Ymyrraeth Glycosidau Phenylethanoid O Cistanche Tubulosa Gyda'r Assay MTT

Cyswllt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-bost:audrey.hu@wecistanche.com

Yu-Jie Wang, Si-Min Zhou, Gang Xu a Yu-Qi Gao

Crynodeb:

Mae'r assay MTT, fel dull sgrinio, wedi'i ddefnyddio'n helaeth i fesur hyfywedd ac amlder celloedd. Fodd bynnag, dylid nodi ei bod yn bosibl nad yw'r asesiad MTT yn adlewyrchu effaithCistanche tubulosadyfyniad ethanolic ar hyfywedd celloedd EA.hy926. Er mwyn ymchwilio a nodi'r cydrannau sy'n gyfrifol am arsylwadau gwrthgyferbyniol o'r assay MTT, echinacoside, ac acteoside, ynyswyd dau brif glycosidau ffenylethanoid, o ddyfyniad ethanolig C. tubulosa. Mae'r data sy'n deillio o CCK-8, Hoechst 33342 ac atodiad V-FITC/PI yn awgrymu mai'r grŵp caffeoyl a oedd yn bresennol yn y ddau gyfansoddyn ynysig oedd yn gyfrifol am ganlyniadau gwrthgyferbyniol y prawf MTT. Mae'r data hyn yn pwysleisio'r angen i ddefnyddio amrywiaeth o wahanol ddulliau i bennu effaith cyfryngau meddyginiaethol ar hyfywedd celloedd er mwyn osgoi cynhyrchu canlyniadau camarweiniol.

Geiriau allweddol: assay MTT;glycoside ffenylethanoid; asid caffeic; hyfywedd celloedd; ymyraeth

Rhagymadrodd

Y planhigyn parasitigCistanche tubulosa(Schrenk) Mae R. Wight (teulu Orobanchaceae) wedi'i ddosbarthu'n eang yng ngwledydd Gogledd Affrica, Arabaidd ac Asiaidd [1]. Mae'r deillio oCistanche tubulosaaCistanche deserticolayn bwysig mewn meddygaeth Tsieineaidd draddodiadol, ar ôl cael eu defnyddio ar gyfer trin analluedd, anffrwythlondeb, lumbago, a rhwymedd oherwydd syrthni cytrefol [2]. Yn ogystal, dangoswyd bod dyfyniad ethanolig Cistanche tubulosa yn cael effaith amddiffynnol sylweddol yn erbyn hypocsia cerebral mewn llygod [3].

Mae celloedd endothelaidd yn chwarae rhan hanfodol yn pathogenesis gorbwysedd pwlmonaidd hypocsig. Mae llinell gell endothelaidd EA.hy926 yn sylweddol debyg i gelloedd endothelaidd cynradd. Yn ystod ein hastudiaeth ein hunain o effaith gwrth-hypoxic oCistanche tubulosadyfyniad ethanolig ar gell endothelaidd EA.hy926, gwnaethom sylwi bod y 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,{6}}diphenyltetrazolium bromid (MTT) assay, a ddefnyddir yn gyffredin i asesu hyfywedd celloedd mewn astudiaethau o sytotocsigedd a gweithgaredd sytostatig, wedi cynhyrchu canlyniadau gwrthdaro trwy ddangos mwy o hyfywedd celloedd EA.hy926 ar ôl triniaeth.

Mae asesiad cywir o hyfywedd celloedd yn hanfodol i nodi effeithiau sytotocsig neu sytoprotective posibl asiant meddyginiaethol. Felly, fe wnaethom ymchwilio i ba gydrannau sy'n bresennol yn echdyniad C. tubulosa ethanolig a allai fod yn gyfrifol am y canlyniadau gwrthdaro a welwyd gyda'r assay MTT. Fe wnaethom ynysu dau brif glycosidau ffenylethanoid (PhGs) o ddyfyniad ethanolig C. tubulosa, echinacoside (cyfansoddyn 1 o hyn ymlaen) ac acteoside (cyfansoddyn 2 o hyn ymlaen), a phenderfynwyd eu heffaith ar hyfywedd celloedd EA.hy926 gan ddefnyddio amrywiaeth o ddulliau. Yn ogystal, er mwyn egluro ymhellach pa amnewidion o gyfansoddion 1 a 2 a allai fod yn gyfrifol am y canlyniadau gwrthgyferbyniol, gwnaethom brofi eu haglyconau, asid caffeic (cyfansoddyn 3 o hyn ymlaen) a 3,4-dihydroxylphenylethanol (cyfansoddyn 4 o hyn ymlaen), ar hyfywedd celloedd EA.hy926 gan ddefnyddio'r un dulliau.

Canlyniadau a Thrafodaeth

Adnabod Cyfansoddion

Nodwyd strwythurau'r ddau gyfansoddyn sydd wedi'u hynysu o echdyniad ethanolig C. tubulosa gan ddadansoddiadau cyseiniant magnetig niwclear (NMR) a sbectrometreg màs (MS) ac fe'u dangosir yn Ffigur 1. Nodwyd cyfansawdd 1 fel echinacoside o'i gymharu â NMR (Tabl) a adroddwyd yn flaenorol 1) ac MS (m/z 785 [M−H]− ) data [4]. Roedd sbectra NMR cyfansawdd 2 yn debyg iawn i rai cyfansoddyn 1, heblaw am absenoldeb grŵp -D-glucopyranosyl (Tabl 1). Adnabuwyd cyfansawdd 2 (m/z 623 [M−H]− ) fel acteosid [5]. Yn bwysig, mae gan y ddau gyfansoddyn yr un aglycone, sy'n cynnwys asid caffeic (cyfansoddyn 3) a 3,4-dihydroxylphenylethanol (cyfansoddyn 4).

Asesiadau Hyfywedd Celloedd

Defnyddiwyd profion MTT a CCK{{{{0}} i ddadansoddi effaith cyfansoddion 1–4 ar hyfywedd celloedd EA.hy926. Dangosodd y assay MTT fod hyfywedd celloedd EA.hy926 wedi cynyddu'n sylweddol ar ôl triniaeth gyda 25 a 5 0 μM cyfansawdd 1, 2, neu 3 (166.3 y cant a 174.1 y cant ar gyfer cyfansawdd 1, 205.8 y cant a 224.3 y cant ar gyfer cyfansawdd 2, a 164.8 y cant a 189.6 y cant ar gyfer cyfansawdd 3, yn y drefn honno; p < 0.05),="" o'i="" gymharu="" â="" chelloedd="" rheoli="" (ffigur="" 2a).="" at="" hynny,="" penderfynodd="" archwiliad="" morffolegol="" o'r="" celloedd="" fod="" triniaeth="" â="" 50="" μm="" cyfansawdd="" 1,="" 2,="" neu="" 3="" yn="" cynyddu="" ffurfio="" crisialau="" formazan="" porffor,="" a="" ystyrir="" yn="" arwydd="" uniongyrchol="" o="" gyfran="" y="" celloedd="" byw="" (ffigur="" 3).="" i'r="" gwrthwyneb,="" awgrymodd="" assay="" cck-8="" fod="" hyfywedd="" celloedd="" wedi="" gostwng="" yn="" sylweddol="" ar="" ôl="" triniaeth="" gyda="" 12.5,="" 25,="" a="" 50="" μm="" cyfansawdd="" 1,="" 2,="" neu="" 3="" (75.5="" y="" cant="" ,="" 45.1="" y="" cant="" ,="" a="" 43.7="" y="" cant="" ar="" gyfer="" cyfansawdd="" 1,="" 85.5="" y="" cant="" ,="" 51.8="" y="" cant,="" a="" 34.3="" y="" cant="" ar="" gyfer="" cyfansawdd="" 2,="" a="" 64.5="" y="" cant,="" 48.2="" y="" cant,="" a="" 36.4="" y="" cant="" ar="" gyfer="" cyfansawdd="" 3,="" yn="" y="" drefn="" honno;="" p="">< 0.05),="" o'i="" gymharu="" â="" chelloedd="" rheoli="" (ffigur="" 2b).="" ni="" effeithiodd="" cyfansawdd="" 4="" ar="" hyfywedd="" cell="" naill="" ai="" yn="" yr="" assay="" mtt="" na="" cck-8.="" mae'r="" anghysondeb="" rhwng="" y="" canlyniadau="" a="" gafwyd="" gyda'r="" ddau="" asesiad="" yn="" awgrymu="" efallai="" na="" fydd="" un="" o'r="" ddau="" asesiad="" yn="" adlewyrchu'n="" gywir="" effeithiau="" cyfansoddion="" 1="" a="" 2="" ar="" hyfywedd="" celloedd="">

Asesiad Apoptosis gan Hoechst Staining

Mae Hoechst 33342 yn staen DNA athraidd cell sy'n cael ei gyffroi gan olau uwchfioled ac yn allyrru fflworoleuedd glas ar 460 i 490 nm. Mae cromatin cyddwys celloedd apoptotig yn staenio'n fwy llachar na chromatin celloedd normal [6]. Tra bod celloedd rheoli yn arddangos cromatin gwasgaredig unffurf, organynnau arferol, a philenni cell cyfan, roedd celloedd wedi'u deor â chyfansoddion 50 μM 1, 2, neu 3 am 48 h yn dangos staenio nodweddiadol celloedd apoptotig (Ffigur 4A). I'r gwrthwyneb, ni chynyddodd amlygiad celloedd i 50 μM o gyfansoddyn 4 nifer y cnewyllyn apoptotig o'i gymharu â'r driniaeth reoli.

Dadansoddiad Cytometrig Llif o Gelloedd Apoptotig

Mae'r assay staenio dwbl anecsin V-FITC/PI yn nodi celloedd apoptotig trwy rwymo anecsin V-FITC i ffosffatidylserine ag affinedd uchel, sy'n cael ei allanoli mewn celloedd sy'n cael apoptosis [7]. Yn y assay hwn, nid yw celloedd hyfyw yn rhwymo i anecsin V na PI ac felly nid ydynt wedi'u staenio (cwadrant chwith isaf), mae celloedd apoptotig cynnar wedi'u staenio'n wyrdd trwy rwymo anecsin V-FITC (cwadrant dde isaf), a chelloedd apoptotig hwyr. yn cael eu staenio'n wyrdd a choch trwy rwymo anecsin V-FITC i phosphatidylserine a PI i gelloedd necrotig, yn y drefn honno (cwadrant dde uchaf). Fel y dangosir yn Ffigur 4B, celloedd wedi'u deor â chyfansoddion 50 μM 1, 2, neu 3 am 48 h, cynyddodd canran y celloedd apoptotig o 3.74 y cant (celloedd rheoli) i 10.32 y cant, 12.95 y cant, a 11.30 y cant, yn y drefn honno. O'i gymharu â chelloedd rheoli, ni chynyddodd cyfansawdd 4 y ganran o gelloedd apoptotic EA.hy926.

Yn gyson â'r canlyniadau a gafwyd gyda'r assay CCK-8 a thrwy staenio Hoechst 33342, dangosodd yr assay cytometreg llif fod cyfansoddion 1, 2, a 3 yn achosi apoptosis mewn celloedd EA.hy926. At ei gilydd, mae'r arsylwadau hyn yn awgrymu bod y cynnydd yn hyfywedd celloedd EA.hy926 a welwyd gyda'r assay MTT ar ôl triniaeth â chyfansoddion 1-3 yn cynrychioli canlyniad ffug-bositif.

Trafodaeth

Ym 1983, datblygodd Mosmann assay microplate lliwimetrig MTT ar gyfer mesur amlhau celloedd a sytotocsigedd [8]. Mae'r assay syml hwn, ac addasiadau ohono, bellach yn cael ei ddefnyddio'n helaeth mewn labordai bioleg celloedd ledled y byd. Dangosodd astudiaethau ffrithiant mewn celloedd mamalaidd mai'r cofactor niwcleotid pyridin llai, NADH, sy'n gyfrifol am y rhan fwyaf o ostyngiadau MTT. Ategwyd hyn gan astudiaethau yn defnyddio celloedd cyfan [9]. Felly mae gostyngiad MTT yn gysylltiedig â chelloedd sy'n weithredol yn fetabolaidd ac mae'n cael ei gyplysu nid yn unig â resbiradaeth mitocondriaidd, ond hefyd â'r cytoplasm a philenni nad ydynt yn mitocondriaidd gan gynnwys y compartment endosome/lysosome a'r bilen plasma [10]. Y wefr bositif net ar y moleciwl MTT yw'r prif ffactor ar gyfer ei gymeriant cellog trwy botensial y bilen plasma.

Yn nodedig, efallai na fydd y assay MTT o bryd i'w gilydd yn adlewyrchu'n gywir yr effaith wirioneddol y mae cyfansawdd wedi'i brofi yn ei chael ar gelloedd penodol. Fodd bynnag, nid yw'r strwythurau neu'r grwpiau cemegol a allai achosi canlyniadau gwrthdaro yn y prawf MTT wedi'u nodi. Mae astudiaethau diweddar wedi dangos y gallai'r assay MTT danamcangyfrif effaith gwrth-ymledol (−)-epigallocatechin-3-gallate, y polyphenol mwyaf toreithiog mewn te gwyrdd [11]. Mewn astudiaethau sy'n defnyddio'r assay MTT i ganfod cemosensitifrwydd tiwmor, dangosodd asiantau cemotherapiwtig gwrth-ganser, megis epirubicin, paclitaxel, docetaxel, ac imatinib mesylate (Gleevec), fwy o hyfywedd celloedd [12,13]. Ar ben hynny, mae nifer o astudiaethau wedi nodi y gallai rhai darnau planhigion a polyphenolau redox-active ymyrryd â'r assay MTT gan eu bod yn lleihau'r halen tetrazolium MTT yn uniongyrchol yn absenoldeb celloedd [14].

Mae'r angen i hydoddi'r crisialau formazan MTT cyn dadansoddi sbectroffotometrig mewn darllenydd microplate a natur endpoint gynhenid ​​yr adwaith yn cyfyngu ar y defnydd o'r assay MTT i rai cymwysiadau. Arweiniodd hyn at ddatblygiad analogau tetrazolium lle'r oedd y moieties ffenyl wedi'u haddurno â grwpiau sylffonad â gwefr negatif, megis 2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro- 5-) sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxamide (XTT), halen mewnol â gwefr negatif [15] a 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl) -5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium (MTS), halen mewnol gwan asidig sy'n perthyn yn agos i MTT [16] . Arweiniodd yr addasiadau hyn at gynhyrchu cynhyrchion formazan hydawdd canolig diwylliant a oedd yn dileu'r gofyniad am gam hydoddi cyn meintioli. Yn gyfatebol, wrth i'r gwefr negyddol gynyddol ar y moleciwlau hyn leihau eu gallu i symud ar draws cellbilenni [17], derbynyddion electronau canolraddol (IEA), megis 1-methoxy-5-methyl phenazinium methyl sulfate (1- Roedd angen }}methoxy PMS) i hwyluso lleihau llifynnau tetrazole neu i wella cyfradd y gostyngiad.

Yn fwy diweddar, datblygwyd cenhedlaeth newydd o halwynau tetrazolium sy'n hydoddi mewn dŵr a WST-1 yw'r prototeip o'r rhain [18]. Mae WST-1, sef halen mewnol disulfonated â gwefr negyddol sy'n cynnwys gweddillion ïodin, yn fwy sefydlog na XTT a MTS ym mhresenoldeb 1-methoxy PMS, ei IEA gorfodol. Arweiniodd hyn at farchnata WST-1/{1-methoxy PMS fel pecyn amlhau celloedd un adweithydd cyfleus. Mae sawl halwyn tetrazolium arall yn y gyfres WST wedi'u datblygu, a'r mwyaf defnyddiol ohonynt efallai yw WST-8 [19]. Mae'n ymddangos bod gan WST-8 briodweddau lleihau cellog yn debyg iawn i WST-1 ac mae'n cael ei farchnata'n annibynnol fel assay CCK-8. Mae WST-8 yn gell anhydraidd ac felly'n cael ei leihau'n allgellog, trwy gludo electronau o NADH mewngellol i WST-8 ar draws y bilen plasma wedi'i gyfryngu gan 1-methoxy PMS. Er bod MTT a WST-8/{{-1lleihad methoxy PMS yn cael eu gyrru gan NADH mewngellol, mae'n ymddangos bod ffynhonnell NADH yn wahanol o fewn y ddau ddull hyn. Mae gostyngiad WST-8/1-methoxy PMS yn fwy dibynnol ar y wennol malate/aspartate sy'n cysylltu cylchred asid tricarbocsilig mitocondriaidd-NADH â'r gofod all-mitochondrial [20].

Mewn arbrofion rhagarweiniol, gwnaethom gadarnhau na allai cyfansoddion 1, 2, 3, a 4 leihau'r halen tetrazolium MTT yn uniongyrchol (heb ei ddangos). Yn yr astudiaeth bresennol, dilëwyd dylanwad uniongyrchol y cyfansoddion eu hunain gyda'r adweithydd trwy olchi'r microplates yn ofalus gyda halwynog wedi'i glustogi â ffosffad (PBS) cyn ychwanegu datrysiad MTT neu CCK-8, fel y nodir ym mhrotocolau'r gwneuthurwr. Serch hynny, roedd y canlyniadau a gafwyd gan ddefnyddio'r ddau ddull yn anghyson o hyd (Ffigur 2). Yn ôl y disgwyl, cynyddodd deoriad celloedd â chyfansoddion 1, 2, a 3 leihad yr halen tetrazolium yn formazan porffor, o'i gymharu â'r grŵp rheoli (Ffigur 3), sy'n awgrymu mai dim ond gostyngiad yn yr halen tetrazolium ym mhresenoldeb cyfansoddyn penodol nid yw'n ddigon i farnu gallu'r cyfansawdd i ymyrryd â'r assay MTT.

I benderfynu a allai cyfansoddion 1, 2, 3, a 4 gymell apoptosis mewn celloedd EA.hy926, aseswyd newidiadau morffolegol cellog ac allanoli ffosffatidylserine. Yn gyson â'r gostyngiad mewn hyfywedd cellog a welwyd gyda'r assay CCK-8, roedd canlyniadau dadansoddiad staenio a llif cytometreg Hoechst gan ddefnyddio atodiad V-FITC/PI yn awgrymu mai'r ataliad twf a welwyd ar ôl triniaeth cyfansawdd 1, 2, a 3 oedd yn ddyledus, yn rhannol o leiaf, i apoptosis celloedd EA.hy926. Roedd ein canlyniadau hefyd yn cefnogi'r syniad mai'r grŵp caffeoyl a oedd yn bresennol yng nghyfansoddion 1 a 2 oedd yn gyfrifol am y canlyniadau gwrth-ddweud a gafwyd gyda'r assay MTT.

Yn debyg i'n canfyddiadau, ni ddangosodd Rottlerin, agorwr sianel potasiwm dargludiad mawr cryf, adweithedd tuag at MTT in vitro. Fodd bynnag, fe wnaeth wella'n gryf ffurfio crisialau formazan y tu mewn i gelloedd, canlyniad a oedd mewn gwrthdaro amlwg ag ataliad Rottlerin o NF-κB ac amlhau celloedd a welwyd trwy ddadansoddiad o [3 H] -thymidine ymgorfforiad yn DNA [21]. Priodolwyd y mecanwaith a ddefnyddiodd Rottlerin i leihau MTT i'w effaith datgysylltu mitocondriaidd [22]. Mae gan Rottlerin grŵp dirprwyon asid cinnamoyl. O'i gymharu ag asid cinnamoyl, mae gan gyfansoddyn 3 ddau weddillion hydroxyl ychwanegol, sydd wedi'u lleoli yn C-3 a C-4. Felly, rydym yn dyfalu y gallai'r mecanwaith y mae cyfansoddion 1 a 2 yn ei ddefnyddio i achosi canlyniadau gwrthdaro yn y prawf MTT hefyd fod yn gysylltiedig â'u heffeithiau dadgyplu mitocondriaidd. I brofi'r ddamcaniaeth hon, mae angen astudiaethau cymharol ymhlith cyfansoddion 1, 2, a dadgyplydd cemegol, fel ffenylhydrazone trifluorocarbonylcyanide (FCCP).

Adran Arbrofol

Adweithyddion a Chemegau

Cyfansoddyn 3 (asid caffeic-powdr, purdeb=98.6 y cant ) ei brynu oddi wrth Chengdu Push Bio-Technology Co, Ltd (Chengdu, Tsieina). Cafwyd cyfansawdd 4 (3,4-dihydroxylphenylethanol-olew, purdeb=98.5 y cant ) gan Chengdu Must Bio-Technology Co, Ltd. (Chengdu, China). Cafwyd MTT a dimethyl sulfoxide (DMSO) gan Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, UDA). Prynwyd assay CCK-8 gan Dojin Laboratories (Kumamoto, Japan). Prynwyd pecynnau canfod apoptosis Hoechst 33342 ac atodiad V-FITC/PI gan Sefydliad Biotechnoleg Beyotime (Haimen, Tsieina)

Deunydd Planhigion

Casglwyd coesynnau C. tubulosa o Yutian Prefecture, Rhanbarth Ymreolaethol Xinjiang Uygur, Tsieina. Cafodd sbesimenau talebau eu hadneuo yn Labordy Allweddol Meddygaeth Uchder Uchel, Trydydd Prifysgol Feddygol Filwrol (Chongqing, Tsieina) a'u dilysu gan Yi Zhang o Brifysgol Meddygaeth Tsieineaidd Traddodiadol Chengdu (Chengdu, Tsieina)

Echdynnu ac Ynysu Deunydd Planhigion

Cafodd coesynnau C. tubulosa (0.6 kg) wedi'u haersychu eu powdr a'u tynnu gyda 50 y cant ethanol am 2 awr ar 70 gradd . Ar ôl tynnu'r toddydd o dan bwysau llai, cafodd y dyfyniad ethanolig (212.5 g) ei ddiddymu a'i atal mewn dŵr (2 L) a'i dynnu â n-butanol (2 L × 3). Cafodd y dyfyniad n-butanolig (110 g) ei gromatograffi ar golofn polyamid a'i guro ag ethanol/dŵr (0:100, 5:95, 15:85, 30:70, 50:50) gan gynhyrchu pum ffracsiwn (A–E) . Ffracsiwn B (65 g) ei ffracsiynu ar golofn ODS; elution ag ethanol: dŵr (1:9) cyfansoddyn wedi'i wahanu 1 (3 g). Ffracsiwn D (10.5 g) wedi'i ffracsiynu ar golofn ODS; elution ag ethanol/dŵr (1:4) cyfansoddyn wedi'i wahanu 2 (1 g).

Cofnodwyd sbectra NMR ar sbectromedr Bruker Avance 600 yn CD3OD gyda Tetramethylsilane (TMS) fel safon fewnol. Cynhaliwyd sbectra màs ar sbectromedr màs BioTOF-Q.

Diwylliant Cell

Cafwyd llinellau cell EA.hy926 o'r Casgliad Diwylliant Math Americanaidd (Manassas, VA, UDA). Cafodd celloedd eu meithrin yn RPMI 1640 canolig, wedi'u hategu â serwm buchol ffetws 10 y cant (v / v) ac 1 y cant (v / v) penisilin-streptomycin mewn amgylchedd llaith gyda 5 y cant o CO2 ar 37 gradd .

Hyfywedd Cell

Aseswyd hyfywedd celloedd gan ddefnyddio'r profion MTT a CCK{{{{{}}}}. Diddymwyd cyfansoddion 1 a 2, a'u aglycones, asid caffeic (3) a 3,4-dihydroxylphenylethanol (4) yn DMSO i'r crynodiad DMSO terfynol <0.1 y="" cant="" (v/v)="" mewn="" cyfryngau="">

Cafodd celloedd EA.hy926 eu hadu ar 96-blatiau ffynnon ar 4 × 103 cell/ffynnon. Ar ôl deori am 24 h, cafodd celloedd eu trin â 6.25-50 μM cyfansawdd 1, 2, 3, neu 4 am 24 h. Tynnwyd y cyfrwng meithrin a golchwyd celloedd ddwywaith â halwynog wedi'i glustogi â ffosffad (PBS). Ychwanegwyd Aliquots (10 μL) o stoc hydoddiant MTT (5 mg · ml - 1 ) at bob ffynnon sy'n cynnwys 100 μL o gyfrwng a'i ddeor â chelloedd am 4 h. Ar ôl deori, tynnwyd y cyfrwng ac ychwanegwyd aliquots 150 μL o DMSO at bob ffynnon i hydoddi'r crisialau formazan. Mesurwyd amsugnedd ar 490 nm gan ddefnyddio darllenydd microplate (Bio-Tek Synergy HT, Winooski, VT, USA). Mynegwyd hyfywedd celloedd fel canran y gostyngiad MTT, gan aseinio'r gwerth 100 y cant i amsugno'r celloedd rheoli. Perfformiwyd yr holl arbrofion dair gwaith a'u cyflwyno fel gwyriad safonol cymedrig ± (SD).

Perfformiwyd assay CCK-8 yn dilyn y llenyddiaeth gyda mân addasiadau [23]. Yn benodol, cafodd celloedd eu trin â chyfansoddion 6.25-50 μM 1, 2, 3, neu 4 am 24 h a'u golchi ddwywaith gyda PBS cyn ychwanegu hydoddiant 10 μL CCK-8 a 100 μL o gyfryngau diwylliant. Ar ôl deor y microplate ar 37 gradd am 2 h, mesurwyd amsugnedd ar 450 nm gan ddefnyddio darllenydd microplate. Mynegwyd hyfywedd celloedd fel canran y celloedd hyfyw o'i gymharu â chelloedd rheoli (100 y cant ). Cynhaliwyd yr holl arbrofion dair gwaith a'u mynegi fel cymedr ± SD.

Asesiad Apoptosis gan Hoechst 33342 Staenio

Gwelwyd newidiadau morffolegol apoptotig gan staenio Hoechst 33342. Yn gryno, cafodd celloedd EA.hy926 eu hadu ar 48-blatiau ffynnon (2 × 104 cell/ffynnon) a'u trin â 50 μM cyfansawdd 1, 2, 3, neu 4 am 48 h ar 37 gradd, wedi'u golchi ddwywaith gyda PBS, a sefydlog gyda 4 y cant (v/v) paraformaldehyd am 15 munud ar dymheredd ystafell. Ar ôl rinsio ddwywaith gyda PBS, celloedd eu staenio gyda Hoechst 33342 (10 ug · ml - 1 ) am 5 munud ar dymheredd ystafell a golchi ddwywaith gyda PBS. Delweddwyd niwclysau lliw Hoechst gan ddefnyddio microsgop fflworoleuedd (Olympus, Tokyo, Japan).

Dadansoddiad apoptosis yn ôl Cytometreg Llif

Canfuwyd celloedd apoptotig gan anecsin V-FITC/PI staenio dwbl a dadansoddiad cytometreg llif. Yn fyr, ar ôl triniaeth gyda 50 μM cyfansawdd 1, 2, 3, neu 4 am 48 h, celloedd yn cael eu cynaeafu a'u hailddarparu yn PBS ar 1 × 105 celloedd · ml -1. Ar ôl centrifugio ar 500 × g am 5 munud ar 25 gradd, ychwanegwyd 195 μL o byffer rhwymo anecsin V-FITC a 5 μL o atodiad V-FITC. Ar ôl cymysgu fortecs ysgafn, deorwyd y gymysgedd am 10 munud ar dymheredd ystafell yn y tywyllwch. Ar ôl centrifugio ar 500 × g am 5 munud ar 25 gradd , ychwanegwyd 190 μL o glustogiad rhwymo atodiad V wedi'i gyfuno â FITC a 10 μL DP. Ar ôl cymysgu fortecs yn ysgafn, dadansoddwyd samplau gan ddefnyddio Cytomedr Llif FACSCalibur (Becton Dickinson, San Jose, CA, UDA) o fewn 30 munud.

Dadansoddiad Ystadegol

Mynegwyd yr holl ddata arbrofol fel cymedr ± SD. Aseswyd arwyddocâd y gwahaniaethau rhwng samplau arbrofol a'r rheolaeth gyfatebol trwy ddadansoddiad un ffordd o amrywiant (ANOVA) gan ddefnyddio meddalwedd SPSS (fersiwn 11.5). Gosodwyd arwyddocâd ystadegol yn p <>

Casgliadau

Mae ein canlyniadau'n awgrymu y gallai goramcangyfrif nifer y celloedd hyfyw a welwyd yn yr asesiad MTT guddio sytowenwyndra rhai cyfansoddion. Felly, yn ystod prosesau sgrinio cyffuriau, rydym yn argymell defnyddio amrywiaeth o ddulliau i bennu effaith y cyfansoddyn penodol ar hyfywedd celloedd (fel CCK-8 a 3 asesiad H-TdR) er mwyn osgoi cynhyrchu canlyniadau camarweiniol.