Ynysu A Mesur Ginsenoside Rh23, Cyfansoddyn Gwrth-Melanogenig Newydd O Ddail Panax Ginseng

Crynodeb:

Ginsenoside newydd, o'r enw ginsenoside Rh23 (1), a 20-O- -D-glucopyranosyl-3 ,6 , 12 ,20 ,25-pentahydroxydammar-23-ene (2) yn cael eu hynysu oddi wrth y dail o ginseng Panax hydroponig. Cafodd cyfansoddion eu hynysu gan gromatograffaeth colofn amrywiol a phenderfynwyd ar eu strwythurau yn seiliedig ar ddulliau sbectrosgopig, gan gynnwys sbectrometreg màs pedwarpol/amser hedfan cydraniad uchel (HR-QTOF/MS), sbectrosgopeg cyseiniant magnetig niwclear (NMR), a sbectrosgopeg isgoch (IR). . Er mwyn pennu gweithgaredd gwrth-melanogenig, profwyd y newid yn y cynnwys melanin mewn celloedd Melan-a sy'n cael eu trin â chyfansoddion a nodwyd.

Yn ogystal, gwnaethom ymchwilio i effeithiau ataliol melanin o ginsenoside Rh23 ar bigmentiad mewn model zebrafish in vivo. Roedd cyfansawdd 1 yn atal melanogenesis cryf mewn celloedd melan-a gyda 37.0 ataliad melanogenesis y cant ar 80 µM a hefyd yn cyflwyno ataliad ar bigmentiad y corff yn y model zebrafish. Er bod cyfansoddyn 2 yn dangos gweithgaredd ataliol ychydig yn is na chyfansoddyn 1, dangosodd hefyd ostyngiad sylweddol mewn melanogenesis mewn celloedd Melan-a a'r model zebrafish. Roedd y canlyniadau hyn yn dangos y gellir defnyddio cyfansoddion sydd wedi'u hynysu o hydroponig P. ginseng fel cyfansoddion gwyngalchu croen newydd trwy'r systemau in vitro ac in vivo. At hynny, dangosodd yr astudiaeth hon ddefnyddioldeb cyfansoddyn 1 yn seiliedig ar MS ar gyfer dadansoddiad meintiol. Canfuwyd Ginsenoside Rh23 (1) ar lefel o 0.31 mg/g mewn dail o ginseng hydroponig P..

Ar gyfer melanin, canfuom y gall Cistanche ddad-reoleiddio gweithgaredd tyrosinase yn sylweddol, sef y prif ensym sy'n cyfyngu ar gyfraddau ym biosynthesis melanin croen ac mae'n gymhleth o gopr a phrotein. Gall hydroxylate tyrosine, y prif ddeunydd crai ar gyfer cynhyrchu melanin yn y corff, i gynhyrchu L-dopa, ac yna oxidize dopa i dopaquinone. Mae Dopaquinone yn mynd trwy gyfres o brosesau metabolaidd, yn aildrefnu a pholymeru, ac yn olaf yn cyfuno â Proteinau yn cyfuno i gynhyrchu cyfres o pigmentau melanin sy'n achosi brownio. Melanin yw'r ffactor pwysicaf wrth bennu lliw croen y corff dynol. Gall synthesis gormodol achosi ffurfio clefydau croen pigmentog fel brychni haul, cloasma, smotiau oedran, a melanoma. Felly, trwy'r ymchwil ar atal gweithgaredd tyrosinase, gellir sgrinio'r cynhwysion effeithiol ar gyfer atal pigmentiad croen, felly gellir gweld bod cyfanswm glycosidau Cistanche deserticola yn atal pigmentiad croen a harddwch gwynnu.

Cliciwch ar y cynnyrch dos cistanche

Geiriau allweddol:

ginsenoside Rh23; Panax ginseng; NMR; UPLC-QTOF/MS; pysgod sebra; dadansoddiad meintiol.

1. Rhagymadrodd

Mae Panax ginseng CA Meyer yn berlysiau meddyginiaethol traddodiadol enwog iawn mewn gwledydd Asiaidd. Mae Panax yn tarddu o "ateb i bob problem", sy'n golygu iachâd i gyd ar gyfer afiechydon. Planhigyn llysieuol lluosflwydd sy'n perthyn i deulu'r Araliaceae [1] yw P. ginseng . Defnyddir gwreiddiau P. ginseng rhwng pedair a chwe blwydd oed yn bennaf at ddibenion therapiwtig. Mae blodau'n blodeuo ym mis Mehefin, ac mae gan y dail siâp daflod. Mae P. ginseng wedi'i drin yn bennaf yn Nwyrain Asia, gan gynnwys Korea, Tsieina, a Japan [2]. Hyd yn hyn, mae llawer o astudiaethau wedi'u hadrodd am gyfansoddion cemegol gwreiddiau ginseng, dail, ac aeron; mae mwy na 100 o fathau o ginsenosides wedi'u hynysu. Adroddwyd am amrywiol fioweithgareddau P. ginseng, megis gwella gweithgaredd imiwnofodiwlaidd, atgyfnerthu maethol, gwella gweithrediad yr afu, gwrth-ddiabetes, gwrth-ganser, gwrth-apoptotig, a gweithgareddau gwrth-ocsidydd [3-10].

Ar hyn o bryd, mae'r diddordeb mewn cynhyrchion amaethyddol o ansawdd uchel sy'n gysylltiedig â lles yn cynyddu'n raddol, gan arwain at dyfu ginseng yn hydroponig. Mae gan amaethu hydroponig fanteision proses amaethu syml a chyfnod twf byrrach na thyfu pridd. Dim ond 2-4 mis sydd ei angen ar ginseng hydroponig mewn system sy'n rheoli tymheredd, yn rhydd o blaladdwyr, yn llaith, yn ysgafn, yn cynnwys cynhwysion organig, ac ati [11]. Ni ddefnyddir dail ginseng tyfu pridd at ddibenion meddyginiaethol a llysiau swyddogaethol, tra gellir defnyddio dail ginseng hydroponig.

In a previous study, the contents and composition of ginsenosides in different parts, such as leaves, roots, and fruits of ginseng, were investigated after a short-term hydroponic system [12]. The total ginsenoside content of the ginseng leaves was found to be significantly higher at 15.30%, while the content of the ginseng roots was at 1.27%. Additionally, the contents of the major ginsenosides components produced in the ginseng leave cultured in the hydroponic system were observed in the order of Rg1 > Rd > Re > Rc > Rb2 > Rg2 >Rb1 > Rh1 > Rf [11]. Yn derfynol, arweiniodd amodau hydroponig at gynnwys ginsenoside uchel, ac roedd cyfanswm y cynnwys ginsenoside mewn dail yn sylweddol uwch nag mewn gwreiddiau, gan awgrymu y gallai dail ginseng fod yn ffynhonnell dda o lysiau swyddogaethol a pherlysiau meddyginiaethol.

Ymchwiliwyd i nifer o gyfansoddion gwynnu hysbys, megis arbutin ac asid kojic, am eu heffeithiolrwydd wrth leihau melanogenesis [13]. Yn anffodus, mae angen dod o hyd i gyfryngau gwynnu croen mwy diogel a mwy effeithiol, oherwydd potensial carcinogenig asid kojic a diogelwch a sgîl-effeithiau arbutin [14]. Felly, mae llawer iawn o sylw wedi cael ei ymchwilio'n barhaus i ddatblygiad cynhyrchion naturiol newydd yn y diwydiant colur [15,16]. Mae sawl astudiaeth wedi adrodd am atal synthesis melanin o P. ginseng a dyfir mewn pridd [17-20].

Fodd bynnag, adroddwyd yr astudiaethau hyn gyda chyfansoddion adnabyddus, megis asid sinamig a chyfansoddion ffenolig, ac nid yw gweithgaredd gwynnu wedi'i adrodd o ddail hydroponig P. ginseng (HPGL). Arweiniodd ein gwaith parhaus at ynysu mân ginsenosides oddi wrth HPGL. Fel arfer, ni ellir canfod ginsenosides mewn symiau bach neu olrhain gyda HPLC. Fel arall, mae'r amser dadansoddol yn hir iawn, nad yw'n gyfleus ar gyfer cymhwyso'r ginsenosides mewn sbeisys ginseng [21,22]. Er mwyn mesur cyfansoddion newydd yn gyflym, dylid sefydlu dull cyflym a sensitif, sy'n gallu canfod symiau hybrin cyfansoddion newydd yn drylwyr. Yn yr astudiaeth bresennol, sefydlwyd cromatograffaeth hylif perfformiad uchel sensitif ynghyd â dull sbectrometreg màs pedwar-bôl/amser hedfan (UPLC-QTOF-MS) i feintioli'r cyfansoddyn newydd.

Yn seiliedig ar y disgrifiad uchod, yn y gwaith hwn, datgelwyd ynysu, ac adnabod cyfansoddyn newydd, gan gynnwys priodweddau ffisegol a meintioli, trwy ddulliau sbectrosgopig, ac archwiliwyd eu gweithgareddau gwrth-melanogenig trwy systemau in vitro ac in vivo.

2. Canlyniadau a Thrafodaeth

Echdynnwyd dail ginseng Panax hydroponig (HPGL) gyda MeOH dyfrllyd a'i rannu'n ffracsiynau ethyl asetad (EtOAc), n-butanol (n-BuOH), a H2O, yn y drefn honno. Rhoddodd cromatograffau colofn SiO2 ac ODS dro ar ôl tro o'r ffracsiwn n-BuOH un ginsenoside newydd (1), ac roedd un ginsenoside prin (2) wedi'i ynysu o ffracsiwn EtOAc o HPGL.

Dangosodd cyfansawdd 1, powdr gwyn (methanol), liw porffor ar y TLC, trwy chwistrellu 10 y cant H2SO4 a gwresogi. Penderfynwyd mai'r fformiwla moleciwlaidd oedd C37H64O10 o'r brig ïon lled-foleciwlaidd m/z 713.44723 [M plws COOH] - yn y QTOF/MS negyddol. Awgrymodd sbectrwm IR bresenoldeb grŵp hydrocsyl (3377 cm−1 ) a bond dwbl (1647 cm−1 ). Dangosodd sbectrwm 1H-NMR (Tabl 1 a Deunyddiau Atodol) ddau signal proton olefin methine (δH 6.02, 5.64), tri signal proton methine ocsigenedig (δH 4.38, 4.03, 3.49), un signal proton methoxy (δH), ac wyth signal proton methine (δH 3.18), signalau proton methyl singlet (δH 1.94, 1.55, 1.43, 1.33, 1.31, 1.14, 1.04, 0.92), sy'n nodi bod gan gyfansoddyn 1 moiety triterpene tetracyclic gan gynnwys un bond dwbl â chydffurfiad traws a thri grŵp hydrocsyl.

Yn ogystal, cadarnheir bod cyfansoddyn 1 yn fath protopanaxatriol (PPT) o symudiad cemegol signal methyl proton yn δH 1.94 (H-28). Mae symudiad cemegol H-28 mewn math protopanaxadiol (PPD) fel arfer yn cael ei arsylwi ar ca δH 1.30 [23]. Ar ben hynny, sylwyd bod signal proton hemiacetal (δH 5.15), a sawl methines ocsigenedig a signal proton methylene yn δH 4.45–3.95 yn arwydd o moiety siwgr. O gysonyn cyplu y signal anomer proton (J=7.6 Hz), roedd y proton hemiacetal a H-2 y moiety siwgr mewn trefniant echelinol. Daeth y cyfuniad o'r data uchod i'r casgliad bod cyfansawdd 1 yn aminoglycoside protopanaxatriol. Roedd y sbectrwm 13C-NMR yn arddangos 37 o signalau carbon oherwydd triterpene, methoxy, a moieties hecsos. Dau garbon methine olefin (δC 138.5 (C-24), 126.8 (C-23)), un carbon cwaternaidd ocsigenedig (δC 74.9 (C-25)), tri charbon methine ocsigenedig (δC 78.5 (C-3), 7{{90}}.3(C-12), 67.7(C-6)), un methoxy carbon (δC 50.2( 25-OCH3)), ac wyth methyl carbon (δC 31.9 (C-28), 26.3 (C-27), 26.1 (C-26), 23.0 (C{{). 57}}), 17.6 (C-18), 17.4 (C-19), 17.3 (C-30), 16.4 (C-29)) signalau ar gyfer y aglycon moiety. Roedd data NMR cyfansoddyn 1 yn debyg i ddata cyfansoddyn 2, ac eithrio'r symudiad cemegol ar gyfer carbon cwaternaidd ocsigenedig, hy, C-25. Yn ogystal, nodwyd bod y siwgr yn -glucopyranose o'r signalau carbon hemiacetal (δC 98.3, (C-10 )), pedwar methin ocsigenedig (δC 78.9 (C{{1}), 78.2 (C{{82)) }} ), 75.2 (C-20 ), 71.6 (C-40 )), ac un methylene ocsigenedig (δC 63.0 (C-60 )). Yn y sbectra graddiant cydberthynas bond lluosog heteroniwclear (gHMBC), sylwyd ar gydberthynas hir-amrediad rhwng y signal proton anomerig (δH 5.15 (H{-10)) a signal carbon cwaternaidd ocsigenedig yr aglycon (δC 83.0 (C). -20)), sy'n nodi bod y -glucopyranose yn gysylltiedig â hydrocsyl C-20 (Ffigur 1).

Yn ogystal, roedd y gydberthynas rhwng y signal methoxy proton (δH 3.18 (25-OCH3)) a'r signal carbon cwaternaidd ocsigenedig (δc 74.9 (C-25)) yn dangos bod y methoxy wedi'i gysylltu â C{{ 7}} (Ffigur 1). Yn seiliedig ar y data uchod, penderfynwyd mai adeiledd cemegol 1 oedd 20-O{18D-glucopyranosyl-3 ,6 ,12 ,20 -tetrahydroxy-25- methoxydammar-23-ene, a'i enwi fel ginsenoside Rh23. Cafodd cyfansawdd 2 ei nodi fel 20-O{- -D-glucopyranosyl-3 ,6 ,12 ,20 ,25- pentahydroxydammar-23-ene o gymariaethau NMR a Data MS gyda'r rhai a adroddwyd yn y llenyddiaeth [23,24] (Ffigur 1). Roedd cyfansoddion 1 a 2, am y tro cyntaf, wedi'u hynysu oddi wrth HPGL.

Penderfynwyd bod purdeb ginsenoside Rh23 yn fwy na 99 y cant trwy normaleiddio'r ardaloedd brig a ganfuwyd gan ddadansoddiad UPLC. Gan fod UPLC-OTOF/MS wedi'i brofi i fod yn arf addas ar gyfer adnabod ginsenoside Rh23, gwahanwyd cyfansoddion mewn dyfyniad HPGL gan UPLC-OTOF/MS yn y modd negyddol-ion. Mae Ffigur 2 yn dangos cromatogram ïon cyfanswm nodweddiadol (TIC) o ginsenoside Rh23 a dyfyniad â chanfod màs.

Cafwyd cromlin graddnodi llinol ar gyfer ginsenoside Rh23 ar wahanol lefelau crynodiad. Crynhoir nodweddion y lleiniau graddnodi yn Nhabl 2. Fel y gwelir yn y tabl, mae ginsenoside Rh23 yn dangos cyfernodau cydberthynas rhagorol. Roedd cyfrifau canfodyddion (ardal brig cymharol) yn dibynnu'n llinol ar grynodiad y sampl dros yr ystod o 0.02–0.8 µg/mL ar gyfer ginsenoside Rh23. Y LODs o ginsenoside Rh23 oedd 0.002 ppm. Penderfynwyd bod LOQs ginsenoside Rh23 yn 0.005 ppm gan UPLC-QTOF/MS yn y modd ïon negyddol. Swm y ginsenoside Rh23 yn yr HPGL a gafwyd gan ddefnyddio dulliau dilysu (Tabl 2) oedd 0.319 mg/g.

Er mwyn pennu gweithgaredd gwrth-melanogenig, astudiwyd y newid yn y cynnwys melanin mewn celloedd melan-a sy'n cael eu trin â chyfansoddion wedi'u puro a'u hadnabod. Cafodd celloedd Melan-a eu trin am 72 h gyda chyfansoddion 1 a 2 mewn crynodiadau yn amrywio o 0 i 80 µM, ac aseswyd hyfywedd celloedd trwy becyn assay hyfywedd celloedd CCK-8. Roedd hyfywedd celloedd cyfansoddion 1 a 2 ar grynodiad 80 µM ar gyfer melan-gell dros 98.1 y cant a 97.8 y cant, yn y drefn honno (data heb ei ddangos). Mae'r canlyniadau hyn yn dangos nad oes gan gyfansoddion 1 a 2 natur sytotocsig. Dangosir effaith gweithgareddau gwrth-melanogenig cyfansoddion yn Ffigur 3. Roedd ataliad synthesis melanin o gyfansawdd 1 yn 20, 40, a 80 µM yn 8.4 y cant, 15.6 y cant, a 37.0 y cant o'i gymharu â'r rheolaeth. Dangosodd Cyfansawdd 2 weithgaredd ataliol ychydig yn is na chyfansoddyn 1 ar 7.6 y cant, 12.8 y cant, a 17.8 y cant yn 20, 40, ac 80 µM, yn y drefn honno. Roedd y ddau gyfansoddyn yn atal synthesis melanin mewn modd a oedd yn dibynnu ar ddos.

Yn nodedig, cyfansoddyn 1 a ddangosodd y gweithgaredd ataliol melanin uchaf, 37.0 y cant ar grynodiad 80 µM. Yn ôl y sôn, ni ddangosodd dyfyniad ginseng radix ar 0-1000 µg/mL unrhyw ataliad sylweddol o melanin [19], a dangosodd asid cinnamig, asiant gwynnu a ddarganfuwyd yn bennaf yn P. ginseng, ataliad o 29 y cant o synthesis melanin ar 675 µM [20]. O'i gymharu â detholiad radix ginseng ac asid cinnamig, dangosodd cyfansawdd 1 weithgaredd ataliol synthesis melanin cryf, a hyd yn oed dangosodd 1.2-gweithgaredd ataliol uwch o synthesis melanin ar grynodiad wyth gwaith yn is o'i gymharu ag asid cumarig. 17,20].

Mae'r zebrafish yn fodel organeb fertebrat hynod fanteisiol oherwydd ei systemau organau a'i ddilyniannau genynnau tebyg i fodau dynol [25]. Ar ben hynny, mae'r defnydd o embryonau zebrafish yn cael sylw cynyddol gan eu bod yn cael eu hystyried yn ddull disodli ar gyfer arbrofion anifeiliaid [26]. Mae gan sebrafish pigmentau melanin ar yr wyneb, sy'n caniatáu arsylwi syml ar y broses pigmentiad heb weithdrefnau arbrofol cymhleth [27].

Felly, fe wnaethom ymchwilio i effeithiau melanin-ataliol cyfansoddyn 1 ar bigmentiad pysgod sebra. Fe wnaethon ni ddefnyddio PTU (N-phenylthiourea; atalydd tyrosinase sy'n cynnwys sylffwr) fel rheolaeth gadarnhaol (Ffigur 4B), a ddefnyddir yn eang mewn ymchwil zebrafish [28,29]. Fel y dangosir yn Ffigur 4C, D, 40, ac 80 µM, cynhyrchodd triniaeth gyda chyfansoddyn 1 ataliad rhyfeddol o bigmentiad y corff zebrafish, a ostyngodd yn rhyfeddol gyfanswm y cynnwys melanin o'i gymharu â'r cerbyd rheoli (Ffigur 4A).

Yn yr astudiaeth hon, rydym yn ynysu nofel ginsenoside Rh23 (1) o hydroponig P. ginseng ddail. Hyd yn hyn mae mwy na 100 o ginsenosides wedi'u hadrodd o rywogaethau ginseng. Fodd bynnag, anaml y ceir 25-hydrocsylatedginsenosides mewn natur, gan gynnwys mewn planhigion ginseng. Yn ogystal, ni adroddwyd am weithgaredd gwynnu. Roedd gweithgaredd ataliol ginsenoside Rh23 yn dangos 37 y cant yn yr uNconcentration 80 heb cytotoxicity cell mewn celloedd melan-a, ond ni welwyd unrhyw ataliad o weithgaredd tyrosinase madarch in vitro gan ginsenoside Rh23 (data heb ei ddangos). Yn ddiweddar, dangoswyd bod y darnau neu'r ginsenosides wedi'u puro o wreiddiau a dail ginseng yn meddu ar briodweddau gwrthocsidiol yn eang (30,31), tra bod dŵr neu echdyniad organig o ginseng wedi arddangos gweithgareddau sborionio tuag atDPPH, superoxide anion a hydroxyl radical (32). Felly, efallai y bydd ein nofel ginsenoside Rh23 ynysig o ddail hydroponig P. ginseng wedi is-reoleiddio tyrosinase gan ei eiddo gwrth-ocsidiol. Fodd bynnag, nid yw ei rôl melanogenesis wedi'i ymchwilio eto. Felly, mewn astudiaeth bellach, mae angen pennu union fecanweithiau gweithredu ginsenoside Rh23 ar reoleiddio synthesis melanin.

3. Arbrofol

3.1. Cyffredinol

Defnyddiwyd resinau Kieselgel 60 a LiChroprep RP-18 ar gyfer cromatograffaeth colofn (Merck, Darmstadt, yr Almaen). Defnyddiwyd Kieselgel 60 F254 (Merck) a RP-18 F254S (Merck) fel cyfnodau solet ar gyfer arbrawf TLC. Perfformiwyd canfod smotiau ar y plât TLC trwy arsylwi o dan lamp UV (Sbectroline, model ENF-240 C/F, Spectronics Corp., Efrog Newydd, NY, UDA) neu drwy chwistrellu H2SO4 dyfrllyd 10 y cant ar y datblygiad. plât ac yna gwresogi. Mesurwyd cylchdroadau optegol gan ddefnyddio polarimedr digidol JASCO P-1010 (Tokyo, Japan). Cafwyd pwyntiau toddi gan ddefnyddio Offer Pwynt Toddi Fisher-Johns (cwmni gwyddonol Fisher, Pittsburgh, PA, UDA) gyda microsgop. Mesurwyd sbectra uwchfioled ar fodel Shimadzu sbectrophotometer UV-1601 (Shimadzu Corp., Kyoto, Japan). Cafwyd sbectra IR o sbectromedr FT-IR Sbectrwm Un Perkin Elmer (Swydd Buckingham, DU). Cofnodwyd sbectra NMR ar sbectromedr Varian Inova AS 400 (400 MHz, Varian, Palo Alto, CA, UDA). Perfformiwyd dadansoddiad UPLC-QTOF/MS gan ddefnyddio cyfres Waters Xevo G2-S (Waters Corp., Milford, MA, USA) yn gweithredu yn y modd ïon negatif.

3.2. Deunyddiau Planhigion

Tyfwyd ginseng Panax Hydroponic yn nhŷ gwydr yr Adran Ymchwil Cnydau Llysieuol a leolir yn Eumseong, Talaith Chungbuk yn unol â phrotocol y "canllaw amaethu safonol ginseng GAP" [11,33] a ddatblygwyd gan y Weinyddiaeth Datblygu Gwledig, Gweriniaeth Corea. Prynwyd gwreiddiau eginblanhigion ginseng blwydd oed sy'n pwyso 0.8 i 1 g gan yr Adran Ymchwil Cnydau Llysieuol, Sefydliad Cenedlaethol Gwyddor Garddwriaethol a Llysieuol (NIHHS), Gweinyddiaeth Datblygu Gwledig (RDA) a'u storio mewn a siambr ar dymheredd isel (1-2 ◦C) cyn ei ddefnyddio. Cafodd gwreiddiau eginblanhigion ginseng eu trawsblannu i faddonau maethol a'u meithrin yn y system hydroponig. Ar ôl tri mis o ddiwylliant, cafodd y ginsengs hydroponig eu tynnu allan i'w cynaeafu. Cafodd y planhigion ginseng hydroponig a gynaeafwyd eu golchi'n lân o lwch â dŵr a'u didoli i ddail a gwreiddiau, a gafodd eu sychu wedyn am 72 h mewn sychwr rhewi (FD8512, Ilshin Biobase Co., Yangju, Korea). Adneuwyd sbesimen taleb (NIHHS14-03) yn llysieufa'r Adran Ymchwil Cnydau Llysieuol, NIHHS, RDA, Eumseong, Gweriniaeth Corea.

3.3. Echdynnu ac Ynysu

Mae'r dail sych a powdr o hydroponig P. ginseng (HPGL, 6 kg) eu tynnu gyda 80 y cant MeOH (30 L × 3) ar dymheredd ystafell am 24 h. Cafodd y darnau eu hidlo trwy bapur hidlo a'u hanweddu dan bwysau llai ar 45 ◦C i gynhyrchu 1.4 kg o echdyniad. Cafodd y dyfyniad ei dywallt i H2O (3L) a'i dynnu gydag EtOAc (3 L × 3) a n-BuOH (2.6 L × 3), yn olynol. Crynhowyd pob haen o dan bwysau llai i gael ffracsiynau EtOAc (75 g), n-BuOH (470 g), a H2O (855 g).

Cafodd y ffracsiwn n-BuOH (HPGLB, 130 g) ei gymhwyso i'r golofn gel silica (φ 13 × 17 cm) a'i eliwtio â CHCl3-MeOH-H2O (8:3:1, 9{{42} } L → 6:4:1, 110 L) i ildio 20 ffracsiynau (HPGLB1 i HPGLB20). Cyfunwyd ffracsiynau HPGLB3 a HPGLB4 (18.9 g, Ve/Vt=0.{99}}5–0.12), a'u ffracsiynu ymhellach dros y golofn gel silica (φ 8 × 15 cm, CHCl3–MeOH–H2O=12:3:1, 14 L) i ildio 14 ffracsiynau (HPGLB3-1 i HPGLB3-14). Cyfunwyd ffracsiynau HPGLB3-4 a HPGLB3-5 (1.27 g, Ve/Vt {{40}}.09–0.16), a'u ffracsiynu ymhellach dros y golofn ODS (φ 4 × 7 cm, MeOH–H2O=2:1, 2.6 L) i ildio naw ffracsiwn (HPGLB3-4-1 i HPGLB3-4-9). Ffracsiwn HPGLB3-4-3 (119.4 mg, Ve/Vt=0.14–0.26) wedi'i ffracsiynu ymhellach dros y golofn ODS (φ 2.5 × 7 cm, MeOH–H2O=1:1, 1 L) i ildio naw ffracsiwn (HPGLB3-4-3-1 i HPGLB3-4-3-9) gan gynnwys cyfansoddyn 1 (HPGLB3-4-3-7, 10.5 mg, Ve/Vt=0.42–0.55, TLC Rf=0.40 (RP-18 F254S, MeOH–H2O=2:1), Rf=0.50 (Kieselgel 60 F254, CHCl3–MeOH–H2O {{90} }:3:1)). Cyfunwyd ffracsiynau HPGLB5 i HPGLB7 (24.0 g, Ve/Vt=0.12-0.22), a'u ffracsiynu ymhellach dros y golofn gel silica (φ 7 × 12 cm, CHCl3-MeOH-H2O=10: 3:1, 10 L → 6:4:1, 9 L) i ildio 16 ffracsiynau (HPGLB5-1 i HPGLB5-16). Ffracsiwn HPGLB5-6 (323.1 mg, Ve/Vt=0.28–0.31) wedi'i ffracsiynu ymhellach dros y golofn ODS (φ 3 × 14 cm, MeOH–H2O=3:2, 1.2 L → 3:1, 1.5 L) i ildio deg ffracsiwn (HPGLB5-6-1 i HPGLB5-6-10) gan gynnwys cyfansoddyn 2 (HPGLB5-6-5, 10.1 mg, Ve/Vt=0 .21–0.23, TLC Rf=0.50 (RP-18 F254S, MeOH–H2O=2:1), Rf=0.45 (Kieselgel 60 F254, CHCl3– MeOH–H2O=7:3:1)).

3.4. Data Sbectrosgopig

Cyfansoddyn 1. Powdwr gwyn, mp: 138–140 ◦C; [ ] 25 D plws 17.4◦ (c=0.39, MeOH); IR (ffenestr CaF2): 3377, 2932, 1382 cm−1; QTOF/MS negyddol m/z 713.44723 [M a COOH] - (calcd. ar gyfer C37H64O10, 668.4499); Data 1H- a 13C-NMR, gweler Tabl 1.

Cyfansoddyn 2. Powdwr gwyn, mp: 133–136 ◦C; [ ] 25 D plws 20.2◦ (c=0.50, MeOH); IR (ffenestr CaF2): 3359, 2929, 1384 cm−1; QTOF/MS negyddol m/z 699.48311 [M ynghyd â COOH] - (calcd. ar gyfer C36H62O10, 654.4323); data 1H- a 13C-NMR, gweler Tabl 1.

3.5. Dadansoddiad Meintiol o Gyfansoddyn Nofel 1 Gan ddefnyddio UPLC-QTOF/MS

Paratowyd hydoddiant stoc safonol o gyfansoddyn 1 trwy hydoddi 1.00 mg yr un mewn 1 mL methanol i gynhyrchu crynodiad o 1.00 mg/mL ac fe'i cadwyd ar 4 ◦C. Gwanhawyd yr hydoddiant stoc safonol (1) â methanol i gael hydoddiannau graddnodi gydag amrediadau o 0.{{10}}2–0.8 µg/mL, yn y drefn honno. Cafodd un gram o ddyfyniad HPGL ei bwyso'n gywir a'i hydoddi mewn cyfeintiau sefydlog (10 mL) o fethanol, ei hidlo drwy bapur hidlo {{27}.2{0 mm, a'i oeri ar 4 ◦C . Perfformiwyd UPLC gan ddefnyddio UPLC Dosbarth H ACQUITY Waters (Waters Corp., Milford, MA, UDA) gyda cholofn ACQUITY BEH C18 (2.1 × 100 mm, 1.7 µm). Roedd y cyfnodau symudol yn cynnwys dŵr (A) gyda 0.1 y cant o asid ffurfig (v/v) ac asetonitrile (B) gyda 0.1 y cant o asid fformig (v/v). Roedd y graddiant elution fel a ganlyn: 0–4 mun, B 10–30 y cant ; 4–15 mun, B 30–60 y cant; 15–16 mun, B 60–100 y cant; 16–19 mun, B 100–10 y cant . Y gyfradd llif oedd 0.45 mL/munud, a chyfaint y pigiad oedd 2 µL ar gyfer pob rhediad.

Nesaf, perfformiwyd dadansoddiad HR-MS gan ddefnyddio Waters Xevo G2-S QTOF MS (Waters Corp., Milford, MA, USA) yn gweithredu yn y modd ïon negyddol. Perfformiodd y sbectromedrau màs sganiau ynni uchel ac isel bob yn ail a elwir yn fodd caffael MSE. Cafwyd mesuriadau màs cywir gan ddefnyddio system dosbarthu graddnodi awtomataidd sy'n cynnwys Leucine enkephalin, m/z 554.262 (modd ESI neg.) fel cyfeiriad mewnol. Gosodwyd y paramedrau gweithredu gorau posibl fel y dangosir yn Nhabl 3.

3.6. Diwylliant Cell

Mae melan-a melanocytes yn llinell gell melanocyte murine normal, wedi'i phigmentu'n fawr, sy'n deillio o lygod C57BL/6. Cafwyd y celloedd melan-a a ddefnyddiwyd yn yr astudiaeth hon gan Dr. Dorothy Bennett (Ysbyty St. George, Llundain, DU). Cafodd celloedd eu meithrin ar 37 ◦C mewn awyrgylch o 95 y cant o aer, 10 y cant o CO2 mewn cyfrwng RPMI 1640 wedi'i ategu at grynodiad terfynol gyda 10 y cant o serwm buchol ffetws anweithredol â gwres, 1 y cant penisilin / streptomycin, a 200 nM PMA. Pennwyd hyfywedd celloedd gan CCK-8 pecyn cyfrif celloedd-8 (Dojindo Lab., Kumamoto, Japan).

3.7. Assay Melanin

Cafodd celloedd Melan-a eu trin â chyfansoddion am 72 h, ac yna diddymwyd y celloedd yn 1 N NaOH ar 60 ◦C am 30 munud. Yna, mesurwyd y lysates ar 450 nm gan ddefnyddio sbectroffotomedr. Cafodd y data eu normaleiddio i gynnwys protein y lysates cell. Wedi hynny, proseswyd y lysates cell ar gyfer pennu'r crynodiad protein gan ddefnyddio pecyn profi protein BCA (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL, UDA).

3.8. Tarddiad a Chynnal Pysgod Rhiant

Cafwyd pysgod sebra oedolion gan ddeliwr masnachol a chadwyd 10-15 pysgod mewn tanc acrylig 5 L gyda'r amodau canlynol: 28.5 ◦C, gyda chylch golau / tywyll 14/10 h. Roedd pysgod sebra yn cael eu bwydo dair gwaith y dydd, chwe diwrnod yr wythnos, gyda bwyd naddion TetraMin wedi'i ategu â berdys heli byw (Artemia salina). Cafwyd embryonau o silio naturiol a ysgogwyd yn y bore trwy droi'r golau ymlaen. Cwblhawyd y casgliad o embryonau o fewn 30 munud. Cymeradwywyd yr holl brotocolau a gweithdrefnau arbrofol a'u cynnal yn unol â chanllawiau a rheoliadau cymeradwy Pwyllgor Moeseg Anifeiliaid Prifysgol Genedlaethol Chungnam (CNU-00866).

3.9. Triniaeth Cyfansoddion a Gwerthusiad Seiliedig ar Ffnoteipiau

Casglwyd embryonau cydamserol a'u gosod gyda phibed (7–9 embryonau fesul ffynnon mewn 24-platiau ffynnon yn cynnwys 1 ml o gyfrwng embryo). Diddymwyd cyfansoddion prawf yn 0.1 y cant DMSO ac yna eu hychwanegu at y cyfrwng embryo o naw i 72 h ôl-ffrwythloni (hpf) (63 h o amlygiad). Gwelwyd yr effeithiau ar bigmentiad pysgod sebra o dan y stereomicrosgop. Roedd troi achlysurol, yn ogystal ag ailosod y cyfrwng, yn cael ei berfformio bob dydd i sicrhau dosbarthiad cyfartal y cyfansoddion. Ym mhob arbrawf, defnyddiwyd 0.2 mM 1-ffenyl-2-thiourea (PTU) i gynhyrchu pysgod sebra tryloyw heb ymyrryd â'r broses ddatblygiadol [33] ac fe'i hystyriwyd yn rheolaeth gadarnhaol safonol. Roedd gwerthusiadau seiliedig ar ffenoteip o bigmentiad corff yn cael eu decorionated gan gefeiliau, anesthetized mewn hydoddiant methanesulfonate tricaine (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, UDA), gosod mewn 3 y cant methylcellulose ar ddysgl 35 mm (SPL Lifesciences, Pocheon, Korea), a llun o dan y stereomicrosgop MZ16 (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, yr Almaen).

4. Casgliadau

Yn yr astudiaeth hon, cafodd ginsenoside Rh23 (1) ei ynysu o ddail ginseng hydrophonic Panax ynghyd â 20-O- -D-glucopyranosyl-3 ,6 ,12 ,20 ,25- pentahydroxydamar-23-ene (2). Yn gyffredinol, rydym wedi bod yn llwyddiannus yn ein hymgais i gael effaith hypo pigmentaidd cyfansoddion o hydroponig P. ginseng. Mae gan Ginsenoside Rh23 a 20-O- -D-glucopyranosyl-3 ,6 ,12 ,20 ,25-pentahydroxydammar23-ene weithgareddau ataliol ar fiosynthesis melanin heb effeithiau sytotocsig mewn melan-a cell. Yn ogystal, fe wnaeth ginsenoside Rh23 wella debigmentiad y pysgodyn sebra fel model anifail amgen. Efallai y bydd gan y gostyngiad mewn cynnwys melanin a phigmentiad yn y corff y potensial ar gyfer gweithgaredd gwynnu a'r effaith nad yw'n sytotocsig yw'r pwynt mwy ffafriol oherwydd bod diogelwch yn brif ystyriaeth ar gyfer asiantau gwynnu mewn cynhyrchion cosmetig.

Felly, yn seiliedig ar ein canlyniadau presennol, mae'n bwysig y gellir defnyddio cyfansoddion ginseng P. hydro ffonig newydd fel asiant goleuo croen effeithiol posibl. Bydd astudiaethau pellach yn egluro union fecanweithiau gweithredu Ginsenoside Rh23 ar reoleiddio synthesis melanin a'r berthynas rhwng nodweddion strwythurol ginsenoside Rh23 a melanogenesis, i ganfod a yw'n asiant gwynnu posibl ar gyfer y diwydiant cosmetig. Mae manteision sbectrometreg màs hybrid Q-TOF yn cynnwys nid yn unig gallu canfod ansawdd a sensitifrwydd, ond hefyd mesuriad cywir, gan wneud esboniadau strwythurol yn haws. Gellir ei ddefnyddio ar gyfer pennu ansoddol a meintiol cyfansoddion bach neu newydd, sy'n helpu i wella rheolaeth ansawdd sbeisys ginseng.

Deunyddiau Atodol:

Mae sbectra 1H-NMR a 13C-NMR o 1 ar gael yn y Deunyddiau Atodol.

Diolchiadau:

Cynhaliwyd y gwaith hwn gyda chefnogaeth y "Rhaglen Ymchwil Gydweithredol ar gyfer Datblygu Gwyddoniaeth a Thechnoleg Amaethyddiaeth" (PJ01136203), Gweinyddiaeth Datblygu Gwledig, Gweriniaeth Corea. Diolchwn i Cheol-Hee Kim (Prifysgol Genedlaethol Chungnam) am rannu'r cyfleuster pysgod sebra.

Cyfraniadau Awdur:

DYL ac N.-IB a luniodd a dyluniodd yr arbrofion; H.-GK ac Y.-GL ynysu y cyfansoddion; eglurodd DYL y strwythurau; I.-BJ cyfranu at y parotoi defnyddiau planhigion; Cynhaliodd JHK yr assay biolegol a helpu gyda pharatoi'r llawysgrif; Perfformiodd JWL a B.-RC yr NMRs, ac UPLC-QTOF/MS y samplau; Cynorthwyodd G.-SK i ddiwygio'r llawysgrif; a DYL ysgrifennodd y papur a rheoli'r prosiect ymchwil. Darllenodd a chymeradwywyd y llawysgrif derfynol gan bob awdur.

Gwrthdaro Buddiannau:

Nid yw'r awduron yn datgan unrhyw wrthdaro buddiannau. Nid oedd gan y noddwyr sefydlu unrhyw ran yng nghynllun yr astudiaeth; casglu, dadansoddi neu ddehongli'r data; ysgrifennu'r llawysgrif; neu'r penderfyniad i gyhoeddi'r canlyniadau.

Cyfeiriadau

1. Ben, EW; Michael, W. Planhigion meddyginiaethol y byd. Yn Shinilbooks; Pren Press Inc.: Portland, OR, UDA, 2007.

2. Parc, JD; Rhee, DK; Lee, YH Gweithgareddau biolegol a chemeg saponins o Panax ginseng CA Meyer. Ffytocemeg 2005, 4, 159–175. [CrossRef]

3. Kwon, SJ; Chung, DK Effaith gwella imiwnedd ginseng gŵn mynydd, ginseng wedi'i drin yn y mynydd, a ginseng Panax. J. Orient. Niwroseiciatreg 2004, 15, 89–101.

4. Gillis, CN Ffarmacoleg ginseng Panax: Mae cyswllt ocsid nitrig? Biocemeg. Ffarmacol. 1997, 54, 1–8. [CrossRef]

5. Kang, KS; Yamabe, N.; Kim, HY; Yokozawa, T. Effaith echdyniad methanol ginseng haul ar anaf i'r afu a achosir gan lipopolysaccharid mewn llygod mawr. Ffytomeddygaeth 2007, 14, 840–845. [CrossRef] [PubMed]

6. Jiang, S.; Ren, D.; Li, J. ; Yuan, G. ; Li, H. ; Xu, G. ; Han, X. ; Du, P. ; An, L. Effeithiau cyfansawdd K ar hyperglycemia ac ymwrthedd i inswlin mewn llygod mawr â diabetes mellitus math 2. Fioterapia 2014, 95, 58–64. [CrossRef] [PubMed]

7. Kim, HS; Lee, EH; Ko, SR; Choi, KJ; Parc, JH; Im, DS Effeithiau ginsenoside Rg3 a Rh2 ar amlhau celloedd canser y prostad. Arch. Pharm. Res. 2004, 27, 429–435. [CrossRef] [PubMed]

8. Nocerino, E.; Amato, M. ; Izzo, AA Priodweddau affrodisaidd ac addasogenig ginseng. Fitoterapia 2000, 71, S1–S5. [CrossRef]

9. Keum, YS; Parc, KK; Lee, JM; Chun, KS; Parc, JH; Lee, SK; Kwon, HJ; Surh, YJ Gwrthocsidiol a gwrth-tiwmor sy'n hyrwyddo gweithgareddau'r dyfyniad methanol o ginseng wedi'i brosesu â gwres. Cancr Lett. 2000, 150, 41–48. [CrossRef]

10. Kim, GS; Lee, De-ddwyrain; Na, HJ; Kwon, H. ; Lee, SW; Kim, SY; Kim, YB Effeithiau cynhyrchion bioactif naturiol ar dwf a chynnwys ginsenoside ginseng Panax wedi'u meithrin mewn system aeroponig. J. Ginseng Res. 2012, 36, 430–441. [CrossRef] [PubMed]

11. Choi, SY; Cho, CW; Lee, YM; Kim, SS; Lee, SH; Kim, KT Cymhariaeth o gynhwysion ginsenoside a ffenolig mewn dail, ffrwythau a gwreiddiau ginseng a dyfir yn hydroponig. J. Ginseng Res. 2012, 36, 425–429. [CrossRef] [PubMed]

12. Matsuda, H. ; Nakamura, S.; Kubo, M. Astudiaethau o gyffuriau cwtigl o ffynonellau naturiol. II. Effeithiau ataliol planhigion Prunus ar fiosynthesis melanin. Biol. Pharm. Tarw. 1994, 17, 1417–1420. [CrossRef] [PubMed]

13. Duncan, CL; Foster, EM Effaith sodiwm nitraid, sodiwm clorid, a sodiwm nitrad ar egino ac alldyfiant sborau anaerobig. Appl. Microbiol. 1968, 16, 406–411. [PubMed]

14. Shimizu, K. ; Yasutake, S.; Kondo, R. Mae stilbene newydd gyda gweithgaredd ataliol tyrosinase gan Chlorophora yn rhagori. Cemeg. Pharm. Tarw. 2003, 51, 318–319. [CrossRef] [PubMed]

15. Parc, SH; Kim, DS; Kim, LlC; Ryoo, IJ; Lee, DH; Huh, CH; Ti, SW; Yoo, ID; Park, KC Terrin: Atalydd melanogenesis newydd a'i fecanwaith. Cell. Mol. Bywyd 2004, 61, 2878–2885. [CrossRef] [PubMed]

16. Kong, YH; Jo, YO; Cho, CW; Mab, DW; Parc, SJ; Rho, JH; Choi, SY Effeithiau ataliol asid sinamig ar fiosynthesis melanin yn y croen. Biol. Pharm. Tarw. 2008, 31, 946–948. [CrossRef] [PubMed]

17. Hwang, EY; Choi, SY Dadansoddiad meintiol o gyfansoddion ffenolig mewn gwahanol rannau o Panax ginseng CA Meyer a'i effaith ataliol ar biosynthesis melanin. Corëeg J. Med. Gwydd Cnwd. 2006, 14, 148–152.

18. Im, SJ; Kim, KN; Yun, YG; Lee, JC; Mun, YJ; Kim, JH; Woo, WH Effaith radix ginseng a radix trichosanthis ar y melanogenesis. Biol. Pharm. Tarw. 2003, 26, 849–853. [CrossRef] [PubMed]

19. Hwang, EY; Kong, YH; Lee, YC; Kim, YC; Yoo, KM; Jo, YO Cymharu cynnwys cyfansoddion ffenolig rhwng ginseng gwyn a choch a'u heffaith ataliol ar fiosynthesis melanin. J. Ginseng Res. 2006, 30, 82–87.

20. Zhang, YC; Pi, ZF; Liu, CM; Cân, FR; Liu, ZQ; Liu, SY Dadansoddiad o ginsenosides pegynol isel mewn ginseng Panax wedi'i stemio ar dymheredd uchel gan HPLC-ESI-MS/MS. Cemeg. Res. Gên. Univ. 2012, 28, 31–36.

21. Xie, YY; Luo, D.; Cheng, YJ; Ma, JF; Wang, YM; Liang, QL; Luo, GA Trawsnewidiadau cemegol a achosir gan stêm ac asesiad ansawdd cyfannol o ginseng coch yn deillio o Panax ginseng gan ddefnyddio olion bysedd meintioli aml-gydran seiliedig ar HPLC-ESI-MS/MSn. J. Amaeth. Cemegydd Bwyd. 2012, 60, 8213–8224. [CrossRef] [PubMed]

22. Liu, GY; Li, XW; Wang, DS; Zhou, HY; Wei, W. ; Gui, FY; Yang, B. ; Jin, YR Tri saponin triterpene math dammarane newydd o ddail Panax ginseng CA Meyer. J. Nat Asiaidd. Prod. Res. 2010, 12, 865–873. [CrossRef] [PubMed]

23. Xing, Q. ; Liang, T. ; Shen, G. ; Wang, X. ; Jin, Y. ; Liang, X. HILIC x RPLC cynhwysfawr gyda chanfod sbectrometreg màs ar gyfer dadansoddi saponins yn Panax notoginseng. Dadansoddwr 2012, 137, 2239–2249. [CrossRef] [PubMed]

24. Cariad, DR; Pichler, FB; Dodd, A. ; Copr, BR; Greenwood, DR Technoleg ar gyfer sgrin trwybwn uchel: Y presennol a'r dyfodol gan ddefnyddio pysgod sebra. Curr. Barn. Biotechnol. 2004, 15, 564–571. [CrossRef] [PubMed]

25. Uwe, S. ; Stefan, S.; Pobert, G. ; Petra, G. ; Henner, H.; Sepand, R. ; Axel, S.; Ingrid, S.; Carsten, W.; Hilda, W.; et al. Embryonau Sebrafish fel dewis arall yn lle arbrofion anifeiliaid - Sylwebaeth ar y diffiniad o ddechrau cyfnod bywyd gwarchodedig mewn rheoliadau lles anifeiliaid. Atgynhyrchu. Gwenwynig. 2012, 33, 128–132.

26. Chio, TY; Kim, JH; Ko, DH; Kim, CH; Hwang, JS; Ahn, S.; Kim, SY; Kim, CD; Lee, JH; Yoo, TJ Zebrafish fel model newydd ar gyfer sgrinio cyfansoddion rheoleiddio melanogenig yn seiliedig ar ffenoteip. Cell Pigment Res. 2007, 20, 120–127. [CrossRef] [PubMed]

27. Elsalini, OA; Rohr, KB Mae Phenylthiourea yn amharu ar weithrediad y thyroid wrth ddatblygu pysgod sebra. Dev. Genes Evol. 2003, 212, 593–598. [PubMed]

28. Lee, DY; Cha, BJ; Lee, YS; Kim, GS; Na, HJ; Kim, SY; Kang, HC; Kim, JH; Baek, GI Potensial mân ginsenosides wedi'u hynysu o ddail ginseng Panax fel atalyddion melanogenesis. Int. J. Mol. Sci. 2015, 16, 1677–1690. [CrossRef] [PubMed]

29. Li, J. ; Huang, M.; Teoh, H. ; Dyn, mae RY Panax quinquefolium saponins yn amddiffyn lipoproteinau dwysedd isel rhag ocsideiddio. Gwyddor Bywyd. 1999, 64, 53–62. [CrossRef]

30. Li, TSC; Mazza, G. ; Cottrell, AC; Gao, L. Ginsenosides mewn gwreiddiau a dail ginseng Americanaidd. J. Amaeth. Cemegydd Bwyd. 1996, 44, 717–720. [CrossRef]

31. Jung, CH; Seog, HM; Choi, IW; Parc, MW; Cho, HY Priodweddau gwrthocsidiol o wahanol ddarnau toddyddion o ddail ginseng gwyllt. LWT 2006, 39, 266–274. [CrossRef]

32. Sefydliad Cenedlaethol Gwyddor Cnydau. Canllaw Tyfu Safonol GAP Ginseng; Sefydliad Cenedlaethol Gwyddor Cnydau, Gweinyddiaeth Datblygu Gwledig: Suwon, Korea, 2009.

33. Karlsson, J.; Von Hoffsten, J.; Olsson, Addysg Gorfforol Cynhyrchu pysgod sebra tryloyw: Dull wedi'i fireinio i wella canfod mynegiant genynnau yn ystod datblygiad embryonig. Mawrth Biotechnol. 2001, 3, 522–527. [CrossRef] [PubMed]

Argaeledd Sampl:

Mae samplau o gyfansoddion 1 a 2 ar gael gan yr awduron.

Dae Young Lee 1 ID , Hyoung-Geun Kim 2 , Yeong-Geun Lee 2 , Jin Hee Kim 3 , Jae Won Lee 1 ID , Bo-Ram Choi 1 , In-Bae Jang 1 , Geum-Soog Kim 1 a Nam-In Baec 2,*

1 Adran Ymchwil Cnydau Llysieuol, Sefydliad Cenedlaethol Gwyddor Garddwriaethol a Llysieuol, RDA, Eumseong 27709, Korea; dylee0809@gmail.com (DYL); jaewon3@gmail.com (JWL); bmcbr@korea.kr (B.-RC); ikanet@korea.kr (I.-BJ); kimgs0725@korea.kr (G.-SK)

2 Adran Biotechnoleg Meddygaeth Oriental, Prifysgol Kyung Hee, Yongin 17104, Korea; zwang05@naver.com (H.-GK); lyg629@nate.com (Y.-GL)

3 College of Herbal Bio-industry, Daegu Haany University, Gyeongsan 38610, Korea; gonogo1@nate.com

Derbyniwyd: 28 Tachwedd 2017; Derbyniwyd: 26 Ionawr 2018; Cyhoeddwyd: 29 Ionawr 2018

For more information:1950477648nn@gmail.com