill mewn 0.4 ml o ddŵr di-haint, ei ychwanegu at 8 ml o sudd berfeddol efelychiedig, a'i ddeor ar 37 gradd am 6 h. Paratowyd y sampl gyda sudd gastrig yn yr un modd. Yn olaf, cafodd y gweddillion ei ail-hydoddi mewn 0.3 ml o ddŵr di-haint, ei ychwanegu at 6 ml o ataliadau llygod mawr arferol a CUS yn y drefn honno, a'i ddeor ar 37 gradd am 48 h mewn deorydd anaerobig. Cafodd un mililitr o'r adwaith ei ddiffodd gan 3 mL o n-butanol dirlawn â dŵr ar unwaith ar 0 a 4 h mewn sudd gastrig, ar 0 a 6 h mewn sudd berfeddol, ac ar 0, 12, 24, a 48 h mewn microbiota coluddol llygod mawr. . Proseswyd y sampl yn union yr un fath CTE(Dyfyniad Cistanche tubulosa)mewn sudd gastrig ffug.

2.4. Metabolaeth CTE(Dyfyniad Cistanche tubulosa)yn ôl arferol a llygoden fawr CUS in vivo

Yna cafodd pob llygoden fawr yn y ddau grŵp ei chadw mewn cawell metabolig unigol. Yn dilyn ymprydio dros nos a oedd yn caniatáu mynediad am ddim i ddŵr yn unig, rhoddwyd 2 ml o ddŵr ar lafar i bob llygod mawr trwy diwb agastrig. Casglwyd samplau wrin gwag a fecal o bob llygod mawr o 0 h i 12 h. Ymhellach, CTE(Dyfyniad Cistanche tubulosa)(400 mg/kg) yn cael ei roi gan gludydd. Casglwyd samplau wrin a fecal o 0 h i 24 h. Roedd yr holl samplau wrin a fecal yn cael eu storio ar −80 gradd ar unwaith.

Disgrifiwyd samplau wrin a fecal o lygod mawr arferol a CUS yn rhag-drin [12]. Dadansoddwyd yr holl samplau canlyniadol ganUPLC-Q-TOF-MS.

2.5. Dull dadansoddol

Perfformiwyd UPLC ar system Waters ACQUITY UPLC (WatersCorp., Milford, MA, UDA) gyda cholofn ACQUITY UPLC BEH C18(100 mm × 2.1 mm id, 1.7 μm, Waters Corp. , UDA) yn ôl graddiant elution gan ddefnyddio {{10}}.1 y cant asid ffurfig acetonitrile (A) a 0.1 y cant asid ffurfig mewn dŵr(B) ar gyfradd llif o 0.4 mL/munud . Y proffil graddiant oedd: 0–5 munud (A:5–20 y cant), 5–7.5 munud (A: 20–30 y cant), 7.5–10 munud (A: 30–70 y cant), 10–11 munud(A : 70-100 y cant ), ac fe'i cynhaliwyd am 1.5 munud. Ailgylchwyd y graddiant yn ôl i 5 y cant mewn 0.5 munud ac fe'i daliwyd am 2.5 munud ar gyfer y rhediad nesaf. Cyfaint y pigiad oedd 3 μL. Gosodwyd tymheredd y popty colofn i 35 gradd.

Cyflawnwyd sbectrometreg màs gan ddefnyddio màs-sbectromedr Waters Vion IMS (Waters Corp., Milford, MA, UDA). Perfformiwyd ïoneiddiad yn y modd electrochwistrellu negyddol (ESI−). Roedd y paramedrau MS fel a ganlyn: foltedd capilari, −2.0 kV; foltedd côn, 20 V; tymheredd y ffynhonnell, 120 gradd ; tymheredd diddymu, 500 gradd ; llif nwy daddymiad conwydd, 50 a 1000 L/h, yn y drefn honno. Ar gyfer mesur màs cywir, defnyddiwyd leucine-enkephalin fel y màs clo i gynhyrchu ïon [M–H] – (m/z 554.2615). Cynhaliwyd arbrawf MSE (Màs Sbectrometri Uwch) mewn dwy ffwythiant sgan fel a ganlyn: swyddogaeth 1 (ynni isel): m/z 50–1000, amser sgan 0.25 s, oedi rhyngsgan 0.02 s, 6 egni gwrthdrawiad eV; swyddogaeth 2 (ynni uchel): m/z50–1000, 0.25 s amser sganio, oedi rhyng-sgan 0.02 s, ramp ynni gwrthdrawiad o 20–45 eV.

2.6. Prosesu data

Proseswyd y data gan ddefnyddio meddalwedd UNIFI 1.8.1 (Waters Corp., Milford, MA, UDA) ar gyfer adnabod metabolion o fewn y data crai sgan llawn a gasglwyd trwy MSE. Nodwyd cyfansoddion ar sail màs cywir, darnau mewn màs-sbectrometreg ynni uchel. Gosodwyd y trothwy dwyster fel 100.0 cyfrif. Gosodwyd adnabod y targed, goddefgarwch paru darn, a pharamedrau eraill yn awtomatig.

3. Canlyniadau

3.1. Newidiadau ymddygiad yn y llygoden fawr iselder a achosir gan CUS

Aseswyd y llygod mawr â symptomau iselder a achosir gan CUS trwy brofion ymddygiadol gan gynnwys prawf dewis swcros, prawf maes agored, a phrawf bwydo wedi'i atal â newydd-deb. Datgelodd prawf-t y myfyriwr fod dewis swcros mewn prawf ffafriaeth swcros (p < .001),="" cyfanswm="" y="" pellter="" a="" gwmpesir="" yn="" y="" prawf="" maes="" agored="" (p="">< .001),="" a="" hwyrni="" i="" fwyta="" yn="" y="" prawf="" bwydo="" wedi'i="" atal="" o="" newydd-deb="" (p="">< .01)="" yn="" sylweddol="" wahanol="" o="" gymharu="" â'r="" grŵp="" rheoli="" ar="" ôl="" {{9}wythnos="" o="" driniaeth="" cus="" (ffig.="" 1).="" roedd="" y="" canfyddiadau="" hyn="" yn="" dangos="" bod="" y="" model="" straen="" anrhagweladwy="" cronig="" wedi'i="" ddatblygu'n="">

3.2. Nodweddu cyfansoddion cemegol CTE(Dyfyniad Cistanche tubulosa)

Dadansoddiad cynhwysfawr o gyfansoddion prototeip CTE(Dyfyniad Cistanche tubulosa)ei gyflawni gan UPLC-Q-TOF-MS. Cyfanswm o 27 o etholwyr o CTE(Dyfyniad Cistanche tubulosa)eu canfod a'u nodweddu'n betrus, gan gynnwys 20 PhG, 5 iridoids a glycosidau iridoid, a 2 oligosacaridau. Mae gwybodaeth fanwl gan gynnwys amser cadw, MS cywir, ac ïonau darn MS/MS wedi'u rhestru yn Gwybodaeth Ategol (Tabl S2) i roi mewnwelediad i strwythur y cyfansoddion cemegol hyn. Dangoswyd cyfanswm ioncromatogram UPLC-Q-TOF-MS (TIC) o CTE yn Ffig. S2.

3.3. Metaboledd gastroberfeddol CTE(Dyfyniad Cistanche tubulosa)yn ôl arfer a llygoden fawr CUS in vitro

Yn yr astudiaeth hon, metabolion posibl CTE(Dyfyniad Cistanche tubulosa)yn ôl normal a CUSrats in vitro eu canfod o'r Canolfannau Croeso a'u hadnabod gyda chyfuniad o gyfansoddiadau elfennol a sbectra màs darn MS/MS ar ôl eu cymharu â'r samplau rheoli. Pob un o'r metabolion o CTE(Dyfyniad Cistanche tubulosa)mewn suddion gastrig a berfeddol efelychiedig, rhestrir microbiota berfeddol llygod mawr arferol a CUS yn Nhabl 1.

3.3.1. Metabolaeth CTE(Dyfyniad Cistanche tubulosa)mewn sudd gastrig a berfeddol efelychiedig

Saith metabolyn o CTE(Dyfyniad Cistanche tubulosa)mewn sudd gastrig efelychiedig eu hadnabod yn betrus gan màs cywir a gwybodaeth darn MSE: M1 (m/z315.1074, C14H20O8, 1.66 mun), M4 (m/z 459.1501, C20H28O12,2.36 mun), M5 (m/z 459,O1,07, C21,07, C21, 45,07, 45,007, 45,007, 450,207). 2.60 mun), M7 (m/z179.0338, C9H8O4, 2.85 mun), M12 (m/z 785.2481, C35H46O20,4.77 mun), M16 (m/z 827.2580, C37H48O23, a M16), C37H48O231, a 5. .1968, C29H36O15, 5.81 mun). Ystyriwyd deglycosylation, dehydroxylation, dehydrogenation, ac isomerization fel y prif lwybrau metabolaidd ar gyfer CTE mewn sudd gastrig. Canfuwyd bod gan M4 a M5 bwysau moleciwlaidd o 2 Da ac 16 Da yn is na'u cydran prototeip, decaffeoylacteoside, ac felly fe'i nodwyd fel ei gynhyrchion dadhydrogenedig a dehydroxylated, yn y drefn honno. Nodwyd M12 fel isomer o echinacoside, gan gynhyrchu'r un ïonau ag echinacoside yn m/z 623.2178, 477.1601, 315.1055, 161.0237.

Canfuwyd yr un metabolion ar ôl CTE(Dyfyniad Cistanche tubulosa)deor mewn sudd berfeddol. Mae'n werth nodi bod y grŵp caffeoyl yn y safle C-6′ mewnPhGs wedi'i fetaboli'n hawdd gan ensymau treulio mewn sudd berfeddol i gynhyrchu ei metabolion decaffeyl ac asid caffeic.

3.3.2. Metabolaeth CTE(Dyfyniad Cistanche tubulosa)gan normal a CUS microbiota berfeddol llygod mawr

Bio-drawsnewidiodd cyfanswm o 20 metabolion o CTE(Dyfyniad Cistanche tubulosa)mewn microbiota ratintestinal arferol eu canfod a'u nodi (Ffig. 2). O'r canlyniadau hynny, sylwyd bod PhGs wedi'u diraddio i aglycone hydroxytyrosol (HT) M2 (m/z 153.0550, C8H10O3, 1.78 mun), ac asid caffeic (CA) M7 (m/z 179.0338, C9H8O4, 2.85 mun), ac yna maent eu metabolized ymhellach i M3 (m/z 163.0390, C9H8O3, 2.02 mun), M6 (m/z181.0501, C9H10O4, 2.76 mun), M10 (m/z 195.0655, C10H12O4,4.15 min), a M6 (m/z181.0501, C9H10O4, 2.76 min). , C9H10O3, 4.36 min) trwy ddadhydroxylation, gostyngiad, a methylation. Yn ogystal, y llwybrau metabolaidd canolog a gynhyrchodd metabolion uniongyrchol o gyfansoddion prototeip PhG o CTE mewn microbiota berfeddol llygod mawr arferol yw gostyngiad, methocsyleiddiad, deglycosylation, decaffeoyl, dehydrogenation, ac isomerization.

Ar ôl deoriad mewn microbiota coluddol llygod mawr iselder a achosir gan CUS, CTE(Dyfyniad Cistanche tubulosa)ei drawsnewid i 20 metabolion trwy'r un llwybrau metabolaidd â llygod mawr arferol.

3.3.3. Metabolaeth dilyniannol CTE gan y sudd gastrig, sudd berfeddol, microbiota coluddol llygod mawr arferol a CUS

Ar ôl deori dilyniannol mewn sudd gastrig, sudd coluddol, normal, a microbiota coluddol llygod mawr CUS, CTE(Dyfyniad Cistanche tubulosa)ei fetaboli i 14 metabolion (gan gynnwys 8 gyda sudd gastrig, 7 gyda sudd berfeddol, 11 agnormal, a 10 gyda microbiota coluddol llygod mawr CUS). Ymhlith y rhain, M2(HT) ac M11 (3-asid hydroxyphenylpropionig, 3-HPP) oedd metabolion terfynol PhGs ar ôl deoriad dilyniannol o CTE(Dyfyniad Cistanche tubulosa)mewn sudd gastrig, sudd perfedd, a microbiota berfeddol. Nid oedd unrhyw wahaniaeth arwyddocaol mewn metabolion rhwng llygod mawr arferol a CUS.

Dim ond ym metabolaeth annibynnol CTE y canfuwyd M8, M9, M14, M17, M19, a M20 gan ficrobiota coluddol llygod mawr arferol a CUS. Canolraddau metabolaidd oedd y metabolion hyn yn bennaf a oedd wedi'u metaboleiddio'n llwyr i fetabolion terfynol wrth astudio metaboledd dilyniannol CTE ac felly mae'n anodd eu canfod.

3.3.4. Gwahaniaethau rhwng cyfradd metabolig CTE yn ôl microbiota ratintestinal arferol a CUS

Er mwyn egluro'r gwahaniaethau rhwng cyfradd metabolig CTE(Dyfyniad Cistanche tubulosa)bynormal a CUS microbiota berfeddol llygod mawr, y cynnwys cymharol o gyfansoddion 27 prototeip ac 20 metabolion ar ôl deor gyda sudd gastrig, sudd berfeddol, normal a CUS llygod mawr berfeddol microbiota eu pennu ar wahân ac yn ddilyniannol (Tablau S3 a S4). Roedd y canlyniadau'n dangos er nad oedd unrhyw wahaniaethau arwyddocaol rhwng CTE(Dyfyniad Cistanche tubulosa)metabolion llygod mawr arferol ac iselder, gwelwyd gwahaniaeth sylweddol yn eu cyfraddau metabolaidd. Er enghraifft, cafodd C2 a C5 eu nodi fel 8-asid epiloganig neu ei isomer. Cawsant eu metabolized llwyr mewn samplau arferol o fewn 12 h deoriad. Fodd bynnag, mewn microbiota berfeddol llygod mawr sy'n dioddef o iselder patholegol, cawsant eu metaboleiddio'n drylwyr ar ôl deoriad 48 h. Roedd yn amlwg bod y gyfradd metabolig yn y llygoden fawr arferol yn gyflymach nag yn y llygoden fawr CUS. Darganfuwyd canlyniadau tebyg o C18 (isoacteoside). Ar ben hynny, mae'n werth nodi bod arwynebedd brig M12 (isomerization echinacoside) a M16 (isomereiddio tubuloside A) mewn samplau arferol yn llawer mwy na'r hyn mewn samplau CUS, sy'n dangos bod adwaith isomerization CTE(Dyfyniad Cistanche tubulosa)yn fwy cyffredin mewn microbiotathan coluddol llygod mawr arferol mewn microbiota berfeddol llygod mawr iselder.

3.4. Metabolaeth CTE yn ôl llygoden arferol a llygoden fawr CUS in vivo

Trwy gymharu samplau biolegol o'r grŵp a driniwyd â CTE â samplau biolegol gwag, cyfanswm o 26 metabolion (cyfansawdd 1-26) o CTE(Dyfyniad Cistanche tubulosa)canfuwyd llygod mawr annormal a CUS (Tabl 2). Cyflwynir cromatogramau UPLC nodweddiadol o samplau wrin llygod mawr arferol a CUS yn Ffig. 3.

3.4.1. Nodweddu metabolion CTE mewn ratwrin arferol a CUS

Cyfanswm o 18 o fetabolion in vivo o CTE(Dyfyniad Cistanche tubulosa)mewn wrin llygod mawr arferol a nodwyd yn betrus. Metabolion diraddio PhGs gan gynnwysHT a CA, a'u metabolion sylffiad pellach (cyfansoddion 1, 2, 3, 5, 8, ac 16), methylation (6, 21, 22, a 24), a methocsyleiddiad (13 a 14) oedd y metabolion prif fetabolion mewn wrin llygod mawr arferol. Roedd glycosidau iridoid yn cael eu metaboleiddio'n hawdd i aglyconau (23, 25, a 26) trwy ddeglycosylation. Mae'n werth nodi na chanfuwyd unrhyw gydran prototeip yn y sampl wrin llygod mawr arferol.

Yn y sampl wrin llygod mawr iselder, 22 metabolion o CTE(Dyfyniad Cistanche tubulosa)eu canfod a'u nodweddu. Cafodd un cyfansoddyn prototeip, 8-asid epiloganig, ei ganfod mewn wrin llygod mawr patholegol. Roedd metabolion eraill yn unol â'r rhai a geir mewn wrin llygod mawr arferol, gan gynnwys metabolion sylffedig (1, 2, 3, 8, 10, ac 16), metabolion methylated (6, 11, 19, a 22), metabolion methocsylaidd (13 a 14) o HT ac CA, a theaglyconau glycosidau iridoid (25 a 26).

3.4.2. Nodweddu metabolion CTE(Dyfyniad Cistanche tubulosa)mewn ratfeces arferol a CUS

Yn yr astudiaeth hon, dim ond un metabolyn (cyfansawdd 20, 3-HPP) o CTE(Dyfyniad Cistanche tubulosa)ei nodi mewn feces llygod mawr arferol. Cafodd y rhan fwyaf o PhGs eu diraddio am y tro cyntaf i CA ac o ganlyniad cawsant eu metaboleddu ymhellach i'w brif fetabolit microbaidd, 3-HPP. Yn y sampl fecal o'r llygoden fawr CUS, roedd 3 metabolyn wedi'u nodweddu'n ofalus, gan gynnwys HPP sulfated (cyfansoddyn 16), a HT sylffedig (cyfansoddion 2 a 3).

3.4.3. Gwahaniaethau rhwng metabolion in vivo CTE mewn normal a CUSrats

Ar ôl gweinyddu CTE ar lafar(Dyfyniad Cistanche tubulosa), roedd y metabolion in vivo yn dangos gwahaniaethau amlwg mewn llygod mawr model iach ac iselder. Canfuwyd 21 metabolion (cyfansawdd 1-3, 5, 6, 8-14, 16, 17, a 19-26) mewn samplau llygod mawr iach a CUS. Dim ond mewn samplau llygod mawr iach y nodwyd cyfansawdd 23 (asid deglycosylatedgeniposidic), tra bod cyfansoddion 4 (HT), 7 (8-asid epiloganig), 15 (3, 4-asid dihydroxybenzenepropionig), a 18 ({{ 19}}Dim ond mewn samplau llygod mawr model CUS y canfuwyd HPP glucuronide conjugation. I grynhoi, dim ond mewn llygod mawr CUS y canfuwyd cyfansoddion prototeip, ond darganfuwyd metabolion mwy cyfnod II mewn llygod mawr arferol.

4. Trafodaeth

Yn yr astudiaeth hon, defnyddiwyd tri model deori in vitro gan gynnwys sudd gastrig, sudd perfedd, microbiota coluddol llygod mawr arferol a CUS yn annibynnol ac yn ddilyniannol i ymchwilio i broffil metabolig gastroberfeddol CTE(Dyfyniad Cistanche tubulosa)in vitro. Canfuwyd bod glycosidau iridoid PhGsand yn CTE(Dyfyniad Cistanche tubulosa)wedi'u metaboleiddio'n rhwydd i'w glycosidau eilaidd ac aglyconau gan ficrobiota coluddol llygod mawr isel a achosir gan CUS. Ar ôl hynny, metaboledd in vivo o CTE(Dyfyniad Cistanche tubulosa)mewn llygod mawr arferol andCUS ei wirio hefyd. Y llwybrau metabolaidd arfaethedig ar gyfer CTE(Dyfyniad Cistanche tubulosa)mewn llygod mawr iach ac iselhaol a achosir gan CUS i'w gweld yn Ffig. 4. Cafodd PhGs, fel echinacoside ac acteosid, eu metaboleiddio i HT ac CA, a chafodd CA metaboledd pellach i'w fetabolit microbaidd mawr, 3-HPP. Yna cafodd HT, CA, a 3-HPP eu metaboleiddio i'w metabolion sylffedig, methylated a methocsylaidd. Cafodd glycosidau iridoid gan gynnwys asid geniposidig, kankanoside A, a kankanoside N eu metaboleiddio i'w haglyconau trwy ddadglycosylation. Dangosodd y rhain ymhellach fod PhGs a glycosidau iridoid yn CTE(Dyfyniad Cistanche tubulosa)wedi'u metaboleiddio'n hawdd i glycosidau eilaidd ac aglyconau mewn llygod mawr CUS. Mae'r metabolion hyn fel arfer yn dangos gwell amsugno coluddol a bio-argaeledd i'w amsugno ymhellach i'r gwaed i wneud gweithgaredd biolegol [16-18]. Mae'n werth nodi bod isomerization yn gyffredin ar gyfer PhGs yn y llwybr gastroberfeddol, nodwyd metabolion perthnasol ar ôl cael eu cymharu ag amser cadw UPLC eu cyfansoddion prototeip yn seiliedig ar broffil graddiant UPLC delfrydol wedi'i optimeiddio.

Asid caffein oedd prif gynnyrch diraddio CTE(Dyfyniad Cistanche tubulosa)gan lygod mawr patholegol iselder microbiota berfeddol. Dywedodd cyhoeddiadau blaenorol fod asid caffeig yn cynhyrchu effeithiau tebyg i wrth-iselder yn y prawf nofio gorfodol mewn llygod. Gostyngwyd lefel mRNA ffactor niwrotroffig sy'n deillio o'r ymennydd (BDNF) yn y cortecs blaen a lefel mRNA TrkB yn theamygdala yn sylweddol ar ôl y prawf nofio gorfodol, a chafodd y gostyngiad blaenorol ei atal yn sylweddol gan asid caffeic [19]. Hydroxytyrosol oedd aglycone PhGs, sy'n amddiffyn niwrogenesis a swyddogaeth wybyddol trwy atal is-reoleiddio protein niwral a achosir gan straen BDNF [20]. Felly, mae angen talu mwy o sylw i rai metabolion bioactif (hy, HT a CA) a drawsnewidir gan ficrobiota berfeddol ar ôl eu rhoi trwy'r geg.

Yn ogystal, mae'r canfyddiadau presennol yn darparu tystiolaeth bod y gallu metabolaidd i gynhyrchu glycosidau eilaidd ac aglycones yn sylweddol wannach na microbiota coluddol annormal mewn microbiota coluddol isel. Mae'r rheswm yn debygol o gael ei briodoli i newidiadau strwythurol a achosir gan iselder yn y microbiota berfeddol, sy'n arwain at lai o weithgaredd ensymau metabolaidd a gynhyrchir gan ficrobiota berfeddol [21]. Yn ddiddorol, dangosodd astudiaeth flaenorol fod phylum Bacteroidetes wedi amgodio'r genynnau lyase polysacarid glycoside mwyaf niferus ar gyfer hydrolysis glycosid a holltiad carbohydradau cymhleth gyda mecanwaith dileu [22]. Yn benodol, mae Bacteroides spp. gan gynnwys B. caccae, B. dorei, B. finegoldii,B. fragilis, B. berfeddol, B. ofatus, B. thetaiotaomicron, B. unffurfis, andB. dangosodd xylanisolvens gyfanswm dominyddol o enynnau amgodioGHs a PLs. Mae gan Parabacteroides distasonis hefyd yr un nodweddion [22]. Cadarnhaodd ein hastudiaethau blaenorol fod ysgogiad straen cronig anrhagweladwy 28-dyddiau wedi lleihau digonedd cymharol genera Bacteroides, Parabacteroides, Butyricimonas, a Weissella, tra bod cynnydd yn Ruminococcus a Deinococcus mewn llygod mawr [4]. Mae'n werth nodi mai Bacteroides a Parabacteroides oedd y ddau dacsa microbaidd mwyaf niferus a oedd yn cyfrif am oddeutu 20 y cant o'r niferoedd cymharol mewn llygod mawr arferol. Ar ôl triniaeth CUS, gostyngwyd niferoedd cymharol Bacteroides a Parabacteroides yn sydyn i tua 5 y cant mewn llygod mawr model iselder. Felly, mae'n anochel y bydd hyn yn arwain at ostyngiad yng nghyfanswm yr ensymau GH a PL mewn llygod mawr CUS, ac yn tarfu ymhellach ar yr adwaith deglycosylated gan ficrobiota coluddol iselhaol CUS ar ôl rhoi CTE ar lafar.(Dyfyniad Cistanche tubulosa)mewn llygod mawr model.

5. Casgliad

Yn yr astudiaeth bresennol, sefydlwyd techneg UPLC-Q-TOF-MS a'i chymhwyso i sgrinio ac adnabod metabolionCistanche tubulosaextractmewn llygod mawr normal ac iselhaol CUS in vitro ac in vivo. Dangosodd y canlyniadau fod CTE(Dyfyniad Cistanche tubulosa)wedi'i fetaboli i aglyconau a chynhyrchion diraddio PhGs a glycosidau iridoid gan ficrobiota berfeddol iach ac isel. Ar ôl gweinyddu CTE ar lafar(Dyfyniad Cistanche tubulosa), canfuwyd metabolitau cam II o aglycones a chynhyrchion diraddio PhGs ac iridoidglycosidau yn bennaf mewn wrin llygod mawr. Roedd y gallu metabolaidd i gynhyrchu glycosidau eilaidd ac aglycones mewn microbiota ratintestinal iselder yn llawer gwannach na'r hyn ym microbiota berfeddol y llygoden fawr arferol, a briodolwyd i'r glycosidehydrolases anhrefnus a gynhyrchir gan ficrobiota berfeddol mewn llygod mawr isel CUS. Mae'r astudiaeth hon yn rhoi persbectif newydd ar gyfer y diweddarach. datblygu CTE(Dyfyniad Cistanche tubulosa)fel cyffur gwrth-iselder posibl.

Diolchiadau

Cefnogwyd y gwaith hwn gan grantiau gan Raglen Ymchwil a Datblygu Allweddol Genedlaethol Tsieina (2017YFC1702400).

Atodiad A. Data atodol

Gellir dod o hyd i ddata atodol i'r erthygl hon ar-lein yn HTTPS://doi.org/10.1016/j.jchromb.2019.121728

O: 'Metaboledd in vitro ac in vivo oDyfyniad Cistanche tubulosamewn llygod mawr iselder arferol a chronig anrhagweladwy a achosir gan straen' ganYang Li, et al

--Cylchgrawn Cromatograffaeth B 1125 (2019) 121728

Cyfeiriadau

[1] Comisiwn Pharmacopoeia Tsieineaidd, The Pharmacopeia Gweriniaeth Pobl Tsieina, 2015 gol., Tsieina Medical Science Press, Beijing, Tsieina, 2015, t. 135 Rhan I.
[2] Y. Jiang, P.-F. Tu, Dadansoddiad o gyfansoddion cemegol mewn rhywogaethau Cistanche, J. Chromatogr. 1216 (2009) 1970–1979.
[3] Z. Fu, X. Fan, X. Wang, X. Gao, Cistanches Herba: trosolwg o'i eiddo cemeg, ffarmacoleg, a ffarmacocineteg, J. Ethnopharmacol. (2017), https://doi.org/10.1016/j.jep.2017.10.015.
[4] Y. Li, Y. Peng, P. Ma, H. Yang, H. Xiong, M. Wang, C. Peng, P. Tu, X. Li, effeithiau tebyg i gyffuriau gwrth-iselder oDyfyniad Cistanche tubulosaar lygod mawr straen anrhagweladwy cronig trwy adfer homeostasis microbiota perfedd, Blaen. Ffarmacol. (2018), https://doi.org/10.3389/fphar.2018.00967.
[5] JA Foster, MV Neufeld, Echel perfedd-ymennydd: sut mae'r microbiome yn dylanwadu ar bryder ac iselder, Tueddiadau Neurosci. 36 (2013) 305–312.
[6] E. Sherwin, TG Dinan, JF Cryan, Datblygiadau diweddar mewn deall rôl microbiota'r perfedd yn iechyd yr ymennydd a chlefyd, Ann. NY Acad. Sci. 12 (2017) e0177977.
[7] Y. Meng, H. Jia, Z. Chao, Y. Yong, Z. Yang, M. Yang, Z. Zou, Amrywiadau mewn microbiota perfedd a ffenoteip metabolig fecal sy'n gysylltiedig ag iselder gan ddilyniannu genynnau rRNA 16S a LC/ Metabolomeg sy'n seiliedig ar MS, J. Pharm. Biomed. Rhefrol. 138 (2017) 231–239.

[8] JR Kelly, Y. Borre, BC O', E. Patterson, AS El, J. Deane, PJ Kennedy, S. Beers, K. Scott, G. Moloney, Trosglwyddo'r felan: induces microbiota perfedd sy'n gysylltiedig ag iselder newidiadau niwroymddygiadol yn y llygoden fawr, J. Seiciatr. Res.. 82 (2016) 109–118.
[9] L. Yang, P. Ying, M. Wang, P. Tu, X. Li, metabolaeth gastroberfeddol Dynol y Cistanches Herba dyfyniad dŵr in vitro: eglurhad o'r proffil metabolig yn seiliedig ar adnabod metabolyn cynhwysfawr mewn sudd gastrig, berfeddol sudd, bacteria berfeddol dynol, a microsomau berfeddol, J. Agric. Cemegydd Bwyd. 65 (2017) 7447–7456.
[10] Y. Li, G. Zhou, S. Xing, P. Tu, X. Li, Adnabod metabolion echinacoside a gynhyrchir gan facteria berfeddol dynol gan ddefnyddio cromatograffaeth hylif uwch-berfformiad / sbectrometreg màs amser hedfan pedwarpol, J. Amaeth. Cemegydd Bwyd. 63 (2015) 6764–6771.
[11] Y. Li, G. Zhou, Y. Peng, P. Tu, X. Li, Sgrinio ac adnabod tri metabolyn glycosidau ffenylethanoid nodweddiadol o Cistanches Herba gan facteria coluddol dynol gan ddefnyddio UPLC/Q-TOF-MS, J. Pharm. Biomed. Rhefrol. 118 (2016) 167–176.
[12] L. Yang, P. Ying, M. Wang, G. Zhou, Y. Zhang, X. Li, Sgrinio cyflym ac adnabod y gwahaniaethau rhwng metabolion Cistanche deserticola a C. tubulosa dyfyniad dŵr mewn llygod mawr gan UPLC- Dadansoddiad adnabod patrwm cyfunol Q-TOF-MS, J. Pharm. Biomed. Rhefrol. 131 (2016) 364–372.
[13] Mae C. Q, P. Y, B. X, Z. W, C. L, L. X, yn nodweddu metabolion echinacoside ac acteoside o Cistanche tubulosa mewn plasma llygod mawr, bustl, wrin, a feces yn systematig yn seiliedig ar UPLC-ESI-Q-TOF-MS, Biomed. Cromatogr. 30 (2016) 1406–1415.
[14] Y. Wang, H. Hao, G. Wang, P. Tu, Y. Jiang, Y. Liang, L. Dai, H. Yang, L. Lai, C. Zheng, Dull o adnabod metabolion dilyniannol o glycoside ffenylethanoid nodweddiadol, echinacoside, yn seiliedig ar amser trap-ion cromatograffaeth hylif o
dadansoddiad sbectrometreg màs hedfan, Talanta 80 (2009) 572–580.
[15] C. Jia, H. Shi, W. Jin, K. Zhang, Y. Jiang, M. Zhao, P. Tu, Metabolaeth echinacoside, gwrthocsidydd da, mewn llygod mawr: ynysu ac adnabod ei fetabolion bustlog, Metab Cyffuriau. Dispos. 37 (2009) 431–438.
[16] J. Xu, HB Chen, SL Li, Deall mecanweithiau moleciwlaidd y cydadwaith rhwng meddyginiaethau llysieuol a microbiota perfedd, Med. Res. Dat 37 (2017) 1140–1185.
[17] H. Liu, J. Yang, F. Du, X. Gao, X. Ma, Y. Huang, F. Xu, W. Niu, F. Wang, Y. Mao, Amsugno a gwarediad o ginsenosides ar ôl llafar gweinyddu dyfyniad Panax notoginseng i llygod mawr, Metab Cyffuriau. Dispos. 37 (2009) 2290–2298.
[18] JM Laparra, Y. Sanz, S. S. Schaffer, F. Visioli, Rhyngweithiadau microbiota perfedd gyda chydrannau bwyd swyddogaethol a nutraceuticals, Pharmacol. Res. 61 (2010) 219–225.
[19] H. Takeda, M. Tsuji, T. Yamada, J. Masuya, K. Matsushita, M. Tahara, M. Iimori, T. Matsumiya, asid Caffeic gwanhau'r gostyngiad mewn mynegiant cortigol mRNA BDNF a achosir gan amlygiad i gorfodi straen nofio mewn llygod, Eur. J. Ffarmacol. 534 (2006) 115–121.
[20] A. Zheng, L. Hao, C. Ke, X. Jie, Z. Xuan, L. Yuan, C. Cong, J. Liu, Z. Feng, Mamol hydroxytyrosol gweinyddu yn gwella niwrogenesis a swyddogaeth wybyddol yn cyn-geni straen epil, J. Nutr. Biocemeg. 26 (2015) 190–199.
[21] H. Li, J. He, W. Jia, Dylanwad microbiota perfedd ar metaboledd cyffuriau a gwenwyndra, Opin Arbenigol. Metab Cyffuriau. Gwenwynig. 12 (2016) 31 .
[22] KA El, F. Armougom, JI Gordon, D. Raoult, B. Henrissat, Digonedd ac amrywiaeth o ensymau carbohydrad-weithredol yn y microbiota perfedd dynol, Nat. Microbiol Parch. 11 (2013) 497–504.