Mae Kaempferol yn Lliniaru Difrod LD-mitochondrial Trwy Hyrwyddo Autophagy: Goblygiadau mewn Clefyd Parkinson Rhan 1
Mar 29, 2022
Cysylltwchoscar.xiao@wecistanche.comam fwy o wybodaeth
Crynodeb:Mae tystiolaeth sy'n dod i'r amlwg yn dangos y gall dyddodiad a perocsidiad defnyn lipid annisgwyl (LD) gyflymu straen organelle a chwarae rhan hanfodol yn pathogenesis clefydau niwroddirywiol (NDDs). Yn ein hastudiaeth flaenorol, cadarnhawyd bod kaempferol (Ka), moleciwl bach flavonoid naturiol , wedi arddangos effeithiau niwro-amddiffynnol ar lygod â chlefyd Parkinson a achosir gan LPS (PD). Yn ogystal, mae astudiaethau blaenorol wedi dangos bod awtophagy yn chwarae rhan bwysig wrth reoleiddio dyddodiad LD cellog. Yn yr astudiaeth gyfredol, dangosom fod Ka yn amddiffyn rhag TH ynghyd â cholled niwronaidd a diffygion ymddygiadol mewn llygod PD a achosir gan MPTP/p, ynghyd â llai o straen ocsideiddiol lipid yn y substantia nigra pars compacta (SNpc). Mewn celloedd niwronol diwylliedig, arddangosodd Ka amrediad crynodiad cymharol ddiogel ac ataliad sylweddol o groniad LD ac apoptosis cellog a achosir gan MPP plus . Dangosodd astudiaeth bellach fod effaith amddiffynnol Ka yn dibynnu ar awtophagi, yn benodol lipophagy. Yn hollbwysig, fe wnaeth Ka hyrwyddo awtophagi i gyfryngu diraddiad LD mewn lysosomau, a oedd wedyn yn lleddfu dyddodiad lipid a perocsidiad a'r difrod mitocondriaidd o ganlyniad, gan leihau marwolaeth niwronaidd o ganlyniad. At hynny, diddymodd AAV-shAtg, a gafodd ei gyfryngu gan Atg5, effeithiau niwro-amddiffynnol Ka yn erbyn ocsidiad lipid mewn llygod PD. Mae'r gwaith hwn yn dangos bod Ka yn atal dirywiad niwronaidd dopaminergig mewn PD trwy atal difrod mitocondriaidd sy'n cael ei gyfryngu gan berocsidiad lipid trwy hyrwyddo awtophagi gwefusau ac mae'n darparu strategaeth therapiwtig newydd bosibl ar gyfer PD ac NDDs cysylltiedig.
1. Rhagymadrodd
Mae clefyd Parkinson (PD) yn glefyd niwroddirywiol cyffredin (NDD) a nodweddir yn patholegol gan golled gynyddol niwronau dopaminergig (DA) yn y substantia nigra pars compacta (SNpc)[]. Er nad yw union etioleg a chwrs naturiol y clefyd hwn wedi'u hegluro'n llawn eto, mae nifer o brosesau a chamweithrediadau ar lefel system, gan gynnwys swyddogaethau mitocondriaidd, homeostasis dopamin, niwro-llid, ac awtoffagi, wedi'u cysylltu â phathogenesis PD [1, 2]. Datgelodd adroddiadau diweddar y gallai lipotoxicity sy'n gysylltiedig â droplet lipid (LD) gymryd rhan mewn patholeg PD [3,4]. Mae LDs yn organynnau deinamig iawn sy'n dod i'r amlwg o'r bilen reticwlwm endoplasmig (ER) ac fel arfer yn gwasanaethu fel safleoedd mewngellol ar gyfer storio lipidau niwtral [5]. Yn ddiweddar dangoswyd bod LDs yn chwarae rhan lawer ehangach na storio asid brasterog (FA) ac yn cymryd rhan mewn llawer o afiechydon. Er enghraifft, mae celloedd myeloid, gan gynnwys macroffagau, leukocytes, ac eosinoffiliau, yn ffurfio LDs mewn ymateb i lid a straen, ac mae LDs yn safleoedd cynhyrchu a storio cytocinau llidiol ac maent yn ymwneud ymhellach â chyflwyniad antigen a chlirio pathogen [6]. Yn bwysig, mewn atherosglerosis, dangoswyd bod celloedd ewyn llawn LD yn niweidiol ym mhob cam o'r afiechyd [7].
Gall Cistanche helpu i wella imiwnedd
Fodd bynnag, nid yw LDs wedi cael eu hastudio'n helaeth yn y system nerfol ganolog (CNS), gydag ychydig o bapurau yn adrodd am bresenoldeb histolegol LDs ym meinwe ymennydd dynol [8,9]. Er hynny, efallai y bydd gan LDs swyddogaethau pwysig yn yr ymennydd, gan fod astudiaethau diweddar wedi cadarnhau bod LDs cyfanredol mewn glia yn cyflymu niwroddirywiad mewn model Drosophila [10]. Adroddwyd yn ddiweddar, mewn llygod, bod celloedd olew O-positif llawn lipid yn cynnwys niwronau, protein asidig ffibrilaidd glial (GFAP) ynghyd â astrocytes a moleciwl addasydd sy'n rhwymo calsiwm ïoneiddiedig-1 (IBA-1). ) microglia, yn bresennol mewn llawer o ranbarthau ymennydd a dangoswyd eu bod yn cymryd rhan mewn prosesau sy'n gysylltiedig ag oedran [11]. Roedd ein gwaith blaenorol hefyd yn dangos bod mwy o LD yn cronni yn yr ymennydd mewn model llygoden PD [12]. Gyda'i gilydd, mae'r astudiaethau hyn yn awgrymu y gallai LDs fod yn gysylltiedig â phathogenesis PD, yn ogystal ag NDDs eraill.
Fel rheol, mae LDs mewngellol yn cael eu diraddio mewn lysosomau ac yn darparu FAs i mitocondria i'w defnyddio fel ffynhonnell ynni amgen yn ystod cyfnodau o ddisbyddu maetholion [13]. Fodd bynnag, mae gan niwronau allu isel ar gyfer defnydd FA mitocondriaidd ar gyfer cynhyrchu ynni [14]. Mae'r nodwedd hon yn gwneud niwronau'n arbennig o sensitif i groniad LD a perocsidiad. At hynny, mae cronni LDs yn gwella cyfradd ocsidiad FA ac yn gosod pwysau parhaus ar y gadwyn cludo electronau mitocondriaidd, sy'n cynyddu cynhyrchiant rhywogaethau ocsigen adweithiol (ROS) gan gyfadeiladau cadwyn trafnidiaeth electronau Iand II [15] i chwyddo straen ocsideiddiol. Mae gorlwytho lipid hefyd yn arwain at gynhyrchu ROS gan ffynonellau extramitochondrial megis nicotinamide adenine dinucleotide oxidases oxidases (NADPH) oxidases ac ensymau ocsideiddiol eraill. Ar y cyd â mynegiant llai o ensymau gwrthocsidiol a'r gallu isel ar gyfer defnydd FA mewn niwronau, mae cronni LD yn cyfryngu straen ocsideiddiol a gall arwain ymhellach at ddifrod mitocondriaidd, camweithrediad lysosomaidd, awtophagi diffygiol, a gweithrediad ymatebion llidiol [16,17]. Oni bai y gellir atal neu ddileu'r LDs cronedig, mae niwronau gweithredol iawn yn cael pathoffisioleg, gan arwain at niwroddirywiad [17]. Mae tystiolaeth yn dangos bod y broses catabolaidd wedi'i chyfryngu gan lysosome o'r enw awtophagy yn chwarae rhan ganolog wrth gynnal homeostasis LD cellog mewn meinweoedd lluosog [17,18]. Yn fanwl, gellir atafaelu LDs yn ddetholus mewn awtoffagosomau a'u danfon i lysosomau i'w diraddio gan lipasau asid lysosomaidd, proses a elwir yn benodol yn lipophagi [19]. Felly, gallai targedu LDs a’u llwybr tynnu awtoffagig gynrychioli dull newydd o reoli niwroddirywiad.
Mae astudio cynhyrchion naturiol ac asiantau dietegol fel ffynonellau ar gyfer triniaethau a strategaethau NDD posibl wedi ennill diddordeb enfawr yn y blynyddoedd diwethaf [20]. Mae Kaempferol (Ka) yn foleciwl bach polyphenolig naturiol y gellir ei ddarganfod mewn nifer o berlysiau meddyginiaethol Tsieineaidd a ffynonellau dietegol [21]. Adroddwyd bod Ka yn cael effeithiau gwrthfacterol, gwrth-heneiddio, ac imiwnofodiwlaidd, yn ogystal â gweithgareddau gwrthocsidiol a niwro-amddiffynnol [20,22,23]. Yn flaenorol, adroddwyd bod Ka yn atal llid mewn celloedd microglial BV2 in vitro [24] a chynyddu ymwrthedd niwronau DA i niwro-lid in vivo [25]. Fodd bynnag, nid yw effaith Ka ar LDs mewn PD wedi cael ei ymchwilio eto.
O ystyried pwysigrwydd LDs a'r cysylltiad agos rhwng LDs, mitocondria, ac awtoffagy [16], sydd i gyd yn ymwneud â PD, rydym yn damcaniaethu bod Ka yn atal perocsidiad LD ac yn atal niwroddirywiad DA mewn PD. Yn yr astudiaeth bresennol, gwnaethom ddangos bod Ka wedi amddiffyn yn sylweddol rhag niwroddirywiad mewn model PD murine trwy atal cronni LD. Datgelodd astudiaeth bellach fod Ka wedi sbarduno awtophagi ac wedi lleihau cronni LDs ocsidiedig i liniaru camweithrediad mitocondriaidd a chynhyrchu ROS mitocondriaidd (mtROS), a thrwy hynny atal marwolaeth apoptotig niwronaidd. Gallai'r canfyddiadau a gafwyd yn yr astudiaeth hon helpu i gyfeirio penderfyniadau clinigol ynghylch defnyddio'r moleciwl naturiol Ka mewn NDDs fel PD.
2. Deunyddiau a dulliau
2.1. Anifeiliaid arbrofol
Cafwyd llygod C57BL/6J (gwryw,4-mis oed) gan Graidd Anifeiliaid Prifysgol Feddygol Nanjing (Nanjing). Cafodd llygod eu cynnal a'u magu yng Nghanolfan Adnoddau Anifeiliaid y Gyfadran Feddygaeth, Prifysgol Feddygol Nanjing ac yn y cyfleuster anifeiliaid yn Ysbyty Nanjing Drum Tower. Mae llygod yn rhydd i gael mynediad at fwyd a dŵr mewn ystafell gyda thymheredd amgylchynol o 22 gradd ± 2 gradd a chylch golau / tywyll o 12:12 h. Cynhaliwyd yr holl weithdrefnau anifeiliaid yn gwbl unol â chanllawiau Canllaw'r Sefydliadau Iechyd Cenedlaethol ar gyfer Gofalu a Defnyddio Anifeiliaid Labordy.
2.2. Adweithyddion
MPTP (M0896),3-MA (M9281), penicillin-streptomycin (V900929), sodium pentobarbital, and probenecid were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Kaempferol (HPLC>95%)for in vivo treatment was purchased from Nanjing Jingzhu Biotechnology Co., Ltd (Nanjing, China), kaempferol(HPLC>99.0 y cant ,96,353)ar gyfer arbrofion in vitro gan Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, UDA). BODIPY 493/503 (D3922), BODIPY 581/591 C11 (D3861), DHE (D11347) eu prynu oddi wrth Thermo Fisher Scientific. Ar gyfer arbrofion anifeiliaid, cafodd Ka ei hydoddi mewn hydoddiant o 10 y cant DMSO mewn 16 y cant SBE- -CD mewn halwynog di-haint. Ar gyfer arbrofion celloedd, paratowyd Ka yn DMSO (Sigma-Aldrich) a PBS (crynodiad DMSO terfynol yw 0.01 y cant), pH 7.4.
2.3. Anwytho a thrin model llygoden PD a achosir gan methyl-4-ffenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP)
Er mwyn gwerthuso effeithiau Ka yn y model PD o MPTP/p-gwenwyndra, rhannwyd llygod (gwryw, 4-5 mis oed) ar hap i'r grŵp wedi'i drin â hallt, grŵp a driniwyd gan MPTP, MPTP a Ka-treated. grŵp, a grŵp wedi'i drin â Ka yn unig. Yn y grŵp a gafodd ei drin gan MPTP, derbyniodd llygod weinyddiaeth MPTP cronig gyda phrotocol tebyg i'r un a ddisgrifiwyd yn flaenorol [26]: toddwyd MPTP mewn halwynog a'i chwistrellu'n isgroenol ar 25 mg / kg ac yna 250 mg / kg probenecid (hydoddi mewn dimethyl sulfoxide) pigiad mewnperitoneol (ip) ar gyfnodau o 1 awr bob 3.5 diwrnod dros gyfnod o 5 wythnos. Derbyniodd llygod rheoli chwistrelliad halwynog a phrobenecid. Yn y grŵp MPTP a Ka-drin, roedd llygod yn derbyn Ka(50 mg/kg, un pigiad/diwrnod yn ystod arbrofion, Jingzhu Biotechnology, Nanjing, Tsieina) yn fewnberitoneol (.p.) bob dydd 3d cyn triniaeth gyda MPTP a thros y 5 Wythnosau pigiad MPTP. Wythnos ar ôl y pigiad MPTP diwethaf, bu llygod yn destun profion ymddygiadol wedi'u dallu i grwpiau. Ar ôl hynny, cafodd yr holl lygod eu hanestheteiddio â 40 mg/kg sodiwm pentobarbital a'u haberthu ar gyfer canfod proteinau ymennydd a dadansoddi imiwn-histocemeg neu qPCR.
2.4. Llawdriniaeth stereotacsig in vivo a thriniaethau arbrofol
Perfformiwyd llawdriniaeth stereotacsig o dan anesthesia pentobarbital sodiwm (425 mg/kg, ip) fel y disgrifiwyd [25]. Trawsnewidiwyd Llygoden Atg5 a shRNA rheoli â fectorau pecynnu (AAV-U6-CMV-shR-NA-EGFP) i gynhyrchu AAV. Ar gyfer micro-chwistrelliad, mae llygod anesthetized yn cael eu gosod mewn cyfarpar stereotacsig. Cawsant eu chwistrellu gyda'r 1μLAAV gan electrod gwydr yn anelu at DG(AP:-0.3 mm; ML: ±0.13 mm; DV:-0.45 mm) ar gyfradd o 0.25 μL/munud Yna cadwyd y nodwydd am 2-munud.2 ychwanegol ar ôl micro-bigiad feirws, roedd llygod yn destun dargludiad model PD a achosir gan MPTP a (neu) driniaeth Ka.
Cafwyd Atg5 shRNA gan Hanbio Biotechnology (Shanghai, China) Co, Ltd Ar gyfer y tawelwch Atg5, dangoswyd y paent preimio yn Nhabl Atodol 1.
2.5. Dadansoddi ymddygiad
Wythnos ar ôl y pigiad terfynol o MPTP neu saline, perfformiwyd y prawf rotarod a phrawf polyn fel y disgrifiwyd o'r blaen [27]. Ar gyfer y prawf rotarod, cafodd llygod eu cynefino â'r rotarod mewn dau dreial (6 munud gyda chyflymder cyflymach o 12-20 rpm) y dydd am 2 ddiwrnod yn olynol cyn dechrau'r arbrawf. Yna, profwyd y llygod ar 20 rpm am 300 s am 3 diwrnod yn olynol arall. Cofnodwyd yr hwyrni i gwympo gan ddefnyddio System Dadansoddi Rotarod (Jiliang, Shanghai, China). Ar gyfer y prawf polyn, gosodwyd llygod pen i fyny ar ben polyn pren fertigol (wyneb bras, uchder 50 cm, diamedr 1 cm). Roedd yr holl lygod yn gyfarwydd â'r offer 2 ddiwrnod cyn profi ac yna'n cael eu profi am dair gwaith yn y trydydd diwrnod. Cofnodwyd cyfanswm yr amser (cyfanswm T, nes i'r llygoden gyrraedd y llawr gyda'i phedair pawen) a'r amser troi (tro T, i'r llygoden droi ei phen i lawr yn llwyr). Cafodd yr arbrawf ei ddallu i grwpiau llygoden ar gyfer pob prawf ymddygiad a pherfformiwyd y prawf deirgwaith.
2.6. Casgliad samplau ymennydd
Ar ôl y profion ymddygiad terfynol, anestheteiddiwyd llygod â sodiwm pentobarbital (40 mg/kg, ip). Ar gyfer qPCR, blotio gorllewinol, a dadansoddiad cromatograffaeth hylif perfformiad uchel (HPLC), echdynnwyd yr ymennydd cyfan yn gyflym o anifeiliaid, yna'r ymennydd canolig a cafodd meinweoedd striatum eu dyrannu'n gyflym, eu rhag-rewi gan nitrogen hylifol. Cafodd yr holl samplau eu storio ar -80 gradd hyd nes y cânt eu dadansoddi.
Ar gyfer dadansoddiad imiwn-histocemegol, cafodd llygod eu darlifo'n draws-cardiaidd gyda 4 y cant o baraformaldehyd (PFA). Cafodd ymennydd ei dynnu, ei ôl-sefydlu, ei ddadhydradu, ei fewnosod yn OCT (Meinwe-Tek), a chafodd adrannau cyfresol o'r ymennydd eu cryosection (30 um y tafell) trwy bob haen gyfan a midbrain gan ddefnyddio microtome rhewi (Leica CM1950, Nussloch, yr Almaen ). Casglwyd yr holl adrannau mewn chwe chyfres ar wahân a chafodd tafelli ymennydd eu storio mewn 50 y cant o glyserin a'u rhewi i-20 gradd tan ddadansoddiad.
Ar gyfer TEM, cafodd llygod eu darlifo â 2.5 y cant o glutaraldehyde a 2 y cant o baraformaldehyd fel y disgrifiwyd 【12】. Rhan fach (<1 mm³）="" of="" the="" mesencephalon="" was="" carefully="" sectioned="" and="" incubated="" in="" the="" same="" fixative="" for="" 2="" h="" at="" 4°c.="" specimens="" were="" postfixed="" in="" 1%="" osmium="" tetroxide,="" stained="" in="" aqueous="" uranyl="" acetate,="" and="" then="" dehydrated="" and="" embedded="" in="" epoxy="" resin.="" ultrathin="" sections="" were="" stained="" using="" lead="" citrate="" and="" examined="" with="" a="" transmission="" electron="" microscope(jem-1010,="" tokyo,="">
2.6. Dadansoddiad imiwnohistocemegol
Roedd tafelli ymennydd yn cael eu rinsio mewn PBS ac yna 3 y cant H2O2 am 10 munud yna eu deor gyda 0.3 y cant Triton X-100 yn PBS wedi'i ategu â 5 y cant BSA am 1 awr. Ar ôl hynny, deorwyd sleidiau gyda'r gwrthgyrff sylfaenol ar 4 gradd dros nos mewn PBS yn cynnwys 5 y cant BSA ar 4 gradd dros nos, yna eu golchi a'u deor mewn gwrthgyrff eilaidd am 1 h ar dymheredd ystafell, ac yna deor gyda diaminobenzidine (DAB) neu mowntio i mewn. DAPI (Life Technologies, Cat P36931) fel staen imiwnfflworoleuol am 5 munud. Ar gyfer Nisslstaining, unwyd y sleidiau mewn hydoddiant cresyl fioled (CV) (0.1 g fioled cresyl, 99 ml H2O ac 1 y cant asid asetig 1 ml) am 30 munud ar dymheredd ystafell ac yna eu dadhydradu ag alcohol a sylene. Arsylwyd delweddau a thynnwyd ffotograffau o dan ficrosgop Olympus BX52 (Olympus America Inc., Melville, NY, Unol Daleithiau America). Cafwyd cyfanswm nifer y niwronau TH-positive a Nissl's-positive yn yr SNpc yn serolegol trwy ddefnyddio'r dull ffracsiynu optegol gyda meddalwedd MicroBrightField Stereo-Investigator (MicroBrightField, Williston, VT, USA).
2.7. Dadansoddiad cromatograffaeth hylif perfformiad uchel (HPLC).
Cafodd samplau striatal llygod eu homogeneiddio â {{0}}.1 M asid perchlorig （ meinweoedd 1 mg mewn asid perchlorig 100 μL） a 0.1 mM EDTA, wedi'i drin gan
2.17. Cytometreg llif
Cafodd celloedd eu treulio a'u rinsio â D-hank's yna eu staenio ag Annexin V-FITC (5 ul wedi'i wanhau mewn 500ul PBS)/PI (0.1 ul wedi'i wanhau mewn pecyn apoptosis 500 ul PBS) (CA1020, Solarbio, Beijing, Chian) yn unol â phrotocol y gwneuthurwr. Ar ôl hynny, dadansoddwyd celloedd apoptotig gan ddefnyddio cytometreg llif (guava easyCyteTM 8, Millipore, UDA). Perfformiwyd mesuriadau potensial mitocondriaidd ROS a philen mitocondriaidd fel y cyhoeddwyd 【12】.Cafodd celloedd SH-SY5Y eu staenio â MitoSOX (2.5 μM, Invitrogen, UDA) neu gyda JCl （10 ug/ml, T-3168, Invitrogen, UDA ） ar 37 ·C am 30 munud. Ar ôl golchi gyda PBS ddwywaith, cafodd y celloedd eu hailddarlledu wedyn mewn PBS oer yn cynnwys 1 y cant FBS ar gyfer dadansoddiad cytometrig llif. Dadansoddwyd data gyda meddalwedd FCS Express (Guava Easy CyteTM8, Millipore, Hayward, CA, UDA).
2.18. Profion resbiradaeth morfarch
Mesurwyd swyddogaeth resbiradol mitocondriaidd mewn celloedd byw SH-SY5Y gan ddefnyddio dadansoddwr fflwcs allgellog Seahorse (XFe96) (Agi-lent, Santa Clara, UDA) trwy newidiadau yn y gyfradd defnyddio ocsigen (OCR). Caniatawyd i gelloedd SH-SY5Y wedi'u hadu ar 3 × 103cells/ffynnon lynu at blatiau diwylliant celloedd Seahorse ac i gyrraedd tua 80 y cant o gydlifiad ar adeg yr arbrawf. Y diwrnod canlynol, cafodd celloedd eu rhag-drin gyda Ka ac yna eu hamlygu i MPP a mwy am 24 awr arall. Canfuwyd OCR o dan amodau gwaelodol ac yna ychwanegiad dilyniannol o 1 μM oligomycin, 1 μM FCCP, yn ogystal ag 1 μM rotenone & antimycin A.
2.19. Dadansoddiad ystadegol
Cyflwynwyd data fel cymedr ± SEM. Pennwyd arwyddocâd y gwahaniaeth gan brawf-t Myfyriwr, Dadansoddiad dwy ffordd o amrywiant, neu ddadansoddiad un ffordd o amrywiant (ANOVA) ac yna prawf post hoc Tukey. Ystyriwyd bod y gwahaniaeth yn arwyddocaol yn P<>
3. Canlyniadau
Canlyniad 1. Mae Ka yn adfer camweithrediad echddygol ac yn cynyddu lefelau dopamin yn striatwm llygod model MPTP/p PD
Er mwyn ymchwilio i effaith niwro-amddiffynnol pathogenesis Kaon PD, 4-chwistrellwyd llygod gwrywaidd C57BL/6 mis oed gyda'r MPTP niwrotocsin i sefydlu'r model PD MPTP/p a chawsant eu trin â Ka (Ffig. la). Ar ôl sefydlu model, defnyddiwyd y prawf rotarod a'r prawf polyn i werthuso perfformiad modur ac ymddygiad llygod yn y gwahanol grwpiau. Fel y dangosir, gostyngwyd yr amser perfformiad rotarod yn sylweddol mewn llygod a gafodd eu trin â MPTP, a chafodd yr effaith hon ei atal gan Ka (Ffig.1b). Adferodd Ka hefyd y diffygion ymddygiadol a achosir gan MPTP, fel y nodir gan y gostyngiadau yn yr amser troi a chyfanswm yr amser yn y prawf polyn (Fig.lc a d), heb effeithio ar bwysau corff y llygod (Ffig.1e). Ymhellach, dangosodd dadansoddiad HPLC fod lefel y dopamin yn y striatwm wedi gostwng yn sylweddol mewn llygod MPTP/p-herio, ac adferwyd y lefel hon gan driniaeth Ka (Ffig. 1f). Roedd triniaeth Ka hefyd yn lleddfu'r gostyngiad a achosir gan MPTP/p mewn lefelau asid asetig dihydroxy-phenyl (DOPAC, metabolyn o dopamin) yn y striatum (Ffig.1g). Mae'r canlyniadau hyn yn awgrymu bod Ka yn adfer camweithrediad modur ac yn cynyddu lefelau dopamin yn y striatwm mewn llygod PD a achosir gan MPTP.
Canlyniad 2. Mae Ka yn lliniaru colli niwronau DA yn yr SNpc o lygod model MPTP/p PD
Nesaf, er mwyn gwerthuso ymhellach effaith niwro-amddiffynnol nam niwronaidd DA a achosir gan Kaon MPTP/p, archwiliwyd tyrosine hydroxylase (THD plus niwronau yn y SNpc murine trwy imiwno-sain. Fel y dangosir yn Ffig. 2a a b, ysgogodd MPTP/p ostyngiad sylweddol yn nifer y niwronau TH plws, a gafodd ei liniaru gan driniaeth Ka. Ymhellach, cyfrifau stereoolegol o gyfanswm niwronau yn y SNpc, fel y'i diffinnir gan Nissl
Ffig. 1. Mae triniaeth Ka yn lleddfu camweithrediad echddygol ac yn cynyddu lefelau dopamin yn striatwm llygod model PD MPTP/p.
(a) Diagram sgematig o'r dyluniad arbrofol. (b) Cafodd amser ar y rhoden ei fesur ar gyfer y prawf rotarod dri diwrnod yn olynol. (cd) Cofnodwyd yr amser a gymerir i droi (amser troi) a disgyn polyn (amser dringo) ar gyfer y prawf polyn. (e) Mesurwyd pwysau corff llygoden ar ddiwedd yr astudiaeth, (fg) dadansoddwyd Dopamin (DA) ac asid asetig dihydroxy-ffenyl (DOPAC) yn y striatwm gan gromatograffaeth hylif perfformiad uchel. Mynegir y data fel y cymedr ± SEM.n =9-10 ar gyfer pob grŵp yn (b, C, d); n=6-8 ar gyfer pob grŵp yn(f,g).ns, ddim yn arwyddocaol,*P<><><0.001, by="" one-way="" anova="" followed="" by="" tukey's="" post="" hoc="" test.="" mptp,="" 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine;="" ka,="">
staenio, gwirio bod colli celloedd THt yn adlewyrchu marwolaeth cellog ond nid is-reoleiddio mynegiant TH a dangosodd bod triniaeth Ka adfer y gostyngiad yn nifer y niwronau Nissl-positif yn yr SNpc o lygod a driniwyd gan MPTP o 43.3 y cant i 25.4 y cant ( Ffig.2c a d). Yn ogystal, gwnaeth Ka leddfu'n sylweddol y gostyngiad a achosir gan MPTP mewn mynegiant protein TH a DAT, fel y'i mesurwyd gan blotio Gorllewinol (Ffig.2e-g). Mae'r dystiolaeth hon yn cadarnhau effaith niwro-amddiffynnol Ka ar y model llygoden PD.
Canlyniad 3. Mae Ka yn lleihau'r casgliad o wagolau LD a straen ocsideiddiol yn SNpc llygod wedi'u trin â MPTP/p
Mae tystiolaeth gynyddol wedi dangos cyfranogiad LDs mewn NDDs [10], yn gyson, nododd ein gwaith blaenorol gynnydd mewn LDs yn yr SNpc o lygod PD a achosir gan MPTP [12]. Gellir adnabod LDs yn hawdd a dangos strwythurau crwn, dwysedd isel gyda chynnwys amorffaidd homogenaidd [28]. Fel rheol, gellir diraddio LDs trwy awtoffagy er mwyn osgoi cronni [29]. Er mwyn ymchwilio i weld a allai Ka reoleiddio LDs mewn PD, dadansoddwyd y casgliad o LDs gan ficrosgopeg electron trawsyrru (TEM) yn yr SNpc rheoli, MPTP/p, a llygod MPTP/p ynghyd â Ka. Fel y dangoswyd yn ein gwaith blaenorol [12], cynyddwyd nifer a maint yr LDs mewn llygod MPTP / p o'u cymharu â rheolaethau wedi'u trin â hallt (Ffig.3a a b) ac fe'u gostyngwyd yn sylweddol mewn llygod a gafodd eu trin â Ka (Ffig.3c-). e). Ar ben hynny, mewn llygod wedi'u trin â Ka, roedd LDs yn cael eu harsylwi'n amlach gerllaw, wedi'u hamgáu i mewn, neu'n cael eu diraddio gan awtolysosomau, a ddiffiniwyd fel gronynnau lipofuscin electron-drwchus. Dangosodd staenio histolegol pellach o niwronau TH ynghyd â BODIPY, lliw sy'n labelu lipidau niwtral yn benodol ac a ddefnyddir yn gyffredin i ganfod LDs [30], fod nifer a maint BODIPY ynghyd â LDs yn yr SNpc yn uwch mewn llygod PD nag mewn rheolaethau , ac fe'u gostyngwyd yn sylweddol gan driniaeth Ka (Ffig. 3f-h).
Os na ellir diraddio LDs mewn modd amserol, gall yr LDs cronedig gael perocsidiad a chyfrannu at straen ROS-gyfryngol mitocondriaidd [4], sy'n cynyddu niwrowenwyndra a dilyniant afiechyd. Felly, gwnaethom archwilio ymhellach broffiliau mynegiant genynnau sy'n gysylltiedig ag amddiffyniad rhag gwenwyndra FA rhad ac am ddim (Gpx8), niwtraleiddio rhywogaethau ocsideiddiol, radicalau superocsid (Sod3) a hydrogen perocsid (Cat), a metaboledd FA (Acsbg1 a Dbi) fel yr adroddwyd [31] , a gostyngwyd pob un ohonynt yn drawiadol yn yr SNpc o lygod wedi'u trin â MPTP o'u cymharu â rheolaethau, a chafodd yr effeithiau hyn eu lleddfu mewn llygod PD wedi'u trin â Ka (Ffig. 3i). Yn yr un modd, cynyddodd MPTP/p hefyd y lefelau mynegiant mRNA
o is-unedau NADPH ocsidas fel Nox1, Nox2, a Nox4 yn yr SNpc o lygod MPTP/p, a gafodd eu pylu ymhellach gan driniaeth Ka (Ffig.3j). Gyda'i gilydd, mae'r data hyn yn awgrymu bod Ka yn lleddfu crynhoad LD a achosir gan MPTP / p, perocsidiad, a straen wedi'i gyfryngu gan ROS.
Daw'r erthygl hon o restrau Cynnwys sydd ar gael ar hafan cyfnodolyn ScienceDirect Redox Biology: www.elsevier.com/locate/redox
