Cistanchehefyd y swyddogaeth ohyrwyddo cynhyrchu colagen, a all gynyddu elastigedd a llewyrch y croen a helpuatgyweirio celloedd croen sydd wedi'u difrodi. CistancheGlycosidau ffenylethanolyn cael effaith is-reoleiddio sylweddol ar weithgaredd tyrosinase, a dangosir bod yr effaith ar tyrosinase yn ataliad cystadleuol a gwrthdroadwy, a all ddarparu sail wyddonol ar gyfer datblygu a defnyddio'r cynhwysion gwynnu yn Cistanche. Felly, mae gan cistanche rôl allweddol mewn croengwynnu. Gallatal cynhyrchu melanini leihau afliwiad a diflastod; a hyrwyddo cynhyrchu colagen i wella elastigedd croen a pelydriad. Oherwydd y gydnabyddiaeth eang o'r effeithiau hyn o cistanche, mae llawer o gynhyrchion gwynnu croen wedi dechrau trwytho cynhwysion llysieuol fel Cistanche i gwrdd â galw defnyddwyr, gan gynyddu gwerth masnachol Cistanche mewn cynhyrchion gwynnu croen. I grynhoi, mae rôl cistanche mewn gwynnu croen yn hollbwysig. Eigwrthocsidioleffaith aeffaith cynhyrchu colagenyn gallu lleihau afliwiad a diflastod, gwella hydwythedd croen a llewyrch, a thrwy hynny gael effaith gwynnu. Hefyd, mae cymhwysiad eang Cistanche mewn cynhyrchion gwynnu croen yn dangos na ellir diystyru ei rôl mewn gwerth masnachol.

Cliciwch Organic Cistanche ar gyfer Whitening

Am fwy o wybodaeth:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

Tyrosinase yw'r ensym sy'n cyfyngu ar gyfraddau cynhyrchu melanin ac, yn unol â hynny, dyma'r targed amlycaf ar gyfer atal gorbigmentu. Mae nifer o atalyddion tyrosinase wedi'u nodi, ond mae diffyg effeithlonrwydd clinigol gan y rhan fwyaf o'r rheini oherwydd eu bod wedi'u nodi gan ddefnyddio tyrosinase madarch fel y targed. Felly, defnyddiwyd tyrosinase dynol ailgyfunol i sgrinio llyfrgell o 50,000 o gyfansoddion a chymharu'r trawiadau sgrinio gweithredol â chynhwysion gwynnu adnabyddus. Dim ond yn wan y rhwystrodd hydroquinone a'i arbutin deilliadol tyrosinase dynol gyda chrynodiad ataliol hanner-uchaf (IC50) yn yr ystod milimolar, a dangosodd asid kojic effeithiolrwydd gwan (IC50> 500 mmol / L). Yr atalyddion mwyaf grymus o tyrosinase dynol a nodwyd yn y sgrin hon oedd deilliadau resorcinol-thiazole, yn enwedig y Thiamidol (Beiersdorf AG, Hamburg, yr Almaen) a nodwyd yn ddiweddar (isobutyl amido thiazolyl resorcinol), a oedd ag IC50 o 1.1 mmol/L. Mewn cyferbyniad, dim ond tyrosinase madarch (IC50 =108 mmol/L) a ataliodd Thiamidol yn wan. Mewn diwylliannau melanocyte, roedd Thiamidol yn atal cynhyrchu melanin yn gryf ond yn wrthdroadwy (IC50 =0.9 mmol/L), tra bod hydroquinone yn atal melanogenesis yn ddiwrthdro (IC 50 = 16.3 mmol/L). Yn glinigol, roedd Thiamidol yn amlwg yn lleihau ymddangosiad smotiau oedran o fewn 4 wythnos, ac ar ôl 12 wythnos nid oedd modd gwahaniaethu rhwng rhai smotiau oedran a'r croen cyfagos arferol. Mae angen archwilio potensial llawn Thiamidol i leihau hyperpigmentation croen dynol mewn astudiaethau yn y dyfodol.

RHAGARWEINIAD

Mae melasma, lentiginau actinig a henaint, a gorbigmentiad ôl-lid yn broblemau cosmetig mawr y mae llawer o gleifion yn gofyn am gyngor meddygol ar eu cyfer. Yn gyffredinol, mae'r anhwylderau hynny'n effeithio ar boblogaethau â chroen tywyllach sy'n fwy aml ac yn fwy difrifol (Stratigos a Katsambas, 2004). Mae llawer o gynhyrchion cyfoes ar gael i drin anhwylderau gorbig, ac maent yn cynnwys cynhwysion actif amrywiol i leihau cynhyrchiant a/neu ddosbarthiad melanin. Er y gellir lleihau hyperpigmentation croen gan amrywiol fecanweithiau (Briganti et al., 2003), tyrosinase, yr ensym cyfyngu ar gyfradd o gynhyrchu melanin, yw'r targed amlwg ar gyfer atalyddion hyperpigmentation (Kanteev et al., 2015; Lee et al., 2014; Ramsden a Riley, 2014). Disgrifiwyd llawer o sylweddau yn y llenyddiaeth fel atalyddion tyrosinase, ond nid oes gan y mwyafrif ohonynt effeithlonrwydd clinigol, a dim ond ychydig o gyfansoddion sy'n cael eu defnyddio ar hyn o bryd mewn cynhyrchion dermatolegol amserol (Chang, 2009; Kim ac Uyama, 2005; Rescigno et al., 2002 ). Ymhlith y rheini, asid kojic, hydroquinone, ac arbutin yw'r rhai mwyaf cyffredin (Solano et al., 2006).

Mae effeithlonrwydd clinigol anfoddhaol atalyddion tyrosinase a ddefnyddir ar hyn o bryd yn fawr oherwydd bod y cyfansoddion hynny wedi'u profi gan ddefnyddio tyrosinase yn unig wedi'i ynysu o'r madarch Agaricus bisporus (mTyr) (Espin et al., 2000; Garcia-Molina et al., 2005), sef yr unig un tyrosinase gweithredol ar gael yn rhwydd yn fasnachol. Mae gweithgareddau catalytig a phenodoldeb swbstrad mTyr yn sylweddol wahanol i'r ensym mamalaidd (Hearing et al., 1980). Cafodd strwythurau tri dimensiwn sawl tyrosinases eu datrys yn ddiweddar, yn eu plith strwythurau mTyr (Ismaya et al., 2011) a dau ensym bacteriol o Streptomyces castaneoglobisporus (Matoba et al., 2006) a Bacillus megaterium (Sendovski et al. , 2011). Mewn cyferbyniad, ychydig iawn o wybodaeth cinetig neu adeileddol sydd ar gael ar gyfer tyrosinase dynol (hTyr), yn bennaf oherwydd yr anawsterau sylweddol i gael symiau digonol o hTyr o ffynonellau naturiol neu drwy fynegiant heterologaidd. Mae hTyr wedi’i fynegi’n fyrhoedlog mewn amrywiol linellau celloedd anifeiliaid (Olivares et al., 2002; Schweikardt et al., 2007; Tripathi et al., 1992; Wendt, 2006), ond roedd y cnwd bob amser yn rhy isel ar gyfer disgrifiad manwl o’r canlyniad. paratoadau hTyr. Yn fwy diweddar, mae sawl grŵp wedi datblygu systemau mynegiant mwy effeithlon ar gyfer hTyr (Cordes et al., 2013; Fogal et al., 2015; Lai et al., 2016), ond mae data ar strwythur tri dimensiwn hTyr neu ddata cinetig o Roedd atalyddion hTyr yn dal ar goll.

CANLYNIADAU

Atal hTyr

A screen of 50,000 compounds in the library, which spans a wide chemical space, yielded several hit series of active and effective hTyr inhibitors. Among them, derivatives of thiazolyl-resorcinol were the most promising group. This lead compound was then optimized to develop derivatives with high activity and physicochemical properties compatible with topical formulations. Thiamidol (isobutyl amido thiazolyl resorcinol, compound 1) (Figure 1) was identified as one of the most potent derivatives. In addition to Thiamidol, 4-butyl resorcinol (compound 2) and the classical tyrosinase inhibitors kojic acid (compound 5), hydroquinone (compound 6), and arbutin (compound 7), as well as rhododendron (compound 9), were also tested as inhibitors of the diphenols (L-dopa oxidase) activity of hTyr over a wide range of concentrations (up to 4 orders of magnitude). The results are summarized in Figure 2a and Table 1. Among these actives, Thiamidol was by far the most efficient inhibitor of hTyr, with a half-maximal inhibitory concentration (IC50) of 1.1 mmol/L, with almost complete enzyme inhibition of hTyr occurring at concentrations above 10 mmol/L. The resorcinol derivatives 4-butylresorcinol, 4-hexylresorcinol, and 4-phenylethylresorcinol had IC50 values of 21mmol/L, 94mmol/L, and 131 mmol/L, respectively (Table 1). With an IC50 of about 500 mmol/L, kojic acid was 500 times less potent than Thiamidol. Hydroquinone and arbutin were both very poor inhibitors of hTyr, with IC50 values in the millimolar range. Kojic acid, arbutin, and hydroquinone were not able to completely inhibit hTyr in the concentration range tested. Racemic rhododendron was also rather ineffective as an inhibitor of L-dopa oxidation, with an IC50 >1,200 mmol/L (Ffigur 2a).

Roedd dadansoddiad cinetig manwl o ataliad hTyr gan Thiamidol wedi esgor ar fath hollol gystadleuol o ataliad gyda chysonyn atalydd (Ki) o 0.25 mmol/L (Ffigur 2b, Tabl 1). Mae'r gwerth hwn yn cyd-fynd â'r gwerth IC50 a amcangyfrifwyd o gromliniau dos-ymateb (1.1 mmol/L) (gweler Ffigur 2a) a ddylai, ar gyfer ataliad cystadleuol, fod tua 3 gwaith yn uwch na'r Ki. Roedd y gwerthoedd Ki ar gyfer 4-butyl resorcinol (9 mmol/L), 4-hexylresorcinol (39 mmol/L), a 4- ffenylethylresorcinol (24 mmol/L) hefyd yn sylweddol uwch na'r Ki gwerth Thiamidol (Tabl 1). Mae'r data hyn yn dangos bod y moiety thiazolyl amide o Thiamidol yn cyfleu ataliad llawer gwell o hTyr na'r cadwyni ochr hydrocarbon sy'n bresennol mewn tri deilliad arall o resorcinol (4-butyl-, 4-hexyl-, a {{). 21}}phenyl resorcinol ethyl). Fel y nodwyd, mae'r effeithiolrwydd yn wahanol iawn yn mTyr, lle mae 4-butyl resorcinol, 4-hexylresorcinol, a 4-phenylethylresorcinol, a hyd yn oed asid kojic, yn well na Thiamidol o ran atal yr ensym (Tabl). 1). Felly, ni fyddai Thiamidol wedi'i nodi'n bositif mewn sgrinio gan ddefnyddio mTyr, a byddai effeithiolrwydd 4-phenylethylresorcinol wedi'i oramcangyfrif yn fawr.

Roedd Garcia-Jimenez et al. (2016) yn ddiweddar bod mTyr yn ocsideiddio rhai resorcinolau yn araf, ar yr amod bod ffurf met-gyffredinol yr ensym yn cael ei drawsnewid yn flaenorol i naill ai'r ffurf ocsi neu ddiocsiwm gan ychwanegion fel H2O2 ac ascorbate a bod yr adwaith yn cael ei gynnal gan o-diphenols . Felly, defnyddiwyd dadansoddiad cromatograffaeth hylif perfformiad uchel meintiol (Ito a Wakamatsu, 2015) i ganfod a allai Thiamidol fod yn is-haen o hTyr hefyd. Yn ein hamodau assay arferol (hy, yn absenoldeb yr ychwanegion a grybwyllwyd gan Garcia-Jimenez et al., 2016), ni ddigwyddodd unrhyw ocsidiad canfyddadwy o Thiamidol o fewn sawl awr i ddeoriad â hTyr, tra bod rhododendron wedi'i ocsidio'n rhwydd o fewn y cyfnod hwnnw. (gweler Ffigur Atodol S1 ar-lein). Felly, tybiwn fod yr adwaith a ddisgrifiwyd gan Garcia-Jimenez et al. ddim yn berthnasol i Thiamidol a hTyr mewn cyflyrau ffisiolegol.

Atal cynhyrchu melanin

Yna gwnaethom brofi effeithiau ataliol posibl y cyfansoddion hyn gan ddefnyddio model tri dimensiwn ar gyfer croen dynol. Fel y gwelwyd gyda hTyr wedi'i buro, dim ond ychydig iawn o effeithiolrwydd a ddangosodd arbutin wrth atal cynhyrchu melanin ym modelau croen MelanoDerm (MatTek Corporation, Ashland, MA) (IC5{0> 4,000 mmol/L) (Ffigur 2c) . Roedd asid Kojic yn atal cynhyrchu melanin gydag IC50 o w400 mmol/L, gan ddangos cromlin ymateb dos syfrdanol o serth, gyda chrynodiadau o dan 200 mmol/L dim ond ychydig yn atal cynhyrchu melanin (hy, 5 y cant ar 150 mmol/L). Dim ond effeithiau ymylol ar felanogenesis a ddangosodd rhododendron, gydag IC50 ymddangosiadol ar gyfer ataliad o w1,200 mmol/L. Roedd hydroquinone yn atal cynhyrchu melanin mewn modelau croen MelanoDerm gydag IC50 o 15 mmol / L, gan awgrymu bod ganddo fecanwaith heblaw ataliad tyrosinase. 4-Rhwystrodd Butylresorcinol synthesis melanin ag IC50 o 13.5 mmol/L. Unwaith eto, Thiamidol oedd, o bell ffordd, yr atalydd mwyaf grymus o gynhyrchu melanin mewn modelau croen MelanoDerm, gydag IC50 o 0.9 mmol/L, ac mewn diwylliannau monolayer, roedd Thiamidol yn amlwg yn lleihau ffurfiant melanin (Ffigur 3a).

Yna profwyd Hydroquinone a Thiamidol mewn diwylliannau monolayer melanocyte hirdymor i wirio gwrthdroadwyedd posibl ataliad. Er bod 1 mmol / L Thiamidol wedi lleihau cynhyrchiant melanin i lai na 60 y cant ar ôl pythefnos, gostyngodd hydroquinone 1 mmol / L gynhyrchu melanin i tua 85 y cant yn unig (Ffigur 3b). Fodd bynnag, ar ôl eu tyfu ymhellach heb y cyfansoddion gweithredol, fe wnaeth melanocytes a oedd wedi'u rhwystro gan Thiamidol ailgychwyn eu cynhyrchiad melanin yn gyflym, gan gyrraedd lefelau rhag-driniaeth o fewn wythnos. Mewn cyferbyniad, ni wnaeth celloedd wedi'u trin â hydroquinone adennill eu gallu llawn ar gyfer cynhyrchu melanin o fewn y 2-cyfnod diwylliant wythnos, a pharhaodd cynhyrchu melanin ar 85 y cant o lefelau rhag-driniaeth.

Modelu moleciwlaidd

Archwiliwyd moddau rhwymo posibl Thiamidol i hTyr gan astudiaethau docio rhithwir. Mae Ffigur 4a yn dangos safle gweithredol y model homoleg o hTyr yn y ffurf fet, gyda ligand Thiamidol wedi'i docio mewn cydffurfiad ynni isaf. Mae'r ganolfan deu-copr gyda'r ocsigen pontio i'w weld ar y chwith. Dim ond gweddillion asid amino yn union gerllaw'r atalydd rhwym sy'n cael eu dangos. (Mae rhifo gweddillion yn cynnwys y peptid signal). Mae arwyneb mewnol y poced rhwymo wedi'i liwio yn ôl hydroffobigrwydd ar raddfa o las ar gyfer hydroffilig i frown ar gyfer hydroffobig. Er bod amgylchedd y ganolfan deu-copr yn amlwg yn hydroffilig, mae is-boced hydroffobig cryf yn cael ei ffurfio yn bennaf gan gadwyni ochr I368, V377, a F347. Yn y cyfeiriadedd gofodol a ddangosir, mae'r 1-grŵp hydrocsi o gylch aromatig y ligand yn gwneud cysylltiadau helaeth â'r ganolfan deu-copr, ac mae'r 3-grŵp hydrocsi yn ymwneud â bondiau hydrogen â'r gadwyn ochr o S380 a carbonyl asgwrn cefn M374. Mae'r cylch thiazolyl yn cael ei ddal yn ei le gan ryngweithiadau hydroffobig â'r boced anpolar (Ffigur 4b), a ffurfiwyd gan gadwyni ochr o asidau amino, y rhan fwyaf ohonynt yn amrywio rhwng mTyr a hTyr (Ffigur 4c).

Cafwyd canlyniadau cymaradwy pan gafodd Thiamidol ei docio i strwythur pelydr-x a gyhoeddwyd yn ddiweddar o'r TRP1 tebyg yn strwythurol, ensym melanogenig sy'n cynnwys Zn2þ nad yw'n gallu gweithio eto mewn bodau dynol (Ghanem a Fabrice, 2011; Lai et al., 2017), gan awgrymu bod yr ensym TYRP1 yn cael ei atal gan Thiamidol hefyd (gweler Ffigur Atodol S2 ar-lein).

Astudiaethau clinigol

Yna archwiliwyd effeithiolrwydd in vivo Thiamidol mewn astudiaethau clinigol lle roedd pobl oedrannus yn trin smotiau oedran ar eu croen ddwywaith y dydd gyda fformiwla yn cynnwys {{0}}.2 y cant Thiamidol neu gyda'r cerbyd yn unig fel rheolydd. Eisoes ar ôl 4 wythnos o driniaeth, roedd y mannau oedran a gafodd eu trin yn sylweddol ysgafnach na'r smotiau oedran rheoli heb eu trin (Ffigur 5a). Parhaodd y gwelliant dros y cyfnod triniaeth cyfan, ac ar ôl 12 wythnos roedd rhai o'r smotiau oedran yn anwahanadwy oddi wrth y croen sydd â phigmenten arferol o'i amgylch (Ffigur 5b). Dangosodd ffotograffau EpiFlash (Canfifield Scientifific Inc., Parsippany, NJ) welliant gweladwy yn ymddangosiad smotiau oedran, ac nid oedd y mannau rheoli oedran rheoli heb eu trin wedi newid (heb ei ddangos). Dangosodd astudiaeth ddilynol fod crynodiadau o Thiamidol mor isel â 0.1 y cant i bob pwrpas yn lleihau gwelededd mannau oedran (gweler Ffigur Atodol S3 ar-lein).

TRAFODAETH

Y ffordd fwyaf diogel a mwyaf effeithiol o drin hyperbigmentation croenol yw lleihau cynhyrchiant melanin trwy atal gweithgaredd tyrosinase. Fodd bynnag, nid oes gan y mwyafrif o atalyddion tyrosinase a ddisgrifir yn y llenyddiaeth effeithlonrwydd clinigol pan gânt eu hymgorffori mewn cynhyrchion amserol. Profwyd bron pob un ohonynt yn erbyn mTyr yn unig (Espin et al., 2000; Garcia-Molina et al., 2005) ac felly, er eu bod yn effeithiol yn erbyn mTyr, trodd allan yn atalyddion gwael o hTyr. Nid yw mTyr sydd ar gael yn fasnachol yn baratoad homogenaidd ond yn hytrach mae'n gymysgedd o sawl isoensym tyrosinase a symiau bach o weithgareddau ensymau ychwanegol a allai effeithio ar astudiaethau ataliad mewn ffyrdd anrhagweladwy (Pretzler et al., 2017). Mae gan isoensymau AbPPO3 ac AbPPO4, sef prif gydrannau mTyr sydd ar gael yn fasnachol, ddilyniannau asid amino yn rhanbarth y safle actif sy'n sylweddol wahanol i hTyr (Ffigur 4c). Mae'r ddau isoensym mTyr yn cynnwys dolenni ychwanegol rhwng Asn371 (un o safleoedd glycosyleiddiad hTyr) a Gly372. Nid yw nifer o'r gweddillion sy'n rhyngweithio â Thiamidol yn hTyr (cf. Ffigur 4b) wedi'u cadw yn mTyr, er enghraifft, Ile368, Ser375, a Ser380. Mae Phe207 yn cael ei warchod yn strwythurol yn mTyr, ond nid yw Phe347. Oherwydd y gallai hyd yn oed newidiadau bach mewn rhyngweithiadau ensymau-ligand gael effeithiau dramatig ar gysylltiadau rhwymo, ni ddaeth proffiliau ataliad amrywiol hTyr a mTyr (a grynhoir yn Nhabl 1) yn syndod.

Prif amcan yr astudiaeth hon oedd cymharu effeithiau arbutin, hydroquinone, ac asid kojic â gwahanol ddeilliadau resorcinol ar swyddogaeth catalytig hTyr ac ar gynhyrchu melanin in vivo. Ac eithrio Thiamidol, mae'r holl sylweddau a brofwyd wedi'u disgrifio fel atalyddion tyrosinase (Kim et al., 2012); fodd bynnag, mae eu gweithgareddau ataliol yr adroddir amdanynt yn hynod wahanol. Yn y llenyddiaeth feddygol, ystyrir hydroquinone fel y safon maen prawf ar gyfer trin hyperpigmentation croen, er bod pryderon difrifol ynghylch ei ddiogelwch. Mae hydroquinone wedi'i wahardd yn yr Undeb Ewropeaidd rhag ei ​​ddefnyddio mewn colur, ond mae'n dal i gael ei werthu yn yr Unol Daleithiau fel cyffur dros y cownter mewn fformwleiddiadau sy'n cynnwys hyd at 2 y cant o hydroquinone. Yn ddiweddar, mynegodd Gweinyddiaeth Bwyd a Chyffuriau yr Unol Daleithiau (2006) bryder am hydroquinone; fodd bynnag, mae dyfarniad terfynol yn yr arfaeth o hyd. Mae'r gwerthoedd IC50 cyhoeddedig ar gyfer ataliad hydroquinone o mTyr yn cwmpasu ystod o 1.1 mmol/L (Kang et al., 2003) i 680 mmol/L (Abu Ubeid et al., 2009). Yn ein dadansoddiad, roedd hydroquinone yn hynod aneffeithiol yn erbyn hTyr, gan ei atal ychydig yn unig, gan gyrraedd ataliad o 50 y cant yn unig ar oddeutu 4,000 mmol/L. Er bod hydroquinone wedi'i ystyried yn atalydd tyrosinase ers y 1990au cynnar (Palumbo et al., 1991), mae ein canlyniadau'n awgrymu bod ei briodweddau sytotocsig yn bwysicach, nid yn unig am ei effeithiau andwyol ar felanocytes ond hefyd am ei effeithiolrwydd fel atalydd melanogenesis (Jimbow et al., 1974; Penney et al., 1984; Smith et al., 1988). Mae'r farn hon yn cael ei chadarnhau nid yn unig gan ein canlyniadau gyda hTyr a'r ffaith bod hydroquinone wedi lleihau cynhyrchiant melanin yn sylweddol mewn modelau croen ond hefyd gan ein harbrofion gyda diwylliannau melanocyte. Yma, gostyngodd hydroquinone gynhyrchu melanin, ond nid oedd y celloedd wedi'u trin yn adennill y gallu llawn i gynhyrchu melanin ar ôl tynnu'r gweithredol.

Although arbutin is generally considered an effective tyrosinase inhibitor, the published IC50 values of arbutin for mTyr range from 40 mmol/L (Ying et al., 1999) to more than 30,000 mmol/L (Sugimoto et al., 2005). In our test system, we found very high IC50 values (>4,000 mmol/L) ar gyfer arbutin gyda model croen hTyr wedi'i buro a'r model MelanoDerm. Mae data ar effeithiolrwydd a-arbutin a b-arbutin wedi'u cyhoeddi (Garcia-Jimenez et al., 2017). Fodd bynnag, mae'r ddau gyfansoddyn yn pro-gyffuriau hydroquinone, gyda'u gweithgaredd biolegol yn dibynnu ar ryddhau hydroquinone o'r moleciwl (Briganti et al., 2003). Cyhoeddodd Pwyllgor Gwyddonol yr Undeb Ewropeaidd ar Gynhyrchion Defnyddwyr (2008) farn feirniadol ar arbutin. O ystyried rhyddhau hydroquinone o'r moleciwl, mae'n ystyried bod y defnydd o arbutin mewn cynhyrchion cosmetig yn anniogel.

Mae'r gwerthoedd IC50 cyhoeddedig ar gyfer ataliad tyrosinase gan asid kojic yn amrywio o 6 mmol/L (Curto et al., 1999) i fwy na 100 mmol/L (Jeon et al., 2005). Fel atalydd hTyr, mae asid kojic yn llawer llai effeithlon, gydag IC50 o tua 500 mmol/L. Mae asid Kojic yn arddangos math cymysg o ataliad, gyda Ki o 145 mmol/L, sy'n nodi ei fod yn clymu i ffurf deoxy tyrosinase (Sun et al., 2014). Pan gaiff ei ddefnyddio i drin y model MelanoDerm, mae asid kojic yn dangos cromlin ymateb dos eithriadol o serth, gydag ataliad cymharol yn cynyddu o 5 y cant ar 150 mmol/L i ataliad mwy na 75 y cant ar 900 mmol/L (gweler Ffigur 2c). Efallai mai'r ffaith hon yw'r prif reswm dros effeithlonrwydd cyfyngedig iawn asid kojic in vivo. O ran diogelwch asid kojic, mae'r Pwyllgor Gwyddonol Ewropeaidd ar Ddiogelwch Defnyddwyr (2012) bellach yn ystyried bod asid kojic mewn crynodiadau hyd at 1.0 y cant yn ddiogel ar gyfer cynhyrchion cosmetig pan gaiff ei gymhwyso i groen iach, barn a rennir gan y Panel Arbenigol Adolygu Cynhwysion Cosmetig ( Burnett et al., 2010).

Rhoddwyd statws lled-gyffuriau i Rhododendron yn Japan yn 2008 ac fe'i defnyddiwyd fel cynhwysyn gwynnu mewn cynhyrchion cosmetig. Tybiwyd ei fod yn atalydd cystadleuol tyrosinase. Fodd bynnag, yn 2013, cafodd cynhyrchion sy'n cynnwys rhododendron eu galw'n ôl mewn 10 gwlad yn Asia pan ddatblygodd yn agos at 20,000 o ddefnyddwyr leukoderma ar ôl defnyddio'r cynhyrchion. Dangoswyd bod rhododendron nid yn unig yn atalydd ond hefyd yn swbstrad i hTyr (Ito et al., 2014a) a mTyr (Ito et al., 2014b). Gall y casgliad o straen reticwlwm endoplasmig sy'n ddibynnol ar dyrosinase a/neu actifadu'r llwybr apoptotig gyfrannu at sytowenwyndra melanocyte rhododendron (Sasaki et al., 2014).

Mae'r 4-motiff resorcinol a amnewidiwyd wedi cael ei adnabod ers peth amser fel moiety cemegol effeithlon sy'n atal tyrosinase (Khatib et al., 2005). Mae llawer o gyfansoddion naturiol sydd wedi'u nodi fel cyfryngau gwynnu, yn bennaf flavonoidau, yn cynnwys y motiff hwn (Shimizu et al., 2000, 2011). Oherwydd bod bio-argaeledd flavonoidau yn gyffredinol isel, ein nod oedd nodi deilliadau resorcinol gyda gwell effeithiolrwydd a bioargaeledd. 4-Roedd Butylresorcinol eisoes wedi'i nodi fel atalydd llygoden a thyrosinase dynol (Kim et al., 2005; Kolbe et al., 2013) ac o weithgaredd asid carbocsilig indole dihydroxy oxidase llygoden TYRP1 (Katagiri et al. , 2001), ac mae ar gael yn fasnachol ar gyfer triniaeth feddygol a chosmetig o orbigmentiad (Bohnsack et al., 2012; Jimenez a Garcia-Carmona, 1997; Kim et al., 2005). Serch hynny, roedd data cinetig manwl o 4-butyl resorcinol yn dal ar goll. Yn yr assay hTyr, canfuwyd math hollol gystadleuol o ataliad gan 4-butyl resorcinol gyda Ki o 9.1 mmol/L, sydd mewn cytundeb ardderchog â'r gwerth IC50 a bennwyd (Tabl 1).

Yn ein harbrofion in vitro, Thiamidol, gydag IC50 o 1.1 mmol/L yn yr assay ensym hTyr a 0.9 mmol/L yn y model croen MelanoDerm, oedd y mwyaf effeithiol o bell ffordd o’r holl sylweddau a brofwyd. Cadarnhaodd arbrofion pellach fod Thiamidol yn atalydd cystadleuol iawn (Ffigur 2b) ac nid yn swbstrad ar gyfer tyrosinase (gweler Ffigur Atodol S1), ac, felly, nid yw Thiamidol yn cael ei drawsnewid yn quinone gwenwynig a allai achosi leukoderma. Felly, dewiswyd Thiamidol ar gyfer astudiaethau clinigol i asesu ei effeithiolrwydd in vivo. Dangosodd astudiaeth o Thiamidol gan ddefnyddio taenwr sbot welliant parhaus yn ymddangosiad smotiau oedran dros y 12-cyfnod triniaeth cyfan, gan gyrraedd arwyddocâd ystadegol mor gynnar â 4 wythnos. Mae'r canlyniadau hyn yn dangos effeithiolrwydd cryf i leihau pigment y cynnyrch prawf Thiamidol a budd clinigol clir wrth reoli gorbigmentu croen.

DEUNYDDIAU A DULLIAU

Tyrosinase dynol

Mynegwyd ffurf wedi'i chwtogi â'i dag o hTyr (hTyr-DHis) sy'n cynnwys parth catalytig hTyr yng nghelloedd HEK 293 a'i buro gan gromatograffaeth affinedd metel ar Ni2þ-Sepharose (GE Healthcare, Munich, yr Almaen) fel y disgrifir mewn man arall ( Cordes et al., 2013). Roedd gan y paratoad dilynol yr un nodweddion catalytig â hTyr gwyllt.

Ffynonellau atalyddion

O lyfrgell gyfansawdd Evotec (Evotec, Hamburg, yr Almaen), dewiswyd 50,000 o gyfansoddion, yn gorchuddio gofod cemegol eang, i gynnal HTS ar gyfer atalyddion hTyr, a aseswyd gan ddefnyddio'r assay Tyr a ddisgrifir yn yr adran nesaf. Yna cafodd deilliadau o gyfansoddion plwm addawol eu syntheseiddio ar gyfer optimeiddio pellach. Prynwyd yr atalyddion eraill gan gyflenwyr amrywiol (gweler Deunyddiau Atodol ar-lein am fanylion).

Assay tyrosine a gweithdrefn HTS

Mae manylion llawn y gweithgaredd L-dopa oxidase a'r gweithdrefnau sgrinio HTS a ddefnyddiwyd i'w gweld yn y Deunyddiau Atodol.

Modelu moleciwlaidd

Yn silico roedd tocio yn seiliedig ar fodel homoleg newydd o hTyr, a ddisgrifir mewn man arall (Mann et al., 2017). Perfformiwyd yr efelychiadau gan ddefnyddio Molegro Virtual Docker (Molegro, Aarhus, Denmarc). Defnyddiwyd Discovery Studio Visualizer 4.0 (Accelrys, San Diego, CA) ar gyfer dadansoddi a chyflwyno data gweledol. Cymerwyd y dilyniannau o gronfa ddata UniProt (UniProt Consortium, 2017).

Profion model croen

Ceir manylion llawn meinweoedd MelanoDerm a ddefnyddir fel model croen a maint n eu cynnwys melanin yn y Deunyddiau Atodol.

Diwylliannau melanocyte

Ceir manylion llawn am ddiwylliannau melanocyte a meintioli eu cynnwys melanin yn y Deunyddiau Atodol.

Astudiaethau clinigol

Cynhaliwyd dwy astudiaeth in vivo ar hap (wedi'u dallu ar gyfer y cynhyrchion prawf, yn agored ar gyfer y rheolaeth heb ei drin). Cofrestrodd un astudiaeth 18 pwnc benywaidd (56e71 oed), gyda 17 pwnc yn cwblhau'r astudiaeth. Perfformiwyd yr ail astudiaeth gyda 19 pwnc (18 benyw, 1 gwryw; 58e7{{10}} oed), gyda phob un o’r 19 pwnc yn cwblhau’r astudiaeth. Cymhwysodd pob pwnc ddau fformiwleiddiad gwahanol ddwywaith y dydd i smotiau oedran ar eu blaenau volar gan ddefnyddio taenwr sbot. Roedd y fformwleiddiadau'n wahanol yn y cynhwysyn gweithredol yn unig: 0.2 y cant Thiamidol yn erbyn cerbyd yn yr astudiaeth gyntaf, a 0.1 y cant Thiamidol yn erbyn cerbyd yn yr ail astudiaeth. Cafodd un smotyn oedran fesul pwnc ei drin â fformiwla yn cynnwys y cynhwysyn gweithredol, a chafodd man rheoli ei drin â'r cerbyd yn unig. Dadansoddwyd pigmentiad y smotiau oedran fel y disgrifir yn y Deunyddiau Atodol. Cynhaliwyd yr astudiaethau in vivo yn unol ag argymhellion y fersiwn gyfredol o Ddatganiad Helsinki a chanllawiau'r Gynhadledd Ryngwladol ar Gysoni Arfer Clinigol Da. Darparodd pawb a gymerodd ran yn yr astudiaethau hyn ganiatâd gwybodus ysgrifenedig. Yn ogystal, cymeradwywyd a chliriwyd yr astudiaethau gan fwrdd adolygu sefydliadol Beiersdorf AG (Hamburg, yr Almaen).

GWRTHDARO DIDDORDEB

DEUNYDD ATODOL

Mae deunydd atodol yn gysylltiedig â fersiwn ar-lein y papur.

CYFEIRIADAU

1.Abu Ubeid A, Zhao L, Wang Y, Hantash BM. Oligopeptidau dilyniant byr gyda gweithgaredd ataliol yn erbyn madarch a thyrosinase dynol. J Invest Dermatol 2009; 129: 2242e9.

2. Bohnsack K, Koop U, Hiddemann S, Kolbe L, Rippke F. Pigmentation yn lleihau effeithiolrwydd a goddefgarwch chwe fformiwleiddiad gofal wyneb newydd sy'n cynnwys 4-n-butyl resorcinol, poster no. P864. Poster a gyflwynwyd yn 21ain Cyngres EADV, Medi 27-30, 2012; Prague, Gweriniaeth Tsiec.

3. Briganti S, Camera E, Picardo M. Dulliau cemegol ac offerynnol i drin hyperpigmentation. Celloedd Pigment Res 2003; 16:101e10.

4. Burnett CL, Bergfeld WF, Belsito DV, Hill RA, CD Klaassen, Liebler DC, et al. Adroddiad terfynol ar asesiad diogelwch asid Kojic fel y'i defnyddir mewn colur. Int J Toxicol 2010; 29(6 Cyflenwad). 244Se73.

5. Chang TS. Adolygiad wedi'i ddiweddaru o atalyddion tyrosinase. Int J Mol Sci 2009; 10: 2440e75.

6. Chen QX, Ke LN, Song KK, Huang H, Liu XD. Effeithiau ataliol hexylresorcinol a dodecyl resorcinol ar madarch (Agaricus bisporus) tyrosinase. Protein J 2004; 23:135e41.

7. Cordes P, Haul W, Wolber R, Kolbe L, Klebe G, Ro¨hm KH. Mynegiant mewn systemau nad ydynt yn felanogenig a phuro amrywiadau hydawdd o tyrosinase dynol. Biol Chem 2013; 394:685e93.

8. Curto EV, Kwong C, Hermersdo¨rfer H, Glatt H, Santis C, Virador V, et al. Atalyddion melanocyte tyrosinase mamalaidd: cymariaethau in vitro o esterau alcyl asid gentisig ag atalyddion tybiedig eraill. Biochem Pharmacol 1999; 57:663e72.

9. Espin JC, Varon R, Fenoll LG, Gilabert MA, Garcia-Ruiz PA, Tudela J, et al. Nodweddiad cinetig o benodolrwydd swbstrad a mecanwaith tyrosinase madarch. Eur J Biochem 2000; 267: 1270e9.

10. Fogal S, Carotti M, Giaretta L, Lanciai F, Nogara L, Bubacco L, Bergantino E. Tyrosinase dynol a gynhyrchir mewn celloedd pryfed: tirnod ar gyfer sgrinio cyffuriau newydd yn mynd i'r afael â'i weithgaredd. Mol Biotechnol 2015;57:45e57.

11. Garcia-Jimenez A, Teruel-Puche JA, Berna J, Rodriguez-Lopez JN, Tudela J, Garcia-Canovas F. Gweithredu tyrosinase ar alffa a beta-arbutin: Astudiaeth cinetig. PLoS Un 2017;12:e0177330.

12. Garcia-Jimenez A, Teruel-Puche JA, Berna J, Rodriguez-Lopez JN, Tudela J, Garcia-Ruiz PA, Garcia-Canovas F. Nodweddu gweithred tyrosinase ar resorcinols. Bioorg Med Chem 2016; 24:4434e43.

13. Garcia-Molina F, Hiner AN, Fenoll LG, Rodriguez-Lopez JN, Garcia-Ruiz PA, Garcia-Canovas F, et al. Tyrosinase madarch: gweithgaredd catalas, ataliad, a diffyg actifadu hunanladdiad. J Cemegydd Bwyd Amaeth 2005; 53:3702e9.

14. Ghanem G, Fabrice J. Protein 1 sy'n gysylltiedig â Tyrosinase (tyrp1/gp75) mewn melanoma croenol dynol. Mol Oncol 2011; 5:150e5.

15. Clywed VJ Jr, Ekel TM, Montague PM, Nicholson JM. tyrosinase mamalaidd. Stoichiometry a mesur cynhyrchion adwaith. Deddf Bioffys Biochim 1980; 611:251e68.

16. Ismaya WT, Rozeboom HJ, Weijn A, Mes JJ, Fusetti F, Wichers HJ, Dijkstra BW. Strwythur grisial tyrosinase madarch Agaricus bisporus: hunaniaeth yr is-unedau tetramer a'r rhyngweithio â tropolone. Biocemeg 2011; 50:5477e86.

17. Ito S, Gerwat W, Kolbe L, Yamashita T, Ojika M, Wakamatsu K. Gall tyrosinase dynol ocsideiddio'r ddau enantiomers o rhododendron. Res Melanoma Cell Pigment 2014a; 27:1149e53.

18. Ito S, Ojika M, Yamashita T, Wakamatsu K. Mae ocsidiad rhododendron wedi'i gataleiddio â thyrosinase yn cynhyrchu 2-methylchromane-6,7-dione, y metabolyn gwenwynig terfynol tybiedig: goblygiadau ar gyfer gwenwyndra melanocyte . Res Melanoma Cell Pigment 2014b; 27:744e53.

19. Ito S, Wakamatsu K. Dull sgrinio cyfleus i wahaniaethu rhwng atalyddion tyrosinase gwynnu croen ffenolig rhag ffenolau sy'n achosi leukoderma. J Dermatol Sci 2015; 80:18e24.

20. Jeon SH, Kim KH, Koh JU, Kong KH. Effeithiau ataliol ocsidiad l-Dopa tyrosinase gan asiantau gwynnu croen. Cymdeithas Cemeg Bull Corea 2005; 26:1135e7.

21. Jimbow K, Obata H, Pathak MA, Fitzpatrick TB. Mecanwaith depigmentation gan hydroquinone. J Invest Dermatol 1974; 62:436e49.

22. Jimenez M, Garcia-Carmona F. 4-amnewidiodd resorcinols (dewisiadau amgen sylffit) fel atalyddion rhwymol araf o weithgaredd catecholase tyrosinase. J Cemegydd Bwyd Agric 1997; 45:2061e5.

23. Kang HH, Rho HS, Hwang JS, Oh SG. Gweithgarwch dadbigmentu a sytowenwyndra isel o bensoadau alcoxy neu sinamate alcoxy mewn melanocytes diwylliedig. Tarw Pharm Chem (Tokyo) 2003; 51:1085e8.

24. Kanteev M, Goldfeder M, Fishman A. Cydberthynas strwythur-swyddogaeth mewn tyrosinases. Prot Sci 2015; 24:1360e9.

25. Katagiri T, Okubo T, Oyobikawa M, Futaki K, Shaku M, Kawai M, et al. Gweithred ataliol 4-n-butyl resorcinol ar felanogenesis a'i effaith gwynnu croen. J Soc Cosmet Chem Jpn 2001; 35:42e9.

26. Khatib S, Nerya O, Musa R, Shmuel M, Tamir S, Vaya J. Chalcones fel atalyddion tyrosinase cryf: pwysigrwydd 2,4-miety resorcinol amnewidiol. Bioorg Med Chem 2005; 13:433e41.

27. Kim DS, Kim SY, Park SH, Choi YG, Kwon SB, Kim MK, et al. Effeithiau ataliol 4-n-butyl resorcinol ar weithgaredd tyrosinase a synthesis melanin. Tarw Pharm Biol 2005; 28:2216e9.

28. Kim H, Choi HR, Kim DS, Parc KC. Asiantau hypopigmented amserol ar gyfer anhwylderau pigmentaidd a'u mecanweithiau gweithredu. Ann Dermatol 2012; 24:1e6.

29. Kim YJ, atalyddion Uyama H. ​​Tyrosinase o ffynonellau naturiol a synthetig, strwythur, mecanwaith atal a phersbectif ar gyfer y dyfodol. Cell Mol Life Sci 2005; 62:1707e23.

30. Kolbe L, Mann T, Gerwat W, Batzer J, Ahlheit S, Scherner C, et al. 4-n-butyl resorcinol, atalydd tyrosinase hynod effeithiol ar gyfer triniaeth argroenol o orbigmentiad. J Eur Acad Dermatol Venereol 2013;27:19e23.

31. Lai X, Soler-Lopez M, Wichers HJ, Dijkstra BW. Mynegiant ailgyfunol ar raddfa fawr a phuro tyrosinase dynol sy'n addas ar gyfer astudiaethau strwythurol. PLoS Un 2016;11:e0161697. 32. Lai X, Wichers HJ, Soler-Lopez M, Dijkstra BW. Mae strwythur protein dynol sy'n gysylltiedig â tyrosinase 1 yn datgelu safle gweithredol sinc binuclear sy'n bwysig ar gyfer melanogenesis. Angew Chem Int Ed Engl 2017; 56:9812e5.

33. Lee SY, Baek N, Nam TG. Atalyddion tyrosinase naturiol, lledsynthetig a synthetig. J Ensym Inhib Med Chem 2014; 31:1e13.

34. Mann T, Gerwat W, Wenck H, Ro¨hm KH, Kolbe L. Isobutylamido thiazolyl resorcinol atalydd pwerus newydd o tyrosinase dynol. Melanoma Cell Pigment Res 2017:e85.

35. Matoba Y, Kumagai T, Yamamoto A, Yoshitsu H, Sugiyama M. Tystiolaeth grisialogaidd bod canolfan gopr dinuclear tyrosinase yn hyblyg FL yn ystod catalysis. J Biol Chem 2006; 281:8981e90.

35. Nesterov A, Zhao J, Minter D, Hertel C, Ma W, Abeysinghe P, et al. 1-(2,{3}} dihydroxy ffenyl)-3-(2,4-dimethoxy-3-methyl phenyl)propan, atalydd tyrosinase newydd ag effeithiau debigmentu cryf. Tarw Pharm Chem (Tokyo) 2008; 56:1292e6.

36. Olivares C, Garcia-Borron JC, Solano F. Nodi gweddillion safle gweithredol sy'n ymwneud â rhwymo cofactor metel a chydnabod swbstrad stereospecific mewn tyrosinase mamalaidd. Goblygiadau i'r cylch catalytig. Biocemeg 2002; 41:679e86.

37. Palumbo A, d'Ischia M, Misuraca G, Prota G. Mecanwaith atal melanogenesis gan hydroquinone. Deddf Bioffys Biochim 1991; 1073:85e90.

38. Penney KB, Smith CJ, Allen JC. Mae gweithredu debigmentu hydroquinone yn dibynnu ar amhariad ar brosesau celloedd sylfaenol. J Invest Dermatol 1984; 82:308e10.

39. Pretzler M, Bijelic A, Rompel A. Mynegiant heterologaidd a nodweddu tyrosinase madarch swyddogaethol (AbPPO4). Cynrychiolydd Gwyddonol 2017; 7: 1810.

40. Ramsden CA, Riley PA. Tyrosinase: pedwar cyflwr ocsidiad y safle actif a'u perthnasedd i actifadu ensymatig, ocsidiad ac anactifadu. Bioorg Med Chem 2014; 22: 2388e95.

41. Rescigno A, Sollai F, Pisu B, Rinaldi A, ataliad Sanjust E. Tyrosinase, agweddau cyffredinol a chymhwysol. J Ensym Inhib Med Chem 2002; 17:207e18.

42. Sasaki M, Kondo M, Sato K, Umeda M, Kawabata K, Takahashi Y, et al. Mae rhododendron, cyfansoddyn ffenolig sy'n achosi debigmentiad, yn rhoi sytowenwyndra melanocyte trwy fecanwaith sy'n dibynnu ar tyrosinas. Res Melanoma Cell Pigment 2014; 27:754e63.

43. Schweikardt T, Olivares C, Solano F, Jaenicke E, Garcia-Borron JC, Decker H. Mae model tri dimensiwn o safle gweithredol tyrosinase mamaliaid yn cyfrif am golli treigladau swyddogaeth. Cell Pigment Res 2007; 20: 394e401.

44. Pwyllgor Gwyddonol ar Gynhyrchion Defnyddwyr. Barn ar b-arbutin; 2008 (cyrchwyd Tachwedd 21, 2017).

45. Pwyllgor Gwyddonol ar Ddiogelwch Defnyddwyr. Barn ar asid kojic; 2012 (cyrchwyd Tachwedd 21, 2017).

46. ​​Sendovski M, Kanteev M, Ben-Yosef VS, Adir N, Fishman A. Mae strwythurau cyntaf tyrosinase bacteriol gweithredol yn datgelu plastigrwydd copr. J Mol Biol 2011;405:227e37.

47. Shimizu K, Kondo R, Sakai K. Atal tyrosinase gan flavonoids, stilbenes, a 4-resorcinolau cysylltiedig: ymchwiliadau strwythur-gweithgaredd. Planta Med 2000; 66:11e5.

48. Shimizu MM, Melo GA, Brombini Dos Santos A, Bottcher A, Cesarino I, Arau’jo P, et al. Nodweddu ensymau, ynysu, a chlonio cDNA o polyphenol oxidase yng nghalonnau palmwydd tair rhywogaeth fasnachol bwysig. Biocemeg Ffisiol Planhigion 2011;49:970e7.

49. Smith CJ, O'Hare KB, Allen JC. Mae sytotocsigedd dewisol hydroquinone ar gyfer celloedd sy'n deillio o melanocyte yn cael ei gyfryngu gan weithgaredd tyrosinase ond yn annibynnol ar gynnwys melanin. Celloedd Pigment Res 1988; 1:386e9.

50. Solano F, Briganti S, Picardo M, Ghanem G. Asiantau hypobigmentu: adolygiad wedi'i ddiweddaru ar agweddau biolegol, cemegol a chlinigol. Celloedd Pigment Res 2006; 19:550e71.

51. Stratigos AJ, Katsambas AD. Rheolaeth optimaidd o anhwylderau ysbeidiol o orbigmentiad mewn cleifion croen tywyll. Am J Clin Derm 2004;5: 161e8.

52. Sugimoto K, Nomura K, Nishimura T, Kiso T, Sugimoto K, Kuriki T. Syntheses o a-arbutin-a-glycosidau a'u heffeithiau ataliol ar tyrosinase dynol. J Biosci Bioeng 2005; 99:272e6.

53. Sul W, Wendt M, Klebe G, Ro¨hm KH. Ar y dehongliad o cineteg atal tyrosinase. J Ensym Inhib Med Chem 2014; 29:92e9.

54. Tripathi RK, Clywed VJ, Urabe K, Aroca P, Spritz RA. Mapio treiglo o weithgareddau catalytig tyrosinase dynol. J Biol Chem 1992;267:23707e12.

55.UniProt Consortium. UniProt: y gronfa wybodaeth brotein gyffredinol. Asidau Niwcleig Res 2017; 45:D158e69.

56. Gweinyddiaeth Bwyd a Chyffuriau UDA, yr Adran Iechyd a Gwasanaethau Dynol. Cynhyrchion cyffuriau cannu croen ar gyfer defnydd dynol dros y cownter; rheol arfaethedig. 71 Cofrestr Ffederal 51146-5115521 (wedi'i godio yn 21 CFR Rhan 310); 2006.

57. Vielhaber G, Schmaus G, Jacobs K, Franke H, Lange S, Herrmann M, et al. 4-(1-phenylmethyl)1,3-benzenediol: asiant goleuo newydd, hynod effeithlon. Int J Cosmet Sci 2007; 29:65e6. 58. Wendt M. Rhesymeg dylunio neuer tyrosinase-atalydd. Ph.D. thesis. Marburg, yr Almaen: Ysgol Feddygol Prifysgol Marburg; 2006.

59. Ying YH, Lee SJ, Chung MH, Ying HJ, Suk JL, Myung HC, et al. Mae Aloesin ac arbutin yn atal gweithgaredd tyrosinase yn synergyddol trwy fecanwaith gweithredu gwahanol. Arch Pharm Res 1999; 22: 232e6.

Am ragor o wybodaeth: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501