RHAN 1 Cistanche Deserticola Polysacarid Yn Atal Colled Esgyrn a achosir gan OVX mewn Llygod ac Osteoclastogenesis a achosir gan RANKL
Mar 02, 2022
Rhagymadrodd
Mae osteoporosis - afiechyd a nodweddir gan ostyngiad mewn màs esgyrn, microstrwythur meinwe esgyrn annormal, mwy o freuder esgyrn, a thorri asgwrn (De Martinis, Di Benedetto, Mengoli, a Ginaldi, 2006) - ar hyn o bryd yn effeithio ar fwy na 200 miliwn o bobl ledled y byd ac yn cyflwyno archwiliad meddygol a sylweddol sylweddol. baich economaidd-gymdeithasol ar gymdeithas fodern (Strom et al., 2011). Mae triniaeth glinigol osteoporosis yn canolbwyntio'n bennaf ar amnewid hormonau, bisffosffonad, neu therapi denosumab. Mae'r dulliau hyn yn effeithiol ond maent yn achosi sgîl-effeithiau hirdymor megis y risg bosibl o ganser y fron a thoriadau ffemwr annodweddiadol (Black, Bauer, Schwartz, Cummings, a Rosen, 2012; Rachner, Khosla, & Hof-Bauer, 2011). Felly, mae angen brys i archwilio cyffuriau a all nid yn unig yn atalosteoporosisond hefyd yn meddu ar lai o sgîl-effeithiau annymunol.
Cistanche deserticola(CD), tonic a bwyd meddyginiaethol a ddefnyddir yn eang yn Tsieina, a elwir yn "ginseng anialwch", yw'r coesyn suddlon sych gyda deilen ar raddfa oC. deserticolaYC Ma (Gu, Yang, & Huang, 2016) ac mae ganddo amrywiol ac effeithiolffarmacolegolgweithgareddau, megis rheoleiddio imiwnedd, gwrth-ocsidiad, a gwrth-osteoporosiseiddo (Hu et al., 2020; Li et al., 2012; Zhang et al., 2014). Roedd astudiaethau blaenorol ar sylweddau gweithredol CD ar driniaeth osteoporosis yn canolbwyntio'n bennaf arffenylethanoidglycosidau(Li, Jiang, & Gu, 2018; Xu, Zhang, Wang, Yao, & Ma, 2017). Fodd bynnag, mae'r CD hefyd yn cynnwys cydrannau effeithiol eraill megis iridoids, lignans,polysacaridau(Wang, Zhang, & Xie, 2012). Mae cymhwysiad clinigol meddygaeth Tsieineaidd traddodiadol (TCM) yn bennaf yn decocting dŵr.Polysacaridauyn gydrannau hydawdd mewn dŵr ac yn fwyaf tebygol o fod yn brif gydrannau ffarmacodynamig TCM. Adroddwyd yn wyllt bod gan polysacaridau a dynnwyd o TCM wrth-osteoporosiseffaith ac ychydig o sgîl-effeithiau annymunol, a ddefnyddiwyd yn gyffredinol mewn clinigau (ee, polysacaridau a dynnwyd o Epimedium brevicornum (Zheng, He, Wu, Cai, & Wei, 2020), Achyranthes bidentata (Zhang, Zhang, Zhang, Wang, & Yan, 2018), a Morinda officinalis (Yan et al., 2019)). Felly, rydym yn damcaniaethu hynnyCistanche deserticolapolysacarid(CDP) a dynnwyd o CD fod yn gyffur a allai fod yn ddiogel ar gyfer trin osteoporosis.
Yn nodweddiadol, mae atsugniad esgyrn a ffurfio esgyrn yn cynnal cydbwysedd deinamig yn ystod ailfodelu esgyrn mewn cydweithrediad â sawl math o gelloedd, gan gynnwys osteoclastau, osteoblastau, celloedd leinin esgyrn, ac osteocytes (Kular, Tickner, Chim, & Xu, 2012). Gall toriad yn y cydbwysedd hwn arwain at amrywiaeth o afiechydon metabolaidd esgyrn, megisosteoporosis(Zhu et al., 2018) ac osteosclerosis (Ihde et al., 2011). Osteoclastau, fel celloedd gwahaniaethol pen sy'n deillio o'r llinach mononiwclear/macroffag, yw'r unig gelloedd â swyddogaeth atsugniad esgyrn (Teitelbaum, 2000). Mae dau cytocin allweddol sy'n cymryd rhan yn y gwahaniaethu osteoclast ac aeddfedu (Koga et al., 2004): ffactor ysgogol cytref macrophage (M-CSF) ac actifydd derbynnydd ffactor niwclear κB (NF-κB) ligand (RANKL). Mae M-CSF yn cyfryngu gwahaniaethu bôn-gelloedd hematopoietig yn epilyddion osteoclast ac yn hyrwyddo gwahaniaethu osteoclastau trwy ddadreoleiddio mynegiant y derbynnydd RANK (Takayanagi, 2007). Mae rhwymo RANKL a RANK ar wyneb y gell osteoclast yn arwain at y canlynol: (1) recriwtio moleciwlau addasydd signalau fel ffactor 6 sy'n gysylltiedig â derbynyddion TNF (TRAF6); (2) activation o dargedau lluosog i lawr yr afon, gan gynnwys NF- κB a kinases protein-activated mitogen (MAPKs); a (3) uwchraddio lefelau mynegiant ffactor niwclear celloedd T actifedig, cytoplasmig 1 (NFATc1) (Liu et al., 2019; Yamashita et al., 2007). Mae actifadu'r llwybrau signalau hyn yn rheoleiddio mynegiant genynnau osteoclast yn uniongyrchol, gan gynnwys asid phosphatase 5 (Acp5) [amgodio ffosffatase asid sy'n gwrthsefyll tartrate (TRAcP)], matrics metalloproteinase 9 (MMP9), a cathepsin K (CTSK) (Boyle, Simonet). , & Lacey, 2003). Felly, mae atal llwybrau signalau sy'n gysylltiedig â gwahaniaethu osteoclast a achosir gan RANKL yn ddull therapiwtig posibl ar gyfer osteoporosis.
Yn yr astudiaeth hon, ein nod oedd pennu effeithiau triniaeth CDP ar yr ovariectomized (OVX) a achosirosteoporosismodel llygoden in vivo ac ar weithgaredd osteoclast a achosir gan RANKL in vitro, gyda ffocws ar fynegiant genynnau osteoclast-benodol ac actifadu NFATc1 a llwybrau signalau NF-κB a MAPKs. Gall ein canfyddiadau roi mewnwelediad newydd i botensial CDP fel cyffur diogel ac effeithiol ar gyfer trin osteoporosis.
Am fwy o wybodaeth cysylltwch â:Joanna.jia@wecistanche.com
2. Deunyddiau a dulliau
2.1. Cemegau a chasglu samplau
Prynwyd CD (rhif 180801) gan Anhui Jishun Traditional Chinese Medicine Co, Ltd. (Anhui, Tsieina) a'i nodi gan yr Athro Haibo Huang o Ysgol Gwyddorau Fferyllol, Prifysgol Meddygaeth Tsieineaidd Guangzhou, Guangzhou, Tsieina. Prynwyd tabledi valerate Estradiol gan Bayer (Leverkusen, Gogledd-Rhine-Westphalia, yr Almaen). Cyfrwng hanfodol lleiaf wedi'i addasu gan alffa
(-MEM) a serwm buchol ffetws (FBS) gan Gibco (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, UDA). Prynwyd penisilin/streptomycin a phecyn staenio TRAcP gan Solarbio (Beijing, Tsieina). Cafodd llygoden ailgyfunol M-CSF a llygoden ailgyfunol RANKL eu caffael o Systemau Ymchwil a Datblygu (Minneapolis, MN, UDA). Prynwyd platiau wedi'u gorchuddio â hydroxyapatite gan Corning Life Sciences (St. Lowell, MA, UDA). Y prif wrthgyrff ar gyfer NFATc1 a CTSK (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, UDA); IκB- , t65, P-p65, t38, P-p38, ERK1/2, P-ERK1/2, JNK, a P-JNK (Technoleg Signalau Cell, Dan- vers, MA, UDA); a chafwyd -actin (CWBIO, Beijing, Tsieina) hefyd. Roedd yr adweithyddion eraill a ddefnyddiwyd yn yr astudiaeth hon o radd ddadansoddol, a chafodd y dŵr ei buro gan system puro dŵr Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, UDA).
2.2. echdynnu CDP
Roedd y CD yn falu i bowdr mân a'i gymysgu ag ether petrolewm deirgwaith i'w drechu. Casglwyd y gweddillion solet trwy hidlo ac yna ei sychu ar dymheredd ystafell. Mae'rpolysacaridaueu tynnu o'r samplau wedi'u trin ymlaen llaw deirgwaith gyda dŵr am 2 h, wedi'u crynhoi, wedi'u gwaddodi trwy ychwanegu ethanol anhydrus i grynodiad terfynol o 80 y cant (v / v), a'u storio ar 4 ◦C am 24 h. Casglwyd y gwaddodion trwy allgyrchu ar 3000 rpm am 20 munud, eu toddi mewn dŵr distyll, a'u puro (tynnu proteinau rhydd) gan ddefnyddio dull Sevag (Zhao et al., 2019). Mae'r adennillpolysacaridaueu dialyzed, sychu, a'u storio nes eu defnyddio ymhellach. Ymhellach, dangosodd canlyniadau cyfansoddiad cemegol fod cyfanswm cynnwys siwgr, asid wronig, sylffad, a phrotein CDP yn 67.63 0.98 y cant , 21.05 0.49 y cant , 1.{{7 }} .24 y cant , ac 8 . { { 10 }} .36 y cant .
Dangoswyd cyfansoddiad monosacarid a dadansoddiad isgoch trawsnewid Fourier o CDP yn Ffig. 1 a 2 Atodol.
2.3. Model llygoden osteoporosis a achosir gan OVX
Cymeradwywyd yr holl arbrofion anifeiliaid gan Bwyllgor Moeseg Anifeiliaid Prifysgol Meddygaeth Tsieineaidd Guangzhou (cymeradwywyd SYXK 2019-0202). Cyflenwyd llygod C57BL/6 benywaidd tri deg wythnos oed C57BL/6 gan Ganolfan Experiment Animal Centre Prifysgol Meddygaeth Tsieineaidd Guangzhou. Ar ôl ymgynefino am 1 wythnos, rhoddwyd llawdriniaeth ffug i un grŵp o lygod (Grŵp Sham), tra bod y llygod a oedd yn weddill yn destun llawdriniaeth ofariectomi (grŵp OVX). Ar ôl llawdriniaeth, caniatawyd i'r llygod wella am 1-wythnos. Yna, rhannwyd llygod a fodelwyd yn llwyddiannus ar hap yn 5 grŵp, gyda 6 llygod fesul grŵp:
(1) Grŵp Sham: wedi'i drin â dŵr distyll, (2) grŵp OVX: wedi'i drin â dŵr distyll, (3) grŵp OVX E2 (E2): wedi'i drin â 0.13 mg/kg tabledi valerate estradiol, (4) ) Grŵp dos isel CDP OVX (CDP-L): wedi'i drin â 300 mg / kg o CDP, (5) grŵp dos uchel OVX CDP (CDP-H): wedi'i drin â 600 mg / kg o CDP. Roedd dŵr distyll, E2, neu CDP yn cael ei weinyddu trwy gludydd unwaith y dydd. Aberthwyd pob llygod ar ôl y cyfnod triniaeth o 12- wythnos (Ffig. 1A). Cafodd y grothau eu casglu a'u pwyso, a chasglwyd y tibias chwith ar gyfer archwiliadau dilynol. Casglwyd samplau gwaed cyfan a'u centrifugio ar 5000 rpm ar gyfer
15 mun am 4 ◦C. Roedd y supernatants serwm yn cael eu hallsugno a'u storio yn
—80 ◦C tan ddadansoddiad pellach.
2.4. Dadansoddiad tomograffeg micro-gyfrifiadurol (micro-CT) a histomorphometreg esgyrn
Cafodd y tibias chwith eu gosod gyda 4 y cant o baraformaldehyd am 48 h ac yna eu gosod mewn tiwbiau centrifuge sy'n cynnwys halwynog arferol. Sganiwyd y samplau sefydlog gydag offeryn micro-CT Skyscan 1172 (Bruker micro-CT, Skyscan, Kontich, Gwlad Belg) gan ddefnyddio'r gosodiadau canlynol: foltedd, 80 kV; ffynhonnell gyfredol, 100 μA; Al, hidlydd 0.5 mm; picsel
maint, 9.76 μm; a cham cylchdro, 0.6◦. Mae nifer o baramedrau'r
asgwrn trabeciwlaidd, gan gynnwys dwysedd mwynau esgyrn (BMD), ffracsiwn cyfaint esgyrn (BV/TV), arwyneb asgwrn fesul cyfanswm cyfaint (BS/TV), nifer trabeciwlaidd (Tb. N), a bylchiad trabeciwlaidd (Tb. Sp) eu mesur gan ddefnyddio Meddalwedd CT- Analyser® (Bruker micro-CT, Skyscan). Cynhyrchwyd delweddau tri dimensiwn gan ddefnyddio meddalwedd CTVol (Bruker micro-CT. Skyscan).
Yn dilyn dadansoddiad micro-CT, dad-galchwyd y tibias chwith mewn hydoddiant EDTA 14 y cant a'i ymgorffori mewn paraffin i'w dorri. Rhannwyd y samplau yn adrannau 5 µm gan ddefnyddio microtome cyn yr arbrofion staenio hematocsilin ac eosin (H&E) a TRAcP. Archwiliwyd yr adrannau lliw a'u dogfennu gan ddefnyddio microsgop Olympus CX 31 (Olympus Optical Co., Ltd, Tokyo, Japan).
Cistancheyn gallu gwella dwysedd esgyrn a lleddfu osteoporosis
2.5. Dadansoddiad serwm
Penderfynwyd ar y crynodiadau calsiwm (Ca) a ffosfforws (P) yn unol â'r cyfarwyddiadau pecyn a ddyluniwyd gan Sefydliad Biobeirianneg Nanjing Jiancheng (Nanjing, Tsieina). Dadansoddwyd lefelau TRAcP-5b a RANKL yn y serwm gan ddefnyddio pecyn TRAcP-5b ELISA (CUSABIO, Wuhan, Tsieina) a phecyn RANKL ELISA (Cloud-CloneCorp., Wuhan, China), yn y drefn honno.
2.6. Assay osteoclastogenesis in vitro
Cafodd BMMs eu hynysu oddi wrth tibia a ffemur 6-llygod benywaidd wythnos oed C57BL/6. Cafodd y celloedd ynysig eu meithrin mewn cyfrwng -MEM sy'n cynnwys 25 ng/ml M-CSF, 10 y cant FBS, ac 1 y cant penisilin/streptomycin. Ar ôl cyrraedd cydlifiad, cafodd y BMMs (1 104 celloedd/ffynnon) eu hadu mewn 96-blatiau ffynnon a'u trin â CDP ym mhresenoldeb 50 ng/mL RANKL. Disodlwyd y cyfrwng a'r CDP bob 2 ddiwrnod. Ar ôl 7 diwrnod, gosodwyd y celloedd â 4 y cant o baraformaldehyd a'u staenio am bresenoldeb TRAcP. Cafodd nifer yr osteoclastau, a ddiffinnir fel celloedd TRAcP-positif gyda thri neu fwy o gnewyllyn, ei gyfrif a'i ddogfennu gan ddefnyddio microsgop golau.
2.7. Assay amlhau celloedd
Cafodd y BMMs (1 × 104 cell/ffynnon) eu hadu mewn 96-plât ffynnon a'u deor dros nos. Yn dilyn hyn, cafodd y celloedd eu trin â chrynodiadau gwahanol o CDP (0, 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10, 20, a 40 µg/mL) am 48 h. Canfuwyd a dadansoddwyd cydlifiad y gell gan ddefnyddio IncuCyte ZOOM® (Essen BioScience, Ann Arbor, MI, UDA), system delweddu celloedd byw deinamig amser hir, amser real.
2.8. Assay resorption hydroxyapatite
Cafodd y BMMs ({{0}} celloedd/ffynnon) eu hadu mewn plât wedi'i orchuddio â hydroxyapatite, eu trin â CDP yn y crynodiadau a nodir (0, 5, a 10 µg/mL), a'u meithrin yn gyflawn -MEM yn cynnwys 25 ng/mL M-CSF a 50 ng/mL RANKL. Ar ôl 7 diwrnod, golchwyd y celloedd gyda hydoddiant cannydd 10 y cant i gael gwared ar gydrannau'r gell. Cafodd y delweddau o ardaloedd atsugniad hydroxyapatite eu dal gan ddefnyddio IncuCyte ZOOM® a'u dadansoddi gan ddefnyddio meddalwedd ImageJ (NIH, Bethesda, MD, UDA) (Abramoff, Magelhaes, & Ram, 2003).
2.9. Ynysu RNA a dadansoddiad PCR meintiol-trosysgrifiad gwrthdro amser real (RT-qPCR).
Cafodd y BMMs ({{0}} celloedd/ffynnon) eu hadu mewn 6-plât ffynnon a'u hysgogi â RANKL ac M-CSF ym mhresenoldeb CDP mewn crynodiadau gwahanol (0, 5, a 10 µg/mL) am 5 diwrnod. Cafodd cyfanswm RNA ei ynysu o gelloedd neu feinwe esgyrn llygod gan ddefnyddio adweithydd TRIzol (Sigma- Aldrich). Cafodd DNA cyflenwol ei syntheseiddio o gyfanswm RNA 2 µg gan ddefnyddio pecyn trawsgrifiad gwrthdro (TransGen Biotech, Beijing, Tsieina). Paratowyd yr adweithiau RT-qPCR gan ddefnyddio PerfectStart™ Green qPCR SuperMix (TransGen Biotech) a'u canfod gan system ABI 7500 (Cymhwysol
Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, UDA). Gosodwyd y paramedrau beicio ar gyfer PCR fel a ganlyn: 95 ◦C am 5 munud, ac yna 40 cylch o 95 ◦C am 15 s, a 60 ◦C am 30 s. Dangosir y paent preimio penodol a ddefnyddiwyd yn Nhabl 1, a chafodd maint pob genyn targed ei normaleiddio i GAPDH (rheolaeth fewnol).
2.10. Dadansoddiad o blotiau gorllewinol
Cafodd y BMMs ({{{0}} celloedd/ffynnon) eu hadu mewn 6-plât ffynnon. Ar gyfer arbrofion cwrs amser byr, cafodd y celloedd eu deor ymlaen llaw gyda'r crynodiadau gwahanol o CDP (0, 5, a 10 µg/mL) am 1 h, ac yna eu trin â 50 ng/mL RANKL am 30 munud . Am gwrs amser hir, ysgogwyd y celloedd gyda 50 ng / mL RANKL ar ddiwrnodau 3, 5, a 7 ym mhresenoldeb CDP (0, 5, a 10 µg / mL). Echdynnwyd cyfanswm y proteinau gan ddefnyddio byffer lysis RIPA (CWBIO). Gwahanwyd proteinau gan 10 y cant SDS-PAGE a'u trosglwyddo i bilenni PVDF. Cafodd y pilenni eu rhwystro â llaeth sgim 5 y cant ar dymheredd yr ystafell am 2 awr, wedi'i ddeor â llaeth cynradd
gwrthgyrff dros nos ar 4 ◦C, ac yna gyda'r uwchradd cyfatebol
gwrthgyrff am 1.5 h. Datblygwyd y pilenni gan ddefnyddio adweithyddion ECL (Millipore Corp., Billerica, MA, UDA), a chymerwyd delweddau gan ddefnyddio System Delweddu Chemiluminescence Tanon 5200 (Tanon Science and Technology, Shanghai, China).
Cistancheyn gallu gwella dwysedd esgyrn
2.11. Canfod trawsleoli NFATc1 gan ddefnyddio prawf imiwnfflworoleuedd
Cafodd y BMMs eu hadu ar {{0}}gorchuddion ffynnon, eu hysgogi â RANKL ac M-CSF, a'u trin â CDP 10 µg/mL am 5 diwrnod. Cafodd y celloedd eu gosod gyda 4 y cant o baraformaldehyd am 15 munud, eu golchi deirgwaith gyda PBS, a'u treiddio gyda 0.1 y cant Triton X-100 am 10 munud. Cymysgwyd y celloedd â serwm gafr 10 y cant (CWBIO) a'u deor am 2 awr. Yn dilyn hynny, deorwyd y celloedd gyda'r gwrthgorff cynradd dros nos ar 4 ◦C ac yna gyda Alexa Fluor 488 gwrth-lygoden gwrth-lygoden eilaidd gwrth-lygoden (Abcam, Caergrawnt, MA, UDA) yn y tywyllwch am 1 h. Cafodd y gorchuddion eu golchi â PBS, eu gosod yn Prolong Gold Antifade Reagent gyda 4′, 6-dimidino-2-ffenyl in-dole (DAPI) (Solar), a
arolygwyd gan ddefnyddio Zeiss LSM 800 gyda microsgop confocal Airyscan (Carl Zeiss, Oberkochen, yr Almaen).
2.12. Dadansoddiad ystadegol
Dadansoddwyd yr holl ddata arbrofol gan ddefnyddio meddalwedd ystadegol SPSS 25. (IBM Corporation, Armonk, NY, USA). Mynegir y data ar gyfer astudiaethau anifeiliaid a chelloedd fel modd ± SEM a modd ± SD, yn y drefn honno. Mae'r canlyniadau'n defnyddio dadansoddiad un ffordd o amrywiant neu brawf-t Myfyriwr. Ystyriwyd bod gwerthoedd p < 0.05="" yn="" ystadegol="">
Cistancheyn gallu lleihauapoptosisa gwella asgwrndwysedd
