Gwerthusiad In Vitro o Ryngweithiadau Cyffuriau-Cyffuriau Cyfryngol P-gp Gan Ddefnyddio Model Cell Arennol Dynol RPTEC/TERT1
Mar 01, 2022
Rhagymadrodd Mae gwerthusiad in vitro o botensial ataliol P-glycoprotein (P-gp) yn fater pwysig yn ystod y broses datblygu cyffuriau, gan ei fod yn caniatáu rhagfynegi rhyngweithiadau cyffuriau-cyffuriau sy'n glinigol berthnasol (DDIs) [1-3]. Mae P-gp yn perthyn i'r superfamily cludwr casét ATP-rhwymo (ABC) ac mae wedi'i amgodio gan y genyn ymwrthedd amlgyffuriau MDR1 (a elwir hefyd yn ABCB1). Mae'n hysbys bod y cludwr pilen hwn yn cael ei or- fynegi mewn celloedd tiwmoraidd ac yn achosi ymwrthedd i lawer o gyffuriau gwrthganser [4]. Wedi'i leoli o fewn pob rhwystr ffisiolegol, gan gynnwys coluddyn, afu, aarennau, Mae P-gp yn amddiffyn rhag xenobiotigau trwy gyfyngu ar amsugno'r swbstradau hyn o'r llwybr treulio a hwyluso eu hefux i'r bustl a'r wrin. Felly, mae P-gp yn chwarae rhan nodedig yn ffarmacocineteg amrywiol ddosbarthiadau therapiwtig [5-7]. Mae'n hysbys bod llu o gyffuriau fel asiantau gwrthganser, gwrthffyngaidd, a chyffuriau cardiofasgwlaidd yn swbstradau P-gp a / neu atalyddion, ac mae llawer ohonynt yn ymwneud â rhyngweithiadau sy'n glinigol berthnasol [8-10]. Felly, mae Gweinyddiaeth Bwyd a Chyffuriau yr Unol Daleithiau (FDA) yn gorchymyn bod yn rhaid gwerthuso'r potensial ataliol P-gp yn ystod camau cynnar datblygu cyffuriau. Mae profion in vitro a wneir at y diben hwn yn aml yn seiliedig ar astudiaethau cludo cyffuriau gan ddefnyddio llinellau cell mynegi P-gp. Yn fwy manwl gywir, mae canllawiau'r FDA yn argymell pennu gwerthoedd crynodiad ataliol hanner mwyafswm in vitro (IC50) i asesu'r risg o DDIs clinigol o ganlyniad i ataliad P-gp. I'r perwyl hwn, mae llawer o brofion arbrofol wedi'u cynnal, ac mae'r rhan fwyaf ohonynt wedi canolbwyntio ar ryngweithiadau cyffuriau sy'n gysylltiedig ag amsugno coluddol gan ddefnyddio'r modelau Caco-2 neu MDCK-MDR1 [11-13]
BYDD CISTANCHE YN GWELLA CLEFYD YR AREN/ARENAU
Ersarennolmae dileu hefyd yn llwybr dileu cyffredin ar gyfer gwahanol ddosbarthiadau o gyffuriau, gall secretion tiwbaidd gweithredol trwy gludwyr ABC hefyd chwarae rhan allweddol yn y rhyngweithiadau hyn [14]. Fodd bynnag, mae data in vitro ararennolMae DDIs a gyfryngir gan P-gp yn gyfyngedig. Mae hyn yn rhannol oherwydd diffyg datblygu a nodweddu modelau in vitro ar gyfer rhagfynegiarennolcludo cyffuriau. Ymhlith amrywiol linellau celloedd dynol, mae'n ymddangos bod model RPTEC/TERT1 yn dangos addewid ar gyfer gwerthusoarennolrhyngweithiadau cyffuriau. Mae'r llinell gell hon yn deillio o roddwr dynol iach ac fe'i cynhyrchwyd o gelloedd tiwbyn procsimol anfarwoledig. Ar ben hynny, mae mynegiant ac ymarferoldeb P-gp wedi'u dangos gan ddefnyddio'r model hwn, gan gadarnhau ei allu i ragweldarennolefuxes cyffuriau [15, 16]. Yn y cyd-destun hwn, cynlluniwyd yr astudiaeth bresennol i ymchwilio i botensial ataliol P-gp gan ddefnyddio model RPTEC/TERT1. Yn gyntaf, perfformiwyd assay sgrinio cronni rhodamine 123 (R123) i gael proffil ataliad ar gyfer pob cyffur a brofwyd. Yn seiliedig ar y sgrinio hwn, dewiswyd pedwar cyffur wedyn i asesu eu heffeithiau canolbwyntio-ddibynnol ar groniad mewngellol dau gyffur swbstrad P-gp: apixaban a rivaroxaban
Geiriau allweddol:cell arennol, model arennol, cyffur arennol, dileu arennol, yr arennau.
Defnyddiau a Dulliau
AdweithyddionApixaban, [2H71 3C ] - api xa ban , ri va r oxa ban ,[13C6]-rivaroxaban, nilotinib, crizotinib, erlotinib, axitinib, idelalisib, warfarin, a dabigatran etexilate eu prynu oddi wrth Alsachim, Ffrainc). Prynwyd Verapamil, ketoconazole, simvastatin, amiodarone, rhodamine 123, hydoddiant halen cytbwys Hank (HBSS), a hydoddiant HEPES gan Sigma-Aldrich (Saint-Quentin-Fallavier, Ffrainc).
Diwylliant Cell Cafwyd celloedd RPTEC/TERT1 o'r Casgliad Diwylliant Math Americanaidd (ATCC, Molsheim, Ffrainc) a'u meithrin mewn cyfrwng di-serwm wedi'i ddiffinio'n hormonaidd sy'n cynnwys F12 Medium Eagle's Modifed Dulbecco (ATCC) wedi'i ategu gan becyn ffactorau twf (ATCC) ac a Cymysgedd gwrthfiotig/antimycotig 1 y cant (penisilin-streptomycin, amffotericin B) ar 37 gradd a 5 y cant CO 2. Ar gyfer yr holl arbrofion, cafodd celloedd eu hadu mewn 96-blatiau ffynnon ar ddwysedd o 50,000 celloedd fesul ffynnon ac fe'u defnyddiwyd i dyfu ar ôl 14 diwrnod o feithriniad. Adnewyddwyd y cyfrwng bob 2 ddiwrnod a defnyddiwyd celloedd o adran 27 i ddarn 34. Prynwyd celloedd Caco gan yr ATCC hefyd. Roedd y celloedd yn cael eu cynnal mewn cyfrwng diwylliant sy'n cynnwys Canolig Hanfodol Lleiaf Eagle (Sigma-Aldrich, Missouri, UDA) wedi'i ategu â 10 y cant FBS, 1 y cant o asidau amino nad yw'n hanfodol, a chymysgedd gwrthfiotig / gwrthmycotig 1 y cant (penisilin-streptomycin, amffotericin B. ) ar 37 gradd a 5 y cant CO2. Cafodd celloedd caco-2 eu hadu mewn 96-blatiau ffynnon ar ddwysedd o 5 × 10 3 o gelloedd fesul ffynnon ac fe’u defnyddiwyd i dyfu ar ôl 14 diwrnod o feithriniad. Cafwyd celloedd epithelial tiwbaidd procsimol dynol (HPTECs) gan BIOPREDIC (Rennes, Ffrainc) a'u meithrin yn DMEM / F12 wedi'u hategu â hydrocortisone, EGF, inswlin, transferrin, a sodiwm selenit. Cafodd celloedd eu hadu mewn 96-blatiau meithrin wedi'u gorchuddio'n dda â colagen ar ddwysedd o 6600 o gelloedd fesul ffynnon ac fe'u defnyddiwyd i dyfu ar ôl 11 diwrnod o feithriniad.
Assay Sgrinio Cronni Rhodamine 123 Pennwyd y potensial ataliol P-gp trwy fesur y casgliad mewngellol o rhodamine 123 mewn celloedd RPTEC / TERT1 ym mhresenoldeb ac absenoldeb gwahanol ddosbarthiadau o gyffuriau. Ymhlith y 14 o gyffuriau a brofwyd, defnyddiwyd cyclosporin A (10 µM), ketoconazole (50 µM), verapamil (100 µM), ac amiodarone (50 µM) fel atalyddion P-gp. Defnyddiwyd apixaban, rivaroxaban, a dabigatran etexilate - tri gwrthgeulydd geneuol uniongyrchol (DOACs) - fel swbstradau P-gp (10 µM). Defnyddiwyd Warfarin (50 µM) fel atalydd, a defnyddiwyd sawl cyffur gwrthganser gan gynnwys nilotinib, crizotinib, erlotinib, ac idelalisib heb wybod eu proffiliau ataliaeth mewn crynodiad o 10 µM. Atgynhyrchwyd sawl cyflwr gyda'r celloedd Caco, sy'n cael eu cymeradwyo gan yr FDA ar gyfer astudiaethau cludo cyffuriau. Yn y modd hwn, penderfynwyd cadw mewngellol rhodamine 123 mewn celloedd Caco-2 ym mhresenoldeb ac absenoldeb verapamil (100 µM), cyclosporin A (10 µM), nilotinib (10 µM), a DOACs (10 µM). ). Yn gryno, ar ôl 14 diwrnod o feithriniad mewn 96-platiau ffynnon, cafodd y celloedd eu deor ymlaen llaw am 10 munud ar 37 gradd gyda phob cyffur yn cael ei hydoddi yn HBSS gyda 10 mM HEPES (v/v). Yna deorwyd y celloedd â 10 µM rhodamine 123 am 45 munud ar 37 gradd. Yn olaf, ar ôl tri golchiad mewn hydoddiant HBSS / HEPES oer, cafodd y celloedd eu gorchuddio ar dymheredd ystafell am 45 munud mewn hydoddiant o sodiwm dodecyl sylffad (SDS) yn cynnwys 1 y cant o sodiwm borate. Cafodd faint o intracellularrhodamine 123 ei feintioli gan ddefnyddio nanospectrofuoromedr Infinite M (Gwyddorau Bywyd, TECAN, y Swistir), gan osod y tonfeddi i 485/535 nm. Mynegwyd data fel canrannau o groniad rhodamine 123 mewn celloedd rheoli nad oeddent yn agored i unrhyw atalyddion P-gp posibl ac a osodwyd yn fympwyol ar groniad 100 y cant.
Assay Croniad Mewngellol DOAC a Phenderfyniad IC50 O'r assay sgrinio rhodamine 123 blaenorol, dewiswyd pedwar cyffur i ymchwilio i'w heffeithiau canolbwyntio-ddibynnol ar groniad mewngellol apixaban a rivaroxaban (10 µM) mewn celloedd RPTEC/TERT1. Dewiswyd Ketoconazole, crizotinib, a nilotinib fel atalyddion P-gp, a dewiswyd warfarin fel atalydd. Defnyddiwyd cyclosporin A (10 µM) fel atalydd sbectrwm eang o gludwyr. Cafodd astudiaethau o'r rhyngweithiadau rhwng DOACs a nilotinib ar gyfer pennu gwerthoedd IC50 eu hatgynhyrchu yng nghelloedd Caco-2 er mwyn cymharu'r ddau fodel cellog. Gwanhawyd yr holl gyfansoddion naill ai ar eu pen eu hunain neu gyda'r atalydd cysylltiedig mewn byfer cludo HBSS wedi'i ategu gan 1 y cant HEPES (v / v) ac 1 y cant DMSO (v / v). Cyn deori, cynheswyd yr holl doddiannau i 37 gradd ac addaswyd y pH i 7.4. Ar gyfer y cyffuriau gwrthganser crizotinib a nilotinib, oherwydd eu hydoddedd gwael a'u potensial sytotocsig, roedd crynodiadau'n amrywio o 0.1 i 25 µM. Ar gyfer cetoconazole a warfarin, roedd y crynodiadau'n amrywio o 0.1 i 100 µM. Yn gryno, ar ôl 14 diwrnod o ddiwylliant, cafodd yr holl gyffuriau a doddwyd yn HBSS gydag 1 y cant HEPES (v/v) eu deor ymlaen llaw am 10 munud ar 37 gradd . Yna, deorwyd celloedd â 10 µM o apixaban neu rivaroxaban am 60 munud ar 37 gradd . Yn olaf, ar ôl tri golchiad mewn hydoddiant HBSS/HEPES oer, cafodd celloedd eu gosod ar dymheredd ystafell am 45 munud mewn hydoddiant 0.2 y cant o Triton X-100. Yna cafodd swm y DOAC mewngellol ei feintioli gan gromatograffeg hylif - sbectrometreg màs (LC-MS). Mynegwyd data fel cynnydd canrannol mewn croniad DOAC, a gosodwyd croniad lular intracel DOAC yn fympwyol ar 100 y cant mewn celloedd rheoli. Pennwyd gwerthoedd IC50 ar gyfer ataliad gweithgaredd P-gp, sy'n cyfateb i werthoedd crynodiad effaith hanner uchaf (EC50) ar gyfer cynyddu croniad DOAC, o fodelu atchweliad sgwariau lleiaf aflinol heb ei bwysoli o groniad cynyddol gyda'r swyddogaeth 'nls()' yn R. meddalwedd, yn ôl yr hafaliad canlynol (Eq. 1):
Cromatograffaeth Hylif – Dadansoddiad Sbectrometreg MàsPerfformiwyd meintioli apixaban (m/z 460.19793) a rivaroxaban (m/z 436.07285) gan ddefnyddio Ultimate U300{{18 }} system cromatograffaeth hylif (Dionex, Sunnyvale, CA, UDA) ynghyd â sbectromedr màs Q-Exactive Plus (ThermoFisher, Bremen, yr Almaen). Cyflawnwyd gwahaniadau LC gan ddefnyddio colofn ddadansoddol Hypersil Gold C18 (3 µm, 50 × 2.1 mm) (ThermoFisher Scientifc, Waltham, MA, UDA) a chyfradd fow o 0.6 mL/min . Dŵr â 0.1 y cant o asid ffurfig (FA) oedd cam A symudol ac roedd cam symudol B yn asetonitrile gyda 0.1 y cant FA. Ar gyfer rivaroxaban, y graddiant oedd: 0–0.3 mun, 10 y cant B; 0.3-1 mun, llinol o 10 y cant i 70 y cant B; 1–1.5 mun, 70 y cant B; 1.51 munud, dychwelyd i amodau cychwyn tan 3 munud. Ar gyfer apixaban, y graddiant oedd: 0–0.3 mun, 10 y cant B; 0.3-0.7 mun, llinol o 10 i 90 y cant B; 0.7–1.5, 90 y cant B; 1.51 munud, dychwelyd i amodau cychwyn tan 3 munud. Perfformiwyd y canfod yn y modd monitro adwaith cyfochrog electrochwistrellu (PRM) ar gydraniad o 35,000 (ar m/z 200). Y safonau mewnol (ISs) oedd [13C,2H7]-apixaban (m/z 468.2452) ar gyfer apixaban a [13C6]-rivaroxaban (m/z 442.09297) ar gyfer rivaroxaban. Ar gyfer pob cyffur a'i IS priodol, cafodd ïon targed (ar gyfer meintioli) ac ïon cadarnhau eu monitro. Ar gyfer rivaroxaban a'i IS, yr ïon targed oedd m/z 144.95125 a'r ïonau cadarnhau oedd m/z 231.11280 a m/z 237.13298, yn y drefn honno. Ar gyfer apixaban a'i IS, yr ïon targed oedd m/z 199.08656 a'r ïonau cadarnhau oedd m/z 282.12387 a m/z 241.06062, yn y drefn honno.
Canlyniadau
Assay Sgrinio Cronni Rhodamine 123Perfformiwyd assay sgrinio cronni rhodamine 123 mewn celloedd RPTEC/TERT1 gyda 14 o gyffuriau gyda phroffiliau ataliad gwahanol (Ffig. 1). Yn ôl y disgwyl, roedd y croniad mewngellol o rhodamine 123 ym mhresenoldeb cyclosporin A, atalydd sbectrwm eang, ymhlith yr uchaf, gyda chynnydd mewn croniad o 75 y cant o'i gymharu â'r celloedd rheoli. Arweiniodd presenoldeb verapamil, atalydd P-gp penodol, at gynnydd mewn cronni rhodamine 123 o 57 y cant, gan ddangos cyfranogiad P-gp. Yn yr un modd, arweiniodd ketoconazole, a ddisgrifir fel atalydd P-gp cryf, at gynnydd mwy (66 y cant) yn y croniad mewngellol o rhodamine 123 o'i gymharu â verapamil, gan gadarnhau ei broffil ataliad. I'r gwrthwyneb, achosodd ychwanegu amiodarone, a nodweddir fel atalydd P-gp cymedrol, gynnydd mewn croniad o 59 y cant, sy'n debyg i'r hyn a achosir gan verapamil. Gwelwyd gwahanol broffiliau ataliad ar gyfer yr asiantau gwrthganser nilotinib, axitinib, crizotinib, erlotinib, ac idelalisib. Achosodd ychwanegu nilotinib gynnydd cryf yn y casgliad o rhodamine 123 (71 y cant), sy'n awgrymu potensial ataliol sylweddol, ac yna axitinib, a achosodd gynnydd mewn cadw o 57 y cant. Ar y llaw arall, dangosodd crizotinib ac erlotinib botensial ataliol cymedrol i isel, gyda chynnydd mewn croniad rhodamine 123 o 23 y cant ac 16 y cant, yn y drefn honno. Nid oedd Idelalisib yn effeithio ar groniad rhodamine 123; yr un peth yn wir am warfarin, sef
wedi'i ddewis fel un nad yw'n atalydd. Ymhlith y tri DOACs, achosodd apixaban a rivaroxaban gynnydd bach yn y cadw rhodamine 123: 33 y cant a 12 y cant, yn y drefn honno. Yn ddiddorol, achosodd dabigatran etexilate, prodrug o dabigatran a swbstrad hysbys o P-gp, gynnydd mewn cadw rhodamine 123 o tua 50 y cant, er na chaiff ei ddisgrifio fel atalydd P-gp posibl. Yn olaf, achosodd ychwanegu simvastatin ychydig o gynnydd yn unig yn y casgliad o'r swbstrad ffwroleuol (32 y cant ). Yn seiliedig ar y sgrinio hwn, dewiswyd pedwar cyffur i asesu eu heffeithiau canolbwyntio-ddibynnol ar y casgliad mewngellol o apixaban a rivaroxaban o fewn y model RPTEC/TERT1. Dewiswyd Ketoconazole fel cyflwr rheoli cadarnhaol ar gyfer ataliad P-gp, a dewiswyd warfarin fel un nad yw'n atalydd P-gp ar gyfer y cyflwr rheoli negyddol. Dewiswyd Nilotinib a crizotinib fel atalyddion P-gp cryf a chymedrol, yn y drefn honno. Atgynhyrchwyd nifer o amodau gyda'r model cyfeirio, Caco-2. Penderfynwyd ar y casgliad mewngellol o R123 mewn celloedd ar ôl cyfuno (neu beidio) ag apixaban a rivaroxaban (10 µM), nilotinib (10 µM), a gyda cyclosporin A (10 µM) a verapamil (100 µM) ar gyfer yr amodau rheoli ar gyfer ataliad. (Ffig. 2A). Yn ôl y disgwyl, achosodd verapamil a cyclosporin A gynnydd uchel mewn cadw R123 o 297 y cant a 275 y cant, yn y drefn honno. Yn yr un modd, achosodd nilotinib gynnydd uchel yn y casgliad mewngellol o R123 (229 y cant), gan gadarnhau ei botensial ataliol. Arweiniodd cyfuno R123 â DOACs at fân gynnydd yn y casgliad o R123 (40-44 y cant) o gymharu â chyffuriau eraill. Ar ben hynny, mae'r casgliad mewngellol o rhodamine 123 yn absenoldeb a phresenoldeb cyclosporin A ynarennolymchwiliwyd i gelloedd dynol cynradd hefyd yn yr astudiaeth hon i wirio dibynadwyedd y canlyniadau a gafwyd gyda chelloedd RPTEC/TERT1 (Ffig. 2B). Dangosodd y dadansoddiadau hyn fod presenoldeb cyclosporin A wedi cynyddu cadw R123 71 y cant. Roedd y gwerth hwn yn agos at yr hyn a gafwyd o dan yr un amodau â chelloedd RPTEC / TERT1 (cynnydd o 75 y cant gyda cyclosporin A). Felly, roedd y gweithgaredd P-glycoprotein yn debyg yn y model RPTEC/TERT1 a chelloedd dynol cynradd.
Assay Croniad Mewngellol DOACs: IC50 ac I1/IC50 Dyfarniad Cymhareb Perfformiwyd astudiaethau cronni mewngellol i asesu cludiant apixaban a rivaroxaban trwy gyfrwng P-gp ar grynodiad cyson o 10 µM mewn celloedd RPTEC/TERT1 in vitro ac ym mhresenoldeb crynodiadau cynyddol o nilotinib, crizotinib, ketoconazole , a warfarin (Ffig. 2, 3). Aseswyd modelu mwy o gadw apixaban a rivaroxaban i bennu gwerthoedd IC50. Arweiniodd cyfuno DOACs â nilotinib at y gwerthoedd IC50 isaf: 0.85 µM a 1.37 µM ar gyfer rivaroxaban ac apixaban, yn y drefn honno (Ffig. 4, 5). Arweiniodd cyfuniad â crizotinib IC50 val u o 10.1 µM a 12.2 µM ar gyfer rivaroxaban ac apixaban, yn y drefn honno. Yn syndod, ni chynhyrchodd cyfuno DOACs â keto conazole y gwerthoedd IC50 isaf (16.5 µM a 16.9 µM ar gyfer rivaroxaban ac apixaban, yn y drefn honno). Yn olaf, yn ôl y disgwyl, cyfuniad â warfarin, a oedd
a ddewiswyd fel un nad yw'n atalydd, nid oedd yn effeithio ar gadw mewngellol y ddau DOACs. Felly ymchwiliwyd i'r casgliad mewngellol o apixaban a rivaroxaban o fewn celloedd Caco ym mhresenoldeb crynodiadau cynyddol o nilotinib er mwyn cymharu â'r modelau cellog. Yn ddiddorol, fel y gwelwyd gyda'r model RPTEC/TERT1, roedd y gwerth IC50 ar gyfer rivaroxaban (4.16 µM) yn is na'r hyn a gafwyd ar gyfer apixaban (9.35 µM). Mae hefyd yn ddiddorol nodi bod y gwerthoedd IC50 a welwyd yng nghelloedd Caco-2 yn uwch na'r rhai a gafwyd mewn celloedd RPTEC/TERT1 ar gyfer yr un atalydd. Gellir rhagweld perthnasedd clinigol DDIs o ddata in vitro. Yn ôl canllawiau'r FDA, cyfrifwyd cymarebau [I1]/IC5{0 ar gyfer pob cyfuniad o gyffuriau. Mae'r gymhareb hon yn caniatáu i grynodiadau in vivo gael eu cymharu â'r rhai y gwyddys eu bod yn cynhyrchu effaith berthnasol in vitro. Ar gyfer apixaban mewn celloedd RPTEC / TERT1, y cymarebau oedd 3.1, 0.06, a 17.4 gyda nilotinib, crizotinib, a ketoconazole, yn y drefn honno (Tabl 1). Mewn celloedd Caco-2, y gymhareb [I1]/IC50 oedd 0.46 ar gyfer y rhyngweithio rhwng apixaban a nilotinib (Tabl 1). Ar gyfer rivaroxaban, roedd y cymarebau ychydig yn uwch na'r rhai a gafwyd ar gyfer apixaban mewn celloedd RPTEC / TERT1: 5.1, 0.08, a 17.7, yn y drefn honno, ar gyfer nilotinib, crizotinib, a ketoconazole (Tabl 2). Yn yr un modd, y gymhareb [I1]/IC50 a arsylwyd ar gyfer y rhyngweithio rhwng rivaroxaban a nilotinib yng nghelloedd Caco-2 oedd 1.03, a oedd yn uwch na'r hyn a gafwyd ar gyfer apixaban (Tabl 2).
Trafodaeth
Mae nifer o astudiaethau a gynhaliwyd yn ystod y degawdau diwethaf wedi nodi rôl nodedig P-gp mewn ffarmacocineteg cyffuriau [17-19]. Yn wyneb y diddordeb rheoleiddiol cynyddol mewn rhyngweithiadau cyffuriau a gyfryngir gan P-gp, mae profion in vitro i ymchwilio i botensial ataliol cyffuriau yn agwedd bwysig ar ddatblygiad cyffuriau ac ymarfer clinigol. I'r perwyl hwn, mae llawer o brofion in vitro wedi'u cynnal, ac mae'r rhan fwyaf o'r data cysylltiedig ar amsugniad coluddol a ragwelir wedi'i gynhyrchu o linellau celloedd Caco-2 a MDCK-MDR1 [20-22]. Fodd bynnag, ychydig o ddata sydd ar gael ar y secretion tiwbaidd gweithredol o gyffuriau, sydd hefyd yn chwarae rhan allweddol mewn gwarediad cyffuriau ac yn dibynnu ar bresenoldeb cludwyr ABC. Mae'r arsylwi hwn yn amlwg yn gysylltiedig â'r diffyg nodwedduarennolllinellau cell ar gyfer rhagfynegi cyffurarennolefux. Mae angen in vitro ar gyfer y nod hwnarennolmodel sy'n dynwared y rhwystr ffisiolegol yn agos. Mae'n ymddangos bod y llinell gell ddynol RPTEC / TERT1, sy'n mynegi nifer o gludwyr ABC (yn enwedig P-gp), yn ddewis arall da, fel y dangoswyd mewn astudiaeth flaenorol [16]. Yn y cyd-destun hwn, roedd y gwaith presennol yn ymchwilio i gymhwyso'r model RPTEC/TERT1 i asesu potensial ataliol P-gp. Hyd eithaf ein gwybodaeth, y gwaith hwn yw'r cyntaf i ddarparu data o astudiaethau atal P-gp gan ddefnyddio dynolarennolcelloedd.
Mae profion in vitro ar gyfer pennu potensial ataliol P-gp yn aml yn seiliedig ar ddefnyddio swbstrad P-gp cyfeirnod penodol, fel digoxin neu rhodamine 123 [23-25]. Oherwydd eu bod yn hawdd i'w defnyddio, mae stilwyr ffwroleuol yn fanteisiol ar gyfer profion trwybwn uchel. Ar ben hynny, mae rhodamine 123 wedi'i gymhwyso'n eang i ganfod gweithgaredd P-gp mewn ystod eang o astudiaethau [26-28]. Yn y modd hwn, cynhaliwyd profion o groniad rhodamine 123 mewn celloedd RPTEC / TERT1 yn yr astudiaeth hon i nodi proffiliau ataliad 14 o gyffuriau. Ymhlith y cyffuriau hyn, dewiswyd cyclosporin A, ketoconazole, a verapamil fel atalyddion P-gp cryf. Mae'r atalyddion hyn wedi'u nodweddu'n helaeth am eu potensial ataliol P-gp sylweddol, sy'n arwain at fodiwleiddio cludiant digoxin a rhodamine 123 [27, 29, 30]. Yn ôl y disgwyl, y cyffuriau hyn a achosodd y cadw rhodamine 123 uchaf mewn celloedd RPTEC / TERT1. Mewn cyferbyniad, ni welwyd unrhyw gynnydd yn y cadw R123 gyda warfarin, a ddefnyddiwyd fel rheolaeth negyddol, gan gadarnhau dibynadwyedd y model RPTEC / TERT1. Yn ddiddorol, ymhlith yr holl gyffuriau a brofwyd, achosodd DOACs - gan gynnwys dabigatran etexilate, apixaban, a rivaroxaban - gynnydd amlwg yng nghadw R123, er nad oeddent wedi'u nodweddu'n flaenorol fel atalyddion, dim ond swbstradau P-gp [31, 32]. Gall yr arsylwi hwn fod oherwydd bodolaeth ataliad "cystadleuol" fel y'i gelwir, lle gall y cyffuriau ryngweithio â'r un safleoedd rhwymo ar P-gp. Y safleoedd sydd â'r nodweddion mwyaf da ar gyfer P-gp yw'r safle H (ar gyfer rhwymo Hoechst 33342) a'r safle R (ar gyfer rhwymo rhodamine 123). Fodd bynnag, gallai nifer o safleoedd rhwymo cyffuriau anhysbys eraill chwarae rhan yn y rhyngweithiadau hyn, a allai esbonio effeithiau gwahanol y DOACs ar groniad R123 [33, 34]. Felly mae'r ataliad P-gp a welwyd ar gyfer cyffur penodol yn dibynnu ar y swbstrad a ddefnyddir yn ystod astudiaethau in vitro [28, 35]. Felly, dylid ystyried defnyddio swbstradau P-gp gwahanol sy'n rhyngweithio â gwahanol safleoedd rhwymo cyffuriau er mwyn disgrifio'n gywir botensial cyffuriau ataliol P-gp tybiedig. Mae hefyd yn ddiddorol nodi bod sawl cyflwr o'r sgrinio rhodamine 123 hefyd wedi'u perfformio mewn celloedd Caco{{-2} er mwyn cymharu celloedd RPTEC/ TERT1 â model cyfeirio mewn astudiaethau cludo cyffuriau. Yn ôl y disgwyl, achosodd cyclosporin A, verapamil, a nilotinib y cynnydd uchaf mewn cadw rhodamine. Gwelwyd yr un proffiliau ataliad gyda chelloedd Caco{{-2) a RPTEC/TERT1. Fodd bynnag, roedd y cynnydd mewn cadw rhodamine 123 a gynhyrchwyd gan y rhyngweithiadau yn y model Caco-2 yn fwy na'r rhai a welwyd mewn celloedd RPTEC / TERT1, gan awgrymu gwahaniaeth posibl yn y mynegiant o P-glycoprotein rhwng modelau Felly, yn y presennol astudiaeth, defnyddiwyd ail ddull i asesu a chadarnhau'r ataliad posibl o P-gp gan gyffuriau.
BYDD CISTANCHE YN GWELLA DIALYSIS AREN/ARENOL
Yn seiliedig ar assay cronni rhodamine 123, dewiswyd pedwar cyffur i bennu eu heffeithiau canolbwyntio ar groniad mewngellol apixaban a rivaroxaban. Dangoswyd bod P-gp yn chwarae prif rôl yn efux apixaban a rivaroxaban [32, 36]. Felly aseswyd gwerthoedd IC50 nilotinib, crizotinib, a ketoconazole, gyda DOACs wedi'u dewis fel y cyffuriau "dioddefwr". Hyd eithaf ein gwybodaeth, yr astudiaeth hon yw'r cyntaf i berfformio astudiaethau cronni mewngellol gyda DOACs mewn dynol.arennolcelloedd. Roedd y gwerthoedd IC50 a gafwyd ar gyfer nilotinib a crizotinib yn unol â'u proffiliau ataliad a gafwyd o'r assay cronni rhodamine 123. Cyflwynodd Nilotinib, a achosodd gynnydd cryf yn y cadw R123, y gwerth IC50 isaf ar gyfer y ddau DOAC, gan gadarnhau ei botensial ataliad uchel. Mae'r canlyniad hwn hefyd yn unol ag astudiaeth flaenorol a ddangosodd gynnydd dibynnol ar grynodiad yn y croniad mewngellol o [3 H]-paclitaxel mewn celloedd a drosglwyddir MDR, gan awgrymu bod ganddo broffil atalydd [37]. Ar gyfer crizotinib, dangosodd assay R123 botensial ataliol cymedrol, gyda llai o gynnydd mewn cadw R123 na'r hyn a achosir gan nilotinib. Cefnogir yr arsylwad hwn gan astudiaeth flaenorol lle cynyddodd crizotinib y casgliad mewngellol o R123 a doxorubicin mewn celloedd a drosglwyddir MDR [38]. Mae'r canlyniad hwn hefyd yn unol â'r gwerthoedd IC50 a bennwyd gyda DOACs, a oedd yn uwch na'r gwerthoedd cyfatebol ar gyfer nilotinib, gan gadarnhau ei broffil ataliad cymedrol. Fodd bynnag, mae'n ddiddorol nodi nad oedd crynodiad o 10 µM o naill ai nilotinib neu crizotinib wedi achosi'r un cynnydd o ran cadw rhodamine 123 a DOACs. Mewn sgrinio rhodamine, cynyddodd nilotinib gadw'r swbstrad tua 71 y cant, tra roedd tua 40 y cant ar gyfer DOACs. Mewn cyferbyniad, achosodd crizotinib gynnydd bach yn y cadw rhodamine (23 y cant) ond mwy o gynnydd o ran cadw DOACs (tua 50 y cant) ar yr un crynodiad. Fel y trafodwyd yn flaenorol, gellid esbonio'r sylw hwn gan wahaniaethau yn y safleoedd rhwymo ar P-gp. Mae'n hysbys bod llawer o gyffuriau yn rhyngweithio ac yn cystadlu â'r safle rhwymo H yn hytrach na'r safle rhwymo R (sef lle mae rhodamine 123 yn rhwymo), ac i'r gwrthwyneb [39]. Yn ddiddorol, achosodd ketoconazole, y gwyddys ei fod yn atalydd P-gp cryf, gynnydd ychydig yn llai o ran cadw rhodamine 123 nag a wnaeth nilotinib (66 y cant yn erbyn 71 y cant, yn y drefn honno). Serch hynny, gwelwyd gwerth tebyg gyda chelloedd Caco-2, lle achosodd presenoldeb ketoconazole gynnydd o 60 y cant yn y casgliad o R123 [40]. Roedd y casgliad mewngellol o DOACs ar gyfer pennu gwerthoedd IC50 hefyd yn dangos gwerthoedd uwch o'i gymharu â nilotinib a crizotinib. Yn ddiddorol, roedd y rhan fwyaf o'r gwerthoedd IC50 a geir yn y modelau LLC-PK1 neu Caco-2 gan ddefnyddio digoxin fel swbstrad P-gp rhwng 3 a 4 µM ar gyfer cetoconazole [41, 42]. Mae'r gwerthoedd hyn yn eithaf gwahanol i'r rhai a geir yn yr astudiaeth bresennol (16.5 µM a 16.9 µM gydag apixaban a rivaroxaban, yn y drefn honno). Mae'r arsylwad hwn yn cadarnhau bod dewisiadau'r swbstrad a'r model a ddefnyddir yn ddylanwadau hanfodol wrth bennu potensial ataliol P-gp. Yn ogystal, nododd astudiaeth ddiweddar fod lefelau mynegiant cludwyr ABC mewn modelau cellog in-vitro yn cael effaith ar brofion cludo cyffuriau ac felly ar werthusiad DDIs yn ymwneud â P-gp [43]. Yn wir, datgelodd penderfyniad gwerthoedd IC50 ar gyfer verapamil gan ddefnyddio rivaroxaban fel swbstrad P-gp heterogenedd rhwng modelau celloedd MDCKMDR1 a Caco-2, gyda gwerthoedd IC50 o 6.94 µM a 21.2 µM, yn y drefn honno [43]. Ymhellach, archwiliwyd effaith crynodiad-ddibynnol nilotinib ar groniad mewngellol apixaban a rivaroxaban yng nghelloedd Caco-2 yn yr astudiaeth hon. Yn ddiddorol, roedd gwerthoedd IC50 ar gyfer nilotinib yn sylweddol uwch mewn celloedd Caco-2 nag yng nghelloedd RPTEC/TERT1. Gellir esbonio'r arsylwad hwn gan y gwahaniaeth mewn mynegiant P-gp rhwng y modelau hyn. Yn ogystal, mae'n hysbys bod y dosbarthiad P-gp yn dibynnu ar y meinwe a ystyriwyd. Mae Fallon et al. dangos bod lefel P-gp yn uwch ynarennag mewn meinwe afu mewn pobl [45]. Ar y llaw arall, mae'n ymddangos bod lefel mynegiant P-gp yn uwch yn y coluddyn nag yn y coluddynarenmeinwe [46]. Felly, gallai defnyddio celloedd dynol fel y model RPTEC/TERT1, nad ydynt yn gorfynegi cludwyr, ddarparu data ychwanegol. Gellid defnyddio'r data hyn a'u priodoli mewn modelu ffarmacocinetig sy'n seiliedig ar ffisiolegol (PBPK) trwy integreiddio nifer o baramedrau, megis maint y P-gp mewn meinwe neu fodel in vitro neu werthoedd IC50.
Er bod y gwerthoedd IC50 a ddarganfuwyd ar gyfer ketoconazole yn y model RPTEC/TERT1 yn uwch na'r rhai a arsylwyd yn y llenyddiaeth, dangosodd y gymhareb [I1]/IC50 - a ddilyswyd fel rhagfynegydd o DDIs clinigol perthnasol posibl ar gyfer cyffuriau a weinyddir ar lafar - gwerthoedd uchel a oedd yn uwch na'r trothwy o 0.1 a ddiffiniwyd gan yr FDA. Mae'r canlyniad hwn yn unol ag astudiaeth glinigol a ddangosodd gynnydd deublyg mewn amlygiad apixaban gyda chyd-weinyddu ketoconazole [44]. Gyda'i gilydd, mae'r holl ganlyniadau hyn yn dangos bod model RPTEC/ TERT1 yn arf addawol ar gyfer asesu potensial ataliol P-gp.
BYDD CISTANCHE YN GWELLA POEN YN YR AREN/ARENIAD
Casgliad
Dangosodd ein hastudiaeth fod cymhwyso model RPTEC/TERT1 yn gyfleus ar gyfer gwerthuso potensial ataliol P-gp o wahanol ddosbarthiadau o gyffuriau. Caniataodd profion cronni Rhodamine 123 i sgrinio cyffuriau cychwynnol gael ei berfformio. Fodd bynnag, rhaid hefyd ymchwilio i botensial ataliol P-gp cyffuriau nad ydynt yn rhyngweithio â safle R P-gp gan ddefnyddio swbstradau ychwanegol i gadarnhau'r rhagfynegiadau. Mae'r gwerthoedd IC50 a bennir o'r casgliad mewngellol o apixaban a rivaroxaban yn unol â'r proffiliau ataliad a welwyd gyda rhodamine 123. Ar ben hynny, roedd y defnydd o ketoconazole a warfarin fel atalydd cryf ac nad yw'n atalydd P-gp, yn y drefn honno, yn cadarnhau'r dibynadwyedd y model RPTEC/TER1 pan gaiff ei ddefnyddio i gael data in vitro am botensial ataliol cyffuriau tuag at P-gp. Yn olaf, roedd cymhariaeth o'r canlyniadau a gafwyd gan ddefnyddio'r model RPTEC/TERT1 â'r rhai a gafwyd gan ddefnyddio celloedd Caco-2 yn amlygu pwysigrwydd cynnal astudiaethau in vitro mewn modelau cellog gwahanol i gadarnhau'r proffil ataliol ar gyfer cyffur penodol.