Gweithgarwch Diliwio Melanin o Ensymau Gwrthocsidiol, Glutathione Peroxidase, Thiol Peroxidase, A Catalase

Cyswllt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Gyeongchan Jeon¹· Chinhan Kim²· DU Min Cho²· Ee Taek Hwang³· Hyung Seo Hwang⁴· Jiho Min¹

Haniaethol

Melanin yw'r ffactor pwysicaf i bennu lliw croen. Mae llawer o ymdrechion ymchwil yn cael eu gwneud i ddadelfennu'r cyfansoddion melanin sydd eisoes wedi'u cynhyrchu mewn croen ar gyfer harddwch. Ymchwiliodd yr ymchwil hwn i effeithiau lleihau lliw melanin y tri ensym gwrthocsidiol, Glutathione peroxidase (GPX), Thiol peroxidase (TPX), a Catalase, mewn ffracsiwn lysosomaidd. Cafodd hydoddiant melanin ei drin â'r ensymau a hydrogen perocsid, yna'i adweithio am 48 h. Roedd GPX a TPX yn dadliwio melanin, a rhyngddynt, roedd GPX yn fwy effeithlon, ond nid oedd Catalase yn effeithiol. Roedd GPX hefyd yn atal cynhyrchu melanin mewn celloedd melanoma B16F10. Mae GPX, sy'n bresennol ym mron pob micro-organebau, yn chwarae rhan bwysig yn y mecanwaith amddiffyn cellog gan rywogaethau ocsigen adweithiol. Yn ogystal, nid oedd yn sytotocsig ond roedd yn sylweddol effeithiol wrth ddad-liwio lliw melanin. Felly, yn y maes biolegol a microbiolegol, mae ei bosibilrwydd o gael ei ddefnyddio mewn cosmetig gwynnu croen yn uchel.

Geiriau allweddol Melanin · Glutathione peroxidase (GPX) · Thiol peroxidase (TPX) · Catalase · B16F10 · Lysosome

Mae cistanche yn gynhwysyn sy'n gwynnu'r croen.

Rhagymadrodd

Mae wyneb glân yn un o elfennau hanfodol harddwch i bobl fodern, yn enwedig mae Asiaid yn frwdfrydig am groen gwyn. Cyfansoddyn melanin yw'r ffactor pwysicaf wrth bennu lliw croen. Mae'n wahanol i eumelanin sydd â lliw du neu frown, a pheomelanin, sy'n arwain at arlliw pinc i goch [1]. Mae cyfansawdd melanin yn cael ei syn-theseiddio gan ocsidiad tyrosin mewn celloedd melanocyte, sydd i'w cael yn haen waelodol yr epidermis; a phrif rôl y pigment hwn yn y croen yw amddiffyn y dermis trwy rwystro ymbelydredd uwchfioled niweidiol [2, 3]. Fodd bynnag, os oes gormod o gyfansoddion melanin yn bresennol yn y croen, mae'n gwneud y croen yn dywyll ac yn aflan, a gall achosi hyperpigmentation, fel melasma [4].

Bu llawer o astudiaethau yn ymwneud â chosmetigau gofal croen sy'n datrys y problemau hyn, ond mae gan y rhan fwyaf o'r colur gwynnu croen a ddatblygwyd ar hyn o bryd swyddogaeth i atal synthesis melanin trwy sawl mecanwaith, fel rhwystro ocsidiad tyrosin, neu belydr UV a all hyrwyddo synthesis melanin [5]. Mae'r cynhyrchion hyn yn cymryd amser hir i fod yn effeithiol, ac nid ydynt yn effeithiol ar gyfer symptomau penodol, megis hyperbigmentation [6]. Ar hyn o bryd, dull nodweddiadol o dynnu melanin sydd eisoes wedi'i wneud yw triniaeth laser [7]. Os datblygir deunyddiau a all ddatrys y problemau hyn heb weithdrefnau o'r fath, bydd ganddynt ddefnyddioldeb mawr yn y maes biolegol a chosmetig.

Mewn ymchwil flaenorol, fe wnaethom geisio dod o hyd i ffordd o ddadliwio'r cyfansoddion melanin a gynhyrchwyd eisoes. Cafwyd adroddiadau ymchwil ynghylch cydberthynas lysosom a melanin. Mae'n debygol iawn bod keratinocytes gwahaniaethol yn arbennig yn diraddio'r melanosomau anghynhenid ​​yn unol â'r math o swyddogaethau awtoffagi sylfaenol sy'n rheoli maint yr organynnau cellog, neu'n cael gwared ar yr organynnau diffygiol, megis perocsisome [8]. Mae'r llwybr awtoffagig, o cytoplasm i lysosomau, yn chwarae rhan sylweddol yn nirywiad melanosomau mewn epidermalkeratinocytes dynol [9]. Mae'r data hyn yn darparu tystiolaeth bod ensymau penodol lysosomaidd yn cyfrannu at ddiraddiad melanin. Yn flaenorol, canfuwyd gweithgaredd lleihau lliw melanin o ensym mewn ffracsiwn lysosomaidd, cymhleth sy'n cynnwys hydrolysadau i ddadelfennu deunydd gwastraff a malurion cellog mewn perocsisomau a lysosomau [10, 11]. Roedd y papurau hwn yn astudio effeithiau'r tri ensym a ddewiswyd, Glutathione peroxidase, Thiol peroxidase, Catalase, mewn ffracsiwn lysosomaidd i leihau lliw melanin. Mae'r perocsidasesau hyn yn amddiffyn rhag difrod celloedd a achosir gan rywogaethau ocsigen adweithiol (ROS), ac maent yn bresennol ym mhob ewcaryotau [12].

Mae rhywogaethau ocsigen adweithiol (ROS) yn cael eu ffurfio fel sgil-gynnyrch naturiol o fetaboledd arferol ocsigen mewn celloedd, a gellir eu cynyddu gan straen amgylcheddol. Gall ROS a gynhyrchir yn helaeth niweidio celloedd. Mae effeithiau niweidiol ROSon y gell fel a ganlyn [12, 13]: difrod DNA orRNA, ocsidiad asidau brasterog amlannirlawn mewn lipidau, ocsidiad asidau amino mewn proteinau, a dadactifadu ocsideiddiol ensymau penodol trwy ocsidiad cofactors. Mae'r celloedd yn niwtraleiddio y ROS gan system gwrthocsidiad i atal difrod meinwe o'r fath. Yn y system hon, mae'r superoxideanion a gynhyrchir gan y metaboledd yn ddinistriol iawn; er ei fod yn cael ei drawsnewid i hydrogen perocsid gan Superoxide dismutase (SOD), mae'r hydrogen perocsid yn dal yn adweithiol. Mae'r hydrogen perocsid yn cael ei drawsnewid i H2O byCatalase, a'i fwyta wrth gynhyrchu Glutathionedisulfide (GSSG) o Glutathione trwy gatalysis GPX. Mae TPX yn gweithio'n debyg i GPX [13].

Ymchwiliodd yr astudiaeth hon i effaith dadliwio melanin tri ensym gwrthocsidiol, GPX, TPX, a Catalase. O ganlyniad, roedd GPX a TPX yn effeithiol wrth leihau lliw melanin. Yn eu plith, nid oedd gan GPX unrhyw sytowenwyndra ar y crynodiad gorau posibl o weithgaredd dadliwio melanin, ac roedd yn atal synthesis melanin i bob pwrpas. Felly, mae'n darparu tystiolaeth bod GPX yn chwarae rhan bwysig yn thema decolorization melanin o ffracsiwn lysosomal, nid yn unig gweithgaredd gwrthocsidiol, ac yn cynnig y potentialof asiant gwynnu cosmetig newydd fel ensym sengl.

Defnyddiau a Dulliau

Perocsidasau a Pherocsidas Assay Gweithgaredd

Pennwyd crynodiad y tri pherocsidas (Glutathione Peroxidase, Thiol Peroxidase, a Catalase) trwy becyn prawf (pecyn assay Peroxidase, D2PD-100, QuantiChromTM) a brynwyd gan Bioassay Systems. Prynwyd Glutathione peroxidase 2 (GPX2, NBP1-78,824, Novus) a Thiol peroxidase (TPX, NBP1-78,805, Novus) gan Novus, aCatalase (9001-05-2, Sigma-Aldrich ) a brynwyd oddi wrth Sigma-Aldrich.

Mae'r pecyn assay hwn yn defnyddio H2O2 a llifyn rhoddwr electron sy'n ffurfio resorufin yn ystod y perocsidas. Perfformiwyd yr assay ar dymheredd ystafell (RT), a mesurwyd dwyster y lliw ar 570 nm. Cafodd y perocsidasau eu hadweithio â'r lliw rhoddwr electron gyda 0.6 y cant o hydrogen perocsid am 10 munud yn RT. Ar ôl adwaith, ychwanegwyd yr adweithydd stop, a mesurwyd amsugnedd y sampl gan sbectrophotometreg microplate. Cyfrifwyd y gweithgaredd fel a ganlyn:

Gweithgaredd perocsidas=RSAMPLE −RBLANK × [Resorufin](𝜇M) × Cyfrol Adwaith(𝜇L)RRESORUFIN −RH2 O t(min) Sample Vol(𝜇L)

(U/L). Bydd un uned (U) o ensym yn cataleiddio ffurfiant 1 μmole resorufin y munud o dan yr amodau assay. Yma mae RSAMPLE, RBLANK, RRESORUFIN, a RH2O yn amsugno'r Sampl, Sampl Blank, Resorufin, a Water, yn y drefn honno; ac n yw'r ffactor gwanhau sampl. Yr [Resorufin] ar gyfer yr assay hwn yw 50 μM. Y Cyfrol Adwaith yw 100μL, a'r Vol Sampl yn yr astudiaeth hon yw 10 μL.

Datliwio Melanin gan Glutathione Peroxidase (GPX), Thiol Peroxidase (TPX), a Catalase

Mae'r hydoddiant melanin yn cynnwys {{0}}.1 mM PBS (hallt ffosffadadwy, pH: 7.0) a phowdr melanin (Synthetig, Sigma) a baratowyd trwy ocsidiad tyrosin gyda hydrogen perocsid. Mesurwyd y cynnwys melanin gan yr amsugnedd ar 450 nm. Er mwyn pennu'r crynodiad melanin, paratowyd cromlin safonol o safon ddilys o melanin synthetig (R2=0.999, data heb ei ddangos).

I wirio'r dad-liwio melanin, adweithiwyd RT ar hydoddiant melanin 100 ppm yn cynnwys (50 i 1000) μU/L Peroxidases (GPX, TPX, Catalase) gyda hydrogen perocsid 1 mM, a'i fesur bob dydd. Pennwyd gwerth decolorization melanin trwy dynnu'r crynodiad melanin ar ôl yr adwaith, o'r gwerth cychwynnol.

Mae Cistanche yn atal synthesis melanin.

Diwylliant Cell

Prynwyd celloedd melanoma llygod B16F10 (KCLB 80008) o Fanc Llinell Cell Corea (KCLB, Seoul, Korea). Cafodd y celloedd eu meithrin yng Nghanolig Eryr Addasedig Dulbecco (DMEM) sy'n cynnwys 4500 mg/L glwcos, 4 mM l-glutamin, 1 mM pyruvate sodiwm, yr ychwanegwyd 10 y cant o serwm buchol ffetws (FBS), 20 mM HEPES, 1 y cant penisilin, ato. a deorwyd y celloedd mewn cyflwr lleithiedig yn cynnwys 5 y cant o CO2 ar 37 gradd. Cyfnewidiwyd y cyfrwng bob 2 ddiwrnod (ch), a chynaeafwyd y celloedd trwy ddefnyddio hydoddiant trypsin / EDTA.

Assay Hyfywedd Cell (MTT Assay)

Cadarnhawyd effaith wenwynig glutathione peroxidase ar gell mela-noma B16F10 gan assay MTT, dull cyffredinol a ddefnyddir i bennu effaith sampl ar hyfywedd cell ymlynu. Mae'r assay hwn yn defnyddio 3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-deuffenyl tetrazolium bromid (MTT) y gellir ei leihau i fformazan gan mitocondriaidd ensym mewn cell hyfyw. Cafodd y 3 × 103 o gelloedd eu hadu fesul ffynnon mewn 96-plât ffynnon, a'u deor am 24 awr. Yna ychwanegwyd sampl toen yn dda, a'i ddeor am 72 h. Ar ôl hynny, cyfnewidiwyd y cyfrwng i un sy'n cynnwys 0.5 mg/ml o MTT, a'i ddeor am 2 h. Nesaf, tynnwyd yr adweithydd llifyn MTT, a diddymwyd y formazan a gynhyrchwyd gan DMSO am 30 munud. Yn olaf, cafodd y crynodiadau o formazan eu mesur ar 570 nm gan ddefnyddio sbectrophotometreg microplate. Cyfrifwyd hyfywedd celloedd fel a ganlyn: hyfywedd cell ( y cant ) { { 20 }} (Asample − gwag) / (Acontrol − Abak) * 100.

cistanche yn Hindi

Assay Cynnwys Melanin

Cafodd y celloedd 3 × 105 B16F10 eu hadu fesul ffynnon mewn 6-plât ffynnon, a'u deor am 24 awr i gadw. Cyfnewidiwyd cyfrwng pob ffynnon gydag un yn cynnwys crynodiad amrywiol o ensym a 10 nM -MSH, yna deorwyd am 72 h. Ar ôl hynny, golchwyd y ffynhonnau i gyd â byffer DPBS, a'u cynaeafu gan ddefnyddio datrysiad trypsin / EDTA 0.5 y cant. Mae'r pelenni o gelloedd a gafwyd drwy centrifugation eu lysed gyda 200 μL o 1 N NaOH yn cynnwys 10 y cant DMSO am 1 awr ar 80 gradd . Yn olaf, mesurwyd y cynnwys melanin lysed gan yr amsugnedd ar 450 nm. Pennwyd effeithlonrwydd atal cynhyrchu melanin yr ensym o'i gymharu â rheolaeth gadarnhaol gan ddefnyddio 100 mg / mL o arbutin.

Canlyniadau

Gweithgaredd Peroxidase o Glutathione Peroxidase (GPX), Thiol Peroxidase (TPX), a Catalase

Mae'r astudiaeth hon yn ymchwil estynedig i gymhwyso triniaeth ffracsiynau lys-osomaidd ar gyfer dad-liwio cyfansoddion melanin in vitro ac in vivo. Mewn astudiaeth flaenorol, canfuom fod ffracsiwn lysosomaidd sydd wedi'i ynysu o gelloedd Hela, S. cerevisiae, wy iâr yn cael yr effaith o leihau lliw melanin, ac mae'rroedd effeithlonrwydd decolorization melanin yn gysylltiedig â gweithgaredd peroxidase y ffracsiwn lysosomal ffracsiwn di-bilen rhwymo microsomal, gan gynnwys lysosomau a per- ocsisomau. Er mwyn cadarnhau effaith lleihau lliw melanin peroxidases, dewiswyd tri peroxidases, Glutathione peroxidase (GPX), Thiol peroxidase (TPX), a Catalase. Mae'r ensymau hyn yn chwarae rhan bwysig wrth leihau straen ocsideiddiol a achosir gan rywogaethau ocsigen adweithiol mewn celloedd [14].

Pennwyd gweithgaredd yr ensymau hyn gan becyn assay (pecyn assay Peroxidase, D2PD-100, QuantiChrom™). Roedd y dull hwn yn seiliedig ar ocsidiad llifyn rhoddwr electronau sy'n ffurfio lliw pinc yn ystod yr adwaith peroxidase [15]. Mynegwyd y gweithgaredd peroxidase gan ddefnyddio'r unedau canlynol: 1 Uned=1 U=ffurfio 1 µmole resorufin y munud o dan yr amodau assay. Mae Tabl 1 yn crynhoi gweithgaredd a chrynodiad y tri perocsidas, GPX, TPX, a Catalase.

Gweithgaredd Diliwio Melanin o Glutathione Peroxidase (GPX), Thiol Peroxidase (TPX), a Catalase

I gadarnhau effaith dad-liwio melanin y perocsi- dasau, cafodd hydoddiant melanin 100 ppm ppm ei drin â 1 mM hydrogen perocsid a (50 i 1000) crynodiad µU/L o bob perocsidas. Adweithiwyd y samplau am 2 ddiwrnod yn RT, yna o'u cymharu â'r crynodiad cychwynnol. Mae Ffigur 1 yn dangos y gostyngiad melanin ar ôl 48 h. Mae Ffigur 1 yn dangos y dystiolaeth bod gan TPX a GPX weithgaredd dad-liwio melanin. Ni chafodd y catalas unrhyw effaith ar leihau lliw melanin (Ffig. 1a). Roedd y TPX yn effeithiol wrth ddadliwio cyfansoddion melanin, ac roedd yr effeithlonrwydd orau pan gafodd ei drin mewn crynodiad o 1 µU/mL (Ffig. 1b). Roedd gan y GPX hefyd weithgaredd lleihau lliw melanin, a oedd orau ar grynodiad o 0.2 µU/mL, a gostyngodd yn raddol ar grynodiadau uwch (Ffig. 1c). Mae'r gwerth hwn yn cynrychioli gostyngiad lliw melanin gwell o 175 y cant, o'i gymharu â'r rheolaeth sy'n cael ei drin â hydrogen perocsid yn unig. Roedd y GPX yn fwy effeithlon o ran crynodiad a gweithgaredd peroxidase, o'i gymharu â TPX. Triniaeth 0.2 µU/mL GPX ac 1 mM hydrogen perocsid idatrysiad melanin wedi'i ddad-liwio 13 y cant o 100 ppm melanin for4 d (Ffig.2). Fodd bynnag, ni ddangosodd GPX na TPX unrhyw effaith lleihau lliw o dan absenoldeb hydrogen perocsid (data heb ei ddangos).

Tabl 1 Data penodol o'r ensymau, Glutathione Peroxidase 2, Thiol Peroxidase a Catalase

Effaith Hyfywedd Cell Glutathione Peroxidase (GPX) a H2O2on B16F10

Cadarnhawyd effaith GPX ar hyfywedd melanomacells B16F10 gan assay MTT, cyn y prawf ataliad melanin syn-thesis. Er mwyn dod o hyd i'r crynodiad cywir o hydrogen perocsid i'w drin, aseswyd Cytotoxicity trwy driniaeth â hydrogen perocsid am 72 h mewn crynodiadau gwahanol. O dan y crynodiad o 0.1 mM, nid oedd gan H2O2 wenwyndra celloedd i'r celloedd am 72 h, tra ar y crynodiad uwch na 1 mM, gwelwyd gwenwyndra mawr. (Ffig. 3a). Yna aseswyd effaith GPX ar oroesiad celloedd ym mhresenoldeb 0.1 mM hydrogen perocsid, nad oedd yn sytotocsig. Nid oedd gan y GPX unrhyw sytowenwyndra i gelloedd B16F10 islaw'r crynodiad o 0.5 μU/mL, a oedd yn effeithiol mewn astudiaethau melanindliwio (Ffig. 3b).

Ffig. 1Y gostyngiad lliw melanin cymharol o'i gymharu â thrin hydrogen perocsid yn unig.

Effaith Synthesis Melanin Glutathione Peroxidase (GPX) a H2O2on mewn Celloedd Melanoma B16F10

Fe wnaethom ymchwilio i effaith GPX, a oedd yn fwyaf effeithiol ar ddadliwio melanin, ar synthesis melanin mewn mel-anocytes. Mae Ffigur 4 yn dangos y cynnwys melanin mewn celloedd melanoma B16F1 a gafodd eu trin gyda phob sampl am 72 h. Y driniaeth â 0.05 μU/mL o GPX a 0.1 mM H2O2 a ysgogodd yr ataliad mwyaf o felanogenesis o 43 y cant o gymharu â rheolaeth (triniaeth gyda -MSH yn unig). Roedd hyn 153 y cant yn uwch na'r rheolaeth gadarnhaol (triniaeth gydag Arbutin a -MSH), a 22 y cant yn uwch na hydrogen perocsid heb ensym, tra nad oedd triniaeth GPX yn dangos gostyngiad dramatig melanin yn absenoldeb hydrogen peroxidealso yn cefnogi'r farn hon (data heb ei ddangos). O ganlyniad, rhwystrodd GPX gynhyrchu cyfansoddion melanin, ond roedd melaninsynthesis mewn celloedd yn cael ei effeithio'n fwy gan hydrogen peroxidethan gan GPX.

Trafodaeth

Yn yr astudiaeth hon, canfu ein hymchwilwyr y crynodiad gorau posibl ac effaith GPX, TPX, a Catalase, ensymau gwrthocsidiol sy'n lleihau straen ocsideiddiol mewn celloedd, ar ddadliwio cyfansoddion melanin. O ganlyniad i arbrofion allgellog gan ddefnyddio cyfansoddion melanin wedi'u syntheseiddio, mae GPX a TPX yn cael effaith dadliwio melanin, ond nid yw Catalasedoes. Mae adroddiadau y gall ensymau sy'n diraddio lignin mewn rhai ffyngau, fel laccas, lignin peroxidase, ddadelfennu melanin ym mhresenoldeb hydrogen perocsid [16-18]. Trwy'r astudiaeth hon, cadarnhawyd bod yr ensymau gwrthocsidiol, sydd ym mhob ewcaryotau a nid ensymau sy'n diraddio lignin, mae ganddynt weithgaredd dadliwio melanin. Er y gallai GPX a TPX hefyd leihau lliw melanin ym mhresenoldeb hydrogen perocsid, mae gan yr ensymau hyn y posibilrwydd o weithredu fel rhan fawr o fecanwaith decolorization melanin y ffracsiwn lysosomal.

Cafodd GPX, a oedd fwyaf effeithiol i leihau melanin colorin vitro, ei drin â chelloedd melanoma B16F10 i bennu ei effaith ar synthesis melanin. Mewn melanomacells B16F10, nid oedd GPX yn sytotocsig mewn crynodiadau a oedd yn effeithiol wrth ddad-liwio cyfansoddion melanin, a chrynodiad hydrogen perocsid a gafodd ei drin gyda'i gilydd oedd 0.1 mM, heb unrhyw wenwyndra. Roedd trin hydrogen perocsid yn atal y synthesis melanin yn fawr, ac wrth weithio gyda GPX, roedd yr effeithlonrwydd yn well, er nad oedd unrhyw ddibyniaeth ar y cyffur yn canolbwyntio. Gan fod hydrogen perocsid yn cael ei fwyta'n gyflym gan ensymau, gellir dehongli po uchaf yw'r crynodiad o ensym i'w drin, yr isaf yw'r ataliad o synthesis melanin gan hydrogenperocsid. Mae'r ffaith na ddangosodd triniaeth GPX ostyngiad dramatig mewn melanin yn absenoldeb hydrogen perocsideal hefyd yn cefnogi'r farn hon (data heb ei ddangos). O ganlyniad, rhwystrodd GPX gynhyrchu cyfansoddion melanin, ond roedd melaninsynthesis mewn celloedd yn cael ei effeithio'n fwy gan hydrogen peroxidethan gan GPX. Mae'r canlyniadau hyn yn awgrymu bod ensymau gwrthocsidiol inducemelanin diraddio mewn awtoffagy mecanweithiau sy'n treulio melanosomau.

tabledi cistanche

Am fwy o wybodaeth, cliciwch yma.

Casgliad

Mae ein hastudiaeth yn dangos bod Glutathione peroxidase (GPX) aThiol peroxidase (TPX) yn cyfrannu at ddad-liwio melanin, a bod GPX yn atal synthesis melanin i bob pwrpas. Mae'r canlyniadau'n cefnogi'r ddamcaniaeth bod ensymau gwrthocsidiol yn achosi diraddiad melanin mewn mecanweithiau awtoffagy sy'n treulio melanosomau. I ddod i gasgliad pendant, mae'n bosibl y bydd angen astudiaeth ar themacaniaeth treuliad melanosom mewn celloedd croen, keratinocyte, a melanocyte.