Rhan 1: Mae Verbascoside yn Amddiffyn Celloedd Pancreatig yn Erbyn Straen ER
Mar 05, 2022
Cyswllt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-bost:audrey.hu@wecistanche.com
Alessandra Galli 1, ynghyd â , Paola Marciani 1, a hefyd , Algerta Marku 1, Silvia Ghislanzoni 1, Federico Bertuzzi 2, Rafaella Rossi 3, Alessia Di Giancamillo 3 , Michela Castagna 1 a Carla Perego 1,*
Crynodeb:
Mae tystiolaeth epidemiolegol sylweddol yn dangos bod diet sy'n llawn polyffenolau yn amddiffyn rhag datblygu diabetes math 2. Y glycoside ffenylethanoidverbascoside/acteoside, cyfansoddyn planhigion polyphenolig eang, mae ganddo nifer o briodweddau biolegol gan gynnwys gweithgareddau gwrthocsidiol cryf, gwrthlidiol a niwro-amddiffynnol. Nod yr ymchwil hwn oedd profi effeithiau posiblverbscosidear gelloedd pancreatig, targed na phrofwyd erioed o'r blaen. Deorwyd celloedd llygoden a dynolverbscoside(0.8–16 uM) am hyd at bum niwrnod a defnyddiwyd cyfuniad o dechnegau biocemegol a delweddu i asesu goroesiad a gweithrediad y gell o dan amodau arferol neu reticwlwm endoplasmig (ER) sy'n achosi straen. Gwelsom effaith amddiffynnol a oedd yn dibynnu ar ddosverbscosideyn erbyn straen ocsideiddiol mewn celloedd clonal a dynol. Datgelodd astudiaethau mecanyddol fod y polyphenol yn amddiffyn celloedd rhag camweithrediad cyfryngol ER-straen, gan fodiwleiddio actifadu cangen protein kinase reticulum kinase endoplasmig tebyg i RNA (PERK) o'r ymateb protein heb ei blygu a hyrwyddo deinameg mitocondriaidd. O ganlyniad, canfuwyd mwy o hyfywedd, swyddogaeth mitocondriaidd a chynnwys inswlin yn y celloedd hyn. Mae'r astudiaethau hyn yn darparu tystiolaeth bodverbscosideyn hybu gallu celloedd i ymdopi â straen ER, cyfrannwr pwysig o gamweithrediad celloedd a methiant mewn cyflyrau diabetig ac yn cefnogi potensial therapiwtig verbascoside mewn diabetes.
Geiriau allweddol:
verbscoside; polyffenolau; celloedd sy'n cynhyrchu inswlin; diabetes; UPR; straen ocsideiddiol; ER-straen; PERC; gwrthlidiol; mitocondria
1. Rhagymadrodd
Mae diabetes yn anhwylder cronig sy'n effeithio ar gannoedd o filiwn o bobl [1]. Mae etioleg wahanol yn nodweddu diabetes Math 1 (T1D) a Math 2 (T2D) ill dau yn cynnwys diffyg inswlin [2]. Mae inswlin yn rheoleiddio crynodiad glwcos plasma gan ysgogi cymeriant glwcos mewn celloedd cyhyrau a braster a modiwleiddio metaboledd glwcos yr afu. Mae argaeledd maetholion, hormonau, a mewnbynnau niwral yn rheoleiddio secretiad inswlin pancreatig ac yn cynnal crynodiadau glwcos yn y gwaed o fewn ystod ffisiolegol [3-5]. Felly, mae camweithrediad celloedd yn arwain at ddiabetes a nodweddir gan hyperglycemia ymprydio.
Mae T2D yn gyflwr cynyddol lle mae ymwrthedd inswlin a chamweithrediad celloedd yn gysylltiedig â'i gilydd a chododd tystiolaeth ddiweddar ddiddordeb yn rôl sylfaenol hanfodol celloedd i'r statws hyperglycemig [6,7]. Mewn pynciau gordew nad ydynt yn ddiabetig - mae celloedd yn gwneud iawn am ymwrthedd inswlin gyda mwy o secretion hormon. Fodd bynnag, mewn rhai pynciau, wrth i'w cyflyrau waethygu, mae inswlinemia yn gostwng a lefel glwcos yn dringo i hyperglycemia [8,9].
Glwcos yw'r modulator swyddogaethau cell mwyaf pwysig. Mae ysgogiad glwcos yn effeithio ar reoleiddio genynnau a mynegiant proteinau sy'n ymwneud â llawer o swyddogaethau celloedd megis glycolysis, synthesis inswlin a secretion [10]. Mae secretion inswlin a achosir gan glwcos yn dibynnu ar fetaboledd ocsideiddiol i gynhyrchu adenosine triphosphate (ATP) a chynhyrchir lefel isel o rywogaethau ocsigen adweithiol (ROS) yn ffisiolegol. Fodd bynnag, nid yw celloedd wedi'u cyfarparu'n dda iawn ag ensymau sborionwyr ac mae'r gwendid hwn yn eu gwneud yn agored iawn i straen ocsideiddiol [11,12]. Wrth i straen ocsideiddiol gynyddu - mae cynhyrchiant inswlin yn lleihau, ac mae celloedd yn cynhyrchu cytocinau sy'n tanio difrod celloedd trwy lid ac apoptosis [13]. Yn ddiddorol, er bod y màs celloedd llai wedi'i briodoli'n flaenorol i farwolaeth celloedd, mae astudiaethau diweddar yn awgrymu rôl fawr o wahaniaethiad celloedd [14,15]. Mae wedi dod yn amlwg bod sawl cam yn gyrru i T2D. Mae sarhad metabolig ac ocsideiddiol yn achosi straen reticwlwm endoplasmig (ER) sy'n arwain at ddirywiad mewn synthesis inswlin a secretiad, mae prosesau llid yn dilyn rhyddhau cytocinau a gall colled celloedd ddigwydd trwy apoptosis a dadwahaniaethu. Mae'r wybodaeth hon yn sylfaenol er mwyn datblygu strategaethau triniaeth priodol, oherwydd gellir gwrthweithio straen ocsideiddiol a llid, ac mae plastigrwydd celloedd pancreatig yn caniatáu'r posibilrwydd i ddychwelyd bôn-gelloedd yn gelloedd fel y profwyd mewn llygod [16].
Yn ddiweddar, mae bregusrwydd -cells i straen ocsideiddiol wedi ysgogi'r defnydd o gwrthocsidyddion dietegol yn llwyddiannus i atal diabetes [17]. Ymhlith y bwyd gwrthocsidiol mwyaf diddorol, mae olew olewydd yn adnabyddus am ei briodweddau buddiol ers yr hen Roegiaid. Mae olew olewydd yn cynnwys llawer iawn o asidau brasterog mono-annirlawn (MUFA) a sawl polyffenolau fel tyrosol, hydroxytyrosol, oleuropein, a verbascoside.
VerbascosideMae , a elwir hefyd yn acteoside, yn glycoside ffenylethanoid a echdynnwyd o Olea europea, planhigion o'r rhywogaeth Verbascum, a 23 o deuluoedd planhigion eraill [18-20]. Gellir ei gael hefyd o sgil-gynhyrchion olew olewydd (mae'n cael ei gyfoethogi mewn dŵr gwastraff melin olewydd sy'n deillio o brosesu ffrwythau olewydd) neu ei gynhyrchu gan ddulliau peirianneg metabolig a bioleg synthetig [21].
Nid oes unrhyw ddata wedi'i adrodd am fio-argaeledd verbascoside mewn bodau dynol, eto. Mae astudiaethau a gynhaliwyd ar gelloedd llygod, SKBR3 a Caco-2 yn awgrymu y gallai fod yn ymarferol i verbascoside heb ei fetaboli groesi'r rhwystr berfeddol, cylchredeg mewn plasma gwaed, a chael effeithiau gwrthocsidiol [20,22,23]. Yn wahanol i'r rhan fwyaf o polyffenolau planhigion, mae verbascoside yn gweithredu'n bennaf ar gelloedd trwy fodiwleiddio trawsgrifio genynnau o amrywiaeth o ensymau a ffactorau rheoleiddio, gydag effeithiau gwrthocsidiol a gwrthlidiol [24-30].
Er bod llawer o effeithiau buddiol verbascoside ar iechyd pobl yn hysbys, nid oes unrhyw ddata am ei effaith ar gelloedd pancreatig. Gan fod straen ocsideiddiol a llid yn sail i pathogenesis T2D, fe wnaethom ymchwilio i weld a allai triniaeth verbascoside wella hyfywedd celloedd a
swyddogaeth mewn amodau ysgogi straen ER a nodweddom fecanweithiau moleciwlaidd ei weithred. Mae ein data yn datgelu bod verbascoside yn atal -celloedd straen ocsideiddiol a llid rhag modiwleiddio actifadu'r ymateb protein heb ei blygu a hyrwyddo dynameg mitocondriaidd, gan arwain at fwy o hyfywedd celloedd a chynnwys inswlin.
2. Defnyddiau a Dulliau
2.1. Celloedd Diwylliant a Defnyddiau
Cafodd celloedd llygoden tc3 (a ddarparwyd yn garedig gan yr Athro Hanahan - Adran Biocemeg a Bioffiseg, Prifysgol California, San Francisco, CA [31]) eu meithrin yn RPMI 1640 cyfrwng (Euroclone SpA, ECB90 0, Pero MI, yr Eidal) wedi'i ategu â 10 y cant (v/v) serwm llo ffetws anweithredol â gwres (Euroclone SpA, ECS0180L, Pero MI, yr Eidal), 1 y cant (v/v) penisilin-streptomycin (EuroClone SpA, ECB3001D, Pero MI, yr Eidal) ac 1 y cant (v/v) L-glutamin (EuroClone SpA, ECB300D, Pero MI, yr Eidal). Cafodd ynysoedd dynol Langerhans eu hynysu ym Milan (Niguarda Ca' Granda) oddi wrth roddwyr aml-organau cadaverig yn ôl y weithdrefn a ddisgrifiwyd gan Ricordi et al. [32]; cawsant eu meithrin mewn cyfrwng diwylliant RPMI sy'n cynnwys 5.5 mmol/L glwcos, 10 y cant o serwm buchol ffetws anweithredol â gwres, 0.7 mM Glutamine, 50 uned/ml penisilin a 50 ug/ml streptomycin (EuroClone, SpA, Pero MI, yr Eidal). Defnyddiwyd pedwar paratoi ynysoedd gwahanol, purdeb ynysoedd oedd 80 ± 10 y cant . Cymeradwywyd astudiaethau ynysig ac ynysig gan Bwyllgor Moeseg ysbyty Niguarda Ca' Granda ym Milan (11.12.2009). cafodd celloedd tc3 eu trin â 0.8, 1.6, a 16 uM verbascoside (Carbosynth, OV08034, Compton, UK), asid caffeic a hydroxytyrosol (rhodd caredig yr Athro Dell'Agli, Adran y Gwyddorau Ffarmacolegol a Biomoleciwlaidd, Universita degli Studi di Milano, Milan, yr Eidal) mewn cyfrwng RPMI cyflawn am 5 diwrnod, tra bod ynysoedd dynol gyda 16 uM verbascoside. Defnyddiwyd celloedd wedi'u trin â methanol/ethanol fel rheolyddion. Er mwyn achosi straen ocsideiddiol, cafodd celloedd eu trin â H2O2 (Sigma Aldrich, H1009, St. Louis MO, UDA) 500 uM mewn cyfrwng RPMI cyflawn am 20 munud cyn dadansoddi, tra'n trin â tunicamycin 2 ug/mL (T7765, Sigma Aldrich ) am 7 h ei berfformio i achosi straen ER.
2.2. Canfod Hyfywedd Cell trwy Brawf MTT
Cafodd celloedd eu platio mewn 96 o blatiau aml-ffynnon, a phum niwrnod ar ôl triniaeth verbascoside cawsant eu deor â 0.5 mg/mL MTT (3-(4,5-dimethyltiazol{{7}) }yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid) (Sigma-Aldrich, M5655, St. Louis, MO, UDA) am 4 awr mewn awyrgylch llaith yn cynnwys 5 y cant o CO2 ar 37 oC. Ar ôl deori, cafodd celloedd eu hailddarlledu'n ysgafn mewn 100 uL DMSO (Euro-Clone SpA, BK12611S, Pero MI, yr Eidal) a chanfuwyd yr amsugnedd ar 540 nm gyda darllenydd microplate (Meincnod, darllenydd microplate, Labordai Bio-Rad, Hercules CA, UDA) [33]. Perfformiwyd arbrofion yn driphlyg a mynegwyd data fel cynnydd plygu dros samplau rheoli.
2.3. Canfod Marwolaeth Cell trwy Sytometreg Llif
Bum diwrnod ar ôl y deoriad gyda 16 uM verbascoside, cafodd y celloedd eu gwahanu gan ddeor 7 munud gyda trypsin/EDTA, eu casglu a'u centrifugio; cafodd y belen ei haildynnu'n ysgafn mewn halwynau halwynog isel byffer ffosffad. Cafodd celloedd eu staenio â chyfrif MuseTM ac adweithydd hyfywedd (Millipore, MCH100102, Burlington MA, UDA) yn dilyn protocol y gwneuthurwr a'u dadansoddi trwy sytometreg llif. Perfformiwyd arbrofion mewn triphlyg a mynegwyd data fel canran o gelloedd marw dros y cyfanswm.
2.4. Cenhedlaeth ROS
Gwerthuswyd ROS mewngellol gyda DCFDA (2/,7/- dichlorofuorescein diacetate) (Sigma Aldrich, D6883, St. Louis, MO, UDA), chwiliedydd pilen athraidd sy'n dod yn fflwroleuol pan gaiff ei glymu i ROS [34]. Cafodd celloedd tc3 eu llwytho ymlaen llaw gyda 15 uM DCFDA mewn byfer Krebs-Ringer (125 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.2 mM MgSO4, 1.2 mM KH2PO4, 25 mM HEPES-NaOH pH 7.4 a 2 mM CaCl2)
wedi'i ategu gan 11 mM o glwcos am 1 awr ar 37 oC. Canfuwyd cynnwys ROS am 30 munud mewn amodau gwaelodol a straen gyda darllenydd microplate (485/528 nm Ex/Em) (TECAN Infinite⑧ F500, Tecan Group Ltd. Männedorf, y Swistir). Roedd gwerthoedd cymedrig a gwyriadau safonol yn seiliedig ar dri arbrawf annibynnol.
2.5. Blotio Gorllewinol
casglwyd a solubilized celloedd tc3 mewn byfer RIPA (150 mM NaCl, 50 mM Tris HCl pH 7.6, EDTA 1 mM, 1 y cant TERGITOLw NP40, 0.5 y cant deoxycholate) ychwanegu gyda aprotinin (Sigma Aldrich, A4529, St. Louis, MO, UDA), PMSF (Sigma Aldrich, 10837091001, St. Louis, MO, UDA) ac atalyddion Roche (Sigma Aldrich, 5892953001, St. Louis, MO, UDA) am 40 munud am 4 oC. Pennwyd crynodiad protein gan assay Bradford [35] trwy ddefnyddio Bradford Reagent (Sigma Aldrich, B6916, St. Louis, MO, UDA), datryswyd 30 ug o broteinau gan 10 y cant SDS-PAGE a'i drosglwyddo i bilen nitrocellulose (Millipore, Burlington MA, UDA). Defnyddiwyd gwrthgyrff cynradd am 2 h mewn byffer blocio gyda 5 y cant o laeth di-fraster neu 5 y cant o doddiannau BSA; defnyddiwyd y gwrthgyrff cynradd a ganlyn: gwrthgyrff llygoden {- -actin (Novus International Inc., NB600501, St. Louis, MO, UDA), gwrth-acrolein llygoden (Abcam, ab48501, Caergrawnt, DU), llygoden gwrth-BIP (rhodd caredig yr Athro Borgese Nica, Sefydliad Niwrowyddoniaeth, CNR, Milan, yr Eidal), gwrth-HNE cwningen (-diagnostic International Inc., HNE11S, San Antonio, TX, UDA), llygoden gwrth-HSP70 (Enzo Life Sciences Inc. ., C92F3A-5, Farmingdale, NY, UDA), cwningen gwrth-phospho-IKB (Ser32) (Cell Signaling Technology Inc., 3033, Danvers, MA, UDA), llygoden gwrth-IKB (Cell Signaling Technology Inc. ., 4814, Danvers, MA, UDA), cwningen gwrth-ffosffo-NFKB p65 (Ser 536) (Cell Signaling Technology Inc., 3033, Danvers, MA, UDA), cwningen gwrth-NFkB p65 (Cell Signaling Technology Inc., 8242, Danvers MA, UDA), defaid gwrth-SOD1 (Merck, KGaA, Darmstadt, Germania), cwningen gwrth-PERK (Cell Signaling Technology Inc., 3192, Danvers, MA, UDA), cwningen gwrth-eIF2 (Technoleg Signalau Cell Inc., 5324, Danvers, MA, UDA) a chwningen gwrth-P-eIF2 (Ser 51) (Cell Signaling Technology Inc., 3597, Danvers, MA, UDA). Defnyddiwyd y gwrthgyrff eilaidd HRP-conjugated (Dako Agilent, Santa Clara, CA, UDA) ar wanhau 1:5000. Canfuwyd proteinau trwy ddefnyddio system ganfod ECL (Euro-Clone SpA, Pero MI, yr Eidal) trwy ddefnyddio system Odyssey Fc Image (LI-COR Biotechnology GmbH, Bad Homburg, yr Almaen) a meintiolwyd dwysedd band gan feddalwedd Image Studiow Lite (LI). -COR Biowyddorau, Lincoln, NE, UDA) [36]. Perfformiwyd arbrofion yn driphlyg a mynegwyd data fel cynnydd plygu dros samplau rheoli.
2.6. Potensial Membran Mitocondriaidd
deorwyd celloedd tc3 ac ynysoedd dynol Langerhans gyda 100 nM MitoSpyw Orange CMTMRos (BioLegend, 424803, Campoverde Srl, Milan, yr Eidal) neu 100 uM MitoSpyw Green FM (BioLegend, 424805, Campoverde min 3) yn Milan, 424805, Campoverde min 3, yr Eidal oC; Canfuwyd dwyster fflworoleuedd gyda'r darllenydd microplate TECAN Infinite⑧ F500 (551/576 nm Ex/Em ar gyfer MitoSpyw Orange CMTMRos; 490/516 nm Ex/Em ar gyfer MitoSpyw Green) (TECAN Infinite⑧ Tecan F50, Swisdir, Tecan F50, Ltd. Deorwyd celloedd â 500 uM H2O2 am 20 munud a chanfuwyd dwyster fflworoleuedd fel y disgrifiwyd yn flaenorol. Roedd gwerthoedd cymedrig a gwyriadau safonol yn seiliedig ar dri arbrawf gwahanol.
2.7. Morffoleg a Dynameg Mitocondriaidd
Cafodd celloedd tc3 eu llwytho ymlaen llaw gyda 100 nM MitoSpyw Orange CMTMRos (BioLegend, 424803, Campoverde Srl, Milan, yr Eidal) mewn byfer glwcos 11 mM Krebs-Ringer ar 37 oC am 30 munud. Gosodwyd samplau mewn siambr ddelweddu a delweddwyd meysydd ar hap gan ddefnyddio hidlydd rhodan y microsgop Axio Observer Z1 (Zeiss, Oberkochen yr Almaen). I werthuso morffoleg mitocondriaidd, dadansoddwyd y paramedrau canlynol trwy ddefnyddio meddalwedd dadansoddwr gronynnau ImageJ: arwynebedd (um2), cylchrededd (4mArea2 / Perimeter2) ac uchafswm diamedr Feret (um) [37].
Ar gyfer arbrofion treigl amser, cynhaliwyd delweddu un-gell ar 1 ffrâm yr eiliad am 30 s dan reolaeth neu amodau straen ocsideiddiol. I fesur y pellter cronnol mitocondriaidd (um2), cywirwyd delweddau yn gyntaf ar gyfer cannu lluniau, yna dadansoddwyd fideos trwy ddefnyddio Plug-in Image-Pro Plus (tracio gwrthrychau) presennol (Media Cybernetics, Rockville, MD, UDA). Hyd at ddeuddeg
delweddwyd celloedd mewn tri arbrawf annibynnol a chyflwynwyd data fel gwerthoedd cymedrig a gwyriadau safonol.
2.8. Cyfrinach inswlin
Cafodd ynysoedd ynysig dynol o Langerhans eu hadu mewn 96-plât ffynnon ar ddwysedd o 20 ynysig y ffynnon ac, ar ôl 5 diwrnod o driniaeth, cafodd cynnwys inswlin a secretiad eu mesur mewn gwaelodol (3.3 mM glwcos) a'u hysgogi (glwcos 16.7 mM ) amodau trwy gyfrwng archwiliad imiwn ELISA (Mercodia, 10-1113-01, Uppsala, Sweden).
2.9. Dadansoddiadau Ystadegol
Perfformiwyd yr holl ddadansoddiadau ystadegol gyda GraphPad Prism 8.0 ar atgynyrchiadau biolegol annibynnol. Gwerthuswyd dulliau rhwng dau grŵp gan ddefnyddio prawf t Myfyriwr deugynffon a gwerth-p < 0.05="" yn="" cael="" ei="" gymryd="" fel="" tystiolaeth="" o="" arwyddocâd="" ystadegol.="" cymharwyd="" cymedrau="" ymhlith="" tri="" grŵp="" neu="" fwy="" gan="" ddadansoddiad="" o="" amrywiant="" (anova),="" ac="" yna="" prawf="" cymharu="" ôl-hoc="" lluosog="" (tukey's).="" mae'r="" prawf="" ystadegol="" a="" ddefnyddiwyd,="" union="" werthoedd="" p="" a="" nifer="" y="" replica="" (n)="" wedi'u="" nodi="" yn="" y="" chwedlau="" ffigur="" unigol.="" mae="" bariau="" gwall="" yn="" y="" ffigurau="" yn="" dangos="" y="" cymedr="" ±="" sd="" neu'r="" cymedr="" ±="" se,="" fel="" y="">
3. Canlyniadau
3.1. Mae Verbascoside yn Gwella Hyfywedd Celloedd
Gan nad oedd unrhyw ddata ar effaith verbascoside ar -gelloedd, gwnaethom gynnal prawf MTT i werthuso hyfywedd celloedd ac fel y dangosir yn Ffigur 1A, gwelwyd tuedd gadarnhaol yn dibynnu ar ddos. Felly, ar gyfer astudiaethau pellach, dewiswyd y crynodiad o 16 uM y profwyd yn ystadegol ei fod yn effeithiol i wella hyfywedd celloedd. Trwy cytometreg llif astudiwyd effaith deori pum diwrnod o oroesiad verbascoside ar-gell mewn amodau gwaelodol ac ar ôl 2{{21} } min o driniaeth ymlaen llaw gyda 500 uM H2O2. Yn y cyflwr gwaelodol, nid oedd verbascoside yn effeithio ar oroesiad celloedd, sy'n awgrymu y gallai'r cynnydd mewn hyfywedd celloedd a welwyd yn y prawf MTT fod oherwydd gwell gweithgaredd mitocondriaidd. Tra, ar ôl dod i gysylltiad â H2O2, roedd cyn-driniaeth verbascoside 16 uM wedi lleihau marwolaeth celloedd ocsideiddiol a achosir gan straen yn sylweddol (Ffigur 1B, C). Mae Verbascoside yn foleciwl cymhleth y gellir ei addasu trwy hydrolysu ensymau [18]. Er mwyn profi a allai metabolion verbascoside fod yn gyfrifol am yr effaith amddiffynnol a arsylwyd, cafodd celloedd tc3 eu trin â hydroxytyrosol ac asidau caffeig (0.8 a 16 uM) am 5 diwrnod. Nid oedd y ddau fetabolyn yn gwella hyfywedd celloedd, i'r gwrthwyneb canfuwyd effaith sytotocsig, a oedd yn fwy perthnasol ar ôl datguddiad H2O2, ar gyfer y crynodiad 16 uM (Ffigur S1). Mae'r canfyddiad hwn yn profi mai verbascoside ac nid ei metabolion sy'n cael yr effaith amddiffynnol i driniaeth H2O2.
3.2. Mae Verbascoside yn Modylu'r Homeostasis Redox ac yn Cael Effaith Gwrthlidiol mewn Celloedd
Yn gyntaf fe wnaethom gadarnhau mewn celloedd tc3 effeithiau gwrthlidiol a gwrth-ocsidydd verbascoside a welwyd mewn mathau eraill o gelloedd [24,29,34]. Gwerthuswyd y gweithgaredd sborion verbascoside ROS gyda chelloedd tc3 wedi'u labelu â stiliwr athraidd cellog DCFDA (2/,7/- dichlorofuorescein diacetate) penodol ROS. Fel y dangosir yn Ffigur 2A, canfuwyd gostyngiad sylweddol yng nghynnwys ROS ar ôl rhag-driniaeth verbascoside, o dan amodau straen gwaelodol ac ocsideiddiol.
Datgelodd dadansoddiadau blot gorllewinol ostyngiad sylweddol yn y marcwyr straen ocsideiddiol acrolein a mynegiant 4-hydroxynononenal (HNE) mewn celloedd sy'n cael eu trin â verbascoside. Yn ogystal, canfuom gynnydd mewn mynegiant superoxide dismutase (SOD1), sy'n awgrymu bod verbascoside yn cyflawni ei weithgaredd gwrthocsidiol yn ôl pob tebyg gyda dau fecanwaith gwahanol, yn uniongyrchol fel sborionwr ROS ac yn anuniongyrchol trwy ysgogi mynegiant ensymau gwrthocsidiol (Ffigur 2B, C).
Aseswyd effaith gwrth-lidiol celloedd verbascoside trwy werthuso gweithrediad y llwybr NFKB, y llwybr gwrthlidiol pwysicaf yn y celloedd hyn [38]. Trwy ddadansoddiad blotiau gorllewinol canfuom fynegiant llai o atalydd ffactor niwclear kappa B (IKB ) a ffactor niwclear kappa-light-chain-enhancer-enhancer (NFKB), a gostyngiad sylweddol o ffosfforyleiddiad NFKB mewn celloedd a driniwyd ymlaen llaw, gan gefnogi'r ddamcaniaeth o yr effeithiolrwydd verbascoside i leihau llid cell (Ffigur 2D, E).
3.3. Mae Verbascoside yn Modylu Ymateb Protein Heb ei Blygu -Celloedd
Yna fe wnaethom ddadansoddi'n fanwl y mecanwaith moleciwlaidd y mae verbascoside yn ei ddefnyddio i gyflawni rolau gwrthocsidiol a gwrthlidiol, gan ganolbwyntio ar y reticwlwm endoplasmig sy'n dod i'r amlwg fel synhwyrydd allweddol o signalau metabolaidd a straen mewn celloedd. O dan amodau straen, mae'r organelle yn gosod ymateb homeostatig, a elwir yn ymateb protein heb ei blygu (UPR), gyda'r nod o adennill y swyddogaeth ER; fodd bynnag, mae gweithrediad gormodol y llwybr hwn yn arwain at apoptosis [39,40].
Mae arwyddion o straen ER cynyddol yn cynnwys dadreoleiddio proteinau hebryngwyr ac actifadu'r ymateb UPR. Datgelodd dadansoddiad blotio gorllewinol o gelloedd a gafodd eu trin â verbascoside lefelau gostyngol o'r ddau brotein sioc gwres chaperonin 70 (HSP70) a phrotein imiwnoglobwlin rhwymol (BIP) (Ffigur 3A, B). Ymhellach, canfuwyd gostyngiad sylweddol mewn mynegiant protein kinase tebyg i RNA ER kinase (PERK) a llai o ffosfforyleiddiad o'i effaith i lawr yr afon, y ffactor cychwyn cyfieithu ewcaryotig 2 (eIF2 ).
