Mae Tubuloside B O Salsa Cistanche yn Achub Y Celloedd Niwronol PC12 O 1-Methyl-4-Apoptosis a Achosir gan Ion a Straen Ocsidiol

Cyswllt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-bost:audrey.hu@wecistanche.com

Guoqing Zheng, Xiaoping Pu, Li Lei, Pengfei Tu, Changling Li

Crynodeb:

Mae'r niwro-amddiffynnoleffeithiau tubuloside B o cistanche, un o'r ffenylethanoidau wedi'u hynysu o'r Tsieineaidmeddyginiaeth lysieuol Cistanche salsa, ar 1-methyl-4-ïon ffenylpyridinium (MPP plus )-apoptosis a achosir a straen ocsideiddiol mewn celloedd niwronaidd PC12 eu hymchwilio. Cafodd celloedd PC12 a gafodd eu trin ag MPP ＋i farwolaeth apoptotig fel y pennir gan assay MTF, cytometreg llif, ac electrofforesis gel agarose DNA; mesurwyd croniad mewngellol o rywogaethau ocsigen adweithiol (ROS) gan staen DCFH-DA gyda microsgopeg confocal sganio laser (LSCM). Triniaeth ar yr un pryd â thuhuloside B MPP wedi'i wanhau'n sylweddol - sytowenwyndra a achosir gan DNA, darnio DNA, a chroniad mewngellol o ROS. Mae'r canlyniadau hyn yn dangos yn gryf bod tubuloside B yn atal apoptosis a achosir gan MPP a straen ocsideiddiol. Gellir cymhwyso Tubuloside B felgwrth-glefyd Parkinsonasiantau.

Rhagymadrodd

Yn patholegol, nodweddir clefyd Parkinson achlysurol (PD) fel arfer gan golli niwronau catecholaminergig, yn enwedig niwronau dopaminergig y substantia nigra pars compacta (SNc), a phresenoldeb intraneurona nodweddiadol| cynhwysiant a elwir yn gyrff Lewy mewn rhanbarthau ymennydd yr effeithir arnynt. Er bod amrywiaeth o ffactorau wedi'u cysylltu â phathogenesis PD, mae'r mecanweithiau sy'n ymwneud â chychwyn a dilyniant PD yn parhau i fod yn ansicr, Er bod achos PD yn parhau i gael ei ateb, mae sawl llinell o dystiolaeth yn awgrymu'n gryf bod straen ocsideiddiol yn cymryd rhan, gan arwain o'r diwedd. i farwolaeth niwronol neu apoptosis gan y genhedlaeth ormodol o radicalau rhydd [1 ], [2], [3]. Mae'r ffaith y gall y system dopaminergig nigral gynhyrchu lefelau uchel o radicalau rhydd ac mae ganddi lefelau cymharol isel o system amddiffyn gwrthocsidiol yn cefnogi'r rhagdybiaeth hon ymhellach. Dangosodd astudiaethau in vivo ac in vitro niwrowenwyndra ocsideiddiol o MPP ＋, metabolyn gweithredol o l-methyl-4-phenyl-l,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) ar niwronau dopaminergig [4 ], [5]. Mae cynnwys radicalau rhydd a gynhyrchir yn ormodol gan straen ocsideiddiol fel achos agos at anhwylderau niwroddirywiol fel PD yn awgrymu rôl ganolog i gwrthocsidyddion. Roedd Tubuloside B (Ffig. l) yn un o'r cyfansoddion ffenylethanoid a ynysu oddi wrth goesynnauCistanche salsa. Roedd astudiaethau blaenorol wedi canfod bod llawer o ffenylethanoidau gan gynnwys tubuloside B yn dangos gweithgaredd sborion radical rhydd cryf [6], [7].

O ystyried y canfyddiadau hyn, gwnaethom ymchwilio yn yr astudiaeth bresennol i effaith tubu]nside B ar niwrowenwyndra in vitro a achosir gan MPP plus, gan ddefnyddio'r llinell gell nerf ffeochromocytoma sympathetig PC12 sydd wedi'i defnyddio'n llwyddiannus dros y blynyddoedd i astudio swyddogaeth niwronaidd [8], [9].

clefyd gwrth-Parkinson:cistanche

Defnyddiau a Dulliau

Defnyddiau

Tubuloside B oCistanche salsaei gyflenwi yn garedig gan Dr. Li Lei (Adran Cynhyrchion Naturiol, Ysgol Gwyddorau Fferyllol, Prifysgol Peking, Beijing, Tsieina). Roedd purdeb y cyfansawdd yn fwy na 98 y cant yn ôl dadansoddiad HPLC. Prynwyd cyfrwng Eagle (DMEM) addasedig Dulbecco, serwm ceffyl, a serwm llo ffetws oddi wrth GIBCO BRL, 1-ïon methyl~-phenylpyridinium (MPP plus ), poly-L-lysin, 3-(4, 5 -dimethylthiazol-2 -yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromid (MTT), propidium ïodide (PI), RNase A, proteinase K, a 2; 7'-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) gan Sigma.

Diwylliant celloedd

Roedd celloedd PCI2 yn cael eu cynnal yn DMEM wedi'u hategu â serwm ceffyl o 10 y cant, 5 y cant o serwm llo ffetws, penisilin 100U/ml a streptomycin 100ug/ml. Cafodd y celloedd eu meithrin mewn deorydd llaithedig wedi'i awyru â 95 y cant o aer a 5 y cant o CO2 ar 37 gradd. Cynhaliwyd pob arbrawf 24-48 h ar ôl i gelloedd gael eu hadu. Roedd y celloedd yn cael eu cynaeafu'n rheolaidd gan trypsinization 0.25 y cant pan ddaeth y celloedd at y cam is-gydlif a'u platio mewn fflasgiau diwylliant 25 cm wedi'u hollti yn 1: 8.

Dadansoddiad o hyfywedd celloedd

Penderfynwyd ar hyfywedd y gell gan ddefnyddio assay MTT wedi'i addasu fel y disgrifiwyd yn flaenorol [10], Yn gryno, cafodd celloedd PC12 eu hadu mewn 96-blatiau ffynnon ar ddwysedd o I × 104 ceils fesul ffynnon. Tyfwyd y diwylliannau am 48 h, ac yna newidiwyd y cyfrwng i'r un sy'n cynnwys crynodiadau amrywiol o ochr tubuln B neu MPP＋. Ar ôl deori am hyd at 48h a 72 h, ychwanegwyd toddiant MTr (5 mg/ml mewn DMEM) at y 96-blatiau ffynnon a chaniatawyd i'r celloedd ddeor am 4 awr ar 37 gradd. Ar ôl i'r cyfrwng gael ei dynnu, cafodd y crisialau cell a llif eu solubilized trwy ychwanegu 200μL o DMSO, a mesurwyd yr amsugno ar 570nm (540 nm fel cyfeiriad) gyda model darllenydd microplate 550 (Bio-Rad). Dadansoddwyd hyfywedd celloedd hefyd gan ddefnyddio'r dull gwahardd glas trypan. Casglwyd y celloedd, eu pelennu'n ysgafn, a'u staenio â thoddiant 0.6 y cant o drypan glas ar gyfer 3 glaw. Aseswyd canran y celloedd heb liw wedi hynny mewn deg maes microsgop a ddewiswyd ar hap. Fel cyffur positif, defnyddiwyd ffactor twf epidermaidd 100 ng ／ml (EGF).

Canfod apoptosis trwy sytometreg llif

Canfuwyd celloedd apoptotig gan cytometreg llif gan ddefnyddio propidium ïodid (PI) [11 ]. Yn gryno, cynaeafwyd tua 1 × 106 o gelloedd wedi'u deor â sylweddau prawf trwy allgyrchu ac fe'u golchwyd unwaith gyda PBS. Cafodd celloedd eu gosod gyda 70 y cant ethanol am 24 awr ar - 20 gradd a'u golchi unwaith gyda PBS. Yna cafodd celloedd eu hailddarparu mewn 300μL o PBS yn cynnwys 0.5 mg/ml RNase a 0.5 mg/ml DP. Ar ôl deori pellach am 30 munud yn y tywyllwch, perfformiwyd cytometreg llif gyda FACScan (Becton Dickinson, Heidelberg, yr Almaen).

Fe wnaethon ni gymhwyso protocol Moore [12] a oedd yn ynysu DNA darniog yn unig a chafodd arbrofion eu normaleiddio trwy ddefnyddio nifer cyfartal o ddiwylliannau o bob grŵp prawf. Yn gryno, golchwyd 3 × 106 niwron o bob un o'r samplau a gafodd eu trin yn hydoddiant halen cytbwys Hank (1000g am 10 munud), a chafodd y pelenni a ffurfiwyd ar waelod y tiwb eu homogeneiddio gyda byffer lysis 1 ml (10 mM Tris ar pH 7.4. 5 mM EDTA, 1 y cant Triton X-100) am 20 munud ar rew. Ar ôl centrifugio ar 11,000 g ar gyfer 20 glaw ar 4 gradd , cafodd gornaturiaid sy'n cynnwys DNA tameidiog eu tynnu a'u treulio gyda 20 mg/ml RNase A ar 37 gradd am 1 h, a 0.1 mg/ml proteinase K ar 56 gradd am 1 h ychwanegol. Echdynnwyd y DNA darniog gan ddefnyddio ffenol a chlorofform a'i allgyrchu ar 1O,000g ar gyfer 1 glaw ar 4 C. Trosglwyddwyd y cyfnod dyfrllyd i diwb Eppendorf newydd, wedi'i gymysgu â 2 gyfrol o ethanol oer-iâ, ac yna gosod ar-20 gradd am o leiaf 1 awr i waddodi DNA. Ar ôl centrifugio yn 15,000g am 20 munud ar 4 gradd, tynnwyd supernatants, a golchiwyd pelenni DNA â 80 y cant ethanol unwaith (15,000 g am 15 munud ar 4 gradd), wedi'i awyrsychu, a'i hydoddi mewn 20μL TE byffer ar pH 7.6. Yna electrofforeswyd y sampl gyfan ar gel agarose 1.5 y cant am 1 awr ar 85 V. Archwiliwyd y gel a thynnwyd llun gan System Dogfennaeth Gel Cynhyrchion Ultra Violet (GELDOC-2000, Bio-Rad, UDA).

Mesur ar gyfer ffurfiant ROS mewngellol

Canfuwyd ffurfio perocsidau mewngellol gyda microsgop laser sganio confocal gan ddefnyddio cyfansoddyn nad yw'n fflwroleuol, 2"7"-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) [13], sy'n cael ei esterified o fewn celloedd gan esterases mewndarddol i'r asid rhydd ïoneiddiedig, 2 ;7"-dichlorofluorescein. 2",7-Mae dichlorofiuorescin yn gallu cael ei ocsidio i fflwroleuol 2"7"-dichlorofluorescein (DCF) gan hydroantioxidants. Deorwyd celloedd â 10 μM DCFH-DA am 30 munud ar 37 gradd . Cafodd diwylliannau eu golchi ddwywaith gyda hydoddiant halen cytbwys Hank a'u delweddu yn yr un cyfrwng. Gwnaed delweddu gan ddefnyddio microsgop laser sganio confocal, roedd DCF yn gyffrous ar 488 nm ac roedd yr hidlydd allyriadau yn hidlydd rhwystr 510nm, Er mwyn darparu cymhariaeth ddilys, defnyddiwyd yr un paramedrau caffael ar gyfer yr holl arsylwadau. Gosodwyd y safle fertigol gorau posibl yng nghanol y celloedd, ac yna cafodd y cae ei sganio'n gyflym. Oherwydd bod goleuo ar y donfedd cyffro o 488 nm wedi achosi mwy o fflworoleuedd oherwydd ocsidiad y llifyn hwn, roedd pob cae yn agored i olau am yr un amser yn union. Defnyddiwyd gwerthoedd gwaelodlin o gelloedd heb eu symbylu fel gwerthoedd rheoli i gymharu â chelloedd a drinnir gan MPP ym mhresenoldeb neu absenoldeb tubuloside B. Ar ôl sganio, mesurwyd dwyster fflworoleuedd cymharol cyfartalog mewn 15-20 o gyrff celloedd niwronaidd fesul maes microsgop mewn pedwar. diwylliannau ar wahân fesul cyflwr triniaeth.

cistanche

Dadansoddiad ystadegol

Mynegwyd yr holl werthoedd a gafwyd fel modd ±SD. Cafodd arwyddocâd ystadegol gwahaniaethau rhwng grwpiau ei bennu gan brawf-t Myfyriwr; Ystyriwyd bod gwerthoedd p wedi'u cyfrifo o lai na 0.05 yn ystadegol arwyddocaol.

Canlyniadau

Fel y dangosir yn Ffig. 2, cynhyrchodd MPP plus leihad dos-ddibynnol yn hyfywedd y celloedd PCI2. Mewn cyferbyniad, cynhyrchodd EGF, ffactor niwrotroffig adnabyddus, amddiffyniad sylweddol o hyfywedd celloedd ar 100ng/mL MPP; gwanhawyd effeithiau sytotocsig a achosir hefyd ym mhresenoldeb tubuloside B (5, 10, 50 neu 100ug-ml-1 ), er gyda llai o nerth na'r cyffur cyfeirio (Ffig .3). Roedd Tubuloside B yn y crynodiadau hyn yn arddangos effeithiau cytoprotective mewn modd dos-ddibynnol ac nid oedd y cyfansoddyn yn unig yn achosi unrhyw sytowenwyndra ymddangosiadol (data heb ei ddangos). Dangosodd electrofforesis gel o'r echdyniad DNA o gelloedd PCI 2 a gafodd ei drin â 200 µM MPP a mwy am 48 h ysgol DNA. dilysnod clasurol o apoptosis, tubuloside B, ar ddosau o 10 a 100 μ g·ml-1ffurfiannau addysgiadol o'r ysgol DNA(Ffig. ym mhresenoldeb neu absenoldeb tubuloside B. Datgelodd meintiad o'r proffil cylchred gell gyda DP nifer y ceils gyda nodweddion subdiploid (rhanbarth M1) sy'n arwydd o ddarniad DNA apoptotig. Mewn celloedd heb eu trin, roedd y ffracsiwn subdiploid apoptotig yn fach iawn hyd at 5 ．94 ％ o gyfanswm o 10000 o gelloedd (Ffig ．5 A). Ar ôl 48 h amlygiad i MPP＋, cynyddodd canran yr apoptosis i 43．02;j; (Ffig. 5 B)． O'i ychwanegu at y diwylliant celloedd, roedd tubuloside B yn atal apoptosis a achosir gan MPP mewn modd sy'n dibynnu ar ddos. Ar grynodiad o 10 ug·ml-1nid oedd yr amddiffyniad gan diwbwloside B yn ystadegol arwyddocaol, ond yn 50 a 1 00ug·ml-1, gostyngiad o 45％ a 63％yn y drefn honno, sylwyd gan arwain at gynnydd yng nghanran y celloedd goroesi (Ffig. 5D, E).

Gellir canfod croniad o ROS mewngellol trwy ddefnyddio celloedd DCFH - DA ．PC12 wedi'u trin â 200 uM MPP＋ am 48 h wedi'u harddangos fflworoleuedd dwys y tu mewn i'r gell ar ôl eu staenio â llifyn DCFH-DA (Ffig . 6). Roedd triniaeth ar yr un pryd â tubuloside B (ar ddosau o 10 a 100ug·ml.) yn atal cynhyrchu ROS a achosir gan MPP＋一 (canran is oedd 24．52％ a 55．63％, yn y drefn honno).

Trafodaeth

Mae pathogenesis PD yn cynnwys straen ocsideiddiol cryf, lefelau gwrthocsidiol is, a diffygion mitocondriaidd. gwyddys eu bod i gyd yn achosi apoptosis mewn sawl system gellog. Yn benodol, dangoswyd bod radicalau rhydd yn sbarduno marwolaeth celloedd gweithredol mewn niwronau[14]. Mae MPTP yn cynhyrchu syndrom di-droi'n-ôl a difrifol tebyg i parkinsonian sy'n achosi dirywiad detholus yn y niwronau dopaminergig nigrostriatal mewn pobl. Mae'r niwrotocsin hwn wedi'i ddefnyddio i greu modelau anifeiliaid o PD[15] ．Mae MPTP yn cael ei drawsnewid gan monoamine ocsidas B i MPP＋, sy'n cael ei gronni mewn mitocondria. lle mae'n atal cymhleth mitocondriaidd I a'r dyddiau mitocondriaidd hynny. Mae swyddogaeth yn achosi apoptosis[16].

Yn yr astudiaeth bresennol, rydym wedi dangos bod tubuloside B yn lleihau marwolaeth celloedd a achosir gan MPP a mwy trwy straen ocsideiddiol mewn celloedd PC12. Ymhellach, dangoswyd bod tubuloside B hefyd yn amddiffyn mewn modd sy'n dibynnu ar ddos ​​yn erbyn yr ysgol DNA a achosir gan MPP a mwy. ac apoptosis, fel y'i mesurir gan ddefnyddio electrofforesis gel DNA a dadansoddiad cytometrig llif. At hynny, roedd triniaeth ar yr un pryd â chrynodiadau uwch o tubuloside B yn atal cynhyrchu ROS a achosir gan MPP. Felly, mae tubuloside B wedi dangos effeithiau niwro-amddiffynnol aml-swyddogaethol. Gall nifer o fecanweithiau, ar wahân neu ar y cyd, fod yn gysylltiedig â gweithredoedd tubuloside B. Mae'r effaith gwrthocsidiol yn fecanwaith posibl ar gyfer niwro-amddiffyniad trwy gyfrwng tubuloside B. Canfu Xiong Q fod tubuloside B yn dangos gweithgaredd sborionu radical rhydd cryf ar yr 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical a xanthine]xanthine oxidase a gynhyrchir gan superoxide anion radical [6].

Adroddwyd yn ddiweddar bod sawl ffenylethanoid yn meddu ar briodweddau sborion radical rhydd ac yn amddiffyn anafiadau gwenwynig a achosir gan straen ocsideiddiol. Mae ROS a gynhyrchir gan MPP plus fel hydrogen perocsid, superoxide anion, a hydroxyl radical yn niweidio moleciwlau biolegol yn hawdd, a all yn y pen draw arwain at farwolaeth celloedd apoptotig neu necrotig. Felly, gall tubuloside B gael effeithiau sborionio uniongyrchol yn erbyn ROS. Er nad yw ein data yn sefydlu'r union safle lle mae tubuloside B yn gweithredu i atal cronni ROS, maent yn awgrymu bod y mecanwaith niwro-amddiffynnol yn cynnwys ysgogi llwybrau gwrthocsidyddion. Mae astudiaeth o adeiledd moleciwlaidd tubuloside B hefyd yn dangos ei fod yn meddu ar allu cryf i chwilota am radicalau rhydd (cyfathrebu personol).

Gallai mecanweithiau eraill fod yn berthnasol hefyd. Er enghraifft, efallai y bydd gan tubuloside B y gallu i wrthweithio gwenwyndra MPP＋ trwy atal agor mandwll trawsnewid athreiddedd mitocondriaidd a chamweithrediad. Yn ogystal, dylid hefyd ystyried a yw tubuloside B yn cael effaith hyrwyddo twf uniongyrchol ar gelloedd niwronaidd. Mae union fecanwaith gweithred niwro-amddiffynnol tubuloside B yn parhau i fod yn aneglur. Mae angen astudiaethau ychwanegol i egluro'r darlun llawn o'i effaith niwro-amddiffynnol.

Yn derfynol, mae gan tubuloside B o echdyniad salsa Cistanche effeithiau amddiffynnol amlwg ar apoptosis a achosir gan MPP ynghyd â straen ocsideiddiol. Gallai ei effeithiau niwro-amddiffynnol yn erbyn gwenwyndra MPP ＋ fod yn bwysig ac awgrymu y gallai fod ganddo botensial therapiwtig wrth atal a thrin PD.

trin PD: cistanche

Cyfeiriadau

7. Xiong Q, Tezuka Y, Kaneko 1", Li H, Tran LQ Hase K, Namba T, Kadota S. Gwahardd ocsid nitrig gan ffenylethanoids mewn macroffagau actifedig. Eur J Pharmaco12000; 400:137 -44

8. Greene LA, Tischler AS. Sefydlu llinell glonaidd noradrenergig o gelloedd pheochromocytoma adrenal sy'n ymateb i ffactor twf nerfau. Proc Nat Acad Sci 1976; 73:2424-8

9. Yao Z, Drieu K, Szweda LI, Papadopoulos V. Nid yw radicalau rhydd a perocsidiad lipid yn cyfryngu - marwolaeth celloedd niwronaidd a achosir gan amyloid. Ymennydd Res 1999; 847: 203- 10

10. Yamamoto T, Yuyama K, Nakamura K, Kato T, Yamamoto H. Nodweddu cinetig y gwenwyndra nitrig ocsid ar gyfer celloedd PC12: effaith hanner oes amser rhyddhau DIM. Eur J Pharmacol 2000; 397:25-33

11. Nicoletti l, Migliorati G, Pagliacci MC, Grignani E Riccardi C. Dull cyflym a syml ar gyfer mesur apoptosis thymocyte trwy staenio ïodid propidium a cytometreg llif. J Dulliau Imiwnol 1991; 139: 271-9

12. Moore KJ, Matlashewski C. Mae haint mewngellol gan Leishmania do nova yn atal apoptosis macrophage. J Immunol 1994; 152: 2930- 7

13. Mark RJ, Keller JN, Kruman I, Mattson AS. Mae FGF sylfaenol yn gwanhau straen ocsideiddiol amyloid a achosir gan beptid, camweithrediad mitocondriaidd, a nam ar weithgaredd Na ＋-K ＋-ATPase mewn niwronau hippocampal. Ymchwil i'r Ymennydd 1997; 756: 205-14

14. Merad-Boudia M, Nicole A, Santiard-Baron D, Saille C, CeballosPicot L Nam mitochondrial fel digwyddiad cynnar yn y broses o apoptosis a achosir gan ddisbyddiad glutathione mewn celloedd niwronaidd: perthnasedd i glefyd Parkinson. Biochem Pharmaco11998; 56: 645-55

15. Langston JW, Ballard P, Tetrud JW, Irwin I. Parkinsonism cronig mewn bodau dynol oherwydd cynnyrch o synthesis meperidine-analog. Gwyddoniaeth 1983; 219:979-80

16. Mizuno Y, Sone N, Suzuki K, Saitoh T. Astudiaethau ar wenwyndra 1-me ethyl-4-ïon phenylpyridinium (MPP ＋) yn erbyn mitocondria ymennydd y llygoden.J Neurol Sci 1988; 86: 97-110