Rhan 1 Effeithiau Ataliol Glycosidau Ffenylethanol O Cistanche Tubulosa Ar Serwm Buchol Ffibrosis Hepatig a Achosir gan Albwmin mewn Llygod Mawr

Cyswllt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-bost:audrey.hu@wecistanche.com

Haniaethol

Cefndir:Cistanche tubulosa yn feddyginiaeth lysieuol Tsieineaidd traddodiadol a ddefnyddir yn helaeth ar gyfer rheoleiddio imiwnedd.Glycosidau ethanol ffenyl o cistanche(CPhGs) o'r planhigyn hwn yw'r deunyddiau mwyaf effeithiol. Nod yr astudiaeth hon oedd gwerthuso effeithiau ataliol a therapiwtig CPhGs ar ffibrosis hepatig a achosir gan BSA mewn llygod mawr a mecanweithiau moleciwlaidd cysylltiedig sy'n cynnwys celloedd stelad hepatig. Defnyddiwyd Biejiarangan (BJRG), meddyginiaeth lysieuol Tsieineaidd draddodiadol arall, fel rheolaeth gadarnhaol. Dulliau: Mewn arbrofion in vivo, rhannwyd 75 o lygod mawr SD ar hap yn 6 grŵp: normal (wedi'i drin â dŵr distyll), model (wedi'i drin gan BSA), cyffur positif (wedi'i drin gan BSA a BJRG 60{{29} } mg/kg/dydd), a grwpiau CPhG wedi'u trin â BSA ynghyd â CPhG (125, 250, a 500 mg/kg/day). Mynegeion yr afu a'r ddueg, lefelau serwm o aminotransferase aspartate (AST), alanine aminotransferase (ALT), asid hecsadecenoic (HA), laminin (LN), procollagen math III (PCIII), colagen math IV (IV-C), hydroxyproline ( Mesurwyd hyp), a thrawsnewid ffactor twf 1 (TGF- 1) mewn afu/iau llygod mawr. Aseswyd graddau histopatholegol ar gyfer ffibrosis yr afu ar gyfer pob grŵp gan ddefnyddio H&E a staen trichrome Masson. Cafodd mynegiant TGF- 1, colagen I (Col-I), a cholagen III (Col-III) eu pennu gan ddull staenio imiwn-histocemegol. Gwerthuswyd yr effeithiau hyn ymhellach yn vitro trwy bennu lefelau mynegiant NF-κB p65 a Col-I trwy ddadansoddiadau PCR amser real meintiol. Archwiliwyd mynegiant protein Col-I hefyd gan blotio gorllewinol. Canlyniadau: Roedd pob grŵp dos (125, 250, a 500 mg/kg/dydd) o CPhGs wedi lleihau mynegai'r afu a'r ddueg yn sylweddol, wedi gostwng lefelau serwm ALT, AST, HA, LN, PCIII, IV-C, Cynnwys TGF- 1 (P < 0.01,="" p="">< 0.01,="" a="" p="">< 0.01),="" a="" chynnwys="" hyp.="" fe="" wnaeth="" cphgs="" hefyd="" liniaru'n="" sylweddol="" ar="" chwyddo="" celloedd="" yr="" afu="" ac="" atal="" necrosis="" hepatocyte="" ac="" ymdreiddiad="" celloedd="" llidiol="" yn="" effeithiol.="" dangosodd="" canlyniadau="" imiwnohistocemegol="" fod="" cphgs="" wedi="" lleihau="" mynegiant="" tgf-="" 1="" yn="" sylweddol="" (p=""><0.01, p=""><0.01, a="" p=""><0.01), col-i,="" a="" col-iii.="" dangosodd="" effeithiau="" in="" vitro="" cphgs="" (100,="" 75,="" 50,="" a="" 25="" ug/ml)="" ar="" hsc-t6="" fod="" cphgs="" wedi="" lleihau="" mynegiant="" mrna="" yn="" sylweddol="" o="" nf-κb="" p65="" a="" col-i,="" ac="" roedd="" cphgs="" hefyd="" yn="" is-reoleiddio="" mynegiant="" protein="" col-i.="" casgliadau:="" mae="" cphgs="" yn="" cael="" effaith="" ffibrosis="" gwrth-hepatig="" sylweddol,="" a="" gellir="" eu="" defnyddio="" fel="" cyfryngau="" hepatoprotective="" ar="" gyfer="" trin="" ffibrosis="">

Geiriau allweddol: Ffibrosis hepatig, Cistanche tubulosa, glycoside Phenylethanol, BSA Chemokine, Atal a therapi.

Cefndir

Mae ffibrosis hepatig yn ymateb iachâd clwyf i anaf difrifol i'r afu sy'n digwydd yn pathogenesis hepatitis cronig a achosir gan ffactorau amrywiol. Y ffactorau hyn yw haint firaol, cam-drin alcohol, colestasis, a chlefydau metabolaidd ac hunanimiwn [1-3]. Mae croniad cynyddol o fatrics allgellog (ECM) a llai o ailfodelu yn amharu ar bensaernïaeth arferol yr afu, gan arwain at ffibrosis hepatig [4]. Mae ffibrosis hepatig yn hanfodol mewn clefyd cronig yr afu ac yn aml mae'n datblygu'n sirosis a charcinogenesis na ellir ei wrthdroi. Ar hyn o bryd, nid oes unrhyw ddulliau na chyffuriau effeithiol ar gyfer trin ffibrosis hepatig. Felly, mae'n frys dod o hyd i gyffur ffibrosis gwrth-hepatig a fydd yn gwanhau dilyniant anaf i'r afu i ffibrosis a chanser.Cistanche tubulosaMae W (o'r teulu Orobanchaceae) yn blanhigyn parasitig sy'n cael ei dyfu'n eang yn rhanbarth deheuol Xinjiang yn Tsieina [5] . Mae pobl fel arfer yn ei ddefnyddio i fywiogi'r arennau, maethu'r gwaed, ymlacio'r coluddyn, ac oedi henaint. Mae wedi'i restru'n swyddogol yn y Pharmacopoeia Tsieineaidd [6]. Mae C. tubulosa yn cynnwys amrywiaeth o gydrannau gweithredol. Mae'r rhain yn cynnwysGlycosidau ethanol ffenyl o cistanche(CPhGs), iridoidau, a polysacaridau. Fel un o lawer o gydrannau gweithredol ynC. tubulosa, Mae CPhGs wedi arddangos effeithiau gwrthocsidiol, gwrth-blinder, niwro-amddiffynnol a gwrthlidiol argyhoeddiadol mewn astudiaethau in vivo ac in vitro [7]. Yn y blynyddoedd diwethaf, adroddwyd bod CPhGs (Glycosidau ethanol ffenyl o cistanche) yn cael effeithiau hepatoprotective. Y mecanweithiau posibl sy'n sail i'r effeithiau hyn yw chwilota radicalau rhydd, amddiffyn pilenni hepatig, imiwnreoleiddiad, ataliad apoptosis, atal mynegiant HBsAg a HBeAg, ac atal dyblygu DNA HBV ac eraill [8-11]. Fodd bynnag, ychydig o astudiaethau yn y llenyddiaeth sy'n mynd i'r afael ag effaith ffibrosis gwrth-hepatig graffeg. Felly, nod yr astudiaeth hon oedd ymchwilio i effaith ffibrosis gwrth-hepatig GPhCs trwy ddefnyddio model o albwmin serwm buchol (BSA) ffibrosis hepatig a achosir gan lygod mawr. Ymchwiliwyd i fecanweithiau moleciwlaidd cysylltiedig mewn celloedd HSC-T6.

Dulliau

Cemegau ac adweithyddion

Prynwyd pecyn Hydroxyproline (hydrolysis alcalïaidd) (Lot: 20140616) gan Sefydliad Biobeirianneg Nanjing Jiancheng (Tsieina). Prynwyd citiau ELISA brechdanau Rat TGF- 1 (Lot: 238240615) oddi wrth Lianke Biotech Co., Ltd. (Tsieina). Darparwyd gwrthgorff Rabbit Anti-Collagen I (Lot: 140619), gwrthgorff Rabbit Anti-Collagen III (Lot: 980788 W), a Rabbit Anti-TGF- 1 gwrthgorff (Lot: 140619) gan Beijing Biosynthesis Biotechnology Co., LTD (Tsieina). Wedi'i amgáu â serwm defaid arferol (hylif gweithio) (Lot: WP141214), prynwyd PV-6000 (Lot: WK141225), a phecyn DAB (Lot: K136621D) gan Zhongshan Golden Bridge Biotech Co., Ltd. (Tsieina) . Perfformiwyd canfod gwrthgyrff cynradd trwy ddefnyddio 2. Datrysiad gwrthgyrff (Alk-Phos. Conjugated, Anti-abbit) a 2. Datrysiad gwrthgyrff (Alk-Phos. Conjugated, Anti-mouse) (lot: 272387) a brynwyd gan Invitrogen Company (UDA) ). Prynwyd albwmin serwm buchol (BSA) (Lot: SLBG8239V) gan Sigma (UDA). Cyn ei ddefnyddio, paratowyd BSA ar 18 g/L mewn halwynog arferol, tynnwyd y bacteria trwy hidlo, a storiwyd BSA ar 4 gradd. Roedd cymhorthydd anghyflawn Freund yn cynnwys 1 g o lipid o wallt defaid (Lot: AF0220LA14, Shanghai yuan ye Bio-Technology Co, Ltd (Tsieina,) yn gymysg â 2 g paraffin hylif (Lot: 20130815, Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd (Tsieina,), wedi'i sterileiddio mewn awtoclaf stêm, a'i storio ar raddau 4. Cafwyd y cyffur positif BJRG fel tabledi Biejiarangan o Inner Mongolia Furui Medical Science Co, Ltd (Tsieina) Paratowyd stociau cyffuriau BJRG trwy hydoddi Tabledi BJRG mewn dŵr distyll ar grynodiad o 600 mg/kg.

Deunyddiau planhigion

C. tubulosa(teulu Orobanchaceae) ei brynu o ranbarth Minfeng yn Xinjiang yn Tsieina. Dilyswyd y deunydd gan yr ymchwilydd Jun Zhao, Labordy Allweddol ar gyfer Meddygaeth Uighur, Sefydliad Materia Medica o Xinjiang. Adneuwyd sbesimenau talebau yn Sefydliad Materia Medica o Xinjiang.

Paratoi GRhGau(Glycosidau ethanol ffenyl o cistanche)

Risomau wedi'u sychu a'u sleisio oC. tubulosa(6.{1}} kg) yn olynol dan adlif dair gwaith gyda 70 y cant ethanol, a chafodd y toddydd ei dynnu i gynhyrchu'r echdyniad ethanol. Cafodd echdynion ethanol eu puro trwy ddefnyddio resin AB-8 i gael y glycosidau ethanol ffenyl (CPhGs). Diddymwyd toddiannau stoc o CPhGs a ddefnyddir ar gyfer gwahanol grwpiau dos mewn astudiaethau anifeiliaid (500 mg / kg, 250 mg / kg, a 125 mg / kg, yn y drefn honno) mewn cellwlos carboxymethyl 0.5 y cant (5 g / L) (halen sodiwm).

Meintioli GRhGau(Glycosidau ethanol ffenyl o cistanche)

Pennwyd cynnwys dwy gydran (echinacoside ac acteoside) yn y CPhGs gan HPLC gan ddefnyddio dull a adroddwyd yn flaenorol (Zhang et al. 2004) [12]. Perfformiwyd HPLC trwy ddefnyddio LC Shimadzu-10HPLC wedi'i gyfarparu â synhwyrydd UV. Colofn ODS Phenomenex Gemini oedd colofn HPLC (250 × 4.6 mm, 5 μm). Roedd y cyfnod symudol isocratig yn cynnwys methanol-acetonitrile-1 y cant o asid asetig (15:10:75, v/v/v). Roedd Elution am 40 munud a chadwyd y gyfradd llif ar 0.6 mL/munud. Cadwyd tymheredd y golofn yn gyson ar 30 gradd. Roedd canfod UV yn 334 nm.

Anifeiliaid a llinell gell HSC-T6

[Gradd SPF] prynwyd llygod mawr Sprague-Dawley (SD) gwrywaidd sy'n oedolion iach (180-220 g) o Ganolfan Anifeiliaid Prifysgol Feddygol Xinjiang, Rhif Trwydded: SCXK (Newydd) 2011-0004. Roedd llygod mawr yn cael eu bwydo â chow di-pathogen penodol (SPF). Cymeradwywyd yr holl weithdrefnau sy'n ymwneud â'r arbrofion anifeiliaid gan Bwyllgor Moeseg Anifeiliaid Ysbyty Cysylltiedig Cyntaf Prifysgol Feddygol Xinjiang. Roedd llygod mawr yn cael eu cadw mewn cewyll o dan amodau amgylcheddol rheoledig (25 gradd a chylch golau/tywyll 12 h) ac roedd ganddynt fynediad am ddim i fwyd safonol pelenni llygod mawr a dŵr tap. Roedd llygod mawr yn gyfarwydd cyn triniaeth. Cafwyd llinell gell stelate hepatig llygod mawr anfarwoledig, HSC-T6, gan Wuhan Procell Gene Biotechnology Co., LTD. (Wuhan, Tsieina). Cafodd celloedd HSC-T6 eu meithrin yng Nghlwcos Canolig Addasedig (Glwcos Uchel) Dulbecco (DMEM, Beijing, Tsieina) wedi'i ategu â serwm buchol ffetws 10 y cant (Gibco, De America), penisilin 100 IU/ml, a streptomycin 100 ug/ml (Beijing). , Tsieina) mewn deorydd llaith ar 37 gradd gyda 5 y cant CO2.

Anafiadau a thriniaethau i'r iau a achosir gan y BSA

Rhannwyd saith deg pump o lygod mawr SD ar hap yn chwe grŵp: Normal (wedi'i drin â dŵr distyll), model (BSAtreated), cyffur positif (wedi'i drin gan BSA ynghyd â BJRG 600 mg / kg / dydd), a BSA wedi'i drin ynghyd â CPhGs.(Glycosidau ethanol ffenyl o cistanche)(125, 250, 5{{2{0}}0 mg/kg/ diwrnod). Roedd gan grwpiau a gafodd eu trin gan y BSA ynghyd â CPhGs (125, 250, 500 mg/ kg/diwrnod) 13 o lygod mawr ym mhob grŵp, ac roedd gan y grŵp arall 12 llygod mawr ym mhob grŵp. Rhennir y model anaf i'r afu a achosir gan BSA yn sensiteiddio sylfaenol ac yna ymosodiad imiwnolegol) [13]. Ac eithrio'r grŵp arferol, rhoddwyd pigiadau isgroenol lluosog i'r grwpiau eraill gyda 0.5 ml (9 mg/ml) cymhorthydd anghyflawn BSA Freund ar ddiwrnod 1, diwrnod 15, diwrnod 22, diwrnod 29, a diwrnod 36 ar gyfer sensiteiddio cynradd. Saith diwrnod ar ôl y pumed pigiad, cafwyd gwaed trwy plexws gwythiennau retinol y llygoden fawr a'i brofi am wrth-gyrff albwmin serwm. Canfuwyd gwrthgorff BSA mewn serwm llygod mawr trwy ddull tryledu agar dwbl. Perfformiwyd y pigiad ymosodiad trwy roi 0.4 ml o BSA mewn halwynog arferol oedd trwy'r wythïen caudal mewn llygod mawr gwrthgyrff-bositif BSA ddwywaith yr wythnos am ddeg gwaith. Crynodiadau ac amseroedd y pigiadau oedd 5.00, 5.50, 6.00, 6.50, 7.00, 7.50, 8.50, 9.00, 9.50 a 10.00 g/L ar ddiwrnod 46, diwrnod 50, diwrnod 53, diwrnod 57, diwrnod 60, diwrnod 64, diwrnod 67, diwrnod 71, diwrnod 74 a diwrnod 78, yn y drefn honno. Yn y grŵp arferol, defnyddiwyd saline arferol ar gyfer pigiadau imiwnolegol cynradd (sensiteiddio) ac eilaidd (ymosodiad) yn lle BSA, ac roedd amodau eraill yr un fath â'r rhai yn y grŵp model. Roedd y grŵp arferol yn rhoi dŵr distyll ar lafar gyda dos o 10 ml/kg/dydd. Rhoddwyd ateb CMC-Na 10 ml/kg/dydd ar lafar i'r grŵp model. Rhoddwyd BJRG 600 mg/kg/dydd i'r grŵp cyffuriau positif ar lafar. Y CPhG a gafodd ei drin gan yr Asiantaeth Sgiliau Sylfaenol a'r CPhGs (125,

250, a 500 mg/kg/dydd) yn cael eu gweinyddu ar lafar gyda CPhGs 125, 250, a 500 mg/kg/dydd(Glycosidau ethanol ffenyl o cistanche), yn y drefn honno. Parhaodd dosio llygod mawr bob dydd am bythefnos ar ôl y pigiad diwethaf. Ar ôl y cyfnod arbrofol, cafodd llygod mawr eu cyflymu am 12 awr cyn 10 y cant o hydrad cloral ac yna eu ewthaneiddio ar unwaith. Casglwyd samplau serwm o bob llygoden fawr a'u defnyddio ar unwaith. Cynaeafwyd iau at ddau ddiben: (1) cadw nitrogen hylifol ar gyfer citiau Hyp a (2) sefydlogi mewn 10 y cant o fformaldehyd ar gyfer arholiadau histolegol ac imiwn-histocemegol. Hyd cyfan yr astudiaethau anifeiliaid oedd 93 diwrnod.

Mynegeion yr afu a'r ddueg

Cafodd yr afu a'r ddueg eu dyrannu gan laparotomi a'u golchi â halwynau 4 gradd arferol. Ar ôl amsugno dŵr gormodol â phapur hidlo, cafodd yr afu a'r ddueg eu pwyso i gyfrifo'r mynegeion cyfatebol: Pwysau organ cymharol=màs organ (g) / màs corff unigol (g) × 100 y cant [14].

Arbrofion cell

Cafodd celloedd HSC-T6 eu platio mewn 96-plât ffynnon. I ddechrau, cafodd celloedd eu meithrin gyda DMEM yn cynnwys 10 y cant FBS am 48 h. Yna disodlwyd y cyfrwng gyda DMEM heb FBS i newynu'r celloedd am 12 h. Yna cafodd y celloedd eu meithrin gyda DMEM a oedd yn cynnwys 5.0 ng/mL TGF- 1 (heb FBS) am 24 h. Yn olaf, crynodiadau gwahanol o GRhGau(Glycosidau ethanol ffenyl o cistanche)(100ug/ml, 50ug/ml, a 25ug/ml), acteoside (6 ug/ml, 3 ug/ml, a 1.5 ug/ml), ac echinacoside (500ug/ml, 250ug/ml, a 125ug/ml) eu cynnal yn y plât mewn ffynhonnau pedwarplyg a'u deor am 48 h.

Dadansoddiad PCR amser real

Pennwyd lefel mynegiant mRNA NF-κB, p65, a cholagen I gan PCR amser real. Er mwyn pennu mynegiadau mRNA mewn celloedd HSC-T6, cafodd y celloedd (celloedd 4 × 105) eu hadu mewn platiau chwe ffynnon gyda 3 mL DMEM gyda 10 y cant FBS a'u deor dros nos ar 37 gradd a 5 y cant CO2, ac ar ôl hynny mae'r cyfryngau diwylliant celloedd eu newid i DMEM di-serwm. Nesaf, CPhGs(Glycosidau ethanol ffenyl o cistanche)(100 ug/ml, 50 ug/ml, a 25 ug/ml), acteoside (6 ug/ml, 3 ug/ml, a 1.5 ug/ ml), ac echinacoside (500 ug/ml , 250 ug/ml, a 125 ug/ml) eu hychwanegu at y ffynhonnau. Ar ôl 48 h o ddeor gyda CPhGs neu gyfansoddiadau monomerig, echdynnwyd cyfanswm RNA gan ddefnyddio adweithydd TRIzol (Invitrogen, UDA) a'i gynhyrfu'n egnïol â chlorofform am 15 s. Ar ôl eistedd ar dymheredd yr ystafell am 3 munud, cafodd y lysate ei allgyrchu ar 12,000 × g am 15 munud ar 4 gradd . Cafodd RNA yn y cyfnod dyfrllyd ei waddodi ag isopropanol, a throsglwyddwyd y cyfnod dyfrllyd uchaf i diwb microcentrifuge newydd. RNA ei waddodi drwy ychwanegu 0.75 y cant ethanol, ac ar ôl hynny y tiwb microcentrifuge a centrifuge ar 12,000 × g ar 4 gradd am ddim mwy na 5 munud. Tynnwyd y supernatant a sychwyd yr RNA ar dymheredd ystafell am 5-10 munud. Setiau penodol o breimwyr (Sangon, Shanghai, Tsieina) a ddefnyddiwyd i ymhelaethu ar lygod mawr -actin [GenBank: NM_031144.3], Collagen I [GenBank: NM_ 053304.1], a NF -κB p65 [GenBank: NM_199267.2] cynlluniwyd genynnau gan ddefnyddio Batch Primer 3. Roedd y preimwyr ymlaen (fw) a chefn (rv) fel a ganlyn: Collagen I (fw: GGA GAG AGC ATG ACC GAT GG , rv: DEDDF GGG TCT TGA GGT TGC CA), NF-κB p65 (fw: CAT ACG CTG ACC CTA GCC TG, rv: TTT CTT CAA TCC GGT GGC GA), -actin (fw: TAA GGC CAA CCG TGA AAA GAT G,rv: AGA GGC ATA CAG GGA CAA CAC A). Cafodd canlyniadau eu normaleiddio i mRNA y genyn cadw tŷ -actin fel rheolaeth fewnol ac fe'u cyflwynir fel lefelau mRNA cymharol. Perfformiwyd adweithiau gyda 8 μL iQ SYBR Green Supermix, 1 μL 10 pM primer pair, 8.5 μL dŵr distyll, a 2.5 μL cDNA. Perfformiwyd pob adwaith cadwyn polymeras o dan yr amodau canlynol: 95 gradd am 3 munud, yna 40 cylch o 10 s ar 95 gradd, 30 s ar 55 gradd, a 10 s ar 55 gradd - 95 gradd ar gyfer estyniad, ac yna mesuriad fflworoleuedd sengl . Disgrifiwyd y canlyniadau terfynol gyda'r gwerthoedd cymharol (2-ΔΔCt). Perfformiwyd cyfrifo a dadansoddi gan System Canfod PCR Amser Real iQ5.

Dadansoddiad o blotiau gorllewinol

Pennwyd lefelau mynegiant protein Collagen I (Abcam, Caergrawnt, DU, Rhif Celf: ab3471{0) gan blotio Gorllewinol [gyda -actin (Lot: 60008-1-lg; Proteintech, China) fel rheolaeth cadw tŷ. Paratowyd echdynion cell gyfan gan ddefnyddio byffer assay radioimmunoprecipitation (RIPA) (Thermo Scientific, UDA) gyda choctel atalydd proteas Halt 1 y cant (Thermo Scientific, UDA) a choctels atalydd atal ffosffatase 1 y cant (Thermo Scientific, UDA). Cafodd y crynodiad protein ei fesur a'i feintioli gan ddull Bradford [18]. Gwahanwyd protein (10-50 ug) ar gel SDS-PAGE 10 y cant a'i drosglwyddo i bilenni PVDF (Millipore, UDA). Cafodd pilenni eu rhwystro am 1 h ar dymheredd ystafell gyda 5 y cant o BSA, a chafodd y gwrthgyrff cynradd (gwrthgorff Anti-Colla gen I, gwanhad 1:200 neu mAb llygoden o -actin, gwanhad 1:5000) eu deor ar 4 gradd dros nos. Mae'r Alk-Phos cyfatebol. deorwyd gwrthgyrff eilaidd cyfun ar dymheredd ystafell. Yn olaf, golchwyd y pilenni dair gwaith gyda saline 1 × Tris-HCl gyda 0.1 y cant Tween 20, a chafodd signalau eu sganio a'u delweddu gan System Ddelweddu GEL DOC XR (Bio-Rad). Perfformiwyd dadansoddiad densitometrig ar y proteinau o ddiddordeb a'i normaleiddio i -actin gan feddalwedd GEL DOC Image Studio (Bio-Rad). -defnyddiwyd actin fel y rheolaeth fewnol.

Dadansoddiad ystadegol

Defnyddiwyd prawf normalrwydd Shapiro-Wilk a phrawf homogeneity amrywiant Levene i wirio normalrwydd a You et al. DARU Journal of Pharmaceutical Sciences (2015) 23:52 Tudalen 4 o 13homogenedd amrywiant. Defnyddiwyd dadansoddiad o amrywiant (ANOVA) wedi'i ddilyn gan brawf post hoc Tukey i nodi gwahaniaethau ystadegol data homogenaidd, a ddosberthir fel arfer. Defnyddiwyd prawf an-barametrig Kruskal-Wallis i ddadansoddi data nad yw'n cael ei ddosbarthu'n normal neu'n homogenaidd. Mynegwyd canlyniadau fel cymedrig ± SD. Gosodwyd arwyddocâd yn P < 2015.05.="" dadansoddwyd="" yr="" holl="" ddata="" gan="" feddalwedd="" spss="" 16.0="" (prifysgol="" feddygol="">

Canlyniadau

Penderfyniad meintiol ar GRhGau

Mae CPhGs yn C. tubulosa yn cynnwys dau glycosidau alcohol ffenylethyl, echinacoside, ac acteoside, a phenderfynwyd eu cynnwys yn y CPhGs gan ddadansoddiad HPLC (Ffig. 1) i fod yn 42.71 ± 0.42 y cant a 14.27 ± {{7 }}.18 y cant , yn y drefn honno.

Mynegeion yr afu a'r ddueg

Fel y dangoswyd Tabl 1, roedd mynegeion yr afu a'r ddueg yn y grŵp model wedi'u codi'n sylweddol [P < 0.01,="" p="">< 0.05].="" cafodd="" mynegeion="" yr="" afu="" a'r="" ddueg="" o'r="" cyffur="" positif="" bjrg="" a="" cphgs="" mewn="" gwahanol="" grwpiau="" dos="" eu="" lleihau'n="" sylweddol="" o="" gymharu="" â'r="" grŵp="" model="" [pliver="0.004," pliver="0.003," pliver="0." 004,="" pliver="0.005;" pspleen="0.017," pspleen="0.027," pspleen="0.024," pspleen="0.070," yn="" y="" drefn="" honno].="" roedd="" mynegeion="" yr="" afu="" a'r="" ddueg="" yn="" is="" na="" rhai'r="" grŵp="">

Effeithiau CPhGs ar ALT, gweithgareddau AST, a marcwyr ffibrosis yr afu

Yn yr astudiaeth bresennol, cynyddwyd lefelau serwm yr ensymau hepatig AST ac ALT yn sylweddol yn y grŵp model, gan adlewyrchu difrod hepatogellog mewn llygod mawr ffibrosis yr afu a achosir gan BSA. Fodd bynnag, mae'r arbrofion.

dangos bod triniaeth gyda BJRG (600 mg/kg) a CPhGs (125, 250, a 5{{10}}0 mg/kg) wedi lleihau'n sylweddol AST [PAST < 0.0{{60}}1,="" gorffennol="">< 0.001,="" gorffennol="">< 0.001,="" gorffennol="">< 0.001="" ,="" re="" spectively]="" a="" alt="" [palt="0.117," palt="0.139," palt="0.189," palt="0.255," yn="" y="" drefn="" honno]="" lefelau="" mewn="" llygod="" mawr="" ffibrosis="" hepatig="" .="" (tabl="" 2).="" cynyddwyd="" lefelau="" ha,="" ln,="" pc="" ac="" iv-c="" mewn="" llygod="" mawr="" model="" yn="" sylweddol="" [pha="">< 0.001,="" pln="">< 0.001,="" ppciii="0.002," piv-c="">< 0.001,="" yn="" y="" drefn="" honno].="" o'u="" cymharu="" â'r="" grŵp="" model,="" mae="" lefelau="" ha="" [pha="0.009," pha="0.007," pha="0.009," pha="0.023," yn="" y="" drefn="" honno],="" ln="" [pln="0.011," p="" ln="0.004," p="" ln="0.026," p="" ln="0.069," yn="" y="" drefn="" honno],="" pc="" iii="" [p="" pciii{="" {47}}.006,="" p="" pciii="0.067," p="" pciii="0.136," p="" pciii="0.296," yn="" y="" drefn="" honno],="" a="" iv-c="" [p="" iv-c="">< 0.001,="" p="" iv-c="">< 0.001,="" p="" iv-c="">< 0.001,="" p="" iv-c="">< 0.001,="" yn="" y="" drefn="" honno]="" mewn="" llygod="" mawr="" wedi="" gostwng="" yn="" sylweddol="" gan="" bjrg="" (600="" mg="" kg)="" a="" cphgs="" mewn="" gwahanol="" grwpiau="" dos="" (125,="" 250,="" a="" 500="" mg/kg)="" (tabl="" 3).cynnwys="" hyp="" a="" tgf-="" 1="" cafodd="" cynnwys="" colagen="" ei="" ganfod="" hefyd="" drwy="" fesur="" lefelau="" hyp="" ym="" meinwe'r="" afu.="" fel="" y="" dangosir="" yn="" nhabl="" 4,="" mae'r="" hyp="">roedd lefel yn y grŵp model yn sylweddol uwch na'r grŵp arferol, ond bu gostyngiad sylweddol yn y grŵp BJRG a'r gwahanol grwpiau dos CPhGs. Cynyddwyd crynodiad hepatig TGF{{0}} y grŵp model mewn llygod mawr [P < 0.001].="" o'u="" cymharu="" â'r="" grŵp="" model,="" bu="" gostyngiad="" sylweddol="" yn="" lefelau="" tgf-="" 1="" o'r="" cyffur="" positif="" a'r="" gwahanol="" grwpiau="" dogn="" cphg="" [p="" tgf-="" 1="">< 0.001,="" p="" tgf-="" 1="">< 0.001,="" p="" tgf-="" 1="">< 0.001,="" ptgf-="" 1="">< 0.001,="" yn="" ôl="" eu="" trefn].="" crynhoir="" y="" canlyniadau="" yn="" nhabl="">

Archwiliad histopatholegol

Mae arsylwadau o ddarnau arferol o feinwe'r iau wedi'u staenio â H&E a thrichrome Masson yn arddangos llabedau hepatig amlwg a sinwsoidau hepatig. Roedd strwythur meinwe'r afu yn y llygod mawr model yn anhrefnus, a disodlwyd meinwe'r afu a sinwsoidau hepatig gan lawer iawn o feinwe gyswllt. Fodd bynnag, canfuwyd mwy o sytosaernïaeth arferol a llai o feinwe gyswllt yn y grŵp triniaeth na'r rhai yn y grŵp model.

Staenio H&E

Yn y grŵp arferol, arsylwyd cywirdeb strwythurol lobule hepatig heb ardaloedd porth annormal a sinwsoidau hepatig. Roedd y cortynnau hepatig wedi'u trefnu'n drefnus, gyda'r craidd yn grwn ac yn glir. Mae'r cnewyllyn wedi'u lleoli yng nghanol y gell, gyda digonedd o cytoplasm. Dim ond ardal y porth sydd ag ychydig bach o feinwe ffibrog (Ffig. 2a). Yn y grŵp model, cafodd y strwythur lobular ei niweidio'n ddifrifol. Roedd celloedd yr afu yn dangos dirywiad dyfrllyd ysgafn, dirywiad balŵn yn bennaf a/neu ddirywiad brasterog. Arsylwyd hefyd ffurfio ymdreiddiad celloedd llidiol, hyperplasia meinwe ffibrog helaeth, ffurfio nifer fawr o'r septwm ffibrog, llabedi hollt, a lluosogiad sylweddol o gelloedd yr afu. Cadarnhaodd yr arsylwadau hyn lwyddiant sefydlu'r model anifail anaf imiwn llygod mawr o ffibrosis hepatig (Ffig. 2b). O'i gymharu â'r grŵp model, bu gostyngiad mewn ymdreiddiad celloedd llidiol yn y gwahanol CPhGs. Gwelwyd hefyd llai o necrosis a dirywiad brasterog celloedd yr afu yn ogystal â lleddfu ffibrosis. Roedd CPhGs wedi lliniaru patholeg ffibrosis hepatig a achosir gan BSA mewn llygod mawr yn sylweddol, wedi lleddfu chwyddo celloedd yr afu, ac yn atal necrosis hepatocyte ac ymdreiddiad celloedd llidiol yn effeithiol, gan awgrymu bod CPhGs yn cael effaith amddiffynnol ar ffibrosis hepatig llygod mawr a achosir gan BSA. (Ffig. 2c–f ). Staeniad trichrome Masson Yn y grŵp arferol, roedd meinwe'r iau yn normal. Dangosodd ardal y porth hepatig nifer fach o ffibrau colagen glas, ac roedd meinwe'r afu wedi'i strwythuro fel arfer (Ffig. 3a). O'i gymharu â meinwe afu y grŵp arferol, meinwe ffibrog amlhau gan y daflen ganolog ac ehangu i mewn i'r parenchyma afu. Ffibrau colagen wedi'u hymestyn a'u cysylltu a

gorchuddio'r llabed cyfan ac amgylchynu'r wythïen ganolog. Darparodd yr effeithiau hyn, ynghyd â ffibrosis hepatocyte, difrod strwythurol lobwlar, ffibrosis periportal, a ffurfio pseudolobule (Ffig. 3b) dystiolaeth bod y model wedi'i sefydlu. O'i gymharu â'r grŵp model, cafodd y ffibrau colagen yn y grŵp rheoli cyffuriau cadarnhaol eu hymestyn ychydig allan o'r ardal porth ymylol (Ffig. 3c). O'i gymharu â'r grŵp model, gostyngwyd y ffibrau colagen yn y gwahanol grwpiau dos CPhGs yn sylweddol, rhwystrwyd amlhau ffibr, a gostyngwyd yn sylweddol ymlediad meinwe ffibrog o fewn parenchyma'r afu. Roedd y canlyniadau hyn yn awgrymu bod CPhGs yn amddiffyn llygod mawr rhag ffibrosis hepatig a achosir gan y BSA (Ffig. 3d–f ).

Staenio imiwnohistocemegol

Yn bwysig, mae mynegiant colagen math I a math colagen III yn chwarae rhan hanfodol yn natblygiad ffibrosis hepatig, a gallai eu cynhyrchu a'u dyddodiad ym meinwe'r afu fod yn benderfynydd pwysig o effeithiolrwydd ffibrosis gwrth-hepatig. Crynhoir y canlyniadau yn Nhabl 5

Collagen math I

Mynegodd y grŵp arferol colagen math I yn bennaf mewn pibellau gwaed ac ardal y porth. Mynegodd y grŵp model ffibrosis fasgwlaidd math I colagen yn uchel mewn ardaloedd porthol. Yng ngofod Disse, gwelwyd staeniau colagen math I yn rhediadau neu fel dosbarthiad anghyson. Roedd colagen yn amgáu septa ffibrog i ffurfio pseudolobule. Yn yr arbrofion hyn, ffurfiwyd llai o septa ffibrog ar gyfer BJRJ (600 mg/kg) a gwahanol grwpiau dos o CPhGs (125, 250, a 500 mg/kg) [PCol I=0.002, PCol I {{ 6}}.001, PCol I=0.023, a P Col I=0.044, yn y drefn honno]. Datgelodd y canlyniadau hanner meintiol fod mynegiant eu math colagen I yn sylweddol is o gymharu â'r grŵp model (Ffig. 4).

Colagen math III

Mynegwyd colagen math III yn wan yn y grŵp arferol, ac roedd yr ardaloedd ymylol o amgylch y porth a'r gwythiennau hepatig yn dangos ychydig o felyn mân yn lle ffibrau parhaus (Ffig. 5a). Yn y grŵp model, roedd ffibrau colagen yn arddangos cordiau eang a thrwchus, gan nodi mynegiant cryf, wedi'i leoli'n bennaf yn yr ardaloedd porthol a meinwe ffibrog (Ffig. 5b). Roedd ffibrau colagen o BJRJ (600 mg/kg) a gwahanol grwpiau dos o CPhGs (125, 250, a 500 mg/kg) yn ffilamentaidd ac wedi'u dosbarthu o amgylch yr ardaloedd gwythïen ganolog a phorthladd. O'i gymharu â'r grŵp model, gostyngwyd y ffibrau colagen yn sylweddol, roedd y staenio yn welw ac yn denau, ac roedd staenio imiwn-histocemegol yn wan gadarnhaol (Ffig. 5c-f ). Mae'r canlyniadau lled-meintiol hyn yn dangos bod y celloedd a fynegir yn gadarnhaol yn y grwpiau dos cadarnhaol a gwahanol [PCol III=0.015, PCol III=0.001, PCol III=0.010, a Roedd P Col III=0.037, yn ôl eu trefn] yn wahanol i'r rhai yn y grŵp model.

TGF- 1

Ychydig iawn o fynegiant o TGIF{{125 a gafwyd yng nghelloedd arferol yr afu llygod mawr. Roedd mynegiant yn gyfyngedig i nifer fach o gelloedd rhyng-raniadol (Ffig. 6a). Yn y grŵp model, roedd mynegiant TGF- 1 wedi'i ddosbarthu'n eang yn ardal y porth, mannau ffibrog, celloedd stellate hepatig, celloedd llidiol, y wal sinwsoidal a cytoplasm. Roedd man porth penodol yn dangos mynegiant cadarnhaol iawn gyda staen melyn-frown (Ffig. 6b). Roedd ychydig bach o fynegiant yn ardal y porth a septa ffibrog o BJRJ (600 mg/kg) a gwahanol grwpiau dos o CPhGs (125, 250, a 500 mg/kg). Lleihawyd maint y staenio cadarnhaol yn y grwpiau hyn yn sylweddol o gymharu â'r grŵp model. Roedd staenio yn y celloedd interstitial yn y septa ffibrog a'r cytoplasm o gelloedd llidiol yn gostwng ( Ffig. 6c - f ). Datgelodd canlyniadau lled-feintiol fod BJRJ a gwahanol grwpiau dos o CPhGs [P TGF- 1=0.001, P TGF- 1 < 0.001,="" p="" tgf-="" 1="0.009," ptgf-="" 1="0" .004,="" yn="" y="" drefn="" honno]="" yn="" arwyddocaol="" o="" gymharu="" â'r="" grŵp="" model.="" fel="" y="" soniwyd="" yn="" gynharach="" yn="" yr="" erthygl,="" mae="" tgf-="" 1="" yn="" cytocin="" pwysig="" yn="" pathoffisioleg="" yr="">

ffibrosis, gan ysgogi cynhyrchu matrics allgellog [19]. Fe wnaethom ddangos bod lefel TGF- 1 wedi cynyddu yn y grŵp model mewn modd sy'n gyson â difrifoldeb ffibrosis yr afu. Roedd lefelau mynegiant TGF- 1 yn yr afu yn gyson â lefelau serwm TGF- 1. Mae hyn yn dangos y gall CPhGs leihau ffibrosis yr afu yn sylweddol oherwydd mynegiant TGF- 1 trwy gymryd rhan yn y synthesis a diraddio ECM. Gall mynegiant colagen math I, colagen math III, a TGF- 1 ganfod proses patholegol ffibrosis hepatig. Gostyngwyd eu lefelau mynegiant yn y grwpiau triniaeth yn sylweddol a dangoswyd y gall CPhGs wella gweithgaredd colagnase, gan gynnal cydbwysedd deinamig synthesis a diraddiad ECM yr afu, gan ohirio ac atal ffurfio ffibrosis yr afu.