Mae Rhyngweithiadau Rhwng Gwrthocsidyddion Polyphenolig Quercetin A Naringenin yn Pennu'r Ymddygiad Cemegol a Biolegol Nodedig sy'n Gysylltiedig â Redox O'u Cymysgeddau Rhan 3
Mar 14, 2022
Cysylltwchoscar.xiao@wecistanche.comam fwy o wybodaeth
Gweithgaredd gwrthocsidiol trwy brawf DPPH.
Cyflawnwyd y penderfyniad ar weithgaredd gwrthocsidiol gwrthocsidyddion a archwiliwyd a'u cymysgeddau gansbectroffotometrigassay gan ddefnyddio DPPH radical fel y disgrifiwyd yn flaenoroll3,55. Yn gyntaf, gwanhawyd hydoddiant stoc radical DPPH â methanol nes bod yr amsugnedd yn cyfateb i 0.9±0.05 ar 515 nm. Yn ail, cafodd gwrthocsidyddion a'u cymysgeddau eu gwanhau'n briodol gyda 70 y cant ethanol i gyflawni crynodiadau sy'n dod o fewn ystod llinol yr assayi355. Yna, cymysgwyd yr hydoddiant DPPH (1 mL) â'r samplau gwanedig （30 μL） a mesurwyd yr amsugnedd ar 515 nm ar ôl 10 munud ar 37 gradd C. Cynhaliwyd yr holl adweithiau mewn 48-blatiau ffynnon. Perfformiwyd y mesuriadau amsugnedd gyda chymorth sbectrophotometer Infinite M200 TECAN (Tecan Group Ltd., y Swistir). Ailgyfrifwyd gweithgaredd gwrthocsidiol y sampl i gyfernod stoichiometry ng fel y disgrifiwyd yn flaenorol, gydag addasiadau5. Yn gryno, cyfrifwyd nifer y radicalau a ysborwyd gan y samplau a brofwyd yn seiliedig ar gyfraith Beer-Lambert a chyfernod difodiant molar DPPH yn dilyn y mesuriadau a berfformiwyd ar ôl 10 munud o adwaith rhwng yr hydoddiant gwrthocsidydd(ion) a radical55. Mae gwerth n yn cael ei gyfrifo fel tangiad o'r berthynas linol rhwng nifer y molau o DPPH sy'n cael ei yswain gan 1 mL ogwrthocsidyddionhydoddiannau o fewn ystod crynodiad, lle mae gan yr hydoddiant "stoc" y crynodiad"100 y cant" a'r crynodiadau eraill yn ffracsiwn o 100 y cant fel y'i diffinnir gan y ffactorau gwanhau.
Gweithgaredd gwrthocsidiol trwy ditradiad potensiometrig a foltametreg curiad y galon gwahaniaethol.
Mesurwyd potensial lleihau safonol(E) ar gyfer Q ac R gan ditradiad potensiometrig (PT) fel y disgrifir mewn man arall5. Yn fyr, diddymwyd cyfansoddion a astudiwyd a'r titrant (K,[Fe(CN)]) mewn PBS. Y crynodiad o gyfansoddion wedi'u puro oedd 0.3 mg/mL, Roedd cymysgeddau yn cynnwys 0.3 mg/mL o bob cyfansoddyn. Cyflawnwyd mesuriadau gan ddefnyddio offer Micro Oxidation-Reduction (UDA) JENCO 6230 N ORP-146C gyda chymorth electrod cyfeirio AglAgCl (RE) ac electrod mesur platinwm. Perfformiwyd PTs ar 37±0.01 gradd a gynhaliwyd yn bennaf gan Ultra Thermostat (PolvScience, UDA). Ychwanegwyd cyfaint cyfartal o titrant at y dadansoddwr a darllenwyd potensial cyson. O ganlyniad, dadansoddwyd cromliniau titradiad, E{=f(V..), gyda chymorth meddalwedd SigmaPlot Version 13.0(Systat Software Inc., UK) drwy osod y paramedrau sigmoidal,{5-mathemategol model i ddata arbrofol35. Darllenwyd potensial ar bwynt cywerthedd (EP vs. RE) yn uniongyrchol o'r model hwn yn seiliedig ar y paramedr a. Mae'n hafal i gyfaint y titrant a ychwanegir ar y pwynt ffurfdro. Yn olaf, cyfrifwyd gwerthoedd EP yn erbyn SHE (potensial gostyngiad safonol, EO). Sefydlwyd term cywiro potensial RE(c) trwy ditradu cyplau rhydocs, FeCl.6H, O, a Na,S, O3.5H,O, a nodweddir gan botensial lleihau safonol hysbys.
Yn ei dro, mesurwyd pŵer gwrthocsidiol (AOP) cyfansoddion a astudiwyd a'u cymysgeddau gan foltammetreg pwls gwahaniaethol (DPV) fel y dangoswyd yn flaenorol gydag addasiadau. Yn gryno, gwnaed mesuriadau gan ddefnyddio'r potentiostat Gamry Reference 60{{1{0}} (Gamry Instruments, UDA) sy'n cynnwys system tri electrod. Defnyddiwyd electrod carbon gwydrog (GC, 1.6 mm mewn diamedr), gwifren platinwm, ac electrod AgAgCl (Hydromet SC, Gwlad Pwyl) fel y gwaith gweithio (WE), yr electrod ategol (AE), a'r electrod cyfeirio (RE), yn y drefn honno13. Cyn arbrofion, cafodd wyneb y WE ei sgleinio gan ddefnyddio crogiad alwmina （0.05 μm gronynnau, Buehler, UDA） ar badiau brethyn micro(MF-1040, BASi, UDA) a yna ei lanhau â dŵr distyll a methanol. Gwanhawyd y cyfansoddion a astudiwyd mewn DMSO a byffer sodiwm ffosffad(pH=7.4±0.1), felly crynodiad terfynol byffer ffosffad oedd {{30}}.1 M yn y sampl. Roedd y byffer yn gwasanaethu fel yr electrolyt cynnal. Crynodiad y cyfansoddion puro oedd 3 mM. Roedd cymysgeddau yn cynnwys 3 mM o bob cyfansoddyn. Er mwyn cael gwared ar yr ocsigen electrocemegol adweithiol, cafodd yr hydoddiannau a astudiwyd eu dadocsideiddio gan drylifiad argon cyn y mesuriadau. Cafodd foltamogramau DPV ar gyfer N-.N plus , a chymysgeddau: ON-and RN plus eu cofnodi yn yr ystod-0.2 i plws 1.3 V, tra ar gyfer Q ac R yn yr ystod-0.2 i ynghyd â 0.6 V vs.RE. Gosodwyd y gyfradd sgan bosibl o 0.1 V.s', uchder pwls o 0.05 V, ac amser pwls o 0.1 s ar 25±0.01 gradd.
Dadansoddwyd foltamogramau DPV gan feddalwedd SigmaPlot Version 13.0 (Systat Software Inc., UK). Cyfrifwyd y gwerthoedd AOP mewn dau gam. Roedd cyfrifiadau'n ystyried nid yn unig botensial brig anodig a cherrynt (E,; I,), ond hefyd y potensial gosod a'r cerrynt mesuredig ar bob pwynt o'r gromlin foltammetrig. Roedd yn caniatáu cael gwerthoedd mwy manwl gywir na'r rhai a adroddwyd yn ein gwaith blaenorol3. Yn gyntaf, cyfrifwyd y paramedr o ynni gwrthocsidiol (AOE) yn ôl Eq. 1:
lle AwE yw arwynebedd arwyneb y WE (sy'n hafal i {{0}}.162±0.004 cm' yn ein hastudiaeth), mae E yn botensial gosod yn erbyn RE [V], yn ffactor cywiro gan ystyried presenoldeb y gyffordd hylif rhwng y WE ac RE (yma 0.103 V), I yw'r cerrynt a fesurir yn erbyn y cerrynt cefndir [A], dyma'r amser samplu posibl [dt=0 .5 s].
Yn ail, cyfrifwyd AOP a fynegwyd yn uned W cm² yn seiliedig ar Eq.2∶
lle tt;—yw'r gwahaniaeth rhwng amser dechrau'r brig ocsidiad(t) a'i ddiwedd (t).
Er mwyn darganfod Awp, perfformiwyd foltametreg cylchol ar gyfer hydoddiant 1.10-3MK,[Fe(CN).] yn 0.1 M KCl. Cyfrifwyd y gwerth hwn yn seiliedig ar hafaliad Randles-Sevcik82 o lethr y cerrynt brig anodig fel ffwythiant gwreiddyn sgwâr y gyfradd sganio, I, =f(pi/2). Fe'th fesurwyd yn yr un modd ag mewn titradiad potensiometrig. Ar ben hynny, yn y gwaith presennol, roedd paramedr thermodynamig y broses ocsideiddio yn botensial brig anodig wedi'i gywiro gan y gyffordd hylif rhwng WE ac RE (E.,=E.. plus e), tra bod paramedrau cinetig yn cofleidio'r tâl a drosglwyddwyd ( Q) a cherrynt anodig (I,).
Gall cistanche wella imiwnedd
Diwylliant celloedd. Yn yr astudiaeth a gyflwynwyd, llinell gell HT29 (colon dynoladenocarcinoma) o'r ATCC yn cael ei ddefnyddio fel model o'r coluddyn dynol, Roedd y celloedd yn cael eu cynnal yng nghyfrwng McCoy ynghyd âgwrthfiotigau(100 U/mL streptomycins a 100 g/L penisilin) a serwm buchol ffetws (100 mL/L)13. Roedd llinell gell HT29 yn cael ei chynnal ar 37Cunder 5 y cant CO, yr atmosffer mewn deorydd cell (Heal Force)3. Defnyddiwyd y llinell gell rhwng darnau 6 ac l1. Profwyd celloedd diwylliedig am halogiad mycoplasma gan ddefnyddio Pecyn Canfod Mycoplasma Universal gan ATCC (UDA).
Asesiad sytowenwyndra. Er mwyn pennu effaith purogwrthocsidyddion(Q, N plws , R, N-) a'u cymysgeddau (QN-, RN plws) ar dwf celloedd HT29, cymhwyswyd MTTtest fel y disgrifiwyd yn gynharach3,5. Yn gryno, cafodd y celloedd a oedd yn tyfu'n esbonyddol eu hadu mewn 96-blatiau meithrin meinwe ffynnon (5×10 celloedd fesul ffynnon mewn 0.18 ml o gyfrwng) a chawsant eu gadael i setlo am 24 h. ar 37 gradd o dan 5 y cant CO, Yna, cafodd y celloedd eu trin am 6,24 neu 72 h gyda 0.02 ml o wahanol grynodiadau o'r gwrthocsidyddion pur neu eu cymysgeddau3,5. Cafodd y gwrthocsidyddion a'u cymysgeddau eu hydoddi mewn ethanol (naringenin, naringin a chymysgeddau - 30 y cant (v/v), quercetin-40 y cant (v/v), rutin - 20 y cant (v/v), )). Roedd y crynodiadau terfynol o gyfansoddion wedi'u puro yn amrywio o 10 nM i 100 uM. Roedd y cymysgeddau yn cynnwys crynodiadau cyfwerth o bob cyfansoddyn (10 nM-100 μM). Y crynodiad terfynol o ethanol mewn cyfryngau diwylliant oedd 2 y cant (v / v) yn achos rutin, 3 y cant (v / v) naringenin, naringin, a chymysgedd yn ogystal â 4 y cant (v / v) quercetin. Ar ôl datguddiadau 6 a 24 h, cafodd y cyfrwng ei allsugnu o'r ffynhonnau a rhoi 0.2 mL o gyfrwng ffres yn ei le. Deorwyd y celloedd ar 37 gradd tan 72 h o gyfanswm yr amser deori13,55. Ar ôl 72 h o ddeori, at yr holl ffynhonnau ychwanegwyd 0.05 ml o hydoddiant MTT (4 g/L) a chafodd y celloedd eu cynnal am 4 awr arall ar 37 gradd C13,5. Yna, dyheadwyd y cyfrwng o ffynhonnau a diddymwyd crisialau formazan mewn 0.05 mL o DMSO. Mesurwyd amsugniad yr hydoddiannau a gafwyd ar 540 nm gyda chymorth darllenydd plât M200 Infinite TECAN (Tecan Group Ltd, y Swistir)15. Perfformiwyd y triniaethau fel pedwar copi technegol. Perfformiwyd tri ailadroddiad annibynnol o bob triniaeth. Mynegwyd effaith samplau a ymchwiliwyd ar dwf celloedd HT29 fel y cant o ataliad twf celloedd sy'n agored i wrthocsidyddion unigol a'u cymysgeddau o'u cymharu â chelloedd rheoli a driniwyd â'r toddydd yn unig, yr ystyriwyd bod eu twf yn 100 y cant 13,55
Assay CAA (gweithgaredd gwrthocsidiol cellog). Defnyddiwyd assay CAA (The OxiSelect Cell Biolabs, Inc. USA) i werthuso gweithgaredd gwrthocsidiol cellog cyfansoddion yn unig (O, N plus , R, N-) a chymysgeddau (ON-, RN plus) mewn celloedd HT29 fel y disgrifiwyd yn gynharach35. Cafodd y celloedd sy'n tyfu'n esbonyddol eu hadu mewn 96-blatiau du meithrin meinwe ffynnon gyda gwaelodion tryloyw ar gyfer mesuriadau fflworoleuedd (3×104 cell y ffynnon mewn 0.2 ml o gyfrwng) ac roeddent yn gadael i setlo am 24 h ar 37 gradd o dan 5 y cant CO,i3.55. Cafodd pob gwrthocsidydd ei hydoddi mewn 10 y cant ethanol. Yna cafodd y celloedd eu trin â hydoddiant gwanedig 50{{50}} gwaith o 2',7'-dichlorofluorescein diacetate (0.05 mL)wedi'i ddarparu gyda'r pecyn, a'r un cyfaint o wahanol grynodiadau o samplau gwrthocsidiol am 1, 3, neu 6 h. Roedd crynodiadau terfynol cyfansoddion wedi'u puro yn amrywio o 1 i 100 uM. Roedd y cymysgeddau yn cynnwys crynodiadau cyfwerth o bob cyfansoddyn(1-100uM). Cafodd y celloedd rheoli eu trin ag 10 y cant ethanol yn unig (v/v). Y crynodiad terfynol o ethanol mewn cyfryngau diwylliant oedd 5 y cant (v/v). Cynhaliwyd yr holl driniaethau mewn tri atgynhyrchiad technegol a chynhaliwyd tri arbrawf annibynnol. Cymerwyd camau dilynol yn unol ag argymhellion y gwneuthurwr (https://www.cellbiolabs.com). Perfformiwyd cyfrifiadau fel y disgrifiwyd yn gynharach, effeithiau genotocsig. Er mwyn pennu'r effeithiau genotocsig a ddangosir gan wrthocsidyddion unigol (O, N plus , RN-) a'u cymysgeddau (ON-, RN plus) mewn celloedd HT29, defnyddiwyd gweithdrefn assay comet fel y disgrifiwyd yn flaenorol. Cafodd y celloedd HT29 a oedd yn tyfu'n esbonyddol eu hadu mewn 24-blatiau meithrin meinwe ffynnon (10 celloedd gradd fesul ffynnon mewn 1.8 mL o gyfrwng) a chaniatawyd iddynt setlo am 24 h ar 37 gradd o dan 5 y cant CO, 55, Yna, cafodd y celloedd eu trin am 24h gyda 0.2 mL o wahanol grynodiadau o'r gwrthocsidyddion yn unig neu mewn cymysgeddau. Roedd y crynodiadau terfynol o gyfansoddion wedi'u puro yn amrywio o 1 i 100 uM. Roedd y cymysgeddau yn cynnwys crynodiadau cyfwerth o bob cyfansoddyn (1-100 uM). Y crynodiad ethanol terfynol yn y cyfrwng diwylliant oedd 3 y cant (v/v). Roedd y celloedd a ddefnyddir fel rheolyddion negyddol yn cael eu trin â thoddydd yn unig. Ar ôl amser triniaeth, cafodd y cyfrwng ei allsugnu o'r ffynhonnau a golchwyd y celloedd â 0.5 mL PBS. Yna datgelwyd y celloedd gan ddefnyddio 0.2 ml o hydoddiant trypsin (0.5 g/L)55 Ataliwyd gweithgaredd trypsin trwy ychwanegu 1.8 ml o gyfrwng twf cyflawn at bob ffynnon. Cafodd y celloedd eu hail-hongian, eu cyfrif, a'u dosrannu'n diwbiau 1.5 mL (30 × 103³ celloedd y tiwb). Roedd ataliad y gell wedi'i ganoli (100 × g, 5 mun, 4 gradd). Golchwyd y pelenni celloedd â l mL o PBS a'u centrifugio eto (100 × g, 5 mun, 4 gradd ） 5. Yna, cafodd PBS ei daflu ac ail-ataliwyd y celloedd mewn 150 μL o 0.5 y cant LMP agarose mewn dŵr cyn- wedi'i gynhesu i 42 gradd C a gosodwyd 40 μL o'r cymysgedd hwn fel dau smotyn ar sleid microsgop wedi'i orchuddio ymlaen llaw ag agarose pwynt toddi arferol 1 y cant (NMP agarose).Gorchuddiwyd y sleidiau â gorchuddion slipiau.Caniatawyd i'r agarose gael ei osod gan gosod y sleidiau microsgop ar hambwrdd oer-iâ am o leiaf 5 munud 5 Paratowyd tair sleid gyda dwy ailadrodd ar bob un ar gyfer pob crynodiad o'r sylweddau a brofwyd Ar ôl lysis dros nos mewn byffer alcalïaidd halen uchel (2.5 M NaCl,0.1 M EDTA ,0.01 M Tris, 1 y cant Triton X100,pH10), gosodwyd y sleidiau i mewn i blatfform electrofforesis Bio-Rad Is-gell GT (DU), wedi'i orchuddio â byffer electrofforesis oer (0.3 M NaOH, EDTA 1 mM, pH 13) a caniatawyd cromatin i ddadflino am 25 munud cyn electrofforesis.Cynhaliwyd electrofforesis ar 26 V a 300 mA(0.75 V/cm) am 30 munud mewn tywyllwch ar 4-8 gradd . Ar ôl y cam hwn, golchwyd y sleidiau yn gyntaf gan ddefnyddio PBS ac yna dŵr. Yn dilyn hynny, cafodd y DNA ei staenio â SybrGreen mewn byffer TE (0.1 M Trizma-Base, EDTA 1 mM, pH 7.5) am 20 munud ~. Ar ôl staenio, golchwyd y sleidiau â dŵr distyll am 5 munud. Dadansoddwyd "comedau" DNA o dan ficrosgop fflworoleuedd (Zeiss ImagerZ2, UDA) ynghyd â system sganio sleidiau gyfrifiadurol (Metafer4, yr Almaen). Roedd dadansoddiad comed yn cynnwys cyfrif 200 o gnewyllyn olynol fesul sampl5. Mynegwyd genowenwyndra samplau a ddadansoddwyd fel y canran DNA yng nghynffon y gomed. Perfformiwyd tri atgynhyrchiad annibynnol o bob triniaeth.
Gall cistanche wella imiwnedd
Methyliad DNA byd-eang.
For the determination of global methylation of DNA, a modified comet assay procedure was developed. Methylation sensitive comet assay was performed according to Wentzel's procedure with significant modifications. The cells were seeded in 6-well tissue culture plates(4×105 cells per well in 3.6 mL of medium) and were allowed to settle for 24 h at 37°C under 5%CO,Then, the cells were treated with 0.4 mL, of different concentrations of the tested antioxidants or their mixtures for 24 h at 37C. The final concentrations of individual compounds and solvents were the same as used for genotoxic effect assessment. After incubation time, the medium was aspirated from the wells and the cells were washed with 2 mL of PBS. The cells were detached using 0.4 mL of trypsin solution (0.5 g/L). Then,3.6 mL of medium was added to each well. The cells were re-suspended, counted, and aliquoted into 1.5 mL tubes(30×10 cells per tube). The cell suspension was centrifuged (100×g,5 min, 4°C). The cell pellets were washed with 1 mL of PBS and centrifuged again(100×g 5 min,4℃C）.PBS was discarded and the cell pellet was re-suspended in 100μL of 1%LMP agarose in water pre-warmed to 45 °C. Then,40 μL of this mixture was placed as two spots on a microscope slide pre-coated with 1%normal melting point agarose(NMP agarose)5. The slides were then covered with coverslips and left to set on an ice-cold tray for at least 5 min to solidify agarose5. Each treatment embraced a set of 3 microscope slides. After overnight lysis in a high salt alkaline buffer(2.5 M NaCl, 0.1 M EDTA, 0.01 M Tris,1% Triton X100, pH 10), the slides were washed twice with water>5. Cafodd cromatin wedi'i bacio'n dynn ei ddad-ddirwyn trwy drin y niwclysau â hydoddiant proteinas K 1.5 mM (0.2 mL fesul sleid)3. Gorchuddiwyd y sleidiau â paraffilm, eu gosod mewn cynhwysydd plastig wedi'i leinio â hances bapur llaith, ei adael am 1{1 munud ar 37 gradd, yna ei olchi â dŵr3. Yn y modd hwn, paratowyd niwcleoidau i'w treulio gydag endonucleasau cyfyngu (Hall a MspI). Mae'r ddau ensym yn adnabod yr un dilyniant cyfyngu (5'-CCGG-3') ond yn dangos sensitifrwydd gwahanol tuag at cytosin methylated. Tybir bod HpalI yn treulio dilyniannau anmethylated yn unig. Gall MspI hollti dilyniannau anmethylated yn ogystal â dilyniannau methylated llawn. Felly, adlewyrchir lefelau cymharol methylation DNA y dilyniant CpG fel y gwahaniaeth rhwng y swm byd-eang o DNA o fewn y gynffon gomed a welwyd gyda threuliad MspI a niwcleoidau wedi'u treulio gan HpalI. I greu amodau priodol ar gyfer treuliad ensymatig.{{20}}.{{20}}.2 ml o byffer Tango wedi'i wanhau â dŵr gradd foleciwlaidd mewn cymhareb 1:9(v/v) ei roi ar bob sleid yn y set. Gorchuddiwyd y sleidiau â paraffilm, eu gosod mewn cynhwysydd plastig wedi'i leinio â hances bapur llaith, a'u gadael am 10 munud ar 37 gradd Ce. Yna, tynnwyd gormodedd y byffer. Cafodd pob un o'r tair sleid yn y set eu trin yn wahanol. Ar y sleid (rheoli) gyntaf, dim ond 0.15 ml o glustogiad Tango gwanedig a ddefnyddiwyd. Cafodd y niwclysau mewnosodedig agarose ar yr ail sleid eu trin â 0.15 ml o ensym Hall (0.37 μunits), tra ar y trydydd sleid ychwanegwyd yr un cyfaint o MspI (0.26 μunits). Paratowyd yr hydoddiannau ensym gan ddefnyddio byffer Tango gwanedig. Gorchuddiwyd y sleidiau â pharafilm a'u gosod mewn cynhwysydd plastig llaith. Cynhaliwyd y treuliad enzymatig am 45 munud ar 37 gradd. Ar ôl treulio, golchwyd y sleidiau ddwywaith â dŵr. Perfformiwyd camau pellach o'r assay comet, megis electrofforesis a staenio DNA, fel y disgrifir yn yr adran "Methyliad DNA Byd-eang". Dadansoddwyd "comedau" DNA o dan ficrosgop fflworoleuedd (Zeiss ImagerZ2, UDA) ynghyd â system sganio sleidiau gyfrifiadurol (Metafer4, yr Almaen). Perfformiwyd dadansoddiad comet gyda chymorth meddalwedd sgôr Comet (UDA) ac roedd yn cynnwys cyfrif o 100 niwclei fesul sampl. Roedd y canran cymedrig DNA yng nghynffon y gomed yn fesur o ddarniad DNA. I gyfrifo'r DNA byd-eangmethylation(methylation CpG y cant), defnyddiwyd yr hafaliad canlynol: methylation CpG y cant=100—Hpal/MspI × 100, lle mae Hpal/MspI yn gymhareb o ganran y DNA yng nghynffon comed niwcleoid wedi'i dreulio â HpalII a'r DNA canran yng nghynffon comed niwcleoid wedi'i dreulio gyda Mspl85. Rhoddwyd cyfrif am arteffactau difrod DNA trwy dynnu'r ganran DNA yng nghynffon y sampl rheoli o'r gwerthoedd a gafwyd ar gyfer y samplau a dreuliwyd ag ensymau cyfyngu. Perfformiwyd tri ailadroddiad annibynnol o bob arbrawf.
Dadansoddiad microarray.
Mae dadansoddiad genomig wedi'i berfformio fel y dangoswyd o'r blaeni355, cafodd celloedd HT29 eu hadu mewn 24-blatiau meithrin meinwe ffynnon (105 cell y ffynnon mewn 1.8 mL o gyfrwng) a chaniatawyd iddynt setlo am 24 h ar 37 gradd o dan 5 y cant CO, Yna, cafodd y celloedd eu trin am 24 h gyda 0.2 mL o wahanol grynodiadau o'r gwrthocsidyddion yn unig (Q, N-) neu yn y cymysgedd (QN-). Roedd crynodiadau terfynol y cyfansoddion a archwiliwyd yn amrywio o 1 i 10 uM. Roedd y cymysgedd yn cynnwys crynodiadau cyfwerth o bob cyfansoddyn. Roedd y celloedd a ddefnyddir fel rheolyddion negyddol yn cael eu trin â'r toddydd yn unig. Y crynodiad terfynol o ethanol mewn cyfryngau diwylliant oedd 3 y cant (v / y). Ynysu RNA. trawsgrifio cefn a PCR amser real o arae sy'n cynnwys 84 o enynnau sy'n ymwneud ag ymateb gwrthocsidiol yn ogystal â dadansoddi data fel y disgrifiwyd yn gynharach. Cynhaliwyd tri ailadroddiad annibynnol o bob triniaeth o gelloedd.
Dadansoddiad ystadegol.
Mynegir pob gwerth fel cymedrig ±SD o dri arbrawf annibynnol oni nodir yn wahanol. Archwiliwyd arwyddocâd ystadegol penderfyniadau gweithgaredd gwrthocsidiol mewn system ddi-gell gan ddefnyddio assay DPV a DPPH yn ogystal ag mewn modelau cellog a gafwyd trwy brawf CAA gan brawf Tukey heb ei baru (p Llai na neu'n hafal i 0.{{ 6}}5). Archwiliwyd canlyniadau genowenwyndra a methylation DNA byd-eang a ddadansoddwyd gan brofion comet gan ANOVA unffordd gyda phrawf post-hoc Dunnett. Perfformiwyd y dadansoddiadau ystadegol hyn gan ddefnyddio pecyn meddalwedd Prism 4.0 (GraphPad Software, Inc., USA). Gwerthuswyd arwyddocâd ystadegol newidiadau mewn mynegiant genynnau rhwng samplau a rheolyddion hefyd gan brawf-t Myfyriwr heb ei baru ar gyfer pob genyn o ddiddordeb gan ddefnyddio Canolfan Dadansoddi Data GenGlobe (Qiagen, UDA). Gosodwyd lefel yr arwyddocâd ystadegol arp Llai na neu'n hafal i 0.05.
Mae'r erthygl hon yn cael ei dynnu owww.nature.com/scientificreports
