Mae Kuwanon T A Sanggenon A Ar Wahân oddi wrth Morus Alba Yn Cael Effeithiau Gwrth-lidiol Trwy Reoleiddio Llwybrau Signalau NF-κB A HO-1/Nrf2 mewn Celloedd BV2 A RAW264.7

Am fwy o wybodaeth. cyswllttina.xiang@wecistanche.com

Haniaethol: Fe wnaethom ymchwilio'n flaenorol i echdyniad methanolig rhisgl Morus alba a nodweddwyd 11 cyfansoddyn o'r dyfyniad: kuwanon G(1), Kuwana E (2), Kuwana T(3), sanggenon A(4), sanggenon M(5), sanggenol A(6), mulberofuran B(7), mulberofuran G(8), moracin M(9), moracin O(10), a norartocarpanone (11). Yma, rydym yn ymchwilio i'rgwrthlidioleffeithiau'r cyfansoddion hyn ar gelloedd microglial (BV2) a macroffagau (RAW264.7). Yn eu plith, rhwystrodd 3 a 4 yn sylweddol y cynhyrchiad a achosir gan lipopolysaccharide (LPS) o ocsid nitrig yn y celloedd hyn, gan awgrymu priodweddau gwrthlidiol y ddau gyfansoddyn hyn. Roedd y cyfansoddion hyn yn atal cynhyrchu prostaglandin E2, interleukin-6, a ffactor-c necrosis tiwmor, a mynegiant synthase ocsid nitrig anwythadwy a cyclooxygenase-2 yn dilyn ysgogiad LPS. Roedd rhag-driniaeth gyda 3 a 4 yn atal gweithrediad y llwybr signalau ffactor niwclear kappa B yn y ddau fath o gell. Fe wnaeth y cyfansoddion hefyd ysgogi mynegiant heme oxygenase(HO)-1 trwy actifadu ffactor niwclear erythroid 2-ffactor cysylltiedig 2. Roedd atal actifedd HO-1 wedi gwrthdroi'r effeithiau gwrthlidiol a achoswyd trwy ragdriniaeth gyda 3 a 4, sy'n awgrymu bod yr effeithiau gwrthlidiol yn cael eu rheoleiddio gan HO-1. Gyda'i gilydd, mae 3 a 4 yn ymgeiswyr posibl ar gyfer datblygu asiantau therapiwtig ac ataliol ar gyferafiechydon llidiol.

Geiriau allweddol: Morus alba ; kuwanon T; sanggenon A; BV2; celloedd RAW264.7; effeithiau gwrthlidiol

Cliciwch yma i ddysgu mwy o gynhyrchion

1. Rhagymadrodd

Mae Morus alba, planhigyn meddyginiaethol sy'n perthyn i'r teulu Moraceae, wedi'i ddefnyddio ar gyfer trin cyflyrau llidiol yr ysgyfaint mewn meddygaeth draddodiadol [1]. Mae rhisgl ei wreiddyn yn cynnwys gwahanol gydrannau gweithredol fel umbelliferone, scopoletin, mwcinau, tannin,flavonoidau(morusin, mulberrin, mulberrichromene, cyclomulberrin, moracin P, moracin O, mulberrofuran Q, Kuwana E, a kuwanon H)[2], 2-arylbenzofurans (moracenin D, moracin P, moracin O, a mulberrofuran O), a flavonoidau prenylated (licoflavone C, cyclomulberrin, neocyclomorusin, sanggenon I, morusin, a Kuwana U)[3,4]. Gall darnau M. alba a chyfansoddion gweithredol liniaru clefydau'r ysgyfaint, fel y datgelwyd gan astudiaethau diweddar [5-7]. Yn ogystal ag effaith ffarmacolegol M.alba ar yr ysgyfaint, mae flavonoidau isoprenylated (sanggenol Q, Kuwana T, sanggenon N, mulberrofuran G, a mulberrofuran C) yn cael effeithiau hepatoprotective mewn celloedd HepG2 a achosir gan t-BHP [8]. Mae prenyl-flavonoids (kuwanon A, Kuwana C, Kuwana T, a morusin) a triterpenoidau (asid betwlin, avail, a -sitosterol) yn atal gwahaniaethu adipocytes 3T{{2-L1) yn sylweddol [9]. Mae Morin hydrate, prif gyfansoddyn flavonoid M. alba, yn lleddfu nam cof anrhagweladwy cronig a achosir gan straen, gan nodi y gallai'r cyfansawdd hwn roi hwb i'r system amddiffyn gwrthocsidiol ac atal llwybrau niwrolidiol [10]. Mae'r astudiaethau hyn yn awgrymu bod y cyfansoddion a gynhwysir yn M.alba yn ymgeiswyr posibl ar gyfer trin afiechydon amrywiol.

Llid, ymateb hunan-amddiffyn cymhleth i ysgogiadau niweidiol, yn chwarae rhan bwysig mewn amddiffyniad imiwn trwy actifadu nifer o gelloedd imiwnedd, gan gynnwys macrophages, monocytes, leukocytes, celloedd mast, a mathau eraill o gelloedd [11]. Macrophages yw'r celloedd imiwn mwyaf helaeth a dosbarthedig yn y corff, ac mae microglia yn macroffagau preswyl yn y system nerfol ganolog (CNS)[12]. Mae macroffagau a chelloedd microglial yn chwaraewyr allweddol yn yr ymateb llidiol. Gellir eu actifadu mewn ymateb i ysgogiadau fel lipopolysaccharide (LPS), cytocinau, a chemocinau, a chymell cyflyrau llidiol [13]. O dan amodau llidiol, mae macroffagau a chelloedd microglial wedi'u actifadu'n ormodol yn achosi rheoleiddiad annormal o gyfryngwyr pro-llidiol (ocsid nitrig (NO), prostaglandin E2 (PGE,), synthase nitrig ocsid anwythadwy (iNOS), a cyclooxygenase (COX)-2 ) a chytocinau pro-llidiol (interleukin (IL)-6 a ffactor necrosis tiwmor (TNF)-a), trwy actifadu llwybr signalau ffactor niwclear kappa B (NF-B)[14,15]. Mae lefelau cynyddol o gyfryngwyr pro-llidiol yn gwaethygu dilyniant clefydau llidiol ymhellach, sy'n cynyddu gweithrediad ffactorau llidiol ymhellach, gan arwain at gylch dieflig [16]. Felly, mae rheoleiddio cyfryngwyr llidiol yn hanfodol ar gyfer trin ac atal afiechydon llidiol.

Mae heme oxygenase (HO)-1 yn ensym sy'n cyfyngu ar gyfraddau sy'n cataleiddio diraddiad heme i biliverdin, ïon fferrus (Fe2 plus ), a charbon monocsid(CO)[17]. Mae sefydlu HO-1 yn cael ei reoleiddio gan actifadu ffactor niwclear erythroid 2-ffactor cysylltiedig 2(Nrf2). Gellir ysgogi HO-1 mewn ymateb i straen ocsideiddiol a llid i amddiffyn meinweoedd a chynnal homeostasis yn y corff[18]. Felly, mae targedu sefydlu HO{-1 yn un o'r strategaethau posibl ar gyfer trin clefydau llidiol.

Yn ein hymdrech barhaus i archwilio ymgeisydd(ymgeiswyr) o gynhyrchion naturiol i drin clefydau llidiol, rydym yma yn cyflwyno'reffeithiau gwrthlidiolo gyfansoddion 11l wedi'u hynysu o M.alba mewn celloedd BV2 a RAW264.7 a achosir gan LPS.

2. Canlyniadau

2.1.Effeithiau 11 Cyfansoddyn Wedi'u Ynysu o M.alba ar Hyfywedd Celloedd BV2 a RAW264.7

Yn yr astudiaeth flaenorol, echdynnwyd rhisgl gwraidd M.alba mewn methanol dyfrllyd, a rhannwyd y darnau a gafwyd yn olynol yn EtOAc, n-BuOH, a H2O2. Rhoddodd cromatograffaeth colofnau ailadroddus SiO2, ODS, a Sephadex LH-20 o'r ffracsiwn EtOAc 11 cyfansoddyn, megis kuwanon G(1), Kuwana E(2), Kuwana T (3), sanggenon A(4), sanggenon M(5), sanggenol A(6), mulberofuran B(7), mulberofuran G(8), moracin M(9), moracin O(10), a norartocarpanone (11)[6,19,20]. Mae adeileddau cemegol 11 cyfansoddyn sydd wedi'u hynysu o M.alba i'w gweld yn Ffigur 1. Er mwyn pennu effeithiau sytotocsig y cyfansoddion hyn, mae 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl){{ 26}}.5-assay bromid diphenyltetrazolium(MTT), cafodd celloedd BV2 a RAW264.7 eu trin â chrynodiadau penodol y cyfansoddion am 48 h, ar grynodiadau o hyd at 80 μM. （Ffigur 2）. Roedd gan gyfansoddion 2, 3, a 4 effeithiau gwenwynig ar 80 μM, cafodd cyfansawdd 5 effeithiau gwenwynig ar 40 μM. Yn seiliedig ar ganlyniad y gwerthusiad gwenwyndra, dewiswyd ystod crynodiad nad yw'n wenwynig ar gyfer astudiaethau dilynol ar yr effeithiau gwrthlidiol (cyfansoddyn 2, 3,4 ar 40 uM, cyfansawdd 5 ar 200 μM, a chyfansoddion eraill ar 80 μM） .

2.2.Effeithiau Cyfansoddion wedi'u Ynysu o M. alba ar Fynegiant Ffactorau Llidiol a Phrotein iNOS mewn Celloedd BV2 ac RAW264.7

Mae NO yn radical rhydd yn y cardiofasgwlaidd, nerfol, asystemau imiwnedd. Mae'n cynnal homeostasis mewngellol, yn cludo niwrodrosglwyddyddion, ac yn rheoleiddio gweithgaredd gwrthlidiol a sytowenwyndra. Fodd bynnag, pan gynhyrchir llawer iawn o NO, mae'n cael effeithiau andwyol ar y corff, gan gynnwys vasodilation, cytotoxicity, a difrod meinwe [21,22]. Yna fe wnaethom archwilio effeithiau'r cyfansoddion hyn ar gynhyrchu nitraid mewn celloedd BV2 a RAW264.7 a achosir gan LPS. Cafodd celloedd eu trin â chrynodiadau gwahanol o gyfansoddion am 2 h cyn eu hysgogi â LPS (1 ug / mL) am 24 h. Ymhlith y cyfansoddion, dim ond Cyfansoddyn 3 (kuwanonT) a 4 (sanggenon A) a rwystrodd cynhyrchu nitraid yn sylweddol yn llinellau celloedd BV2 a RAW264.7 (Ffigur 3). Yn ogystal, gwnaethom gynnal arbrawf ychwanegol i gymharu effaith ataliol cynhyrchu nitraid rhwng y grŵp a gafodd ei drin â LPS ar ôl y rhag-drin cyfansawdd a'r grŵp a driniwyd â chyfansoddyn ar ôl y rhag-driniaeth LPS. O ganlyniad, nid oedd unrhyw wahaniaeth yn effaith ataliol cynhyrchu nitraid rhwng y ddau grŵp arbrofol (Ffigur Atodol S1). Felly, yn yr astudiaeth hon, cynhaliwyd yr arbrofion canlynol gan ddefnyddio'r rhag-driniaeth gyda chyfansoddion o fewn 2 ~ 3h cyn trin LPS.

Mae cynhyrchu NO yn cael ei gynyddu gan y proteinau pro-llidiol anwythol nitric ocsid synthase (iNOS). Fodd bynnag, mae gorfynegiant iNOS yn amharu'n ddifrifol ar bathoffisioleg y clefyd [23]. Roedd cyfansoddion 3 a 4 yn atal mynegiant iNOS mewn modd canolbwyntio-ddibynnol (Ffigur 4). Fe wnaethom archwilio effeithiau cyfansoddion 3 a 4 ar fynegiant a achosir gan LPS o ffactorau llidiol mewn celloedd BV2 a RAW264.7. Cafodd y celloedd eu trin â chrynodiadau gwahanol o gyfansoddion 3 a 4 am 2 h cyn eu hysgogi â LPS (1 ug / mL) am 24 h. Roedd y ddau gyfansoddyn yn atal mynegiant a achosir gan LPS o PGE2, TNF , ac IL-6 yn sylweddol mewn celloedd BV2 a RAW264.7 (Ffigur 5). Roedd yn ymddangos bod y canlyniadau'n dangos bod rhag-driniaeth gyda chyfansoddyn 3 a 4 yn atal y llid a achosir gan LPS mewn celloedd BV2 a RAW264.7.

2.3.Effeithiau Cyfansoddion 3 a 4 ar Drawsleoli NF-xB mewn Celloedd BV2 a RAW264.7

Mae NF-kB yn ffactor trawsgrifio sy'n rheoleiddio mynegiant iNOS [24]. Mae NF-kB arferol yn parhau yn ei ffurf anactif trwy ffurfio cyfadeiladau â phroteinau rheoleiddiol fel IKB . Fodd bynnag, pan gaiff ei actifadu gan LPS, mae IkBa yn cael ei ddiraddio gan ffosfforyleiddiad, ac mae NF-kB (fel p65) yn cael ei drawsleoli i'r cnewyllyn [25], sy'n hyrwyddo'r genyn cyfryngwr llidiol ac yn ysgogi mynegiant ffactorau llidiol [26]. Er mwyn archwilio ymhellach effaith ataliol cyfansoddion 3 a 4 ar gynhyrchu ffactorau pro-llidiol mewn celloedd BV2 a RAW264.7 a ysgogwyd gan LPS, gwnaethom ymchwilio i'r mynegiant trawsleoli niwclear p65 mewn celloedd sy'n cael eu trin â chyfansoddion 3 a 4, LPS, neu y ddau yn defnyddio gwrthgorff gwrth-p65 â label FITC. Defnyddiwyd DAPI ar gyfer staenio niwclear. Yn y grŵp rheoli, canfuwyd mynegiant p65 yn y cytosol. Fodd bynnag, yn y celloedd a achosir gan LPS, canfuwyd cronni p65 yn y cnewyllyn, fel y nodir yn y delweddau cyfun o staenio DAPI a p65. Ar ben hynny, o'i gymharu â'r celloedd a achosir gan LPS, gostyngodd cyfansoddion 3 a 4 yn sylweddol y cynnydd a gyfryngir gan LPS mewn gweithgaredd rhwymo NF-KB (t65) DNA (Ffigur 6A, B) a thrawsleoli niwclear (Ffigur 6C-F). Mae'r canfyddiadau hyn yn dangos bod cyfansoddion 3 a 4 yn rheolyddion negyddol trawsleoli niwclear NF-kB a ysgogir gan LPS.

2.4.Effeithiau Cyfansoddion 3 a 4 ar Lwybr Nrf2/HO-1 yn BV2 a RAW264.7

Celloedd Mae Heme oxygenase-1(HO-1)yn darged o ffactor niwclear E2-ffactor cysylltiedig 2(Nrf2), mae llwybr Nrf2/HO-1 yn system signalau gwrthocsidiol bwerus ar gyfer hyrwyddo haearn rhad ac am ddim mewn carbon monocsid (CO), biliverdin, a heme [27]. Mae carbon monocsid, metabolyn nwyol o gataboledd heme, yn arddangos effeithiau rheoleiddiol vasodilation ac ymatebion proinflammatory [28]. Yn ogystal, gwyddys hefyd bod HO-1 yn chwarae rhan bwysig wrth amddiffyn celloedd rhag llid a straen ocsideiddiol ac i reoleiddio cynhyrchu nitraid mewn macroffagau actifedig [29]. Fe wnaethom berfformio blotio Gorllewinol i ymchwilio i weld a yw cyfansoddion 3 a 4 yn cynyddu lefel mynegiant HO-1, lle defnyddiwyd y protoporffyrin cobalt inducer (CoPP) inducer adnabyddus HO{{{{{{{{{{{{{1), inducer inducer cobalt protoporphyrin(CoPP)) adnabyddus fel rheolaeth bositif sy'n cynyddu HO{{). 16}} mynegiant protein. [30]. Datgelodd y canlyniadau fod cyfansoddion 3 a 4 hefyd yn uwchreoleiddio mynegiant HO-1 (Ffigur 7). Fe wnaethom archwilio ymhellach a yw cyfansoddion 3 a 4 yn rheoleiddio actifadu Nrf2. Cynyddwyd trawsleoliad Nrf2 i'r cnewyllyn mewn modd a oedd yn dibynnu ar amser, sy'n dangos bod cyfansoddion 3 a 4 wedi uwchreoleiddio'r llwybr Nrf2/HO{-1 yn sylweddol mewn celloedd BV2 a RAW264.7 (Ffigur 8).

Er mwyn archwilio ymhellach a yw effeithiau gwrth-niwrolidiol a gwrthlidiol cyfansoddion 3 a 4 yn cydberthyn â mynegiant HO-1 mewn celloedd BV2 a RAW264.7, fe wnaethom berfformio set o arbrofion gyda phrotoporffyrin-IX (SNPP) tun sy'n atalydd gweithgaredd dethol HO-1. Gan ddefnyddio SNPP a all is-reoleiddio mynegiant HO-1, ceisiwyd pennu a yw HO-1 yn cyfryngu effaith ataliol y cyfansoddion uchod ar yr ymateb llidiol a achosir gan LPS 【31】. Ar ôl trin y celloedd â 20 μM o gyfansoddion 3 a 4 am 2 awr gyda neu heb 50 uM SNPP cawsant eu trin â LPS am 24 h. Er bod cyfansoddion 3 a 4 wedi lleihau cynhyrchiant nitraid mewn celloedd BV2 a RAW264.7 a ysgogwyd gan LPS, cafodd eu heffeithiau gwrthlidiol eu gwrthdroi gan driniaeth SNPP (Ffigur 9). Ni effeithiodd SNPP ar ei ben ei hun ar gynhyrchu ocsid nitrig (NO) yn dilyn ysgogiad LPS, gan awgrymu bod effeithiau gwrthlidiol cyfansoddion 3 a 4 yn cael eu rheoleiddio gan fynegiant HO{-1.

3. Trafodaeth

Dangosodd yr astudiaeth bresennol fod Kuwana T a sanggenon A yn atal llid a achosir gan LPS mewn celloedd BV2 a RAW264.7. Roedd y cyfansoddion hyn yn atal cynhyrchu NO, PGE2, a chytocinau pro-llidiol a achosir gan LPS, gan gynnwys IL-6 a TNF-, a mynegiant iNOS a COX-2 mewn celloedd BV2 a RAW264.7. Dangosodd y canlyniadau hyn fod Kuwana T a sanggenon A wedi cael eu heffeithiau gwrthlidiol trwy anactifadu llwybr signalau NF-kB. Yn ogystal, ysgogodd y cyfansoddion hyn fynegiant HO-1 trwy actifadu Nrf2.Yn ogystal, ysgogodd y cyfansoddion hyn fynegiant HO-1 trwy actifadu Nrf2, a chadarnhawyd bod yr effaith hon hefyd yn gysylltiedig â y gweithgaredd gwrthlidiol.

Nitric oxide synthase (NOS) has three isoforms: neuronal NOS (nNOS; NOS1), iNOS (NOS2), and endothelial eNOS (NOS3)[32]. iNOS is an inducible form that is upregulated in response to various stimuli, including LPS, cytokines, chemokines, and stress, while nNOS and eNOS are constitutive forms that catalyze continuous NO secretion at basal concentrations J33]. Similar to iNOS, COX-2 is also an inducible form upregulated by various inflammatory stimuli, such as cytokines, growth factors, tumor promoters, and bacterial LPS[34]. Its other isoform, COX-1, is constitutively expressed in most tissues under normal physiological conditions [35].COX-2 exerts an enzymatic effect on the conversion of prostaglandin H2 (PGH2), which converts arachidonic acid to PGE, prostaglandin 12(PGI2), prostaglandin F2a (PGF>.), a thromboxane A2(TXA,)[361. O dan amodau llidiol, mae lefelau iNOS a COX-2 yn cynyddu, gan arwain at orgynhyrchu NO a PGE2, yn y drefn honno, ac yn arwain at waethygu anhwylderau llid [37]. Yn yr astudiaeth bresennol, fe wnaethom werthuso'n gyntaf 11 cyfansoddyn wedi'u hynysu o M.alba i benderfynu a yw cynhyrchu NO wedi'i atal mewn celloedd BV2 a RAW264.7 a symbylwyd gan LPS. Dangosodd ein canlyniadau fod kuwanon T a sanggenon A wedi cael yr effeithiau ataliol cryfaf mewn celloedd BV2 a RAW264.7 (Ffigur 3). Yn ein hastudiaeth flaenorol, cafodd moracin M effaith gwrthlidiol ar macroffagau alfeolaidd, ond dangosodd ein canlyniadau wahanol patrwm. Fodd bynnag, gan fod gan bob cell nodweddion gwahanol, gall gwahanol weithgareddau ymddangos hyd yn oed gyda'r un mecanwaith J38]. Felly, fel yng nghanlyniadau'r papur hwn, cadarnhawyd nad oedd gan moracin M unrhyw weithgaredd gwrthlidiol mewn celloedd BV2 a RAW264.7 hyd at y crynodiad triniaeth. Felly, dewiswyd kuwanon T a sanggenon A ar gyfer arbrofion pellach.

Mae gan cytocinau ddylanwad rheoleiddiol cymhleth ar ymatebion llidiol ac imiwn [39]. Mae actifadu macroffagau a chelloedd microglial yn gwella secretion cytocinau pro-llidiol J40, ac mae'r secretion cynyddol hwn yn arwain at ryddhau cytocinau pellach [41]. Mae IL-6 yn un o'r prif sytocinau ac mae'n gyfryngwr hydawdd sy'n gyfrifol am lid, ymateb imiwn, a hematopoiesis [42]. Mae signalau IL-6 yn cael eu rheoleiddio trwy ddau fecanwaith gwahanol, gan gynnwys rhwymo i'r derbynnydd IL-6 rhwymo bilen (mblL6R) ac adnabod y derbynnydd IL-6 hydawdd (sIL6R)[43]. Mae'r ddau fecanwaith yn gysylltiedig ag actifadu glycoprotein (GP)130, sy'n arwain at actifadu moleciwlau signalau i lawr yr afon, gan gynnwys y Janus kinase (IAK) / transducer signal a activator of transcription (STAT)kinases, phosphoinositide 3-kinase (PI3K). ), a kinase protein a weithredir gan mitogen (MAPK)[44]. Defnyddir IL-6 i ragfynegi a gwerthuso lefelau llid mewn cleifion â chanser, haint, clefydau hunanimiwn, clefydau pancreatig, a chlefydau cardiofasgwlaidd.

Mae TNF-, cytocin mawr arall, hefyd yn chwarae rhan bwysig mewn llawer o brosesau imiwn ac ymfflamychol, megis amlhau celloedd imiwnedd, apoptosis, necrosis, a goroesiad. Mae effeithiau biolegol TNF- yn cael eu rheoleiddio trwy rwymo i ddau dderbynnydd gwahanol, derbynnydd ffactor necrosis tiwmor (TNFR)1 a TNFR2. TNFR1 yw prif gyfryngwr gweithgaredd TNF yn y rhan fwyaf o gelloedd, oherwydd mae gan TNFR2 gysylltiad llai rhwymol ar gyfer TNF-, gan arwain at ddatgysylltu TNF yn haws o TNFR2 nag o TNFR1. Mae annormaleddau mewn signalau TNF a gorgynhyrchu TNF - yn arwain at ddatblygiad llawer o afiechydon, gan gynnwys arthritis gwynegol, soriasis, clefyd Crohn, atherosglerosis, sepsis, diabetes, a gordewdra [45,46. Felly, mae'n bwysig atal cynhyrchu cytocinau pro-llidiol i atal ac atal adweithiau llidiol a datblygiad afiechydon llidiol. Yn yr astudiaeth bresennol, rhwystrodd kuwanon T a sanggenon A y cynhyrchiad a achosir gan LPS o IL-6 a TNF- mewn celloedd BV2 a RAW264.7.

NF-KB yw'r ffactor trawsgrifio mwyaf hollbresennol [47], ac mae signalau NF-kB yn chwarae rhan bwysig wrth fynegi genynnau sy'n gysylltiedig ag ymatebion llidiol, gan gynnwys y rhai sy'n amgodio iNOS, COX-2, a chytocinau pro-llidiol [ 48]. Yn y cyflwr anweithredol, mae is-unedau NF-kB yn bodoli yn y cytoplasm sy'n rhwym i'w brotein atalydd, atalydd kappa B (kB)- . Mae sawl ysgogiad, gan gynnwys LPS a cytocinau, yn achosi ffosfforyleiddiad a diraddio IkB- , gan ganiatáu rhyddhau a thrawsleoli is-unedau NF-kB i'r cnewyllyn. Mae'r is-unedau trawsleoli yn rhwymo i safleoedd kB o enynnau targed mewn DNA, gan arwain at sefydlu trawsgrifio genynnau sy'n amgodio cyfryngwyr pro-llidiol [49]. Felly, gall anactifadu'r llwybr NF-kB fod yn darged therapiwtig ar gyfer clefydau llidiol. Yn yr astudiaeth bresennol, roedd rhag-driniaeth â kuwanon T a sanggenon A yn atal actifadu signalau NF-kB a achosir gan LPS trwy atal gweithgaredd rhwymo DNA a thrawsleoli niwclear is-unedau NF-kB (Ffigur 6). Mae'r canlyniadau hyn yn awgrymu bod effeithiau gwrthlidiol kuwanon T a sanggenon A yn cael eu cyflawni trwy reoleiddio'r llwybr signalau NF-kB.

O dan amodau arferol, mae Nrf2 yn rhwymo protein 1 tebyg i Kelch sy'n gysylltiedig ag ECH (Keap1) yn y cytoplasm. Fodd bynnag, mae'n daduniadu oddi wrth Keapl, yn trawsleoli i'r cnewyllyn, ac yn clymu i safleoedd elfen ymateb gwrthocsidiol (ARE) ar y DNA, gan arwain at fynegiant o enynnau gwrthocsidiol amrywiol, gan gynnwys y rhai sy'n amgodio HO-1, NAD(P)H : quinone oxidoreductase 1(NQO1), peroxiredoxin (Prx), a thioredoxin (Trx)[50]. Yn benodol, mae'n hysbys bod HO-1 yn gysylltiedig ag effeithiau gwrthlidiol, a chynrychiolir ei weithgarwch gan y lefelau CO, un o'r tri sgil-gynnyrch a gynhyrchir o heme gan actifedd ensymatig HO{{12 }} [51]. Yn yr astudiaeth bresennol, canfuom fod mynegiant kuwanon T a sanggenon HO-1 a ysgogwyd gan A trwy actifadu Nrf2 (Ffigurau 7 ac 8). Yn ogystal, gwnaethom wirio'r gydberthynas rhwng effaith gwrthlidiol kuwanon T a mynegiant sanggenon A a HO{{-1 gan ddefnyddio SNPP, atalydd detholus o weithgarwch HO{-1. Cafodd effeithiau ataliol kuwanon T a sanggenon A ar gynhyrchu NOand TNF ac actifadu NF-kB eu gwrthdroi'n rhannol trwy gyd-driniaeth â SNPP (Ffigur 9). Mae'r canlyniadau hyn yn awgrymu bod effeithiau gwrthlidiol kuwanon T a sanggenon A yn cael eu rheoleiddio gan fynegiant HO{-1.

4. Defnyddiau a Dulliau

4.1. Defnyddiau

Prynwyd Sefydliad Coffa Roswell Park 1640 (RPMI 1640) a serwm buchol ffetws oddi wrth Gibco BRL Co. (Grand Island, NY, UDA). Cafwyd yr holl gemegau gan Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, UDA). Prynwyd y prif wrthgyrff gwrth-iNOS, gwrth- -actin, gwrth-p65, a gwrth-HO-1 oddi wrth Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, UDA); a gwrthgyrff eilaidd gwrth-cwningen a gwrth-lygoden o Millipore

(Billerica, MA, UDA). Prynwyd pecynnau assay immunosorbent-cysylltiedig ag ensymau (ELISA) ar gyfer PGE,, IL-6, a TNF- gan R&DSystems Inc. (Minneapolis, MN, UDA). Disgrifiwyd arwahanrwydd a phenderfyniad adeileddol yr 11 cyfansoddyn o Morus alba mewn man arall [19-21].

4.2. Asesiadau Diwylliant Celloedd a Hyfywedd

Cafodd celloedd BV2 a RAW264.7 eu hadu ar ddwysedd o gelloedd 5 × 105 / mL yn RPMI 1640 wedi'u hategu gan wrthfiotig 1 y cant (penisilin-streptomycin) a 10 y cant FBS anweithredol â gwres. Cafodd y celloedd eu meithrin ar 37 gradd mewn 5 y cant CO llaithedig, gydag awyrgylch aer o 95 y cant, yn ôl dull a ddisgrifiwyd yn flaenorol [52].

4.3. Mesur DIM Cynhyrchiad

Mesurwyd cynhyrchu nitraid, sef cynnyrch terfynol sefydlog o NO ocsidiad, fel dangosydd o gynhyrchu NO mewn celloedd. Yn gryno, penderfynwyd crynodiad nitraid yn y cyfryngau cyflyru gan ddefnyddio dull yn seiliedig ar adwaith Griess [53]. Disgrifiwyd manylion yr assay yn flaenorol [54].

4.4. PGE2 Ass4y/

Mesurwyd y crynodiad o PGEz ym mhob sampl gan ddefnyddio pecyn ELISA sydd ar gael yn fasnachol, yn ôl dull a ddisgrifiwyd yn flaenorol [55].

4.5.Mesur Lefelau IL-6 a TNF-a

Casglwyd y cyfrwng diwylliant i bennu lefelau IL-6 a TNF- gan ddefnyddio cit sydd ar gael yn fasnachol (BioLegend, San Diego, CA, UDA). Perfformiwyd yr assay yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Yn gryno, cafodd celloedd BV2 a RAW264.7 eu hadu mewn 24-blatiau meithrin ffynnon ar ddwysedd o 20 × 10 cell/ffynnon. Ar ôl deori, casglwyd yr uwchnatant a'i ddefnyddio i fesur crynodiadau IL-6 a TNF- gyda chitiau ELISA.

4.6. Dadansoddiad Blotiau Gorllewinol

Cafodd y celloedd BV2 a RAW264.7 â phelenni eu golchi â PBS a'u gosod mewn byffer RIPA. Mesurwyd symiau cyfartal o broteinau gan ddefnyddio dwysfwyd adweithydd llifyn assay protein a gafwyd o Bio-Rad Laboratories (# 5000006; Hercules, CA, UDA), wedi'i gymysgu yn y byffer llwytho sampl, a'i wahanu gan ddefnyddio SDS-PAGE. Yna trosglwyddwyd y proteinau gwahanedig i bilen nitrocellwlos. Cafodd rhwymiad amhenodol i'r bilen ei rwystro gan ddeor mewn hydoddiant o laeth sgim. Cafodd y bilen ei deor â gwrthgyrff cynradd (a ddefnyddiwyd i gyd ar 1:1000) ar 4 gradd dros nos ac yna'n adweithio â gwrthgorff eilaidd wedi'i gyfuno â marchruddygl peroxidase (a ddefnyddiwyd i gyd mewn 1:5000)(Millipore) [ 31].

4.7.NF-xB Lleoleiddio a Dadansoddi Imiwnofflworoleuedd

I astudio lleoleiddio celloedd NF-kB, cafodd celloedd BV2 a RAW264.7 eu meithrin ar sleidiau siambr Lab-Tek II a'u trin â chrynodiadau gwahanol o gyfansoddion am 2 awr cyn ysgogiad LPS (0.5 ug/mL) ar gyfer 1 h. Yna gosodwyd y celloedd mewn fformalin a'u permeabilized ag aseton oer a'u harchwilio â gwrthgyrff gwrth-p65 (1:200), ac yna deor gyda gwrthgorff eilaidd fflworoleuol wedi'i labelu â isothiocyanad (1:1000) (Alexa Fluor 488, Invitrogen). Er mwyn delweddu niwclysau, cafodd celloedd eu trin â 1 ug/mL o 4'6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) am 30 munud, eu golchi â PBS am 5 munud, a'u trin â 50 μL VectaShield (Labordai Vector, Burlingame, CA, UDA). Delweddwyd celloedd lliw a chaffaelwyd delweddau gan ddefnyddio microsgop fflworoleuedd Zeiss (Provis AX70; Olympus Optical Co., Tokyo, Japan). [31].

4.8. Dadansoddiad Ystadegol

Cyflwynir data fel gwyriad safonol cymedrig ± tri arbrawf annibynnol. Defnyddiwyd dadansoddiad un ffordd o amrywiant, ac yna prawf cymharu lluosog Tukey, i gymharu gwahaniaethau rhwng y tri grŵp. Perfformiwyd dadansoddiadau ystadegol gan ddefnyddio meddalwedd GraphPad Prism (fersiwn 5.01, GraphPad Software Inc., San Diego, CA, UDA),

5. Casgliadau

Gwnaeth Kuwanon T a sanggenon A effeithiau gwrthlidiol mewn celloedd BV2 a RAW264.7 a ysgogwyd gan LPS trwy atal cynhyrchu NO, PGE2, IL-6, a TNF- a mynegiant iNOS a COX{{8} }. Dangosodd ein canlyniadau fod yr effeithiau ataliol hyn wedi'u cyfryngu trwy anactifadu'r llwybr NF-KB trwy driniaeth â kuwanon T a sanggenon A. Yn ogystal, ysgogodd y cyfansoddion hyn fynegiant HO-1 trwy actifadu trawsleoliad Nrf2 i'r cnewyllyn . Dangosodd ein canfyddiadau fod y mynegiant HO{-1 a achosir gan kuwanon T a sanggenon A yn gysylltiedig â'r effeithiau ataliol yn erbyn llid a achosir gan LPS. Gyda'i gilydd, mae ein canlyniadau'n darparu tystiolaeth y gallai Kuwana T a sanggenon A sydd wedi'u hynysu o M. Albu fod yn ymgeiswyr ar gyfer datblygu asiantau therapiwtig ac ataliol ar gyfer clefydau niwrolidiol fel clefyd Alzheimer a chlefyd Parkinson.