A yw'r Gymdeithas Y Rhai Prin Rs35667974 IFIH1 Amryffurfedd Genynnau Gyda Chlefydau Awtoimiwn Yn Achos O ​​Epigeneteg RNA?

delweddu - AA, AP, ac EEE, goruchwyliaeth - EEE, a chaffael cyllid - EEE. Mae pob awdur wedi darllen a chytuno i'r fersiwn cyhoeddedig o'r llawysgrif. Haniaethol

Mae interfferon a achosir gan hofrennydd C sy'n cynnwys genyn protein 1 (IFIH1) yn amgodio hofrennydd RNA cytoplasmig a elwir fel arall yn 5 sy'n gysylltiedig â gwahaniaethu melanoma (MDA5), hofrennydd tebyg i RIG sy'n adnabod RNA firaol ac sy'n ymwneud â chynhenid. imiwnedd trwy gydnabod RNA firaol. O'i rwymo i RNA dwy-sownd (ds), mae MDA5 yn ffurfio cynulliad ffilamentaidd ar hyd dsRNA ac yn defnyddio llofnodion moleciwlaidd i wahaniaethu rhwng yr hunan, yn erbyn anhunan yn seiliedig ar hyd dsRNA a methylation. Mae ei amrywiad missense rs35667974 yn amddiffyn rhag diabetes math 1, soriasis, ac arthritis soriatig, ond canfyddir hefyd ei fod yn gysylltiedig â risg uwch ar gyfer spondylitis ankylosing, clefyd Crohn, a colitis briwiol. Er mwyn cael mewnwelediad i rôl gymhleth yr amrywiad hwn, gwnaethom ddadansoddiad strwythurol o MDA5 mewn cymhleth gyda dsRNA gan ddefnyddio efelychiadau deinameg moleciwlaidd.

Mae ein data yn awgrymu, er nad yw treiglad Ile923Val yr amrywiad rs35667974 yn effeithio'n sylweddol ar rwymo i dsRNA brodorol, mae'n dangos effaith ansefydlogi ym mhresenoldeb methylation wridin 2′-O. Felly, mae presenoldeb 2′-O-methylation yn y dsRNA yn cyflwyno llofnod synhwyro sy'n arwain at ostyngiad detholus yng ngweithgaredd catalytig cyffredinol MDA. Mae'r astudiaeth hon yn cynrychioli gwerthusiad o rôl yr amrywiad rs35667974 a rennir o locws awtoimiwn IFIH1, yr adroddwyd ei fod yn arwain at leihau gweithgaredd catalytig y ffenoteip MDA5 wedi'i addasu yn ddetholus ac, o ganlyniad, llai o adborth negyddol ar signalau cytocin a chemocin ac amddiffyniad dethol rhag hunanimiwn. .

Mae parth helicase C yn brotein ensym pwysig sy'n gallu dad-ddirwyn strwythur helics dwbl DNA. Gall helpu DNA i gwblhau'r atgynhyrchu, golygu a chyflwyno cywir yn y broses o ddyblygu, atgyweirio a thrawsgrifio celloedd, ac mae'n un o'r allweddi i swyddogaeth arferol celloedd. Ar yr un pryd, mae imiwnedd yn fecanwaith amddiffyn pwysig iawn yn y corff dynol, a all ein hamddiffyn yn effeithiol rhag pathogenau fel bacteria a firysau.

Mae astudiaethau wedi dangos bod parth helicase C yn chwarae rhan bwysig mewn imiwnedd. Yn gyntaf oll, gall parth helicase C sicrhau sefydlogrwydd ac effeithlonrwydd codio genynnau trwy helpu i ddyblygu, atgyweirio a thrawsgrifio DNA cellog arferol, a thrwy hynny wella imiwnedd y corff dynol. Yn ail, gall y parth helicase C hyrwyddo adnabyddiaeth o moleciwlau heterogenedd protein gan gelloedd, a rheoleiddio trawsgludiad signal y system imiwnedd, a thrwy hynny gefnogi swyddogaeth amddiffyn y corff. Mae'r ddau ddull uchod wedi chwarae rhan gadarnhaol wrth hyrwyddo cynnal a gwella imiwnedd.

Yn ogystal, mae'r astudiaeth fanwl o'r berthynas rhwng y parth helicase C ac imiwnedd hefyd yn darparu ysbrydoliaeth bwysig i ni ddarganfod cyffuriau newydd ar gyfer trin canser a chlefydau sy'n gysylltiedig ag imiwn. Gall datblygu cyffuriau a therapi genynnau sy'n targedu parth helicase C wella ymwrthedd y corff i ganser a chlefydau eraill sy'n gysylltiedig ag imiwnedd, a helpu cleifion i ymdopi'n well â thrin ac adfer clefydau cysylltiedig.

I grynhoi, mae'r berthynas rhwng parth helicase C ac imiwnedd yn agos iawn, ac mae'n chwarae rhan hanfodol wrth sicrhau sefydlogrwydd genynnau, hyrwyddo imiwnedd cellog, a chefnogi amddiffyn y corff. Y gobaith yw, trwy ddulliau ymchwil a thriniaeth berthnasol, y gallwn gynnal a gwella imiwnedd dynol yn well a chreu bywyd iachach a gwell i ni. O'r safbwynt hwn, mae angen inni wella imiwnedd personol. Mae Cistanche yn cael effaith sylweddol ar wella imiwnedd oherwydd bod past cig yn gyfoethog mewn amrywiaeth o sylweddau gwrthocsidiol, megis fitamin C, fitamin C, carotenoidau, ac ati. Gall y cynhwysion hyn chwilota radicalau rhydd a lleihau straen ocsideiddiol. Ysgogi a gwella ymwrthedd y system imiwnedd.

Cliciwch budd-daliadau cistanche tubulosa

Geiriau allweddol

Amryffurfedd niwcleotid sengl (SNP) · Model moleciwlaidd · Interfferon a achosir gan helicas C parth 1 (IFIH1) · Gwahaniaethu melanoma-gysylltiedig 5 (MDA5) · methylation RNA.

Rhagymadrodd

Mae genynnau a mecanweithiau sy'n ymwneud â chlefydau awtoimiwn, sy'n effeithio ar tua 5 y cant o'r boblogaeth, yn dal i fod yn anodd dod o hyd iddynt, ond mae data cronnus yn awgrymu'n gryf y gall gwahanol glefydau hunanimiwn rannu cefndir genetig cyffredin, gan dynnu sylw at fodolaeth amrywiadau a rennir gan wahanol glefydau hunanimiwn. (Zhernakova et al. 2009). Mae ceisio datod y wybodaeth enetig hon i fecanweithiau biolegol ystyrlon sy'n arwain at afiechydon yn cyfeirio at adnabod genynnau achosol. Mae nodi amrywiadau sy'n achosi clefydau yn dasg anodd ond angenrheidiol er mwyn ceisio sefydlu dulliau effeithiol o ragfynegi, atal ac ymyrryd (Biros et al. 2005).

Mae gwahanol fathau o foleciwlau RNA yn ymwneud â rheoleiddio sawl proses fiolegol, gan gynnwys RNA negesydd (mRNA), RNA trosglwyddo (tRNA), RNA ribosomaidd (rRNA), microRNA (miRNA), a RNA digodio hir (lncRNA). Mae moleciwlau RNA yn cynnwys nifer o (mwy na 150) o addasiadau cemegol (Machnicka et al. 2013; Boccaletto et al. 2018). Mae'r addasiadau hyn wedi'u cysylltu'n swyddogaethol â phob cam o fetaboledd RNA, megis strwythur, sefydlogrwydd, a rhyngweithiadau, ac maent yn chwarae rolau hanfodol mewn sawl proses fiolegol, megis modiwleiddio dyblygu firysau ac ymatebion imiwnedd gwrthfeirysol (Machnicka et al. 2013). Yn eu plith, mae methylation ribose ymhlith yr addasiadau mwyaf hollbresennol a geir yn RNA. Mae 2′-O -methyluridine i'w gael mewn rRNA, snRNA, snoRNA, a tRNA o Archaea, Bacteria, ac Eukaryota (Aučynaitė et al. 2018). Mae'r ribos-2′-Omethylation yn cynyddu hydroffobigedd niwcleotidau ac yn eu hamddiffyn rhag gweithrediad niwcleasau (Yildirim et al. 2014).
Mae tystiolaeth gronnus yn dangos bod 2′-O-methylation o RNA firaol (2′OMe-RNA) yn chwarae rhan bwysig wrth osgoi ymatebion imiwnedd cynhenid ​​cellog yn y celloedd cynnal (Dmitrova et al. 2019). Mae Züst a chydweithwyr wedi dangos bod 2′ OME o RNA firaol wedi cyfrannu at osgoi ymateb gwrthfeirysol cyfryngol interfferon (IFN), a thrwy hynny hyrwyddo atgynhyrchu firaol (Züst et al. 2011). Hefyd, mae Vitali a Scadden wedi cynnig bod IU-dsDNA yn atal llwybr ysgogol MDA5 IFN (Vitali a Scadden 2010).

Mae interferon a ysgogwyd â genyn parth 1 (IFIH1) helicas yn amgodio hofrennydd RNA cytoplasmig a elwir hefyd yn MDA5 (protein sy'n gysylltiedig â gwahaniaethu Melanoma 5), ​​ac mae'n dderbynnydd tebyg i RIG-I (RLR) sy'n cyflawni swyddogaeth gwrthfeirysol mewn imiwnedd cynhenid trwy ganfod RNAS firaol. Mae MDA5 yn cydnabod 0.5–1 kb strwythur coesyn deublyg RNA sydd fel arfer yn cael ei ffurfio yn ystod atgynhyrchu picornafirol ac yn cyfryngu ymateb imiwn i haint firaol (Nejentsev et al. 2009; Crow 2011). Mae MDA5, ar ôl canfod RNAs hirfain dwy-sownd firaol (dsRNAs), a gynhyrchir wrth ddyblygu picornafirysau, yn actifadu llwybr signalau interfferon math I. Mae astudiaethau wedi dangos bod MDA5 yn ffurfio ffilament ar hyd dsRNA ac yn defnyddio deinameg ffilament-ddibynnol ATP i wahaniaethu rhwng hunan a rhai nad ydynt yn hunan yn seiliedig ar hyd dsRNA (Toro et al. 2015). Dangoswyd bod MDA5 yn ymwneud â modiwleiddio crosstalk rhwng celloedd a'r system imiwnedd gynhenid ​​/ addasol trwy gynhyrchu cytocinau a chemocinau yn lleol.

Gall newidiadau mewn mynegiant a/neu weithgaredd MDA5 sbarduno ymatebion celloedd i dsRNA, sgil-gynnyrch atgynhyrchu firws (Colli et al. 2010). Dangoswyd hefyd bod treiglo gweddillion sy'n gysylltiedig â ffurfiant fflamaidd yn arwain at golli ffurfiant ffilament a signalau dibynnol MDA, heblaw am bâr o dreigladau, sy'n gwella signalau yn gymedrol. Mae'r canlyniadau hyn yn awgrymu bod mecanweithiau ATP-annibynnol, hy, rhwymiad RNA tynnach a/neu ryngweithio protein-protein mwy sefydlog, yn debygol o fod yn gyfrifol am sefydlogrwydd a arsylwyd ar ffurfiant ffilament MDA5 in vitro ac am weithgaredd signalau uwch mewn celloedd (Sohn a Hur 2016).

Roedd Smyth et al. (2006) a Nejentsev et al. (2009) yn disgrifio alel prin o'r genyn IFIH1 sy'n amddiffyn rhag diabetes math 1 (T1D). Mae'r polymorffedd niwcleotid sengl rs35667974 IFIH1 hwn (SNP), lle mae isoleucine wedi'i gadw (codon [ATT]) ar safle #923 yn newid i faline (codon [GTT]), yn amrywiad prin gan mai C {{ yw amledd alel bach (MAF) 9}}.010031 (2655 o unigolion mewn cyfanswm sampl o 264690) yn seiliedig ar TOPMED (Taliun et al. 2021) a C = 0.016267 (3343 o unigolion mewn cyfanswm sampl o 205514) yn seiliedig ar ALFA (Phan et al. al. 2020; Sherry et al. 2001). Yn Nhabl 1 cyflwynir y bioddaearyddiaeth ddynol o amlder yr amryffurfedd mewn gwahanol ranbarthau cyfandirol yn seiliedig ar ddata prosiect ALFA (Phan et al. 2020; Sherry et al. 2001). Cadarnhaodd astudiaethau dilynol fod yr alel prin hwn yn cael yr un effaith ar T1D, psoriasis (PS) (Li et al. 2010), ac arthritis soriatig (PsA) (Budu-Aggrey et al. 2017). I'r gwrthwyneb, mae'r PCE hwn wedi'i gysylltu fel ffactor risg ar gyfer tueddiad i ddatblygu spondylitis ankylosing (AS) (Ellinghaus et al. 2016), clefyd Crohn (CD) (Ellinghaus et al. 2016; Budu-Aggrey et al. 2017 ), a colitis briwiol (UC) (Ellinghaus et al. 2016; Budu-Aggrey et al. 2017).

Mae Chistiakov et al. (2010) wedi dangos bod treigladau colli-swyddogaeth E627X ac I923V o MDA5 yn gysylltiedig â poly(I: C) is - a achosir gan interfferon- cynhyrchu mewn celloedd mononiwclear gwaed ymylol o gleifion diabetes math 1 ac felly yn T1D amddiffynnol. Dywedir hefyd, yn y moleciwl MDA5, fod yr amnewidiad asid amino I923V yn byw yng nghyffiniau gweddillion H927, sy'n cyfrannu at rwymo dsRNA (Yoneyama a Fujita 2008). Fodd bynnag, dangoswyd bod gan yr amrywiad MDA I923V allu arferol ar gyfer rhwymo dsRNA ond 2.5-plyg gweithgaredd catalytig llai (Shigemoto et al. 2009). Felly, mae'n ymddangos nad yw'r amryffurfedd hwn yn effeithio'n fawr ar briodweddau rhwymo asid niwcleotid yr helicas synhwyro RNA cytoplasmig hwn ond mae'n newid ei swyddogaeth trwy fecanwaith anhysbys o hyd.

Darganfuwyd y berthynas rhwng amryffurfedd IFHI1 ac achosion o haint enterofirws yn T1D a'r cysylltiad rhwng yr amrywiad MDA5 I923V ac amlder RNA enterofirol mewn cleifion T1D (Looney et al. 2015). Ymhellach, dangosodd astudiaethau diweddar ar lygod MDA5- a MAVSknockout rôl hollbwysig y proteinau hyn wrth gyfryngu ymatebion interfferon math 1 yn erbyn firws Coxsackie B (Wang et al. 2010). Dangosir bod protein arweinydd mengofeirws yn atal mynegiant IFN- trwy rwystro'r pylu IRF3 sydd ei angen ar gyfer actifadu'r ffactor hwn (Hato et al. 2007). Mae'r arsylwad hwn yn awgrymu bod amrywiadau sy'n tarfu ar swyddogaeth IFIH1 yn yr ymateb gwrthfeirysol gwesteiwr wedi'u dewis yn negyddol, yn hytrach na'u dewis yn gadarnhaol oherwydd eu bod yn amddiffyn rhag T1D (Crow 2011).

Mae Chow et al. (2018) wedi dadansoddi'n helaeth ymhlith eraill y derbynyddion tebyg i RIG-I, tra bod Brisse a Ly (2019) wedi adolygu'n helaeth esblygiad a rhywogaethau MDA5 a'i RIG-I cysylltiedig. Arweiniodd lleoliad y gweddillion newidiedig yn neu'n agos at y safleoedd rhwymo RNA ac ATP neu'r rhyngwyneb ffilament i ni ddamcaniaethu y gallai'r treigladau a arsylwyd wella sefydlogrwydd y ffilament IFIH1 trwy gynyddu'r affinedd cynhenid ​​rhwng IFIH1 a dsRNA neu rhwng IFIH1 moleciwlau yn y ffilament neu drwy leihau effeithlonrwydd hydrolysis ATP ac, felly, cyfradd dadosod ffilament (Rice et al. 2014).

Mae'r gwaith hwn yn cynrychioli astudiaeth strwythurol o rôl bosibl yr amrywiad rs35667974 a rennir o locws hunanimiwn IFIH1, yr adroddwyd ei fod yn arwain at ffenoteip swyddogaeth ataliedig yn amgodio amnewid asid amino Ile923Val yn y cynnyrch protein genyn IFIH1 MDA5. Mae'r olaf yn genyn ymgeisydd achosol credadwy yn fiolegol a rennir ymhlith nifer o afiechydon, gan ddylanwadu ar reolaeth mynegiant lleol cytocinau a chemocinau sy'n amddiffyn rhag hunanimiwnedd (Colli et al. 2010). Nod y gwaith hwn yw archwilio'r mecanwaith llonydd anhysbys y mae amnewidiad Ile923Val yn ei ddefnyddio i leihau gweithgaredd catalytig MDA5 dynol. Yn yr astudiaeth hon, gwnaethom ymchwilio i'r gwahaniaethau yn y rhyngweithio rhwng MDA5 a dsRNA rhwng yr amrywiad brodorol a'r amrywiad prin Ile923Val wrth gychwyn y mecanwaith llid. Yn unol â hynny, ein nod oedd ymchwilio i ymddygiad deinamig y cymhleth MDA5/dsRNA dynol mewn amgylchedd dyfrllyd ym mhresenoldeb Ile923 neu Val923 pan fydd uracil 2′-O yn methylated ai peidio. Efallai y bydd y dadansoddiad strwythurol hwn o dueddiad genetig prin a rennir neu loci amddiffyn yn rhoi mewnwelediad i'n dealltwriaeth o bathoffisioleg clefydau hunanimiwn a gallai canfyddiadau'r ymchwil effeithio ar reolaeth well ar y clefydau dan sylw.

Defnyddiau a Dulliau

Adalw Dilyniant, Llunio Coed Ffylogenetig, a Dadansoddiad Dewis Cadarnhaol

Adalwyd dilyniant protein Homo sapiens (ID dilyniant: NP_071451.2) o gronfa ddata UniProt (The UniProt Consortium 2021). I ddod o hyd i homologau ar draws rhywogaethau, cynhaliwyd chwiliadau BLAST gyda Mega BLAST (Canolfan Genedlaethol Gwybodaeth Biotechnoleg, NCBI, Bethesda, MD, UDA) yng nghronfa ddata protein RefSeq ac NR (a PDB ac UniProt) gan ddefnyddio Blastp (protein-protein BLAST) gyda paramedrau rhagosodedig (Altschul et al. 1997). Dewiswyd 1000 o homologau i'r proteinau MDA5 dynol i ddechrau a defnyddiwyd detholiad traws-rywogaeth yn canolbwyntio ar y parth C-terminal sy'n cynnwys y dilyniant o amgylch yr amnewidiad dynol I923V i nodi'r amrywiad hwn mewn rhywogaethau eraill. Defnyddiwyd Clustal Omega, y rhaglen alinio dilyniant lluosog (Clustal-O) (Sievers et al. 2011), a gweinydd aliniad dilyniant lluosog T-Cofee (Notredame et al. 2000; Di Tommaso et al. 2011) i berfformio aliniadau dilyniant protein a meddalwedd biowybodeg platfform Unipro UGENE (Okonechnikov et al. 2012) i ddelweddu aliniadau lluosog yn ddetholus.

Defnyddir y dadansoddiad esblygiadol i nodi safbwyntiau ar y dilyniannau protein sy'n cael eu cadw'n drwm ar draws rhywogaethau, gan nodi pwysigrwydd strwythurol (Andreou et al. 2018). Adeiladwyd y goeden ffylogenetig gan ddefnyddio'r dull Tebygolrwydd Uchaf (Nei a Kumar 2000) a'r model Tamura-Nei (Tamura a Nei 1993) gyda 500 o atgynhyrchiadau bootstrap (Felsenstein 1985). Cafwyd coeden(au) cychwynnol ar gyfer y chwiliad hewristig yn awtomatig trwy gymhwyso algorithmau Neighbour-Join a BioNJ i fatrics o bellteroedd pâr a amcangyfrifwyd gan ddefnyddio model Tamura-Nei ac yna dewis y topoleg gyda gwerth tebygrwydd log uwch. Roedd y dadansoddiad ffylogenetig yn cynnwys 52 o ddilyniannau niwcleotid homolog (39 ortholog a 13 paralog) o'r genyn IFIH1 dynol. Y swyddi codon a gynhwyswyd oedd 1af ac 2il a 3ydd plws Heb godio. Roedd cyfanswm o 3729 o safleoedd yn y set ddata derfynol. Cynhaliwyd dadansoddiadau esblygiadol gan ddefnyddio pecyn meddalwedd MEGA11 (Tamura et al. 2021).

Er mwyn canfod a yw'r genyn IFIH1 wedi esblygu'n addasol, rydym wedi defnyddio'r rhaglen codeml yn y pecyn meddalwedd PAML v4.9j (Yang 2007). Cyflwynwyd y dilyniant niwcleotid a'r ffeil aliniad dilyniant protein cyfatebol i PAL2NAL (Suyama et al. 2006) i ffurfio'r ffeiliau aliniad niwcleotid mewnbwn CODEML priodol. Perfformiwyd y dadansoddiadau dethol cadarnhaol ar gyfer genynnau ortholog MDA5 gan ddefnyddio modelau safle a changen (Yang et al. 2005; Yang a Bielawski 2000). Mae'r gymhareb cyfradd amnewid ddiystyr/cyfystyr (ω=dN/dS) yn darparu mesur o bwysau dethol ar y lefel asid amino. Mae maint gwerth dN/dS (ω) yn cynrychioli'r mathau o ddetholiad: ω<1 for negative selection, ω=1 for neutral selection, and ω>1 ar gyfer dewis positif (Yang et al. 2005). Yn CODEML dewiswyd y modelau safle (M0, M1, M2, M3, M7, ac M8) a modelau safle cangen (Cladau A ac C) i gyflawni'r dadansoddiad dethol cadarnhaol (Bielawski a Yang 2004; Yang a Nielsen 2002). Yn y modelau safle, defnyddiwyd y prawf cymhareb tebygolrwydd (LRT) i brofi detholiad cadarnhaol trwy gymharu'r tri phâr o fodelau (M0/M3, M2/M1, ac M7/M8). Perfformiwyd y dadansoddiad ar gyfer y dilyniant hyd llawn yn ogystal â'r dilyniant Parth C-Terminal (CTD).

Dadansoddiad Strwythurol ac Efelychiadau Deinameg Moleciwlaidd

Defnyddiwyd strwythur microsgopeg cryoelectron (cryo-EM) o ffilament hMDA5-dsRNA ym mhresenoldeb ATP (PDB ID: 6GKM) (Yu et al. 2018) (Berman et al. 2000) fel system fodel ar gyfer y ddeinameg moleciwlaidd ( MD) efelychiadau. Datryswyd yr holl weddillion protein (307-1020), cadwyd y 14 pâr sylfaen o RNA llinyn dwbl (dsRNA), a'r sinc cydlynol, tra bod gweddillion coll yn cael eu modelu gan ddefnyddio gweinydd SWISS-MODEL (Waterhouse et al. 2018). Ychwanegwyd paramedrau maes grym ac atomau hydrogen gan ddefnyddio modiwl XLEaP AMBR 18 (Case et al. 2005). Defnyddiwyd meysydd grym AMBER f14SB (Maier et al. 2015) a f99OL3 (Zgarbová et al. 2011) ar gyfer y protein a'r RNA, yn y drefn honno, gyda pharamedrau modrna08 (Aduri et al. 2007) ar gyfer niwcleosidau wedi'u haddasu. Cyflwynwyd y treiglad I923V yn MDA5 trwy dynnu'r grŵp Cδ methyl o I923 â llaw, tra bod y ribose wedi'i addasu o U12 yn cael ei methylated ar 2′-O gan ddefnyddio gweddillion llyfrgell modrna08 MRU. Bondiwyd yr ïon sinc â'r 4 gweddillion cystein 907, 910, 962, a 964, gan ddefnyddio paramedrau maes grym priodol i gadw sffêr cydsymud tetrahedrol (hyd bond Zn–S o 2.35 Å gyda 50 kcal·mol–1·Å–2 cysonion grym ac onglau S–Zn–S o 109.5 deg gyda 25 kcal·mol–1·rad–2).

Yn y modd hwn, fe wnaethom baratoi 4 system ar gyfer yr efelychiadau MD: (i) y brodorol MDA5-dsRNA, (ii) MDA5(V923)-dsRNA, (iii) MDA5-dsRNA(2′OMe), a (iv) MDA5( V923)–dsRNA(2′OMe). Cafodd yr holl systemau eu toddi mewn blychau toddyddion octahedrol wedi'u cwtogi o foleciwlau dŵr TIP3P wedi'u rhag-gydbwyso, gyda byffer lleiafswm o 10 Å o amgylch y cymhlyg ac yna ychwanegwyd y nifer gofynnol o ïonau cownter i gael niwtraliad gwefr o'r systemau. Perfformiwyd efelychiadau MD gyda'r fersiwn cyflymedig GPU o'r modiwl PMEMD (Salomon-Ferrer et al. 2{0}13) yn AMBR 18 a cham amser o 2 fs. Rheoleiddiwyd y tymheredd gan ddefnyddio thermostat Langevin gydag amledd gwrthdrawiad o 1.0 ps–1, tra bod pwysedd yn cael ei reoleiddio gan ddefnyddio barostat Berendsen gydag amser ymlacio pwysau o 1.0 ps. Defnyddiwyd ysgwyd i gyfyngu ar fondiau yn cynnwys atomau hydrogen gyda goddefiant o 10–6 Å, tra bod rhyngweithiadau heb eu bondio yn cael eu cyfrifo gyda therfyn gofod uniongyrchol o 10 Å.

Perfformiwyd lleihau egni i ddechrau ar gyfer 1{{20}},000 o gamau gyda chyfyngiadau lleoliadol o 100 kcal·mol–1·Å–2 cysonyn grym ar atomau di-hydrogen MDA5-dsRNA. Yna cafodd y toddydd ei gydbwyso ar 300 K ac 1 atm trwy rowndiau byr o efelychiadau yn yr ensembles NVT a NPT, 100 ps a 400 ps, ​​yn y drefn honno, gan gadw'r cyfyngiadau ar atomau di-hydrogen yr hydoddyn. Yn dilyn hynny, perfformiwyd lleihau egni ar gyfer 10,000 cam, ond gyda chyfyngiadau lleoliadol o 10 kcal·mol–1·Å–2 yn unig ar atomau C MDA5 ac asgwrn cefn ffosffad y dsRNA. Mewn 3 roedd is yn cael eu llacio’n raddol (10.0, 1.0, 0.1 kcal·mol–1·Å–2) drwy gydol 1 ns, ac yna 9 ns o gydbwysedd ataliaeth o dan bwysau cyson. Ar ôl y 10 ns cychwynnol hyn o gydbwysedd (na ddefnyddir yn y dadansoddiad), perfformiwyd 100 ns o efelychiadau cynhyrchu yn ensemble CNPT ar gyfer pob system ar 300 K ac 1 atm, tra'n storio cipluniau o'r system bob 5.0 ps i'w dadansoddi gan ddefnyddio'r CPPTRAJ modiwl AMBR 18 (Roe a Cheatham 2013). Cynhyrchwyd yr holl ffigurau sy'n darlunio modelau 3D gan ddefnyddio system graffeg foleciwlaidd PyMOL (adn.2.3 adeiladu ffynhonnell agored).

Canlyniadau

Dadansoddiad Ffylogenetig o Amnewidiad Ile923Val o MDA5

Mae esblygiad a rhywogaethau MDA5 a'i RIG-I cysylltiedig yn cael eu hadolygu'n helaeth gan (Brisse a Ly 2019). Yma defnyddiwyd esblygiad IFIH1 i ddiffinio elfennau cadwraeth yn y dilyniant MDA5 am yr amryffurfedd penodol. Datgelodd dadansoddiad esblygiadol gadwraeth dilyniant trwm ymhlith MDA5 o wahanol rywogaethau (mae gan 984 o'r 1000 o ddilyniannau yr ymchwiliwyd iddynt isoleucine yn y safle cyfatebol hMDA #923) yn y parth RD/CTD, gan nodi pwysigrwydd strwythurol/swyddogaethol. Mae'r amryffurfedd rs35667974 yn exon 14 o'r genyn dynol yn achosi mwtaniad asid amino cadw yn safle 923 o Ile i Val yn hMDA5. Fodd bynnag, mae un ar bymtheg o rywogaethau pell eraill sydd â'r un safle wedi'u meddiannu gan falin (Ffig. 1) sy'n nodi hyfywedd y newid hwn ar draws rhywogaethau ym mharth RD/CTD MDA5 a'r parth RS/GY homologaidd agos o isofformau X1, helicasau X3, a DHX58 (Ffig. 2). Yn ogystal, mae aliniad dilyniant y rhanbarth o amgylch safle hMDA #923 (dolen ryngweithio CTD MDAs) yn datgelu dilyniant cymedrol i warchodedig iawn ymhlith rhywogaethau pell sy'n nodi pwysigrwydd swyddogaethol y rhanbarth ar draws rhywogaethau.

Canfod Detholiad Cadarnhaol

Er mwyn canfod a yw'r genyn IFIH1 wedi esblygu'n addasol defnyddiwyd modelau safle a modelau cangen-safle i berfformio dadansoddiad dethol cadarnhaol o orthologau'r genyn cyfan a'r parth CTD. Yn y modelau safle, ni nodwyd unrhyw safleoedd dethol cadarnhaol ar gyfer y parth CTD (Tabl 2). Mae M0 yn awgrymu cyfradd gyson o esblygiad (ω=dN/dS=0.2) (Tabl 2). Nodwyd rhai safleoedd a oedd wedi cael dewis cadarnhaol gan ddefnyddio'r dull modelau gwefan M2- a M{8-ar gyfer y genyn cyfan (Suppl. Tabl 1), er nad ydynt yn y rhanbarthau sy'n rhyngweithio ag RNA a'r parth CTD. Yn y modelau safle, mae ω (dN/ dS).<1 which indicates a highly conserved gene (Table 2, Suppl. Table 1). In the branch-site model, the human branch (as well as the primate's branch) was used as the foreground clade, the ω value was low, and no sites with posterior probability greater than 0.85 were identified (Suppl. Table 2).

Yn benodol, ar gyfer y model cangen-safle C ar gyfer y parth CTD (Suppl. Tabl 3), mae 33 y cant o'r safleoedd yn esblygu yng nghategori ω0=0. 036. Gan nad yw safleoedd sy'n datblygu o dan y categori hwn yn gwahaniaethu rhwng mathau o ganghennau, mae gan y ddau fath o gangen yr un gwerth o ω ar gyfer safleoedd o dan y categori hwn. At hynny, mae 55 y cant o'r safleoedd yn esblygu o dan gategori ω2. Eto i gyd, mae gan y rhain werthoedd ω sy'n amodol ar y math o gangen (ω20=0.25 a ω21=0). Hefyd, ar gyfer y model cangen-safle C ar gyfer y 39 genyn ortholog MDA5 (Suppl. Tabl 4), mae 33 y cant o'r safleoedd yn esblygu yng nghategori ω0=0. 027. Ar y llaw arall, mae 41 y cant o'r safleoedd yn esblygu o dan gategori ω2. Eto i gyd, mae gan y rhain werthoedd ω sy'n amodol ar y math o gangen (ω20=0.25 a ω21=15.32).

Dadansoddiad Strwythurol

Mae'r dadansoddiad esblygiadol a gynhaliwyd yn dangos nad yw amnewidiad Ile923Val yn amrywiad unigryw yn y rhywogaeth ddynol, gan fod Val yn bodoli yn safle dilyniant MDA5 mewn rhywogaethau eraill hefyd. Mae MDA5 yn dderbynnydd RNA llinyn dwbl firaol (dsRNA) sy'n chwarae rhan allweddol mewn imiwnedd gwrthfeirysol trwy ei benodolrwydd penodol ar gyfer RNA firaol (Wu et al. 2013). Dangoswyd bod 2′-O-methylation o mRNA firaol yn bwysig ar gyfer ymatebion imiwn cynhenid, felly awgrymwyd bod 2′-O-methylation yn llofnod moleciwlaidd ar gyfer gwahaniaethu rhwng hunan-mRNA yn erbyn mRNA nad yw'n hunan-hunan. (Zust et al. 2011). Er mwyn ymchwilio i rôl bosibl amnewid Ile923Val yn yr amrywiad missense IFIH1 rs35667974, dadansoddwyd strwythur microsgopeg cryoelectron (cryo-EM) ffilament MDA5-dsRNA ym mhresenoldeb ATP (PDB ID: 6GKM) (Yu et al. 2018). Swydd 923 wedi ei leoli ar y ddolen 921-927 sy'n rhyngweithio yn uniongyrchol gyda'r dsRNA ( Ffig. 3 A ). Yn benodol, mae Ile923 wedi'i leoli 4.8 Å o 2′-ΟΗ o wridin U12, ac mae eu rhyngweithiad yn cael ei sefydlogi trwy fond hydrogen rhwng yr His927 cyfagos a'r sylfaen uracil. Ni ddisgwylir i amnewidiad Ile923 gan Val mewn amrywiad rs35667974 gyflwyno unrhyw wrthdaro steric, yn hytrach na lleihau'r rhyngweithiadau â 2′-ΟΗ o wridin U12 (Ffig. 3 B). Rhag ofn i RNA gael ei fethyleiddio ar ribos U12, yna mae'r amrywiad MDA5 naturiol gydag Ile923 yn dangos cysylltiad van der Waals ffafriol â grŵp 2′-OMe o U12 ar 3.6 Å (Ffig. 3C), tra bod Val923 o'r amrywiad rs35667974 yn lleoli yn 5.0 Å (Ffig. 3D). Ni all y gwahaniaethau hyn awgrymu effaith fawr o amnewid Ile923Val per se; fodd bynnag, mae newidiadau strwythurol cynnil yn aml yn arwain at newidiadau swyddogaethol sylweddol trwy amharu ar ddeinameg strwythurol y system.

Cyfrifiadau Deinameg Moleciwlaidd

Er mwyn ymchwilio i effaith treiglad I923V MDA5 yn ei ryngweithio â dsRNA, yn frodorol a 2′-Ο-methylated, rydym wedi defnyddio efelychiadau deinameg moleciwlaidd o 4 system ar yr amserlen 100-ns. Cafodd deinameg y systemau eu monitro gan ddefnyddio amrywiadau gwraidd-cymedr-sgwâr (RMSF) pob gweddillion protein a phellter bondio hydrogen H927 gyda U12 (Ffig. 4). Mae ein cyfrifiadau yn awgrymu bod treiglad o I923 i V923 yn MDA5 arwain at aflonyddiad bach o'r ddeinameg o fewn y rhanbarth cyswllt RNA (gweddillion 923-934) a'r ddolen rhyngweithio interprotein (950-955) o'r cymhleth gyda brodorol dsRNA ( Ffig. 4 C ) . Roedd yr arsylwad hwn yn debyg yn achos 2′-O-methylation yn U12, er bod effaith fwy amlwg a arsylwyd yn y dynameg cyffredinol y rhanbarth carboxy-terminal o MDA5 V923 mutant ( Ffig. 4 D ).

Nawr o ystyried y rhyngweithio hydrogen-bondio allweddol o'r gweddillion H927 cyfagos gyda'r sylfaen uracil, mae ein efelychiadau MD yn awgrymu nad yw methylation yn 2′-O yn effeithio arno yn y MDA5 brodorol (Ffig. 4 E). Fodd bynnag, nid yw'r treiglad V923 yn effeithio ar y bond hydrogen o H927 yn y dsRNA brodorol ond yn arddangos effaith ansefydlogi ym mhresenoldeb 2′-O-methylation ( Ffig. 4 F ). Gyda'i gilydd, mae ein hefelychiadau MD yn awgrymu, er bod effaith treiglad I923V o MDA5 yn y rhyngweithio â dsRNA brodorol yn ymylol, mae ei effaith ar ddeinameg a sefydlogrwydd y cymhleth MDA5/RNA yn fwy arwyddocaol pan fydd uracil yn 2′-O-methylated .

Trafodaeth

Mae'r astudiaeth hon yn cynrychioli ymchwiliad esblygiadol a strwythurol o rôl yr amrywiad rs35667974 a rennir o locws hunanimiwn IFIH1, yr adroddwyd ei fod yn arwain at ffenoteip ymarferoldeb wedi'i addasu ar gyfer MDA5 (Downes et al. 2010). Mae cymhwyso modelau safle esblygiadol a safle cangen i berfformio dadansoddiad dethol cadarnhaol yn dangos nad oes unrhyw safleoedd dethol cadarnhaol yn y safleoedd rhyngweithio RNA lle mae'r amryffurfedd rs35667974 yn byw. Nid yw'r modelau safle cangen ychwaith yn dangos bod unrhyw safleoedd penodol wedi cael eu dewis yn gadarnhaol yn y parth CTD.

Mae hyn yn cyd-fynd ag amlder ymddangosiad isel iawn yr amrywiad Ile923Val hyd yn oed ymhlith y boblogaeth ddynol (Tabl 1). Serch hynny, mae gan boblogaeth Ewrop o'i gymharu â'r lleill wahaniaeth yn amlder yr alel C o un trefn maint. Heb anwybyddu maint bach y sampl, mae dosbarthiad daearyddol y polymorphism dan astudiaeth yn dangos y gall ei ymddangosiad yn y boblogaeth Ewropeaidd fel y man cychwyn fod oherwydd amodau byw a maeth sydd wedi newid yn y blynyddoedd diwethaf. Perfformiwyd yr ymchwiliad strwythurol i rôl yr SNP a archwiliwyd trwy archwilio strwythur y cymhleth dsRNA-MDA5 (brodorol a mutant).

Ar lefel ffurfio cymhleth dsRNA-MDA5 mae cyflwyniad y treiglad Ile923Val yn dylanwadu ar ryngweithiad y parth C-terminal protein (CTD) gyda'r dsRNA gyda chyflwyniad ceudod hydroffobig wrth ymyl siwgr ribos un llinyn y dsRNA . Rydym wedi dangos, yn achos RNA methylated yng nghadwyn ffosfforibosyl yr un llinyn, y gallai effeithiau deinamig pellach ddylanwadu ar ryngweithio'r mutant heb effeithio ar y math gwyllt. Mae hyn yn cyd-fynd ag astudiaethau arbrofol (Looney et al. 2015; Brisse a Ly 2019) sy'n dangos ei bod yn bosibl na fydd effaith amryffurfiaeth Ile923Val a nodwyd yng nghyffiniau pwynt rhyngweithio MDA5-dsDNA yn dylanwadu ar briodweddau rhwymo dsRNA brodorol ond yn cael ei newid gan 2.5-plyg lleihau'r gweithgaredd catalytig (Shigemoto et al. 2009). Hefyd, mae'r astudiaethau deinamig moleciwlaidd wedi dangos rôl hanfodol methylation yn y mutant yn ymwneud â symudedd a sefydlogrwydd dolenni MDA5 941-959 a 970-977 sy'n ymwneud â rhyngweithio dsRNA a rhyngweithio interprotein wrth ffurfio ffilament MDA. Gall effeithiau o'r fath rwystro cynulliad ffilament MDA5, y gymdeithas MDA5-MAVS, a chynulliad ffilament MAVS sy'n actifadu mynegiant y genynnau interferon math I ymhellach (IFN1: IFN ac IFN ). Mewn achosion o T1D a PsA, o ganlyniad, mae lefelau is o weithgaredd protein MDA5 ac felly cynhyrchiant IFN is yn amddiffyn rhag hunanimiwnedd. Mae'r arsylwadau hyn yn awgrymu y byddai nifer o amrywiadau IFIH1, y rhagwelir y byddant yn effeithio ar ryngweithiad MDA5 i MAVS a lleihau cynhyrchiant IFN yn lleihau'r risg o glefydau, tra bod swyddogaeth MDA5 arferol yn gysylltiedig â hwy (Shigemoto et al. 2009).

Mae hyn yn arwain at y casgliad, fel yn achos RNA firaol, bod methylation hunan-dsRNA, treiglad a nodwyd gan RNA, yn ffactor dethol / actifadu pwysig ar gyfer cyflwyno effeithiau amddiffynnol mewn rhai clefydau hunanimiwn. Mae canlyniadau'r astudiaeth bresennol yn ehangu'r wybodaeth am arwyddocâd biolegol rs35667974 SNP o locws IFIH1 yn natblygiad y clefydau uchod ac yn amlygu pwysigrwydd astudiaethau o enynnau a rennir gan glefydau hunanimiwn lluosog. Fodd bynnag, mewn astudiaethau poblogaeth ar gyfer cysylltiad genetig SNPs â chlefydau hunanimiwn, gan ddefnyddio, ee, PCR-RFLPs, dilyniannu, neu sglodion genoteipio, ni chymerir achos o methylation RNA i ystyriaeth. Mae'n bwysig felly gwybod cyflwr methylation y dsRNA rhyngweithiol a'i effaith ar yr alel MDA5. Fel yn achos y gydnabyddiaeth firaol dsRNA (Wu et al. 2013) a'r gwahaniaeth rhwng hunan- a nonself mRNA (Züst et al. 2011), colli grŵp methyl o'r MDA5 rhyngweithiol, fel yn achos y mutant Ile923Val MDA5, gall effeithio ar ffurfio ffilament ac ymsefydlu interfferon math I.

O bwys, mae Plenge et al. (2013) wedi trafod yn flaenorol y potensial o amrywiad prin mewn genyn clefyd achosol i gynrychioli targed therapiwtig tybiedig ar gyfer ymyrraeth fferyllol. I'r perwyl hwn, mae'n rhaid i swyddogaeth fiolegol yr amrywiad achosol fod yn hysbys mewn unrhyw ymgais i gysylltu canfyddiadau genetig â tharged therapiwtig newydd. Felly, mae lleoli amrywiad achosol yn strwythur 3D y protein priodol ac ymchwilio i'w rôl o'r safbwynt adeileddol/swyddogaethol mewn llwybr pathogenetig sy'n arwain at glefyd hunanimiwn yn ymddangos yn hollbwysig ar gyfer rheolaeth bellach a gwell triniaeth o y cleifion. Mae angen mawr o hyd i symud y tu hwnt i ddarganfod SNPs cysylltiedig i ddealltwriaeth ddyfnach o amrywiadau achosol i egluro mecanweithiau moleciwlaidd a llwybrau afiechyd. Mae angen dadansoddiad adeileddol-swyddogaethol pellach i ymchwilio i rwymo ribose-2′-Ο-methylated self-dsRNA i MDA5 a sut mae hyn yn effeithio ar gynulliad ffibril MDA5. Mae'n bosibl bod rôl fiolegol swil 2′-Ο-methylated mRNA fel synhwyrydd gwahaniaeth rhwng firaol a hunan-mRNA wrth sefydlu interfferon math I wedi'i ymestyn i synhwyrydd amddiffynnol mewn rhai awtoimiwnopathïau.

Casgliad

Mae'r polymorphism genyn rs35667974 IFIH1 prin yn amddiffyn rhag T1D, PS, a PsA, tra bod yr alel IFIH1 a gludir gan fwyafrif y boblogaeth yn rhagdueddu i'r clefydau. Mae'r cyllid y mae'r mutant Ile923Val MDA5 yn gweithredu'n wahanol yn y rhyngweithio â hunan-dsRNA ac yn arbennig ag un 2′-O-methylated yn awgrymu, mewn rhai achosion, bod amrywiadau sy'n rhyngweithio â dsRNA methylated yn amharu ar ffurfio ffilament MDA5, rhyngweithio MAVS, a ffurfio ffilament, a Mae'n bosibl bod signalau IFN, fel yn yr ymateb gwrthfeirysol gwesteiwr, wedi'u dewis yn negyddol oherwydd eu bod yn amddiffyn rhag clefydau.

Cyfraniadau awdur

Cysyniadoli - AA, AP, EEE, a GNG, methodoleg - AA, AP, ac EEE, dilysu - AA, AP, MIZ, GNG, ac EEE, ymchwiliad - GNG, AA, AP, a MIZ, adnoddau - GNG, AA, AP, a MIZ, curadu data - AA ac AP, ysgrifennu a pharatoi drafft gwreiddiol - EEE, GNG, AA, AP, ac MZ, ysgrifennu, adolygu a golygu'r llawysgrif - AA, AP, MZ, GNG, ac EEE, delweddu - AA, AP, ac EEE, goruchwyliaeth - EEE, a chaffael cyllid - EEE. Mae pob awdur wedi darllen a chytuno i'r fersiwn cyhoeddedig o'r llawysgrif.

Ariannu

Darperir cyllid mynediad agored gan HEAL-Link Gwlad Groeg. Cefnogwyd y gwaith hwn gan y prosiect "INSPIRED-Y Seilwaith Ymchwil Cenedlaethol ar Fioleg Strwythurol Integredig, Ymdrechion Sgrinio Cyffuriau a Tharged Nodweddu Swyddogaethol Cyffuriau" (Grant MIS 5002550), a weithredir o dan y Cam Gweithredu "Atgyfnerthu'r Seilwaith Ymchwil ac Arloesi," wedi'i hariannu gan y Rhaglen Weithredol "Cystadleurwydd, Entrepreneuriaeth ac Arloesi" (NSRF 2014-2020) ac wedi'i chyd-ariannu gan Wlad Groeg a'r Undeb Ewropeaidd (Cronfa Datblygu Rhanbarthol Ewrop).

Argaeledd Data

Mae'r setiau data a ddefnyddiwyd a/neu a ddadansoddwyd yn ystod yr astudiaeth gyfredol ar gael gan yr awdur cyfatebol ar gais.

Datganiadau

Gwrthdaro buddiannau

Nid yw'r awduron yn datgan unrhyw wrthdaro buddiannau. Nid oedd gan y cyllidwyr unrhyw rôl yng nghynllun yr astudiaeth; wrth gasglu, dadansoddi neu ddehongli data; wrth ysgrifennu'r llawysgrif, neu yn y penderfyniad i gyhoeddi'r canlyniadau.

Cymeradwyaeth Foesegol

Ddim yn berthnasol.

Caniatâd i Gyfranogi

Ddim yn berthnasol.

Caniatâd i Gyhoeddi

Ddim yn berthnasol.

Mynediad Agored

Mae'r erthygl hon wedi'i thrwyddedu o dan Drwydded Ryngwladol Creative Commons Attribution 4.0, sy'n caniatáu defnyddio, rhannu, addasu, dosbarthu ac atgynhyrchu mewn unrhyw gyfrwng neu fformat, cyn belled â'ch bod yn rhoi credyd priodol i'r awdur(on) gwreiddiol ) a’r ffynhonnell, darparu dolen i’r drwydded Creative Commons, a nodi a wnaed newidiadau. Mae'r delweddau neu ddeunydd trydydd parti arall yn yr erthygl hon wedi'u cynnwys yn nhrwydded Creative Commons yr erthygl oni nodir yn wahanol mewn llinell gredyd i'r deunydd. Tybiwch nad yw deunydd wedi'i gynnwys yn nhrwydded Creative Commons yr erthygl ac ni chaniateir eich defnydd arfaethedig gan reoliad statudol nac yn fwy na'r defnydd a ganiateir. Yn yr achos hwnnw, rhaid i chi gael caniatâd yn uniongyrchol gan ddeiliad yr hawlfraint.

Cyfeiriadau

1. Aduri R, Psciuk BT, Saro P et al (2007) AMBR paramedrau maes grym ar gyfer y niwcleosidau addasedig sy'n digwydd yn naturiol mewn RNA. J Chem Theory Comput 3:1464–1475.

2. Altschul SF, Madden TL, Schäfer AA et al (1997) Gapped BLAST a PSI-BLAST: cenhedlaeth newydd o raglenni chwilio cronfa ddata protein. Asidau Niwcleig Res 25:3389–3402.

3. Andreou A, Giastas P, Christoforides E, Eliopoulos EE (2018) Mewnwelediadau strwythurol ac esblygiadol o fewn y teulu genyn deacetylase polysacarid o anthracis bacillus a bacillus cereus.

4. Aučynaitė A, Rutkienė R, Tauraitė D et al (2018) Adnabod hydrolase niwcleosid 2′-O-methyluridine gan ddefnyddio'r llyfrgelloedd metagenomig. Moleciwlau.

5.Berman HM, Westbrook J, Feng Z et al (2000) Y banc data protein. Asidau Niwcleig Res 28:235-242.

6. Bielawski JP, Yang Z (2004) Dull tebygolrwydd mwyaf ar gyfer canfod gwahaniaeth swyddogaethol mewn safleoedd codon unigol, gyda chymhwysiad i esblygiad teulu genynnau.

7. Biros E, Jordan MA, Baxter AG (2005) Genynnau yn cyfryngu rhyngweithiadau amgylchedd mewn diabetes math 1.

8. Boccaletto P, Machnicka MA, Purta E, et al (2018) MODOMEG: cronfa ddata o lwybrau addasu RNA. diweddariad 2017. Asidau Niwcleig Res 46:D303–D307.

9. Brisse M, Ly H (2019) Dadansoddiad o strwythur a swyddogaeth gymharol y derbynyddion tebyg i RIG-I: RIG-I ac MDA5.

10. Budu-Aggrey A, Bowes J, Stuart PE et al (2017) Mae alel codio prin yn IFIH1 yn amddiffynnol ar gyfer arthritis soriatig. Ann Rheum Dis 76:1321–1324.

For more information:1950477648nn@gmail.com