Mae Perocsidiad Lipid Lysosomal yn Rheoleiddio Imiwnedd Tiwmor
Sep 19, 2023
Gall ataliad lysosomaidd a achosir gan atalyddion palmitoyl-protein thioesterase 1 (PPT1) fel DC661 gynhyrchu marwolaeth celloedd, ond ni ddeellir y mecanwaith ar gyfer hyn yn llwyr. Nid oedd angen llwybrau marwolaeth celloedd wedi'u rhaglennu (awtophagy, apoptosis, necroptosis, ferroptosis, a pyroptosis) i gyflawni effaith sytotocsig DC661. Nid oedd atal cathepsinau, na chelation haearn neu galsiwm, yn achub sytowenwyndra a achosir gan DC. Roedd ataliad PPT1 yn achosi perocsidiad lipid lysosomaidd (LLP), a arweiniodd at athreiddedd pilen lysosomaidd a marwolaeth celloedd y gellid ei wrthdroi gan y gwrthocsidydd N-acetylcysteine (NAC) ond nid gan gwrthocsidyddion perocsidiad lipid eraill. Roedd angen y cludwr cystein lysosomaidd MFSD12 ar gyfer cludo NAC mewnlysosomaidd ac achub LLP. Cynhyrchodd ataliad PPT1 imiwnogenigrwydd celloedd-gynhenid gyda mynegiant arwyneb o galreticwlin y gellid ei wrthdroi gyda NAC yn unig. Gwnaeth DC661-drin celloedd T naïf preimio a gwenwyndra cyfryngol T uwch. Roedd llygod a gafodd eu brechu â chelloedd wedi'u trin gan DC wedi arwain at imiwnedd addasol a gwrthodiad tiwmor mewn tiwmorau "imiwn-boeth" ond nid mewn tiwmorau "imiwnedd oer". Mae'r canfyddiadau hyn yn dangos bod LLP yn gyrru marwolaeth celloedd lysosomaidd, ffurf imiwnogenig unigryw o farwolaeth celloedd, gan bwyntio'r ffordd at gyfuniadau rhesymegol o imiwnotherapi ac ataliad lysosomaidd y gellir eu profi mewn treialon clinigol.
Manteision cistanche tubulosa-Antitumor
Rhagymadrodd
Gyda gweithgaredd calonogol mewn treialon clinigol sy'n cynnwys yr atalydd lysosomal hydroxychloroquine (HCQ) (1), nodi palmitoyl-protein thioesterase 1 (PPT1) fel targed moleciwlaidd deilliadau cloroquine (2), a lansio atalyddion PPT1 newydd yn glinigol. treialon (3, 4), mae angen deall y mecanwaith y mae atalyddion lysosomaidd yn achosi marwolaeth celloedd ac effaith ataliad lysosomaidd ar imiwnedd tiwmor. Mae'r mecanwaith canonaidd o farwolaeth celloedd lysosomal a ddisgrifir ar gyfer HCQ yn cynnwys athreiddiad pilen lysosomal (LMP), gollwng cathepsinau, ac actifadu apoptosis caspase-gyfryngol (5, 6). Rydym wedi dangos yn flaenorol bod yr atalydd lysosomal DC661 yn treiddio i gelloedd yn y microamgylchedd tiwmor asidig ac yn lleoleiddio i'r lysosom yn fwy effeithlon na HCQ (2, 7). Mae DC661 yn cynhyrchu marwolaeth celloedd cryf ar draws llawer o linellau celloedd canser (2). Mae DC661 yn rhwymo ac yn atal PPT1, yn dadasideiddio'r lysosom, ac yn atal awtoffagi. Mae DC661 hefyd yn cymell LMP ac yn cynyddu lefelau caspase hollt 3 (2, 7). Yn ystod y blynyddoedd diwethaf, mae mecanweithiau newydd marwolaeth celloedd sydd â chanlyniadau imiwnogenig wedi'u diffinio ac maent yn cynnwys necroptosis, ferroptosis, a pyroptosis (8). Dangoswyd bod awtoffagi sy'n ddibynnol ar lysosom yn diraddio MHC dosbarth I (9), yn ogystal â chydrannau o'r imiwnoproteasome (10), sy'n awgrymu y gall ataliad awtophagi wella prosesu antigen. Fodd bynnag, nid yw effeithiau imiwnogenig ataliad lysosomaidd a marwolaeth celloedd dilynol wedi'u nodweddu'n llawn. Er mwyn mynd i'r afael â'r bwlch gwybodaeth hwn, gwnaethom ymchwilio i effeithiau DC661 ar fecanweithiau marwolaeth celloedd canonaidd i benderfynu a yw marwolaeth celloedd lysosomaidd yn ffurf ar farwolaeth celloedd neu'n rhagflaenydd i un o'r mecanweithiau sefydledig eraill. Canfuom fod HCQ a DC661 wedi achosi cynnydd sylweddol mewn nifer fach yn unig o broteinau yn y proteome melanoma ac roedd y rhan fwyaf o'r rhain yn broteinau cysylltiedig ag awtophagi ac apoptosis. Ni wnaeth atalyddion marwolaeth celloedd rhaglenedig (apoptosis, necroptosis, ferroptosis, a pyroptosis) liniaru effeithiau sytotocsig ar ôl nam lysosomaidd gan DC661. Mae perocsidiad lipid lysosomal (LLP) yn brif ysgogydd marwolaeth celloedd a achosir gan LMP sy'n gysylltiedig â mynegiant calreticulin (CALR) ar wyneb y gell. Dim ond trwy ddefnyddio'r gwrthocsidydd N-acetylcysteine (NAC) y gellir gwrthdroi'r math hwn o farwolaeth celloedd. Amharwyd ar weithgarwch NAC gan ataliad mewnforiwr cystein lysosomaidd MFSD12. Sbardunodd LLP ffenoteipiau imiwnogenig yn hyrwyddo lladd trwy gyfrwng celloedd T. Mae'r canfyddiadau hyn yn dangos bod marwolaeth celloedd lysosomaidd yn ffurf unigryw o bosibl o farwolaeth celloedd imiwnogenig.
system imiwnedd sy'n cynyddu planhigion cistanche
Canlyniadau
Mae ataliad lysosomaidd yn achosi newidiadau sylweddol yn y proteome sy'n gysylltiedig ag awtoffagy ac apoptosis. Er mwyn sefydlu effeithiau sytotocsig atalyddion lysosomaidd, fe wnaethom asesu hyfywedd melanoma A375P, carcinoma colon RKO, a llinellau celloedd canser y pancreas MIA PaCa a gafodd eu trin â'r atalydd gwagolar H{{2} ATPase bafilomycin-A1 (1 00 nM); Atalyddion PPT1 DC661 (3 μM) neu HCQ (10 μM neu 30 μM); palmitate mimetic hexadecyl sulfonyl fflworid (HDSF; 60 μM); atalyddion cathepsin pepstatin A (PepA; 10 ug/mL), E64 (PepA; 10 ug/mL), neu PepA+E64; ac aflonyddwr pilen lysosomaidd Leu-Leu methyl ester hydrobromide (20 μM) am 48 awr. Dim ond bafilomycin-A1 a DC661 a achosodd ostyngiad sylweddol mewn hyfywedd celloedd ar draws y llinellau celloedd canser (Ffigur 1A a Ffigur Atodol 1A; deunydd atodol ar gael ar-lein gyda'r erthygl hon; https://doi.org/10.1172/JCI164596DS1), gyda DC661 yn cynhyrchu gostyngiad mwy dwys mewn hyfywedd celloedd na bafilomycin-A1. Yn seiliedig ar y data hyn a phriodweddau ffarmacolegol tebyg i gyffuriau deilliadau cloroquine, fe wnaethom ganolbwyntio ein hastudiaeth ar ddeilliadau cloroquine fel offer i ddeall marwolaeth celloedd lysosomaidd. Cymhwyswyd dadansoddiad proteome byd-eang diduedd i gelloedd melanoma A375P a gafodd eu trin â DC661 (3 μM) neu'r HCQ llai grymus (10 μM neu 30 μM) am 24 awr. O'r 4,264 o broteinau hyder uchel a fesurwyd, dim ond 87 a 55 o broteinau a gynyddodd yn sylweddol gyda DC661 (3 μM) a HCQ (30 μM), yn y drefn honno; yn ogystal, gostyngwyd proteinau 14 a 15 yn sylweddol gyda DC661 (3 μM) a HCQ (30 μM), yn y drefn honno (newid plyg absoliwt o fwy na 2; q <0.05) gyda DC661 (3 μM) neu HCQ (30 μM), yn y drefn honno , o'i gymharu â rheoli cerbydau. Ni ddangosodd y dos isaf o HCQ (10 μM) unrhyw newidiadau protein arwyddocaol o gymharu â rheolaeth cerbydau. Roedd y 50 protein uchaf a gynyddwyd yn sylweddol yn dilyn triniaeth DC661 yn gysylltiedig yn bennaf ag awtoffagy ac apoptosis, a gwelwyd newidiadau tebyg ar gyfer y dos uwch o HCQ (Ffigur 1B). Am y rhesymau hyn, dewisom ganolbwyntio astudiaethau pellach ar y DC661 mwy grymus. Enghreifftiau o rai o'r newidiadau protein mwyaf sy'n gysylltiedig ag awtophagi ac apoptosis oedd protein rhwymo treth 1 (TAX1BP1; cynnydd 15-plyg); BCL2-protein rhyngweithiol 3 (BNIP3; cynnydd 6-plyg); cymydog BRCA1 protein genyn 1 (NBR1; cynnydd 12-plyg); sequestosome-1 (SQSTM1/p62; cynyddu 5-plyg); cydysgogydd derbynyddion niwclear 4 (NCOA4; cynnydd 3-plyg); ac LC3B (MAP1LC3B; cynnydd 3-plyg). Roedd apolipoprotein B-100 (APOB; cynnydd 66-plyg) yn deillio o serwm llo ffetws ac ni chafodd ei astudio ymhellach. Cadarnhaodd Immunoblotting fod triniaeth gyda DC661 neu grynodiadau uwch o HCQ wedi arwain at gynnydd amlwg yn y mynegiant o dderbynyddion cargo awtophagi NBR1, TAX1BP1, SQSTM1/p62, ac NCOA4 mewn modd dos ac amser-ddibynnol (Ffigur Atodol 1, B ac C). Fe wnaeth CRISPR/Cas9 KO o PPT1 mewn celloedd A375P ffenocopïo effeithiau DC661 ar y proteinau hyn o'u cymharu â'u cymheiriaid WT (Ffigur Atodol 1D). Fodd bynnag, roedd mynegiant derbynyddion cargo awtoffagi a'r cynnydd cymharol a achoswyd gan driniaeth DC661 yn amrywio ar draws canser y colon, canser y pancreas, a llinellau celloedd melanoma eraill lle mae DC661 yn dangos sytowenwyndra (Ffigur Atodol 1E). Roedd hyn yn awgrymu bod derbynyddion cargo awtophagi eu hunain, er eu bod wedi cynyddu ar lefel protein, yn annhebygol o fod yn gyfrifol am farwolaeth celloedd yn dilyn triniaeth DC661. I gadarnhau hyn, fe wnaethom ganolbwyntio ar dderbynyddion cargo awtophagi TAX1BP1 a BNIP3 oherwydd eu bod yn gwybod am effeithiau proapoptotig mewn celloedd canser (Ffigur 1C). Mae TAX1BP1 yn addasydd cargo autophagy (11) ac mae hefyd yn rheoleiddio apoptosis a achosir gan atalyddion synthesis protein neu asiantau sy'n niweidio DNA mewn celloedd canser (12). Ni wnaeth chwalu TAX1BP1 gan siRNA (Ffigur 1D) effeithio ar sytowenwyndra DC661-yn y tymor byr (Ffigur 1E) a phrofion hyfywedd hirdymor (Ffigur 1F). Dangosodd y canlyniadau hyn nad yw TAX1BP1 yn chwarae rhan hanfodol mewn sytowenwyndra cyfryngol DC. Mae BNIP3 yn brotein proapoptotig sy'n amharu ar fio-egni mitocondriaidd ac yn rheoleiddio mitophagi (13). Nid oedd dymchweliad effeithiol o BNIP3 (Ffigur 1G) yn effeithio ar sytowenwyndra ysgogedig DC (Ffigurau 1, H, ac I). Dangosodd y canlyniadau hyn fod effeithiau sytotocsig DC661 yn annibynnol ar fynegiant BNIP3. Nesaf, buom yn astudio effeithiau disbyddu celloedd genynnau awtophagi canonaidd sydd eu hangen ar gyfer cynhyrchu awtoffagosom ar effeithiolrwydd DC661 trwy ddymchwel unc-51 fel awtophagi yn actifadu kinase 1 (ULK1) a genyn cysylltiedig ag awtophagi 7 (ATG7). Roedd dymchweliad effeithiol o ULK1 neu ATG7 (Ffigur Atodol 2, A a B) yn atal fflwcs awtoffagig (Ffigur Atodol 2C) ond nid oedd yn effeithio ar sytowenwyndra a achosir gan DC (Ffigur 1, J–M). Dangosodd y canlyniadau hyn nad yw absenoldeb y peiriannau awtoffagi craidd hanfodol yn diddymu effeithiau sytotocsig DC661. Mae ataliad lysosomaidd gan DC661 yn ysgogi llwybrau marwolaeth celloedd lluosog wedi'u rhaglennu. Y safbwynt canonaidd yw bod marwolaeth celloedd lysosomaidd o ganlyniad i apoptosis (5). Datgelodd Immunoblotting fod triniaeth DC661 wedi arwain at actifadu caspase-3, -7, a -9 a holltiad PARP-1, gan gadarnhau bod apoptosis wedi'i actifadu gan DC661 (Ffigur 2A). Roedd yr atalydd pan-caspase Z-VAD-FMK yn atal actifadu caspase gan DC661 ond nid oedd yn atal cronni LC3B a p62, gan ddangos bod actifadu apoptosis a rhwystr awtophagi yn wahanadwy yn dilyn ataliad lysosomaidd (Ffigur 2B). Ni wnaeth blocio apoptosis â ZVAD-FMK wella na chyfyngu ar sytowenwyndra DC661, gan awgrymu bod apoptosis yn anhepgor ar gyfer marwolaeth celloedd lysosomaidd (Ffigur 2, C, a D). Roedd effeithiau sytotocsig DC661 yn debyg yng nghelloedd mêr esgyrn cynradd dwbl-KO Bax/Bak nad oeddent yn gallu cael apoptosis a chelloedd WT (Ffigur 2E). Nid oedd rhwystr o apoptosis wedi effeithio ar sytotocsigedd DC661- mewn canser y colon a chelloedd canser y pancreas hefyd (Ffigur Atodol 2, D–F). Oherwydd ein bod wedi canfod bod apoptosis yn anhepgor ar gyfer marwolaeth celloedd a achosir gan DC, gwnaethom ymchwilio i weld a yw DC661 yn achosi necroptosis, math arall o farwolaeth celloedd wedi'i raglennu a reoleiddir gan kinase protein sy'n rhyngweithio â derbynyddion (RIPK) a phrotein tebyg i barth kinase llinach gymysg ( MLKL). Cynyddwyd lefelau'r ffurfiau ffosfforyleiddio ac actifedig o RIPK a MLKL yn dilyn triniaeth DC661 o 0.1-1 μM (Ffigur 2F). Ar 3 μM DC661 roedd absenoldeb RIPK1 ffosfforylaidd ond MLKL ffosfforylaidd parhaus, sy'n awgrymu, ar y crynodiad uwch hwn, y gellid ymgysylltu â ffurfiau ychwanegol o farwolaeth celloedd. Roedd rhag-driniaeth gyda'r atalyddion RIPK1 necrostatin-1 neu necrostatin{-1s neu'r atalydd MLKL necrosulfonamide yn atal ffosfforyleiddiad RIPK1 ar ôl triniaeth DC661 (1 μM) mewn celloedd melanoma (Ffigur 2G) ond methodd ag achub DC{{192} }}sytowenwyndra a achosir mewn celloedd melanoma (Ffigur 2H) neu ganser y colon neu gelloedd canser y pancreas (Ffigur Atodol 2G). Mae'r canfyddiadau hyn yn awgrymu bod necroptosis wedi'i actifadu ond yn anhepgor ar gyfer marwolaeth celloedd cyfryngol DC.
Ffigur 1. Mae ataliad awtophagi lysosomaidd yn achosi newidiadau sylweddol mewn apoptosis ac awtophagi proteinau. (A)
Lysosomau yw un o'r prif safleoedd storio haearn. Gall metaboledd haearn mewngellol wedi'i ddadreoleiddio ynghyd â llai o gapasiti gostyngol ysgogi marwolaeth celloedd anapoptotig a elwir yn ferroptosis. Nodwedd o ferroptosis yw dadreoleiddio prostaglandin-endoperoxide synthase 2 (PTGS2), rheolydd cludo cation homolog 1 (CHAC1), a synthetase cysteinyl-tRNA (CARS) (14). Cafodd pob un o'r 3 marcwyr ferroptosis hyn eu huwchreoleiddio'n drawsgrifiadol gan driniaeth DC661 (Ffigur 3A), sy'n awgrymu bod ataliad lysosomaidd yn achosi ferroptosis. Arweiniodd DC661 at newid fflworoleuedd mewn celloedd A375P a driniwyd gan C11-CODIPY, gan nodi perocsidiad lipid, sy'n nodweddiadol o ferroptosis. Cafodd y shifft a ysgogwyd gan DC hwn ei wrthdroi'n sylweddol ym mhresenoldeb atalyddion ferroptosis ferrostatin-1 neu lip roxstatin-1 a weinyddir ar grynodiad effeithiol (Ffigur 3B a Ffigur Atodol 3A), sy'n dangos ymhellach bod DC661 ferroptosis a achosir. Fodd bynnag, nid oedd ataliad ferroptosis yn achub y cytotoxicity sy'n gysylltiedig â DC661 (Ffigur 3, C a D). Nid oedd cyd-drin celloedd canser gyda'r chelator haearn deferoxamine (DFO) a DC661 yn achub cytotoxicity DC661 (Ffigur 3E). Ni wnaeth triniaeth â ferrostatin-1, lip roxstatin-1, na DFO achub ataliad DC661 rhag hyfywedd tymor byr neu dwf clonogenig hirdymor mewn melanoma, colon, a chelloedd canser y pancreas (Ffigur Atodol 3, B). –E, a Ffigur Atodol 4, A–D). Mae'r data hyn yn dangos bod ferroptosis wedi'i actifadu ond yn anhepgor ar gyfer marwolaeth celloedd cyfryngol DC. Mae pyroptosis yn fath o farwolaeth celloedd wedi'i raglennu sy'n gysylltiedig ag ymateb llidiol sy'n cynnwys actifadu caspasau sy'n prosesu gastrin (GSDM), gan ganiatáu ffurfio mandwll ar y bilen plasma a rhyddhau patrymau moleciwlaidd sy'n gysylltiedig â difrod wedi hynny, megis symudedd uchel. blwch grŵp 1 (HMGB1). Arweiniodd triniaeth DC661 mewn llinellau cell melanoma lluosog (A375P, A375, WM35, a WM793) at actifadu caspase cychwynnwr-8 a -9 a caspase dienyddiwr-7, sy'n nodweddiadol ar gyfer pyroptosis, a chynhyrchwyd holltiad GSDME hyd llawn, yn debyg o ran graddau i'r inducer pyroptosis hysbys PLX4720 a PD0325901 (Ffigur Atodol 5A). Cynhyrchodd DC661 ryddhad allgellog cryfach o HMGB1 na'r inducer pyroptosis hysbys, BRAF, ac ataliad MEK mewn 1% FBS (15), gan adlewyrchu canlyniad swyddogaethol pyroptosis actifedig. Nesaf, gwnaethom brofi a fyddai atal pyroptosis gan GSDME KO yn lleddfu effeithiau sytotocsig DC661. Arweiniodd triniaeth DC661 at groniad LC3II a SQSTM1 / p62 ac actifadu caspase, ond diddymwyd rhyddhau HMGB1 bron yn gyfan gwbl yng nghelloedd dynol GSDME-KO WM35, gan ddangos bod canlyniad swyddogaethol atal pyroptosis wedi'i gyflawni (Ffigur 3F). Fodd bynnag, cynhyrchodd triniaeth DC661 sytowenwyndra cyfartal yn YUMM1.7 WT, fector gwag (EV), a chelloedd Gsdme KO1 a KO2 mewn amodau FBS 10% ac 1% (Ffigur 3G a Ffigur Atodol 5B). Un canlyniad cyffredin o fathau lluosog o farwolaeth celloedd yw rhyddhau LDH. Cynhyrchodd DC661 gynnydd sylweddol mewn rhyddhau LDH, ac ni allai hyn gael ei wrthdroi gan apoptosis, necroptosis, neu ataliad ferroptosis (Ffigur Atodol 5C). Dangosodd y canlyniadau hyn fod DC661 yn achosi moddau lluosog o farwolaeth celloedd, gan gynnwys apoptosis a pyroptosis yn ogystal â necroptosis a ferroptosis, ond nid oes angen yr un o'r dulliau hyn o farwolaeth celloedd ar gyfer marwolaeth celloedd a achosir gan DC. Nid yw ataliad cathepsin na chelation calsiwm yn atal marwolaeth celloedd o athreiddedd pilen lysosomaidd. Ar ôl dangos bod actifadu caspase (sy'n ofynnol ar gyfer apoptosis a pyroptosis) yn anhepgor ar gyfer marwolaeth celloedd a achosir gan DC, gwnaethom ddamcaniaethu y gallai rhyddhau cathepsin o lysosomau achosi marwolaeth celloedd sy'n ddibynnol ar caspase. Roedd ataliad cemegol (DC661) neu enetig (PPT1 siRNA [siPPT1]) o PPT1 yn cynhyrchu athreiddedd pilen lysosomaidd (LMP), tra na allai HDSF, atalydd anwrthdroadwy llai grymus o PPT1 sy'n cael ei ddisbyddu'n gyflym mewn meithriniad celloedd, achosi LMP, fel y'i mesurwyd. gan galectin-3–positive puncta (Ffigur 4A). Mae LMP yn arwain at ryddhau cathepsinau a chynnwys lysosomaidd arall i'r cytoplasm a chredir ei fod yn nodwedd agosol allweddol o farwolaeth celloedd sy'n seiliedig ar lysosomau. Roedd LMP a ysgogwyd gan DC661 yn gysylltiedig â chynnydd sylweddol mewn gweithgaredd cathepsin-L cytoplasmig, a gafodd ei rwystro'n sylweddol ag atalydd proteas cystein E64 (Ffigur 4B). Mae adroddiadau blaenorol wedi awgrymu bod rhyddhau cathepsin o lysosomau wedi torri yn hyrwyddo actifadu caspase, gan arwain at farwolaeth celloedd apoptotig (16-18). Nid oedd ataliad cathepsin cyflawn yn atal holltiad caspase (Ffigur 4C) ac nid oedd yn achub sytowenwyndra a achosir gan DC mewn profion hyfywedd tymor byr a thymor hir mewn melanoma (Ffigur 4, D ac E), canser y colon, a'r pancreas celloedd canser (Ffigur Atodol 6, A-C). Mae'r canlyniadau hyn yn gwrthweithio'r farn ganonaidd o farwolaeth celloedd lysosomaidd fel y'i hysgogwyd gan farwolaeth celloedd trwy gyfrwng cathepsin. Ar wahân i ryddhau cathepsin o lysosomau sy'n gollwng, mae rhyddhau calsiwm o lysosomau wedi'i gysylltu â chamweithrediad cellog pan fo nam ar PPT1 (19). Arweiniodd triniaeth DC661 at ryddhad calsiwm helaeth, a gafodd ei ddileu gan rag-drin calsiwm parhaol celloedd (Ca2+), BAPTA-AM. (Ffigur 4F). Yn nodedig, ni wnaeth BAPTA-AM atal LMP a achosir gan DC (Ffigur 4G) na holltiad caspase (Ffigur Atodol 6, D, ac E) ac, yn bwysicaf oll, ni wnaeth achub sytowenwyndra a achosir gan DC (661-). Ffigur 4H). Gwelwyd y canfyddiadau hyn hefyd yn llinellau celloedd RKO a MIA PaCa{-2, lle na welwyd unrhyw wahaniaethau arwyddocaol mewn gwerthoedd IC50 gyda BAPTA-AM a DC661 (Ffigur Atodol 6F), a awgrymodd fod marwolaeth celloedd sy'n gysylltiedig â LMP yn ddim yn ddibynnol ar galsiwm neu gathepsinau.
Ffigur 2. Apoptosis a necroptosis a achosir gan DC. (A)
Ffigur 3. Fferoptosis a phyroptosis a achosir gan DC. (A)
LLP yn gyrru LMP. Ar ôl sefydlu bod atalyddion prif lwybrau marwolaeth celloedd (apoptosis, necroptosis, ferroptosis, a pyroptosis), cathepsinau (PepA ac E64), a chelators ïon (BAPTA-AM [Ca{2+] a DFO [Fe{{3}). }]) nad oedd yn atal marwolaeth celloedd erbyn DC661 a chanfod tystiolaeth o berocsidiad lipid gan C-11- BODIPY, gwnaethom gynnal dadansoddiad lipidome byd-eang 2 a 4 awr ar ôl triniaeth DC661. Arweiniodd DC661 at gynnydd cynnar a pharhaus 3- i 10-blygu ym mhob dosbarth o lysoffosffolipid (Ffigur 5A). Mewn cyferbyniad, gwelwyd newidiadau bach neu ddim newidiadau mewn dosbarthiadau ffosffolipid, gan gynnwys phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, phosphatidylinositol, phosphatidylglycerol, ac asid ffosffatidig (Ffigur Atodol 7A). Gall rhywogaethau Lysophospholipid gael eu cynhyrchu gan ROS, sy'n ocsideiddio'r gadwyn asid brasterog dirlawn sydd wedyn yn cael ei hollti gan ffosffolipasau (20). Er mwyn penderfynu a allai gwrthocsidyddion atal difrod lipid wedi'i gyfryngu gan ROS, fe wnaethom ymchwilio i sytowenwyndra a achosir gan DC ym mhresenoldeb y sborionwr pan-ROS N-acetylcysteine (NAC) (21, 22) ac atalyddion perocsidiad lipid tybiedig Trolox (23). ) a fitamin C (asid asgorbig) (24, 25). Yn wahanol i unrhyw un o'r asiantau eraill a brofwyd hyd yn hyn, llwyddodd cotreatment â NAC i achub DC661-sytowenwyndra cysylltiedig ar draws llinellau cell lluosog (Ffigur 5B a Ffigur Atodol 7B). Dangosodd profion CFU hirdymor fod NAC, yn wahanol i'r holl atalyddion marwolaeth celloedd, chelators ïon, ac atalyddion cathepsin a brofwyd yma, wedi atal effeithiau cytotocsig DC661 yn A375P, RKO, MIA PaCa-2, B16F10, a chelloedd MC38 ( Ffigur 5C a Ffigur Atodol 7C). Yn ddiddorol, ni achubodd Trolox a fitamin C cytotocsigedd DC661 mewn melanoma dynol, canser colorefrol, celloedd canser y pancreas a melanoma murine a chelloedd canser y colon a'r rhefr (Ffigur 5D a Ffigur Atodol 7, D-H). Ysgogodd y gwahaniaeth hwn ni i brofi a oedd NAC, Trolox, a fitamin C yn effeithio ar LMP. Dangosodd ein canlyniadau mai NAC oedd yr unig wrthocsidydd a leihaodd LMP a achosir gan DC yn sylweddol (Ffigur 5E). Roeddem yn rhagdybio bod LLP yn gyrru cynhyrchu LMP gan DC661, a all gael ei ddychwelyd gan NAC ond nid gan Trolox a fitamin C. I astudio'r broses o LLP defnyddiwyd y chwiliwr fflwroleuol FOAM-LPO (26), sy'n lleoleiddio'n benodol i'r lysosom ac yn cynhyrchu newid sbectrol o 586 i 512 nm (coch i wyrdd) pan fydd yn agored i berocsidau lipid. Canfuom fod LLP wedi'i hysgogi gan DC661 o'i gymharu â rheolaeth (Ffigur 5F). Gostyngodd NAC berocsidiad lipid yn lysosomau'r DC661-gelloedd melanoma, tra methodd Trolox a fitamin C â lleihau LLP (Ffigur 5F). Ni chafodd NAC, Trolox, a fitamin C ar eu pen eu hunain unrhyw effaith sylweddol ar berocsidiad lipid. Roedd chwalu PPT1 (Ffigur Atodol 8A), neu driniaeth â chrynodiadau uchel o HCQ (Ffigur Atodol 8B) hefyd wedi achosi LMP y gellid ei wrthdroi gan NAC, tra nad oedd ataliad cemegol o ULK1 yn achosi LMP (Ffigur Atodol 8C). Yn bwysig ddigon roedd dymchwel siPPT1 hefyd yn cynnwys LLP y gellid ei wrthdroi gyda NAC (Ffigur Atodol 8D) Dangosodd y canlyniadau hyn fod ataliad PPT1 yn achosi PAC y gellir ei hachub gan NAC ac mae'n debygol mai LMP a achosir gan ataliad PPT. Ymhellach, roedd y canfyddiadau hyn yn awgrymu bod LLP yn hanfodol ar gyfer marwolaeth celloedd lysosomaidd.
Planhigyn cistanche perlysiau Tsieineaidd - Antitumor
Mae mewnforio cystein i lysosomau trwy MFSD12 yn gwanhau marwolaeth celloedd lysosomaidd. O'r 3 atalydd perocsidiad lipid, dim ond NAC oedd yn atal LLP. Dangosodd adroddiad diweddar fod y parth uwch-deulu hwylusydd mawr sy'n cynnwys 12 (MFSD12) yn elfen hanfodol o'r mewnforiwr cystein ar gyfer lysosomau a melanosomau (27). Fe wnaethom resymu bod NAC, neu ei gystein metabolit, yn cael ei gludo i'r lysosom trwy MFSD12, lle mae cystein yn cael ei ocsideiddio i'w disulfide, cystein. I brofi'r ddamcaniaeth hon, fe wnaethom gymharu gallu NAC i achub cytowenwyndra DC661 mewn celloedd EGFP sinNT a siMFSD12 A375P-hGal3-. Dangosodd ein canlyniadau fod NAC wedi achub LMP wedi'i achosi gan DC mewn celloedd sinNT ond nad oedd wedi achub LMP mewn celloedd siMFSD12 (Ffigur 6A). Fe wnaeth NAC leihau LLP o gelloedd DC661-trin celloedd siNT-A375P ond nid celloedd siMFSD12. Roedd celloedd siMFSD12 a gafodd eu trin â DMSO neu NAC wedi cynyddu LLP gwaelodol (Ffigur 6B) o gymharu â chelloedd siNT. Tra achubodd NAC sytowenwyndra DC661 mewn celloedd sinNT, diddymwyd gallu NAC i achub cytotoxicity DC661 yn llwyr mewn celloedd siMSFD12 (Ffigur 6C). Dangosodd hyn fod dymchwel MFSD12 yn rhwystro effeithiau cytoprotective NAC yn erbyn DC661. Mae NAC yn cael ei ddad-asylu gan acylase yn y cytosol (28). Er mwyn penderfynu a yw triniaeth NAC yn cynhyrchu croniad o cystein neu gystin o fewn lysosomau, fe wnaethom ddefnyddio'r dechneg imiwnodiad lysosomal (Lyso-IP) (29) i buro lysosomau o gelloedd DMSO a chelloedd A375P a driniwyd gan NAC (Ffigur 6D a Ffigur Atodol 9A) a pherfformiwyd metabolomeg wedi'i dargedu i fesur NAC a metabolion cysylltiedig. Yn ôl y disgwyl, canfuwyd NAC mewn lysate cell gyfan wedi'i drin â NAC a ffracsiynau heb eu rhwymo cysylltiedig. Cynyddwyd lefelau L-cystein yn sylweddol o fewn lysosomau a driniwyd gan NAC. Dim ond o fewn lysosomau a driniwyd gan NAC y gellir canfod L-cystin. Yn drawiadol, ni welsom gynnydd sylweddol mewn glutathione (llai) yn y grwpiau a driniwyd gan NAC (Ffigur 6E); roedd hyn yn syndod oherwydd credir yn gyffredin bod triniaeth NAC yn arwain at gynhyrchu mwy o glutathione, gan gywiro cydbwysedd rhydocs. Mae'r canlyniadau hyn yn awgrymu bod cystein sy'n cael ei fewnforio i lysosomau trwy'r mewnforiwr MFSD12 yn hanfodol ar gyfer achub LLP, LMP, a marwolaeth celloedd lysosomaidd. Mae LLP yn imiwnogenig. Mae rhai mathau o farwolaethau celloedd rheoledig a achosir gan DC661 (pyroptosis, necroptosis, ferroptosis) wedi'u nodi fel imiwnogenig. Yn flaenorol, disgrifiwyd marwolaeth celloedd imiwnogenig ar gyfer cyffuriau cemotherapi yn seiliedig ar nodweddion nodweddiadol, sy'n cynnwys arddangos patrymau moleciwlaidd sy'n gysylltiedig â difrod, gan gynnwys mynegiant arwyneb celloedd CALR a rhyddhau protein HMGB1 ac adenosine triphosphate (ATP) (30). Mae CALR yn gweithredu fel signal "bwyta-fi" pan fydd yn agored i arwynebau celloedd yn ystod straen celloedd. Mae rhyddhau allgellog o HMGB1 ac ATP yn gweithredu fel signal "dod o hyd i mi" a gydnabyddir gan gelloedd phagocytig. Gwnaethom gymharu dau fodel: celloedd B16F10, sydd bron yn gyfan gwbl yn amddifad o lymffocytau sy'n ymdreiddio i diwmorau mewn modelau tiwmor syngeneig, a chelloedd MC38, sydd â lymffocytau ymdreiddio tiwmor mewn modelau tiwmor syngeneig. Yn gyntaf, rydym wedi dangos bod triniaeth DC661 neu siPpt1 yn achosi mynegiant CALR arwyneb yn sylweddol y gellir ei ddileu'n llwyr â thriniaeth NAC mewn celloedd MC38 (Ffigurau 7, A, a B). Gwelwyd canfyddiadau tebyg mewn celloedd B16F10 (Ffigur 7C). Methodd atalyddion prif lwybrau marwolaeth celloedd (apoptosis, necroptosis, ferroptosis, a pyroptosis) ag atal mynegiant wyneb CALR (Ffigur 7D). Er mwyn penderfynu a yw marwolaeth celloedd imiwnogenig a achosir gan DC661 yn ganlyniad i upregulation dosbarth I MHC, cafodd celloedd B16F10 a MC38 eu trin â DC661 (3 μM) neu DMSO am 24 awr. Canfuom nad oedd triniaeth DC661 yn cynyddu mynegiant MHC dosbarth I a upregulation immunoproteasome (Ffigur 7E a Ffigur Atodol 9, B ac C).
Ffigur 4. Nid yw ataliad cathepsin na chelation calsiwm yn atal marwolaeth celloedd a achosir gan DC. (A)
Er mwyn deall effeithiau ataliad awtoffagy ar preimio cell T, rydym yn perfformio in vitro preimio a coculture arbrawf gan ddefnyddio C57BL6 / J splenocytes fel y disgrifiwyd yn flaenorol (31). Ar gyfer preimio, fe wnaethom amlygu splenocytes i gelloedd DC661- neu gelloedd B16F10 neu MC38 a driniwyd gan DMSO. Nesaf, cafodd y splenocytes preimio hyn eu meithrin â chelloedd B16F10 neu MC38 byw, a mesurwyd sytowenwyndra (Ffigur 8A). Cynhyrchodd splenocytes wedi'u preimio â chelloedd B16F10 a driniwyd gan DC gynnydd sylweddol mewn IFN- o'i gymharu â splenocytes sy'n agored i gelloedd B16F10 a driniwyd gan DMSO. Cynyddwyd lladd cyfryngol cell T preimio o gelloedd B16F10 lluosog yn sylweddol mewn splenocytes preimio DC o gymharu â splenocytes wedi'u preimio gan DMSO (Ffigur 8, B ac C). Cynhyrchodd celloedd MC38 a gafodd eu trin â DC661 hyd yn oed mwy o sytowenwyndra celloedd T IFN- a preimio o'u cymharu â chelloedd B16F10 (Ffigur 8, D, ac E). Roedd cotreatment NAC gyda DC661 yn gallu diddymu IFN-rhyddhau o splenocytes yn llwyr a sytotowenwyndra celloedd T wedi'u preimio'n ddi-fin (Ffigur 8, F, a G). Fe wnaeth chwalu calreticulin gan siCalr mewn celloedd MC38 (Ffigur Atodol 9D) ddiddymu effeithiolrwydd preimio triniaeth DC661 a lleihau sytowenwyndra celloedd T preimio yn sylweddol (Ffigur 8, H, ac I). Gyda'i gilydd, mae'r data hyn yn cefnogi rôl fecanistig o ddadreoleiddio CALR sy'n gysylltiedig â LLP wrth hyrwyddo imiwnedd celloedd T gwrth-tiwmor. Nesaf, fe wnaethom ehangu'r canfyddiadau in vitro hyn i astudiaeth brechu gwrth-tiwmor in vivo mewn modelau llygod imiwn-gymwys ac imiwnoddiffygiol. Ar gyfer y assay hwn, chwistrellwyd celloedd B16F10 neu MC38 wedi'u rhewi-dadmer in vitro neu DC wedi'u trin sc ar yr ystlys chwith i amddiffyn llygod imiwnocompetent C57BL/6 neu NOD/SCID rhag ail-herio gyda chelloedd tiwmor byw o'r un math wedi'u chwistrellu 7 diwrnod yn ddiweddarach i mewn i'r ochr dde (Ffigur 9A). Methodd DC661-trin celloedd B16F10 ag atal tiwmor rhag cael ei wrthod er gwaethaf profion in vitro, gan awgrymu bod DC661 wedi achosi marwolaeth celloedd imiwnogenig (Ffigur 9B a Ffigur Atodol 9E). Mewn cyferbyniad, roedd brechu un ochr â chelloedd MC38 wedi'u trin gan DC yn annog gwrthod llwyr celloedd MC38 byw a fewnblannwyd ar yr ochr arall (Ffigur 9C a Ffigur Atodol 9F). I benderfynu a oedd imiwnedd addasol yn hanfodol ar gyfer yr effaith brechlyn yr oedd yn ymddangos bod DC661 yn ei chael gyda thiwmorau MC38, gwnaethom ailadrodd yr arbrawf mewn llygod NOD / SCID. Yn drawiadol, canfuom nad oedd celloedd MC38 a oedd wedi’u trin gan DC yn achosi gwrthod tiwmorau ail-herio mewn llygod NOD/SCID imiwnoddiffygiol (Ffigur 9D a Ffigur Atodol 9G), gan nodi bod angen imiwnedd addasol ar gyfer yr effaith brechlyn a arsylwyd. I brofi cadernid y canfyddiad hwn, dewiswyd llinell gell canser llygoden imiwnogenig adnabyddus arall, CT26, a pherfformiwyd yr arbrawf brechu fel uchod. Yn ôl y disgwyl, cynhyrchodd mewnblannu celloedd CT26 mewn un ochr i'r llygoden effaith tebyg i frechlyn ac atal twf celloedd CT26 byw a fewnblannwyd ar yr ochr arall (Ffigur 9E a Ffigur Atodol 9H). Roedd ein canfyddiadau’n awgrymu bod LLP a achosir gan DC661-yn hanfodol ar gyfer marwolaeth celloedd imiwnogenig wedi’i chyfryngu gan LMP, sy’n cael ei wrthdroi gan fewnforio cystein i lysosom gan gludwr lysosomaidd MFSD12 (Ffigur 9F).
Trafodaeth
Ymddengys bod ataliad lysosomaidd yn ddull therapiwtig addawol mewn astudiaethau cyn-glinigol, ac mae treialon clinigol HCQ wedi cynhyrchu canlyniadau calonogol ond cymysg (1, 32). PPT1 yw targed moleciwlaidd HCQ, ac mae atalyddion PPT1 cryfach, megis DC661 (2) a GNS561 (3), yn achosi marwolaeth celloedd trwy gyfrwng LMP in vitro. Nid yw union fecanwaith marwolaeth celloedd lysosomaidd a'i rôl mewn imiwnogenigrwydd tiwmor wedi'i egluro'n llawn. Mae imiwnedd gwrth-tiwmor yn cael ei wella pan gyfunir ataliad awtoffagi ag imiwnotherapi (9, 10, 31). Mae mecanweithiau arfaethedig ar gyfer imiwnogenigrwydd celloedd-gynhenid yn dilyn ataliad awtophagi yn cynnwys MHC dosbarth I ac imiwnoproteasome upregulation, sydd ill dau yn cefnogi gwell prosesu antigen a chyflwyniad. Yn ogystal, mae colli proteinau awtoffagy neu ataliad awtophagi gan ymateb celloedd T CD8+ estynedig cloroquine trwy gynyddu lefelau arwyneb dosbarth I MHC mewn celloedd dendritig (33). Fe wnaethom ddangos yn flaenorol y gall ataliad PPT1 systemig ailbegynu macroffagau o ffenoteip M2 i M1. Gall atalyddion PPT1 wella lefelau STING, gan arwain at ryddhau IFN ac ychwanegu at ladd trwy gyfrwng celloedd T mewn modelau melanoma (31). Yma, gwnaethom ddangos bod LLP ei hun yn cynhyrchu ffurf imiwnogenig celloedd-gynhenid tiwmor o farwolaeth celloedd. Canfuom fod ataliad lysosomaidd wedi achosi ychydig iawn o newidiadau mewn proteinau mewn celloedd canser, ac roedd y proteinau mwyaf arwyddocaol yn cynnwys derbynyddion cargo awtophagi a rheolyddion apoptosis. Dangosodd ein dull o dargedu rhai o'r genynnau hyn ar draws swyddogaethau nad proteinau a achosir gan gyffuriau oedd y prif reoleiddwyr tebygol ar gyfer marwolaethau celloedd. Nid oedd ataliad genetig o ULK1 neu ATG7 ychwaith yn achub cytotoxicity DC661. Gwnaethom ddangos bod ataliad lysosomaidd yn actifadu ffurfiau lluosog o farwolaethau celloedd wedi'u rhaglennu, gan gynnwys apoptosis, necroptosis, ferroptosis, a pyroptosis, ond roedd pob un o'r rhain yn anhepgor ar gyfer sytowenwyndra a achosir gan gyffuriau. O bwys, gall mecanweithiau marwolaeth celloedd wedi'u rhaglennu orgyffwrdd a gallai cyd-dargedu mecanweithiau marwolaeth celloedd lluosog ddarparu cytoprotection yn erbyn marwolaeth celloedd yn dilyn athreiddiad pilen lysosomaidd. Mae ein gwaith wedi diystyru mecanweithiau cathepsin-ddibynnol ar galsiwm ar gyfer marwolaeth celloedd lysosomaidd ac wedi amlygu pwysigrwydd LLP fel penderfynydd hanfodol marwolaeth celloedd. Gwelsom dystiolaeth o LLP a oedd yn gildroadwy gan wrthocsidydd a gludwyd i'r lysosome, NAC ac a oedd yn hanfodol ar gyfer athreiddedd pilen lysosomaidd a sytowenwyndra. NAC oedd yr unig asiant a oedd yn gallu lliniaru neu wrthdroi marwolaeth celloedd a achosir gan DC, ac roedd y capasiti hwn yn dibynnu ar bresenoldeb y cludwr cystein lysosomal MFSD12. Mae diffyg treiddiad lysosomaidd yn debygol pam nad oedd atalyddion perocsidiad lipid tybiedig eraill, Trolox a fitamin C, yn gallu atal sytowenwyndra DC661. Mae NAC yn cael ei drawsnewid yn cystein, sy'n cael ei fewnforio i'r lysosomau ac yn ocsideiddio i'w ffurf disulfide, cystin. Mae cystin yn cael ei allforio i'r cytosol gan gludwr lysosomaidd arall, cystinosis, lle mae'n cael ei leihau i cystein sy'n ailsefydlu ffynonellau maetholion mewnol, yn ail-greu targed cymhleth rapamycin 1, ac yn hyrwyddo awtoffagy (34). Gallai'r cylchred lleihau ocsidiad hwn o gystein i systin (lysosomau) ac yn ôl i cystein (cytosol) fod yn fecanwaith achub posibl o NAC yn erbyn cytowenwyndra DC661 neu anaf lysosomaidd mwy cyffredinol ar draws cyd-destunau clefydau eraill lle mae NAC wedi profi i fod yn ddefnyddiol yn therapiwtig (35) . Roedd NAC nid yn unig wedi gwrthdroi LLP ac LMP a ysgogwyd gan DC ond hefyd mynegiant arwynebol calreticulin marciwr marwolaeth celloedd imiwnogenig. Roedd angen mynegiant arwyneb celloedd o brotein CALR ar gyfer y cytotocsigedd cyfryngol T uwch a ysgogwyd gan splenocytes preimio DC, gan ddangos bod ataliad lysosomaidd yn cynhyrchu math penodol o imiwnogenigrwydd celloedd-gynhenid.
Er bod astudiaethau blaenorol wedi dangos y gall ataliad lysosomaidd wella gweithgaredd antitumor ataliad pwynt gwirio imiwnedd mewn tiwmorau ystlys sefydledig (9, 31), ein hastudiaeth yw'r cyntaf i'n gwybodaeth i ddangos effaith tebyg i frechlyn ar gyfer tiwmorau MC38 ond nid tiwmorau B16 yn celloedd tiwmor wedi'u rhag-drin â DC661 cyn eu mewnblannu. Mae hyn yn dangos y gall marwolaeth celloedd lysosomaidd achosi imiwnogenigrwydd celloedd-gynhenid, ond nid yw'r newidiadau hyn ynddynt eu hunain yn ddigon tebygol o wrthdroi micro-amgylchedd tiwmor “imiwn oer” yn ficro-amgylchedd tiwmor “imiwnedd-boeth”. Dangosodd ein hastudiaethau blaenorol mewn modelau micro-amgylchedd tiwmor “imiwn oer” B16 a’r BRafCA PtenloxP Tyr: modelau llygoden a luniwyd yn enetig CreERT2 (31) fod ataliad lysosomaidd systemig yn cynhyrchu effeithiau ar macroffagau sy’n gysylltiedig â thiwmor a chelloedd atal sy’n deillio o gelloedd myeloid a oedd yn ddigonol i’w gwella. effeithiolrwydd imiwnotherapi. Gall fod yn wir bod imiwnogenigrwydd celloedd-gynhenid hefyd yn chwarae rhan yn y tiwmorau oer imiwn hyn sy'n dod yn fwy ymatebol i ICD yn dilyn ataliad lysosomaidd. Efallai y bydd effaith ataliad lysosomaidd tebyg i frechlyn a welwyd mewn amgylchedd labordy rheoledig yn trosi i'r clinig neu beidio, ond gallai esbonio pam roedd gan rai cleifion a gafodd eu trin â dabrafenib, trametinib, a HCQ mewn melanoma mutant BRAF a gafodd ei drin yn flaenorol mor ddwfn a gwydn. ymateb i'r drefn hon (32). Mae angen astudiaeth bellach i ddeall sut mae ataliad PPT1 yn cynhyrchu ROS lysosomaidd a pherocsidiad lipid. Nid yw rheoliad dibynnol PPT o'r V-ATPase ac asideiddio lysosomaidd yn esboniad digonol oherwydd bod bafilomycin yn atal asideiddio lysosomaidd ond nid yw'n cynhyrchu LMP (data heb ei ddangos). Mae goblygiadau'r canfyddiadau hyn yn awgrymu y gellir cyfuno atalyddion lysosomaidd sy'n gwella imiwnogenigrwydd celloedd tiwmor yn rhesymegol â therapïau sy'n gwella actifadu celloedd T, neu ymdreiddiad i'r micro-amgylchedd tiwmor, gan arwain at effeithiau synergaidd o bosibl.
Ffigur 5. Mae cystein N-acetyl yn atal marwolaeth celloedd a achosir gan DC. (A)
Dulliau
Diwylliant celloedd. Dynol A375P (CRL-3224), RKO (CRL-2577), DLD-1 (CCL- 221), MIA PaCa-2 (CRL-1420 ), A549 (CRM-CCL-185), a llinellau cell llygoden B16F10 (CRL-6475) gan ATCC. Cafwyd llinellau dynol A375 (CRL-1619, ATCC), WM35, WM793, a llygoden YUMM1.7 (WT, Gsdme EV, a Gsdme KO1 a KO2) yn fewnol. Darparwyd celloedd Llygoden MC38 a CT26 gan Andy Minn, Prifysgol Pennsylvania. Cafwyd celloedd mêr esgyrn cynradd FL5.12 ac IL-3-dibynnol Bax−/−Bak−/− (Bax/Bak DKO) gan Kathryn E. Wellen, Prifysgol Pennsylvania. Darparwyd y llinell gell Panc dynol-1 (CRL-1469, ATCC) gan Ben Z. Stanger, Prifysgol Pennsylvania. Cafwyd llinell gell llygoden YUMMER 1.7 gan Xiaowei (George) Xu, Prifysgol Pennsylvania. Profwyd pob llinell gell am Mycoplasma ddwywaith y flwyddyn gan gyfleusterau Craidd Prifysgol Pennsylvania a'u dilysu gan ddefnyddio olion bysedd ailadroddus tandem byr gan graidd Genomeg Sefydliad Wistar. Cafodd llinellau celloedd A375P, RKO, DLD-1, A549, CT26, FL5.12, a Bax/Bak DKO eu meithrin yn RPMI 1640 (Invitrogen, 11875); Cafodd llinellau cell A375, MIA PaCa-2, Panc-1, B16F10, a MC38 eu meithrin yn DMEM (Invitrogen, 11995); ac roedd celloedd YUMMER1.7, YUMM1.7 WT, Gsdme EV, a Gsdme KO1 a KO2 (15) wedi'u meithrin mewn DMEM/F12 50/50 (Corning, 10-092-CV). Ategwyd y cyfryngau diwylliant â 10% o serwm buchol ffetws (12306C, MilliporeSigma) a hydoddiant gwrthfycotig gwrthfiotig 1 × (Gibco, 15140-122). Cynhaliwyd llinellau celloedd FL5.12 a Bax/Bak DKO mewn cyfryngau RPMI cyflawn wedi'u hategu â 50 μM -mercaptoethanol (Life Technologies, 21985-023), 10 mM HEPES (H3537, MilliporeSigma), a 0.35 ng/mL a 3.5 ng /mL IL-3, yn y drefn honno. Roedd llinellau celloedd YUMMER1.7 a YUMM1.7 (WT, Gsdme EV, a Gsdme KO) yn cael eu cynnal mewn cyfryngau cyflawn wedi'u hategu â 1 × MEM NEAA (Gibco, 11140-050). Cafodd celloedd WM35 a WM793 eu meithrin yng nghyfryngau MCDB 153 (MilliporeSigma, M7403), yn cynnwys 10% FBS mewn cyfrwng 1 × Leibovitz L-15 (Corning, 10-045-CV), 7.5% w/v sodiwm bicarbonad ( Corning, 25-035-CI), 1 × hydoddiant gwrthfycotig gwrthfiotig (Gibco, 15140-122), a 5 ug/mL inswlin (MilliporeSigma, I0516). Tyfwyd celloedd ar 37 gradd ym mhresenoldeb 5% CO2. Cemegau ac adweithyddion. Roedd y cemegau a brynwyd yn cynnwys HCQ Sulfate (Spectrum Chemicals, 747-36-4) a DC661 (Selleckchem, S8808). Defnyddiwyd Fluo-4, AM (Thermo Fisher Scientific, F14201) i staenio'r celloedd ar gyfer calsiwm yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Darperir rhestr o wrthgyrff ac atalyddion yn Nhabl Atodol 1 a Thabl Atodol 2.
Ffigur 6. Mae NAC yn gwrthdroi PAC mewn modd dibynnol ar MFSD. (A-C)
Echdynnu a threulio protein ar gyfer cromatograffaeth hylif - dadansoddiad sbectrometreg màs tandem ar gyfer proteomeg. {{0}}.7 × 10Cafodd 6 o gelloedd melanoma A375P eu meithrin mewn dysglau meithrin 60 mm. Cafodd celloedd eu trin â DMSO (rheolaeth), DC661 (3 μM), HCQ (10 μM), neu HCQ (3{{7{0}} μM) am 24 awr ar tua 5{{{{{}). 112 }} % cydlifiad. Cafodd pelenni celloedd wedi'u rhewi eu gorchuddio â 50 mM Tris pH 7.4, 1% SDS, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.15 mM PMSF, 1 ug/mL pepstatin, ac 1 ug/mL leupeptin. Cafodd lysateau clir (10 ug yr un) eu electrofforesi 0.5 cm i mewn i gel bis-tris ac yna eu gosod a'u staenio â Coomassie coloidaidd. Cafodd pob lôn gel 0.5 cm ei halltudio, ei chadw, ei lleihau â ffosffin tris (2-carboxyethyl), ei alkylated ag iodoacetamide, a'i dreulio â trypsin fel y disgrifiwyd yn flaenorol (36). Dadansoddwyd crynhoadau (1 ug) yn ôl cromatograffaeth hylif - sbectrometreg màs tandem (LC-MS/MS) ar sbectromedr màs Q-Exactive Plus (Thermo Fisher Scientific) yn unol â nanoAQUITY UPLC (Waters). Perfformiwyd gwahaniad dadansoddol ar golofn Peptid BEH C18 1.7 μm × 250 mm (Waters, 186003546) gan ddefnyddio graddiant munud 245- gyda 0.1% asid fformig mewn dŵr (cyfnod symudol A) ac asetonitrile (cyfnod symudol B) fel a ganlyn : 5%–30% B dros 225 munud, 30%–80% B dros 5 munud, 15-dal munud ar 80% B, a dychwelyd i amodau cychwynnol. Cafwyd sbectra MS llawn ar gydraniad 70,000, gydag ystod sgan o 400–2,000 m/z, targed rheoli ennill awtomatig o ïonau 3 × 106, ac uchafswm amser pigiad o 50 milieiliad. Cafwyd sbectra MS2 sy’n ddibynnol ar ddata ar gyfer yr 20 ïon mwyaf niferus ar gydraniad 17,500, gyda lled ynysu o 1.5 m/z, targed rheoli enillion awtomatig o ïonau 5 × 104, ac uchafswm amser chwistrellu o 50 milieiliad. Gosodwyd paru peptid fel yr oedd yn well, a gwrthodwyd ïonau heb eu neilltuo a gwefr unigol (37). Dadansoddwyd data crai MS gan ddefnyddio MaxQuant 1.6.5.0 (https:// maxquant.net/perseus/) gyda chronfa ddata dilyniant dynol Uniprot (a gyrchwyd ar Hydref 10, 2019) a chronfa ddata halogion cyffredin, gan gynnwys trypsin, ceratinau, proteinau buchol, a mycoplasma (38). Defnyddiwyd penodoldeb peptid tryptig gydag uchafswm o 2 holltiad a gollwyd, addasiad sefydlog ar cystein (carbamidomethylation), ac ocsidiad methionin amrywiol neu asetyliad N-terminal yn y chwiliad (39). Defnyddiwyd toriad o 1% FDR ar gyfer peptidau a phroteinau. Galluogwyd paru rhwng rhediadau; proteinau eu meintioli gan ddefnyddio label-rhad ac am ddim meintiol (40). Perfformiwyd dadansoddiad ystadegol gan ddefnyddio Perseus 1.6.2.3 ( https:// maxquant.net/perseus/ ) (41, 42). Roedd yn ofynnol i broteinau gael eu hadnabod gan o leiaf 3 pheptid unigryw a chael 3 gwerth dilys (meintioli heb fod yn sero) o fewn grŵp sampl, a chafodd halogion a phroteinau gwrthdro eu hidlo o'r set ddata. Cafodd gwerthoedd coll eu priodoli o ddosraniad normal. Perfformiwyd cymariaethau parwise rhwng cyflyrau ar y lefel protein gan ddefnyddio 2-prawf t Myfyriwr cynffon gyda FDR seiliedig ar drynewid gydag s0=0.1 a 250 o haposodiadau. Diffiniwyd newidiadau sylweddol fel FDR o lai na 5% a newid plyg absoliwt yn fwy na 1.5 neu 2.0, fel y nodwyd. Lyso-IP. Cafodd celloedd A375P eu heintio â pLJC5-Tmem192-3xHA lentivirus a’u dewis gan ddefnyddio 1 mg/mL puromycin (MilliporeSigma, P4512). Cafodd tua 3 × 106 o gelloedd A375P wedi'u tagio gan HA eu trin â naill ai NAC 10 mM neu reolaeth cerbyd dŵr am 24 awr mewn amodau diwylliant a ddisgrifiwyd yn flaenorol. Ar ôl triniaeth, cafodd celloedd eu golchi mewn PBS, eu cynaeafu mewn 0.5 mL KPBS oer, a'u homogeneiddio'n ysgafn gan ddefnyddio 20 strôc mewn homogenizer Dounce 2 mL. Cadwyd tua 2.5% o'r homogenad ar gyfer dadansoddiad lysate cell gyfan, a chafodd y gweddill ei allgyrchu ar 3,000g am 2 funud ar 4 gradd i gael gwared ar falurion cellbilen. Yna trosglwyddwyd uwchnatur homogenad i diwb 1.5 ml glân a'i ddeor â gleiniau gwrth-HA 50 μL (Pierce, 88836) neu gleiniau gwrth-DDK/Flag (OriGene, TA150042) am 15 munud ar 4 gradd . Yna cafodd samplau eu gwaddodi trwy osod tiwbiau ar DynaMag (Thermo Fisher Scientific, 12321D) a'u siglo'n ysgafn am 2 funud ar dymheredd ystafell. Cadwyd yr uwchnatant ar gyfer dadansoddiad ffracsiynau heb eu rhwymo. Cafodd IP ei olchi 3 gwaith gyda KPBS yn cynnwys 8 mM CaCl2. Echdynnwyd y Lyso-IP mewn 80% MeOH ar gyfer dadansoddiad metabolomeg. Echdynnu a dadansoddi lipidau gan ddefnyddio LC-MS/MS ar gyfer lipidome byd-eang. Cafodd celloedd Melanoma A375P eu hadu mewn dysglau 60 mm ar 0.7 × 106 o gelloedd fesul dysgl. Pan oedd celloedd tua 50% o gydlifiad, cawsant eu trin â DMSO (rheolaeth), DC661 (3 μM), neu HCQ (30 μM) am 24 awr. Cafodd celloedd eu golchi 2 waith gyda HBSS, eu crafu i fethanol oer-iâ, a'u trosglwyddo i diwbiau gwydr ar gyfer echdynnu lipid gyda chlorofform/methanol/0.88% NaCl (2:1:1) yn cynnwys safon lipid mewnol EquiSPLASH (Avanti Polar Lipids). Samplau eu vortexed ac yna bath dŵr sonicated am 5 munud ar iâ. Ar ôl centrifugio ar 500g am 15 munud ar 40 gradd, trosglwyddwyd y cyfnod isaf i diwb gwydr arall. Cafodd y cyfnod uchaf ei ail-dynnu gan ddefnyddio cyfnod is synthetig. Ar ôl sonication a centrifugation, cyfunwyd y cyfnod isaf gyda'r casgliad cyfnod is cyntaf. Sychwyd y samplau o dan nitrogen, eu hailddarparu mewn 10% clorofform/90% methanol, a'u trosglwyddo i ffiolau gwydr LTQ. Dadansoddwyd samplau lipid ar sbectromedr màs HF-X Gwyddonol Thermo Fisher a system Vanquish Horizon UHPLC. Defnyddiodd y gwahaniad dadansoddol golofn Accucore C30 (2.1 mm × 150 mm, Thermo Fisher Scientific) gyda 50:50 acetonitrile / dŵr a 88:10:2 isopropanol / acetonitrile / dŵr, pob un yn cynnwys fformat amoniwm 5 mM a 0.1% asid fformig. Cafwyd data LC-MS/MS ar wahân mewn pegynau positif a negyddol gyda'r paramedrau offeryn canlynol: sgan MS1 120, cydraniad {000; MS2 sy'n ddibynnol ar ddata ar yr 20 ïon mwyaf niferus ar 15, 000 cydraniad; Lled ynysu 0.4 m/z; ac egni gwrthdrawiad normaleiddio grisiog o 20:30:40 (43).
Ffigur 7. Mae cystein N-acetyl yn atal mynegiant arwyneb calreticwlin a achosir gan DC. (A-D)
Cafodd lipidau eu nodi a'u meintioli gan ddefnyddio LipidSearch 4.2 (Thermo Fisher Scientific). Hidlwyd y rhywogaethau lipid a nodwyd yn ôl adductau disgwyliedig a gradd adnabod yn seiliedig ar ddosbarth. Cafodd ardaloedd brig eu normaleiddio i safonau EquiSPLASH ar gyfer dosbarthiadau â chymorth a'u normaleiddio ymhellach yn seiliedig ar gyfanswm arwynebedd pob sampl i gywiro amrywiad yn nifer y celloedd. Perfformiwyd dadansoddiad ystadegol ar ddata a drawsnewidiwyd gan log gan ddefnyddio Perseus 1.6.2.3 ( https://maxquant.net/perseus/) (41, 42). Echdynnu a dadansoddi metabolit gan ddefnyddio LC-MS/MS ar gyfer metabalone. Echdynnwyd metabolion pegynol o gelloedd cyfan, ffracsiynau Lyso-IP heb eu rhwymo, a samplau wedi'u rhwymo â Lyso-IP gan ddefnyddio 80% methanol a chawsant eu storio ar –8{{30}} gradd cyn cromatograffaeth hylifol –dadansoddiad sbectrometreg màs (LC-MS). Dadansoddwyd detholiadau gan LC-MS gan ddefnyddio sbectromedr màs HF-X Thermo Scientific Q-Exactive gyda stiliwr HESI II yn unol â system Thermo Vanquish Horizon UHPLC. Perfformiwyd gwahaniad LC gan ddefnyddio colofn ZIC-HILIC (2.1 mm × 150 mm, maint gronynnau 5 μm, EMD Millipore) gyda cholofn gwarchod ZIC-HILIC (2.1 mm × 20 mm, EMD Millipore) a gynhaliwyd ar 45 gradd gyda chyfradd llif o 0.2 mL/munud. Perfformiwyd cromatograffaeth o dan amodau asidig i leihau adweithedd grwpiau thiol. Dŵr oedd cam A symudol a B yn acetonitrile, y ddau yn cynnwys 0.1% asid fformig. Y graddiant LC oedd 85% B am 2 funud, 85% B i 20% B dros 15 munud, 20% B i 85% B dros 0.1 munud, a 85% B am 8.9 munud. Cynhaliwyd yr autosampler ar 4 gradd, a chwistrellwyd 4 μL o bob sampl fesul dadansoddiad. Defnyddiwyd y paramedrau MS canlynol: cyfradd llif nwy gwain, 40 AU; cyfradd llif nwy ategol, 10 AU; cyfradd llif nwy ysgubo, 2 AU; tymheredd gwresogydd nwy ategol, 350 gradd; foltedd chwistrellu, 3.75 kV ar gyfer modd positif a 3.5 kV ar gyfer modd negyddol; tymheredd capilari, 375 gradd; a lefel RF twndis, 40%. Dadansoddwyd pob sampl yn ôl MS llawn gyda newid polaredd. Cafwyd sganiau MS llawn o 65 i 975 m/z ar gydraniad 120,000 gyda tharged rheoli cynnydd awtomatig o ïonau 1 × 106 ac uchafswm amser pigiad o 100 milieiliad. Dadansoddwyd data crai gan ddefnyddio TraceFinder 4.1 (Thermo Fisher Scientific). Nodwyd metabolion wedi'u targedu yn ôl màs cywir ac amser cadw yn eu polaredd dewisol yn seiliedig ar safonau dadansoddol. Roedd canfod brig yn defnyddio algorithm ICIS gyda llyfnu o 1. Perfformiwyd meintioli cymharol gan ddefnyddio ardal brig integredig, a chywirwyd y gwerthoedd hyn i'r cyfanswm fesul sampl (a ddiffinnir fel cyfanswm yr arwynebedd brig). golygu PPT{66}}CRISPR/Cas9. Paratowyd celloedd heb fod yn darged a chelloedd KO A375P fel y disgrifiwyd yn flaenorol (44). pSpCas9(BB)-2Anrheg gan Feng Zhang (Addgene plasmid, 48139) oedd A-Puro (PX459). Cafodd oligosau RNA canllaw (IDT) eu hanelio, eu ffosfforyleiddio, ac yna eu clymu i mewn i plasmid pX459 wedi'i dreulio a'i ddadffosfforyleiddio gan BbsI yn dilyn protocolau labordy Zhang, sydd ar gael trwy Addgene. Trawsnewidiwyd plasmidau clymedig yn gelloedd Stbl3 (Invitrogen). Cadarnhaodd dilyniannu paratoadau plasmid bresenoldeb y dilyniannau RNA canllaw a ddymunir. Trawsnewidiwyd celloedd A375P gan ddefnyddio Lipofectamine 3000 (Invitrogen, L3000015), ac yna detholiad puromycin. Cadarnhaodd profion syrfëwr olygu'r genyn PPT1 gan CRISPR/Cas9, a chadarnhawyd dymchwel PPT1 gan blotio'r Gorllewin gyda gwrthgorff PPT1 (Origene). Mae dilyniannau ar gyfer canllaw oligos RNA fel a ganlyn: canllaw nontarget RNA ymlaen (CACCGTAGCGAACGTGTCCGGCGT), canllaw nontarget RNA gwrthdroi (AAACACGCCGGACACGTTCGCTAC), canllaw PPT1 dynol RNA 1 ymlaen (CACCGTTTGGACTCCTCGATGCCC), canllaw PPT1 dynol RNA 1 gwrthdro (AAACACGCCGGACACGTTCGCTAC), canllaw PPT1 dynol RNA 1 ymlaen (CACCGTTTGGACTCCTCGATGCCC), canllaw PPT1 dynol RNA 1 gwrthdro (AAACACGGGCAT AAA) canllaw ymlaen (CAACCGCCTCGTGGCAAGCCGAATAC), a chanllaw PPT1 dynol RNA 3 gwrthdroi (AAACGTATTCGGCTTGCACGAGGC). Mae'r clonau a dyfir o gelloedd sengl a ddefnyddir yn y papur hwn yn cynnwys y canlynol: clon C8 yw canllaw dynol 1 a chlôn B5 yw canllaw dynol 3. Immunoblotting. Cafodd miliwn o gelloedd eu rhoi ar blatiau mewn dysgl 10 cm, a rhoddwyd triniaethau y diwrnod wedyn; casglwyd celloedd trwy grafu. Paratowyd lysadau cell gyfan gan ddefnyddio byffer lysis SDS. Mesurwyd crynodiad protein gan ddefnyddio Pecyn Assay Protein BCA Pierce (Thermo Fisher Scientific, 23225). Defnyddiwyd 30-50 ug o brotein ar gyfer SDS-PAGE a chafodd ei drosglwyddo i bilen PVDF (Bio-Rad, 1620177). Cafodd y bilen ei rhwystro gan ddefnyddio 5% BSA neu 5% o laeth sgim, yn unol ag amodau optimaidd, a'i deor â gwrthgorff cynradd dros nos ar 4 gradd . Golchwyd pilenni PVDF ag 1 × TBS-T (Cell Signaling Technology Inc., CS-9997) a'u deor am 1 awr ar dymheredd ystafell gyda gwrthgorff eilaidd cyfun HRP rhywogaeth-benodol. Wedi hynny, golchwyd a datblygwyd pilenni gan ddefnyddio swbstrad Pierce ECL Western Blotting (Thermo Fisher Scientific, 32106) a ffilmiau awtoradiograffeg (Lab Scientific Inc., XAR ALF 1318). Ar gyfer astudiaethau pyroptosis, gwahanwyd lysates protein gan SDS-PAGE a'u trosglwyddo i bilenni PVDF. Ar ôl blocio yn BSA 5%, deorwyd pilenni PVDF gyda'r gwrthgyrff sylfaenol a nodwyd dros nos ar 4 gradd , eu golchi mewn PBS / Tween, a'u deor â gwrthgyrff eilaidd wedi'u cyplysu peroxidase. Canfuwyd imiwn-actifedd gan ddefnyddio gwrthgyrff eilaidd cyfun HRP (CalBioTech), swbstrad cemiluminescence (Thermo Fisher Scientific), a system ddelweddu MP ChemicDoc (Bio-Rad). Ar gyfer arbrofion yn ymwneud â supernatant, cafodd celloedd eu meithrin mewn cyfrwng di-FBS i osgoi ystumio SDS-PAGE. Cafodd supernatants cell eu cynaeafu a'u centrifugio am 10 munud ar 500g ar 4 gradd i gael gwared ar falurion celloedd. Crynhowyd y supernatants canlyniadol 10 × gan ddefnyddio Amicon Ultra 10K (MilliporeSigma) trwy allgyrchu am 30 munud ar 4,500g ar 4 gradd . Cymysgwyd y crynodiadau â byffer sampl a'u dadansoddi trwy blotio Gorllewinol fel y disgrifir uchod. Perfformiwyd staen gel protein gan ddefnyddio staen coch Ponceau. Assay gweithgaredd LMP a cathepsin L. Rhodd gan Tamotsu Yoshimori (Addgene plasmid, 73080) oedd plasmid pEGFP-hGal3 dynol ac fe'i defnyddiwyd i greu'r llinell A375P-Galectin-3. Prynwyd asgwrn cefn fector plasmid rheoli pEGFP-C1 (novo prolabs, V012024). Trosglwyddwyd plasmidau (1 ug/mL) i gelloedd A375P gan ddefnyddio Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 11668019) yn unol â phrotocol y gwneuthurwr; dewiswyd celloedd a drawslifwyd yn sefydlog gan ddefnyddio G418 (Gibco, 10131035). Ar gyfer LMP, cyfrifwyd cyfanswm o 25 A375P-galectin-3 celloedd puncta-positif mewn meysydd delwedd lluosog. Cyfrifwyd canran y celloedd puncta-positif ym mhob maes ar wahân, a chyfrifwyd canran gyfartalog ar gyfer pob grŵp. Defnyddiwyd y pecyn assay Magic Red Cathepsin L (Abcam, ab270774) yn unol â phrotocol y gwneuthurwr. Delweddwyd celloedd o dan ficrosgop gwrthdro Zeiss Axio Observer 7. Cyfrifwyd dwyster integredig amrwd Magic Red gan ddefnyddio meddalwedd Fiji - ImageJ (NIH). MTT (3-[4, 5-dimethylthiazol-2-yl]-2, 5 diphenyl tetrazolium bromid) assay hyfywedd cell. Cafodd 2,000 o gelloedd eu platio mewn triphlyg ym mhob ffynnon o 96-blat ffynnon, a 3-profiadau MTT diwrnod yn cael eu perfformio gan ddefnyddio Cell hyfywedd Kit (Roche, 11465007001) yn unol â phrotocol y gwneuthurwr. Rhoddwyd rhag-driniaeth atalydd am 1 awr, ac yna cotreatment o'r celloedd ag atalyddion gyda DC661 neu hebddo. Defnyddiwyd y dull atchweliad aflinol (ffit cromlin) i gyfrifo IC50.
cistanche tubulosa-gwella system imiwnedd
Cliciwch yma i weld cynhyrchion Gwella Imiwnedd Cistanche
【Gofyn am fwy】 E-bost:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Assay ffurfio cytref. cafodd 2,000 o gelloedd ym mhob ffynnon eu hadu i mewn i 6-blat ffynnon a chawsant eu trin y diwrnod canlynol; roedd celloedd yn cael eu cadw o dan y driniaeth am gyfanswm o 8 diwrnod. Cafodd cytrefi a ffurfiwyd ym mhob ffynnon eu golchi â PBS, eu gosod â methanol oer ar -20 gradd am 20 munud, a'u staenio â hydoddiant dyfrllyd Crystal fioled 0.5% (V5265; MilliporeSigma).
Assay gwahardd llifyn glas Trypan. Paratowyd y cymysgedd adwaith ar gyfer assay glas Trypan trwy gymysgu 1 rhan o 0.4% Trypan glas (25- 900-CI, Corning) ac 1 rhan o samplau celloedd gwanedig. Deorwyd y gymysgedd am 1 munud, a chafodd celloedd eu cyfrif ar Cellometer Vision (Nexcelom, Vision-310-0208).
Ffigur 8. Mae mynegiant arwyneb calreticwlin a achosir gan DC yn cyseipio celloedd T yn erbyn celloedd tiwmor. (A)
Ffigur 9. Mae brechu celloedd DC wedi'u trin yn arwain at wrthod tiwmor mewn cyd-destunau penodol. (A)
Ewyn-LPO. Astudiwyd LLP gan ddefnyddio chwiliwr fflwroleuol, FOAMLPO. Cafodd FOAM-LPO ei syntheseiddio fel y disgrifiwyd yn flaenorol (26). Cafodd celloedd eu meithrin ar sleid 8 Ffynnon μ (ibid, 80807) a'u trin ag atalyddion a gyda neu heb DC661. Deorwyd celloedd â chyfryngau sy'n cynnwys FOAM-LPO (1 M) mewn awyrgylch o 5% CO2 a 95% aer am 5 munud ar 37 gradd . Golchwyd y celloedd ddwywaith gyda chyfryngau, ac yna gwelwyd celloedd o dan y microsgop (microsgop gwrthdro Zeiss Axio Observer 7) i ganfod fflworoleuedd yn symud o 586 i 512 nm mewn ymateb i LLP. qRT-PCR a paent preimio. Cafodd celloedd A375P (3 × 105 ) eu meithrin mewn dysglau 60 mm a chawsant eu trin â DMSO neu DC661 (3 μM) am 24 awr. Cafodd cyfanswm RNA ei ynysu â phecyn ynysu RNA (QIAGEN, 74134) yn ôl protocol y gwneuthurwr. Cafodd cDNA ei syntheseiddio gan ddefnyddio pecyn iScript Reverse Transcriptase gyda 500 ng o RNA wedi'i buro yn unol â phrotocol y gwneuthurwr (Thermo Scientific, K1642). Sefydlwyd yr adwaith qPCR gan ddefnyddio SYBR Green PCR Master Mix (BioRad, 1725121) yn cynnwys 1 μL cDNA. Cynhaliwyd yr holl fesuriadau mewn triphlyg, a defnyddiwyd BACTIN fel safon fewnol ar gyfer cyfrifiadau ΔCT. Gwnaed dadansoddiad mynegiant genynnau gan ddefnyddio'r paent preimio canlynol: PTGS2/COX-2 ymlaen (CGGTGAAACTGGCTAGACAG), PTGS2/COX-2 cefn (GCAAACCGTAGATGCTCAGGGA), CARS ymlaen (CTGGACTACTCCAGCAACACCA), gwrthdroi CARS (GACCAGTG), ATGT CHACCAG forwardGC (GTGGTGACGCTCCTTGAAGATC), gwrthdroi CHAC1 (GAAGGTGACCTCCTTGGTATCG), BACTIN ymlaen (CAACTGGGACGACATGGAGAAAAT), a BACTIN gwrthdroad (CCAGAGGCGTACAGGGATAGCAC).
trawsnewid siRNA. Perfformiwyd astudiaethau dymchwel genetig ar gyfer dynol ULK1, ATG7, TAX1BP1, BNIP3, PPT1, a MFSD12 mewn llinellau cell A375P. Perfformiwyd astudiaethau ataliad genetig ar gyfer llygoden Ppt1 a Calreticulin mewn celloedd MC38. SiRNA nad yw'n darged (sc{{10}}), ULK1 dynol (sc-44182), ATG7 (sc-41447), TAX1BP1/T6BP (sc-106831), BNIP3 (sc{{20}}), PPT1/CLN1 (sc-105216), MFSD12 (sc-97888), llygoden Ppt1/Cln1 (sc-142398) a Calreticulin /Calregulin (sc-29895) siRNAs eu prynu gan Santa Cruz Biotechnology. Mae'r siRNAs hyn yn cynnwys cronfeydd o 3-5 siRNAs targed-benodol. Cytometreg llif. Mesurwyd sefydlu feroptosis gan ddefnyddio C11- BODIPY (BODIPY 581/591 C11, Thermo Fisher Scientific, D3861). Cafodd celloedd A375P eu hadu mewn 6-plât ffynnon a'u trin â DMSO, ferrostatin{{40}} (10 μM), lip roxstatin-1 (2 μM), elastin (5 μM). ), DC661 (3 μM), neu gyfuniad am 24 awr. Cynaeafwyd celloedd trwy allgyrchu ar 300g am 5 munud. Cafodd celloedd eu hailddarparu mewn 500 μL 1X HBSS (Corning, 21-023-CV) yn cynnwys 1 μM C11-BODIPY a'u deor ar 37 gradd am 15 munud. Cafodd celloedd eu pelenni a'u hailddarparu mewn 500 μL 1X HBSS, a mesurwyd dwyster fflworoleuedd ar cytomedr BD LSRII gan ddefnyddio 530/30 Blue (Cyfleuster Craidd Llif Prifysgol Pennsylvania). Perfformiwyd meintioli mynegiant arwyneb celloedd calreticulin ar gyfer marwolaeth celloedd imiwnogenig fel y disgrifiwyd yn flaenorol (45) gan sytometreg llif. Cafodd celloedd B16F10 neu MC38 eu meithrin a'u trin â NAC (10 mM) neu DC661 (3 μM) am 24 awr. Cafodd celloedd MC38 eu trin â siPpt1 neu siNT am 48 awr ym mhresenoldeb neu absenoldeb NAC 10 mM am 24 awr. Cafodd celloedd eu staenio â gwrthgorff CALR (Cell Signaling Technology, 12238), ail wrthgorff gwrth-gwningen gafr Alexa Fluor 647 (Invitrogen), a propidium ïodid (PI) (Biolegend, 421301). Cafwyd samplau lliw ar cytomedr llif BD LSRII gan ddefnyddio 710/50 Blue a 670/30 Red i ddal fflworoleuedd PI a CALR, yn y drefn honno (cyfleuster craidd Llif Prifysgol Pennsylvania), a chyfyngwyd y dadansoddiad i gelloedd CALR-positif a DP-negyddol. i osgoi digwyddiadau ffug-bositif. preimio celloedd T a chanran sytowenwyndra. Cafodd celloedd tiwmor B16 neu MC38 (5 × 104) eu meithrin a'u trin â NAC (10 mM) neu DC661 (1 μM neu 3 μM), yn y drefn honno am, 24 awr. Ar gyfer ataliad genetig Calr, cafodd celloedd MC38 eu trin â Calr siRNA neu siRNA nontarget (siNT) am 48 awr, ac yna triniaeth gyda naill ai DMSO neu 3 μM DC661 am 24 awr. Yna cafodd splenocytes eu meithrin gyda DC661 gyda neu heb gelloedd B16 neu MC38 ym mhresenoldeb IL-2 (5 IU/mL) a'u cyd-ddiwyllio am 72 awr. Cadarnhawyd preimio gan IFN- ELISA (Biolegend, 430815) o'r supernatant. Yna cafodd splenocytes preimio eu cyd-ddiwyllio â chelloedd B16 neu MC38 wedi'u meithrin yn ffres gyda chymarebau targed-i-effeithydd (B16 neu MC38 i splenocytes) o 1:20 ac 1:50 ar gyfer celloedd B16 a MC38, yn y drefn honno. Mesurwyd y rhyddhad LDH sy'n gysylltiedig â marwolaeth celloedd B16 neu MC38 ac yna sytowenwyndra canrannol yn unol â phrotocol y gwneuthurwr (MilliporeSigma, 4744926001) ( 31 ). Profion brechu rhag tiwmor ac astudiaethau cemotherapi gyda modelau canser sefydledig. Cafwyd llygod WT C57BL/6 benywaidd chwech i wyth wythnos oed, NOD/SCID , a llygod BALB/c gan Labordy Jackson. Ar gyfer arbrofion brechu antitumor, cafodd celloedd WT B16F10, MC38, a CT26 eu trin â DC661 (3 μM) am 36 awr mewn fflasgiau 175 cm2. Yna, casglwyd supernatants a chelloedd ar wahân mewn tiwb hebog 50 ml. Cafodd y celloedd eu centrifugio a'u golchi â PBS oerfel iâ. Ar gyfer brechu, chwistrellwyd ataliad cellog 150 μL sc yn ochr chwith llygod C57BL/6 imiwnocompetent, llygod NOD/SCID imiwnoddiffygiol (celloedd 1.8 × 104 B16F10, celloedd 1.5 × 106 MC38 fesul llygoden), neu lygod syngeneaidd BALB/c (BALB/c) × 106 o gelloedd CT26 fesul llygoden). Chwistrellwyd celloedd rhew-dadmer a ail-ddarlledwyd yn PBS fel rheolaeth negyddol. Wythnos yn ddiweddarach, chwistrellwyd celloedd canser byw o'r un mathau (3 × 104 o gelloedd B16F10, 2 × 105 o gelloedd MC38, neu gelloedd 5 × 105 CT26 fesul llygoden) gyda chyfaint cyfartal o Matrigel (Corning, 354248) yn yr ochr dde o lygod wedi'u brechu. Mesurwyd tiwmorau gan ddefnyddio calipers electronig, a chyfrifwyd cyfaint fel L × W2 × 0.5. Roedd twf tiwmor yn cael ei fonitro'n rheolaidd ar gyfer y diwrnodau canlynol, ac ystyriwyd absenoldeb tiwmorau fel arwydd o frechu gwrth-tiwmor effeithlon. Ailadroddwyd astudiaethau brechu DC661-MC38 mewn llygod NOD/SCID. Ystadegau. Pennwyd arwyddocâd ystadegol trwy ddefnyddio prawf-t cynffon, 2-di-bâr y Myfyriwr wrth gymharu 2 grŵp. Defnyddiwyd y prawf ANOVA 1-ffordd pan gymharwyd mwy na 2 grŵp. Gwrthodwyd rhagdybiaeth nwl yn sylweddol os oedd y gwerth P yn llai na 0.05. Dangosir data fel y cymedr ± SEM. Cymeradwyaeth astudio. Perfformiwyd yr holl arbrofion anifeiliaid yn unol â'r protocolau a gymeradwywyd gan Bwyllgor Gofal a Defnydd Anifeiliaid Sefydliadol Prifysgol Pennsylvania.
Planhigyn cistanche perlysiau Tsieineaidd - Antitumor
Cyfeiriadau
1. Zeh HJ, et al. Astudiaeth cyn-llawdriniaeth ar hap cam II o ataliad awtoffagi gyda hydroxychloroquine dos uchel a gemcitabine / Nab-paclitaxel mewn cleifion canser pancreatig. Canser Clin Res. 2020; 26(13):3126–3134.
2. Rebecca VW, et al. Mae PPT1 yn hyrwyddo twf tiwmor a dyma'r targed moleciwlaidd o ddeilliadau cloroquine mewn canser. Canser Discov. 2019; 9(2): 220-229.
3. Brun S, et al. GNS561, atalydd awtophagi newydd sy'n weithredol yn erbyn bôn-gelloedd canser mewn carsinoma hepatogellog a metastasis hepatig o ganser y colon a'r rhefr. J Cancr. 2021; 12(18): 5432-5438.
4. Brun S, et al. Mae GNS561, atalydd PPT1 cam clinigol, yn effeithlon yn erbyn carsinoma hepatogellog trwy fodiwleiddio swyddogaethau lysosomaidd. Autophagy. 2022; 18(3):678–694.
5. Oberle C, et al. Mae athreiddiad pilen lysosomaidd a rhyddhau cathepsin yn ddigwyddiad sy'n dibynnu ar Bax/Bak, sy'n chwyddo apoptosis mewn ffibroblastau a monocytes. Marwolaeth Cell yn Wahanol. 2010; 17(7): 1167-1178.
6. Boya P, Kroemer G. Permeabilization bilen lysosomal mewn marwolaeth celloedd. Oncogene. 2008; 27(50):6434–6451.
7. Rebecca VW, et al. Dull unedig o dargedu rolau diraddiol a thwf y lysosom. Canser Discov. 2017; 7(11):1266–1283.
8. Tang R, et al. Ferroptosis, necroptosis, a pyroptosis mewn imiwnedd gwrthganser. J Hematol Oncol. 2020; 13(1):110.
9. Yamamoto K, et al. Mae awtophagy yn hyrwyddo osgoi imiwn o ganser y pancreas trwy ddiraddio MHCI. Natur. 2020; 581(7806):100–105.
10. Deng J, et al. Mae ataliad ULK1 yn goresgyn cyflwyniad antigen dan fygythiad ac yn adfer imiwnedd gwrth-tiwmor mewn canser yr ysgyfaint mutant LKB1. Nat Canser. 2021; 2(5): 503–514.
11. Lazarou M, et al. Mae'r ubiquitin kinase PINK1 yn recriwtio derbynyddion awtophagi i gymell mitophagi. Natur. 2015; 524(7565):309–314.
12. Choi YB, et al. Mae TAX1BP1 yn atal apoptosis a achosir gan firws trwy hwyluso diraddio'r addasydd mitocondriaidd MAVS ar sail cosi. Mol Cell Biol. 2017; 37(1): e00422-16.
13. Rikka S, et al. Mae Bnip3 yn amharu ar fio-egni mitocondriaidd ac yn ysgogi trosiant mitocondriaidd. Marwolaeth Cell yn Wahanol. 2011; 18(4):721–731.
14. Leu JI, et al. Sail fecanyddol ar gyfer ferroptosis â nam mewn celloedd sy'n mynegi'r amrywiad S47 Affricanaidd-ganolog o t53. Proc Natl Acad Sci US A. 2019; 116(17):8390–8396.
15. Erkes DA, et al. Mae atalyddion Mutant BRAF a MEK yn rheoleiddio micro-amgylchedd imiwnedd tiwmor trwy pyroptosis. Canser Discov. 2020; 10(2): 254-269.
16. Serrano-Puebla A, Boya P. Athreiddedd pilen lysosomaidd mewn marwolaeth celloedd: tystiolaeth newydd a goblygiadau ar gyfer iechyd ac afiechyd. Ann NY Acad Sci. 2016; 1371(1):30–44.
17. Thirusangu P, et al. Mae awtoffagi a achosir gan quinacrin mewn canser ofarïaidd yn sbarduno athreiddedd pilen lysosomaidd/mitochondrial wedi'i chyfryngu gan cathepsin-L a marwolaeth celloedd. Canserau (Basel). 2021; 13(9): 2004.
18. Michaelalet MC, et al. Apoptosis sy'n ddibynnol ar gathepsin wedi'i ysgogi gan actifadu lymffocytau T yn ormodol: mecanwaith posibl o oddefgarwch dos uchel. J Immunol. 2004; 172(9):5405–5414.
19. Mondal A, et al. Mae diffyg ppt{1}}yn dadreoleiddio cartrefostasis lysosomaidd Ca++ gan gyfrannu at bathogenesis mewn model llygoden o glefyd CLN1. J Etifeddu Metab Dis. 2022; 45(3):635–656. 20. Engel KM, et al. Roedd ffosffolipasau a rhywogaethau ocsigen adweithiol yn deillio o fiofarcwyr lipid mewn pobl ac anifeiliaid iach ac afiach - ffocws ar lysoffosphatidylcholine. Ffisiol Blaen. 2021; 12: 732319.
21. Fu R, et al. Effeithlonrwydd N-acetylcysteine mewn ataliad ffenotypig modelau llygoden o glefyd Niemann-Pick, math C1. Hum Mol Genet. 2013; 22(17):3508–3523.
22. Boz Z, et al. Mae N-acetylcysteine yn atal straen ocsideiddiol a achosir gan olanzapine mewn niwronau hypothalamig mHypoA-59. Cynrychiolydd Gwyddonol 2020; 10(1):19185.
23. Khare S, et al. Mae ASS1 ac ASL yn atal twf mewn carsinoma celloedd arennol celloedd clir trwy newid metaboledd nitrogen. Metab Canser. 2021; 9(1):40.
24. Gęgotek A, et al. Cymhariaeth o effaith amddiffynnol asid ascorbig ar ryngweithiadau systemau rhydocs ac endocannabinoid mewn ffibroblastau croen dynol diwylliedig sy'n agored i ymbelydredd UV a hydrogen perocsid. Arch Dermatol Res. 2017; 309(4): 285-303.
25. De Raedt T, et al. Manteisio ar wendidau celloedd canser i ddatblygu therapi cyfunol ar gyfer tiwmorau a yrrir gan ras. Cell Cancr. 2011; 20(3):400–413.
26. Zhang X, et al. Monitro perocsidiad lipid o fewn celloedd ewyn trwy stiliwr lysosome-targedadwy a chymarebau. Cemeg rhefrol. 2015; 87(16):8292–8300.
27. Wei CY, et al. Mae dadansoddiad seiliedig ar fiowybodeg yn datgelu MFSD12 uchel fel hyrwyddwr allweddol o amlhau celloedd a tharged therapiwtig posibl mewn melanoma. Oncogene. 2019; 38(11): 1876-1891.
28. Aldini G, et al. N-Acetylcysteine fel asiant torri gwrthocsidiol a disulfide: y rhesymau pam. Rhydd Radic Res. 2018; 52(7):751–762. 29. Abu-Remaileh M, et al. Mae metabolomeg lysosomaidd yn datgelu rheoleiddio V-ATPase- a mTOR-ddibynnol ar alllif asid amino o lysosomau. Gwyddoniaeth. 2017; 358(6364):807–813.
30. Zhou J, et al. Marwolaeth celloedd imiwnogenig mewn therapi canser: ysgogwyr presennol a rhai sy'n dod i'r amlwg. J Cell Mol Med. 2019; 23(8): 4854-4865. 31. Sharma G, et al. Mae ataliad PPT1 yn gwella gweithgaredd antitumor gwrthgorffynnau gwrth-PD-1 mewn melanoma. Mewnwelediad JCI. 2020; 5(17): e133225.
32. Mehnert JM, et al. BAMM (awtoffagi BRAF ac ataliad MEK mewn melanoma): treial cam I/II o dabrafenib, trametinib, a hydroxychloroquine mewn melanoma mutant BRAFV datblygedig. Canser Clin Res. 2022; 28(6): 1098-1106. 33. Loi M, et al. Mae proteinau macroautophagi yn rheoli lefelau dosbarth I MHC ar gelloedd dendritig ac yn siapio ymatebion celloedd T gwrth-feirysol CD8(+). Cynrychiolydd Cell 2016; 15(5): 1076-1087.
34. Jouandin P, et al. Mae symud cystein lysosomal yn siapio ymateb TORC1 a thwf meinwe i ymprydio. Gwyddoniaeth. 2022; 375(6582):eabc4203.
35. Schwalfenberg GK. N-acetylcysteine: adolygiad o ddefnyddioldeb clinigol (hen gyffur gyda thriciau newydd). J Nutr Metab. 2021; 2021: 9949453.
36. Cwrw LA, et al. Darganfod biomarcwyr serwm beichiogrwydd ectopig yn systematig gan ddefnyddio proffilio protein 3-D ynghyd â meintioli heb label. J Proteome Res. 2011; 10(3):1126–1138. 37. Goldman AR, et al. Yr effaith sylfaenol ar y proteome o garsinoma celloedd clir ofarïaidd treigledig ARID1A yw is-reoleiddio'r llwybr mevalonate ar y lefel ôl-drawsysgrifol. Proteomeg Cell Mol. 2016; 15(11):3348–3360.
38. Mae Cox J, Mann M. MaxQuant yn galluogi cyfraddau adnabod peptidau uchel, cywirdeb màs amrediad ppb unigol, a meintioli protein ar draws y proteome. Nat Biotechnol. 2008; 26(12): 1367-1372.
39. Cox J, et al. Andromeda: peiriant chwilio peptid wedi'i integreiddio i amgylchedd MaxQuant. J Proteome Res. 2011; 10(4): 1794-1805.
40. Cox J, et al. Meintioliad cywir ar draws y proteome heb label trwy oedi wrth normaleiddio ac echdynnu cymhareb peptid uchaf, a elwir yn MaxLFQ. Proteomeg Cell Mol. 2014; 13(9): 2513-2526.
41. Tyanova S, et al. Llwyfan cyfrifiannol Perseus ar gyfer dadansoddiad cynhwysfawr o ddata (prote)omics. Dulliau Nat. 2016; 13(9):731–740.
42. Tyanova S, Cox J. Perseus: llwyfan biowybodeg ar gyfer dadansoddiad integredig o ddata proteomeg mewn ymchwil canser. Dulliau Mol Biol. 2018; 1711: 133-148.
43. Alicea GM, et al. Mae newidiadau ym metabolaeth lipidau ffibroblast oedrannus yn achosi ymwrthedd i gell melanoma sy'n dibynnu ar oedran i therapi wedi'i dargedu trwy'r cludwr asid brasterog FATP2. Canser Discov. 2020; 10(9): 1282-1295.
44. Ran FA, et al. Peirianneg genom gan ddefnyddio system CRISPR-Cas9. Nat Protoc. 2013; 8(11):2281–2308.
45. Liu P, et al. Meintioli amlygiad calreticulin sy'n gysylltiedig â marwolaeth celloedd imiwnogenig. Dulliau Enzymol. 2020; 632: 1-13.
