Glycosidau Ffenylethanol O Cistanche Tubulosa Sy'n Atal Ysgogi Celloedd Stelate Hepatig Ac yn Rhwystro Dargludiad Llwybrau Signalau yn TGF-01/smad Fel Asiantau Ffibrosis Gwrth-Hepatig Posibl
Mar 05, 2022
Cyswllt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-bost:audrey.hu@wecistanche.com
Shu-Ping Chi, Long Ma, Jun Zhao, Shi-Lei Zhang a Tao Liu
Crynodeb: Cistanche tubulosayn feddyginiaeth lysieuol Tsieineaidd traddodiadol a ddefnyddir yn eang ar gyfer rheoleiddio imiwnedd aglycosidau ffenylethanoid(CPhGs) ymhlith y prif gydrannau sy'n gyfrifol am y gweithgaredd hwn. Mae astudiaethau blaenorol wedi nodi effeithiau ataliol a therapiwtig CPhGs ar ffibrosis hepatig a achosir gan serwm albwmin buchol (BSA) mewn llygod mawr. Nod yr astudiaeth oedd gwerthuso effaith ffibrosis gwrth-hepatig CPhGs a'r monomerauechinacosideaacteosidtrwy atal actifadu celloedd stellate hepatig (HSC), rhwystro dargludiad llwybrau signalau wrth drawsnewid ffactor twf-p1 (TGF-p1) / smad, a phennu eu bod yn weithgaredd hepatoprotective in vitro. Roedd yn amlwg bod lledaeniad HSC wedi'i atal ar ôl triniaeth gyda CPhGs (100,50 ^ g/mL)/echinacoside (500,250,125 ^ g/mL)/acteoside (6, 3 ^g/mL), gyda gwerthoedd IC50 o 119.125,520.345 a 6.999 g/6.999 mL, yn y drefn honno, yn yr assay MTT. Crynodiadau gwahanol o CPhGs/echinacoside/acteosidnid oedd yn effeithio ar y gwenwyndra cellog ar HSC yn ôl mesuriadau lactate dehydrogenase (LDH). Crynodiadau gwahanol o CPhGs/echinacoside/acteosidcynyddu lefel mRNA a mynegiant protein smad7 a gostwng lefelau mRNA smad2, smad3 a mynegiant protein smad2, phospho-smad2 (p-smad2), smad3, phospho-smad3 (p-smad3) yn HSC. I grynhoi, mae'r canlyniadau hyn yn dangos bod GRhGau/echinacoside/acteosidyn gallu rhwystro dargludiad y llwybrau signalau yn TGF-p1/smad, ac yn atal actifadu HSC, gan awgrymuC. tubulosagall felly fod yn feddyginiaeth lysieuol bosibl ar gyfer trin ffibrosis yr afu.
Geiriau allweddol: Cistanche tubulosa; glycosidau ffenylethanol oCistanche(CPHGs);echinacoside; acteosid; celloedd stellate hepatig (HSC); TGF-p1/smad
1. Rhagymadrodd
dod yn lluosogol a ffibrogenig, yn cronni ECM wedyn, ac yn y pen draw yn gwahaniaethu i gelloedd ffibrogenig tebyg i myofibroblast. Ystyrir mai trawsnewid ffactor twf-.1 (TGF-p 1) yw'r prif gyfryngwr proffilogenig. Mae'r llwybr signalau sy'n gysylltiedig â TGF-&1 yn fecanwaith pwysig o ffibrosis hepatig, ac mae'n bennaf yn cynnwys signalau sy'n ddibynnol ar smad a smad-annibynnol, a chredir bod y llwybr trawsyrru signalau sy'n ddibynnol ar smad yn sianel fawr o signalau TGF-p1. . Felly, gall rhwystr ar lwybr signalau TGF-p1/smad atal cynhyrchu colagen ac yn y pen draw liniaru ffibrosis hepatig bwyta, sydd wedi gwneud y llwybr hwn yn darged pwysig mewn ymchwil cyffuriau ffibrosis gwrth-hepatig yn y blynyddoedd diwethaf.
Er gwaethaf yr achosion uchel o ffibrosis hepatig ledled y byd, nid oes therapi gwrth-ffibrogenig a dderbynnir yn gyffredinol ar gael [2-4]. Mae Meddyginiaethau Llysieuol Tsieineaidd Traddodiadol (TCHMs) o ddiddordeb mawr ar gyfer trin anhwylderau'r afu oherwydd gellir defnyddio rhai cyffuriau therapiwtig i reoli ac atal ffibrosis yr afu. Ar hyn o bryd, mae llawer o astudiaethau'n canolbwyntio ar gyffuriau gwrth-ffibrogenig posibl sydd wedi'u defnyddio fel TCHMs ers miloedd o flynyddoedd [5].
Mae Cistanche tubulosa W (teulu Orobanchaceae)fa planhigyn parasitig, yn cael ei dyfu'n eang yn rhanbarth deheuol Xinjiang yn Tsieina [6]. Mae pobl yn ei ddefnyddio i fywiogi'r arennau, maethu'r gwaed, ymlacio'r coluddion ac oedi henaint heb sgîl-effeithiau, ac fe'i rhestrir yn swyddogol yn y Pharmacopoeia Tsieineaidd [7]. Mae C. tubulosa yn cynnwys amrywiaeth o gydrannau gweithredol, gan gynnwys glycosidau ffenylethanoid (CPhGs), iridoids, a polysacaridau. Ymhlith y nifer o gydrannau gweithredol yn C. tubulous, mae'r CPhGs, sy'n cyflwyno nifer o fioweithgareddau (gwrthocsidiol, gwrthfatig, radioresistance, ac ati) yn brif gydrannau Pie o'r planhigyn hwn. Yn ystod y blynyddoedd diwethaf, adroddir bod CPhGis yn cael effeithiau hepatoprotective Hent gormodol, a gallant ysbeilio radicalau coed, amddiffyn pilenni hepatig, ac arddangos effeithiau imiwn-reoleiddio, ataliad apoptosis, atal mynegiant antigen wyneb hepatitis B (HBs Ag) a hepatitis B. e antigen (HBeAg) a firws hepatitis B (HBV) gweithgaredd atgynhyrchu DNA, ac ati. Lefel DNA HBV yw'r mynegai mwyaf dibynadwy sy'n adlewyrchu'n uniongyrchol y gweithgaredd atgynhyrchu firaol, sef y ffactor allweddol wrth bennu hanes naturiol heintiau HBV cronig, monitro effaith therapi gwrthfeirysol oP, ac asesu prognosis heintiau HBV acíwt a chronig. Mae mynegeion canfod serolegol HBV yn bennaf yn cynnwys HBsAg, HBeAg, ac ati [8-11]. Fodd bynnag, ychydig o adroddiadau llenyddiaeth sydd ar effeithiau ffibrosis gwrth-hepatig CPhGs. Mae astudiaethau blaenorol wedi nodi effeithiau ataliol a therapiwtig CPhGs ar ffibrosis hepatig a achosir gan serwm albwmin buchol (BSA) mewn llygod mawr, ond nid yw gweithgaredd gwrthfibrogenig CPhGs a'i monomerau mawr (echinacoside ac acteoside, Ffigur 1) erioed wedi'u gwerthuso in vitro.
Cistanche tubulosa organig
2. Canlyniadau
2.1. Penderfyniad Meintiol o GRhGau
CPhGs ynC. tubulosacynnwys glycosidau alcohol ffenylethyl ITwo: echinacoside ac ochr acteo, a chanfuwyd eu cynnwys yn y CPhGs gan ddadansoddiad HPLC (Ffigur 1) i fod yn 42.71 y cant 土 0.42 y cant a 14.27 y cant 土 0.18 y cant , yn y drefn honno.
2.2. Gweithgareddau Ataliol CPhGs, Echinacoside ac Acteoside ar HSC-T6
Roedd CPhGs, echinacoside ac acteoside (62.5-500 卩g/mL) yn atal hyfywedd celloedd HSC mewn modd sy'n dibynnu ar grynodiad. Dangosodd CPhGs ac acteoside weithgaredd ataliol rhyfeddol ar gelloedd HSC, gydag ataliad o 50 y cant o werthoedd gweithgaredd twf celloedd (IC50) yn 119.125 昭 / mL a 6.999 昭 / mL yn y drefn honno. Dangosodd Echinacoside weithgaredd ataliol cymedrol (IC50,520.345 昭/mL; Tabl 1 a Ffigur 2).
2.3. Gwenwyndra Celloedd CPhGs, Echin ochr yn ochr ac Acteorida ar HSC
Mae lactad dehydrogenase (LDH), ensym cytoplasmig sothach sy'n bresennol ym mhob cell, yn cael ei ryddhau'n gyflym i'r meithriniad celloedd uwchnatur ar niwed i'r bilen plasma. Mae gweithgaredd ensymau yn y diwylliant supernatant yn cyfateb i'r gyfran o lysed celfs [12]. Fel y dangosir yn Nhabl 2, pan gafodd ei drin â gwahanol: crynodiadau o C PhGs, echinacoside ac acteoside, er bod gweithgaredd LDH yn dangos cynnydd bach o'i gymharu â'r grŵp coirtrol cell, nid oedd y gwahaniaeth yn ystadegol arwyddocaol (p> 0.05 ), sy'n nodi bod y rhan fwyaf o'r cellbilenni'n cynnal eu cyfanrwydd, ac nad yw ataliad CPhGs, echinacoside ac acteosid ar HSC yn ganlyniad i wenwyndra cellog amhenodol.
2.4. Effaith CPhGs, Echinacoside ac Acteosde ar Ymlediad HSC a Achosir gan TGF-^i
Mae amrywiaeth o ffactorau yn rheoli amlder, actifadu a gwahaniaethu HSC. Ymhlith y ffactorau amrywiol sy'n gysylltiedig â ffibrosis yr afu, ystyrir mai TGF yw'r pwysicaf, gan y gall actifadu HSC, hyrwyddo gwahaniaethu myofibroblast, cynyddu synthesis ECM, ac atal diraddio ECM, a rhyddhau chemocines a cytocinau sy'n ymwneud â ffibrosis yr afu [13]. Yn yr astudiaeth hon, ac eithrio'r grŵp rheoli, ysgogwyd HSCs llonydd gyda TGF-P1 in vitro i efelychu ffurfiant ffibrosis cynnar yr iau, ac i ymchwilio i effaith CPhGs, echinacoside ac acteoside ar TGF-p1- amlhau HSC a achosir. Fel y dangosir yn Nhabl 3, o'i gymharu â'r grŵp rheoli, roedd y grŵp TGF-61 wedi hyrwyddo'n sylweddol yr amlhau HSC (p < 0.01).="" o'i="" gymharu="" â'r="" grŵp="" tgf-p1,="" mae="" tgf-p1="" ynghyd="" â="" cphgs="" (tc)="" (50,100="" 卩g/ml,="" p="">< 0.05),="" tgf{{18}="" }="" ynghyd="" ag="" echinacoside="" (te)="" (125,="" 250,="" 500="" 卩g/ml,="" p="">< 0.05),="" tgf-p1="" ynghyd="" ag="" acteoside="" (ta)="" (3.0,="" 6.0="" 卩g/ml,="" p="">< 0.05)="" i="" gyd="" yn="" rhwystredig="" iawn="" rhag="" ymledu="" hscs="" a="" achosir="" gan="" tgf-|3="" 1="" i="" raddau="">
2.5. Mynegiadau o mRNA smad2)smad3 a smad7 ar ôl CPhGs, ochmacoside ac ymyrraeth acteside ar HSCs
Mae Smad3 a smad2 yn effeithwyr allweddol i lawr yr afon o lwybr signalau TTGF-p [14,15], ac mae smad7 yn atalydd signalau smad. Yn ddamcaniaethol, gall mynegiant cynyddol smad7 neu fynegiant gostyngol o smad2/smad3 rwystro dargludiad llwybrau signalau yn TGF-p 1/ smad. Fel y dangosir yn Ffigur 3, dangosodd dadansoddiad PCR meintiol amser real fod mynegiant mRNA smad2 a smad3 yn nodi lefel is, tra bod smad7 yn nodi lefelau uwch yn y grŵp rheoli, o gymharu â grŵp TGF-|31. Yn y grŵp TC (25, 50, 75,100 |dg/mL), lefel mRNA smad2 (p < 0.{{37}="" }}5)="" a="" smad3="" (p="">< 0.01)="" wedi="" gostwng="" yn="" sylweddol="" o="" gymharu="" â'r="" grŵp="" tgf-pf="" ,="" ac="" roedd="" hyd="" yn="" oed="" yn="" debyg="" i'r="" grŵp="" rheoli;="" mi="" dro,="" mae="" lefel="" mrna="" o="" smad7="" wedi="" cynyddu'n="" sylweddol="" yn="" y="" tc="" (50,="" 75,100="" 卩g/ml)="" grŵp="" (p="">< 0.05,="" p="">< 0.05,="" p="">< 0.01,="" yn="" y="" drefn="" honno).="" fodd="" bynnag;="" roedd="" mynegiant="" smad7="" yn="" nodi="" tuedd="" esgynnol="" yn="" y="" grŵp="" 25="" 卩g/ml="" tc="" o'i="" gymharu="" â="" grŵp="" tgf-p1="" (ffigur="">
Yn y cyfamser, o gymharu â grŵp TGF-p1, roedd mynegiant mRNA smad2 a smad3 wedi gostwng yn sylweddol yn y TE (62.5, 125, 250, 500 卩g /mL) grŵp (p < 0.01),="" ac="" ymadroddion="" smad7="" mrna="" wedi="" cynyddu'n="" sylweddol="" yn="" y="" grŵp="" te="" (125,="" 250,500="" 昭/ml)="" (p="">< 0.01)="" (ffigur="" 4)="" .="" yn="" yr="" un="" modd,="" dangosodd="" grŵp="" ta="" (0.75,1.5,="" 3.0,="" 6.0="" ^g/ml)="" yr="" un="" duedd="" hefyd="" (ffigur="">
2.6. Dylanwad CPhGs, Echinacoside, ac Ac) eosidau ar Lwybr Signalau T GF-^i/smad yn HSC
Mae llwybr signalau TGF-p 1/smad yn dibynnu ar smad2, smad3, phospho-smad2 (p-smad2), phospho-smad3 (p-smad3) a smad7, lle mae p-smad2, p-smad3 yn ffurfiau actifedig o smad2 a smad3. Yn yr astudiaeth hon, dadansoddwyd lefelau protein omad2, smad3, p-smad2, p-smsd3 a smad7. Canfu dadansoddiad blotiau gorllewinol gynnydd yn y lefelau smad2, smad3, p-smad2, p-smad3 yn ôl TGF-p1, ac ataliad y cynnydd hwn gan CPhGs, ec hinacoside ac acteoside; yn y cyfamser, datgelodd dadansoddiad blotiau wesiern lefelau smad7 uwch-reoledig gan CPhGs, echinacoside ac acteoside. (Fi gures 6—8).
Fel y dangosir yn Ffigur 6, o gymharu â'r grŵp c on2rol (cynnyddwyd mynegiadau protein smad2, smad3, p-smad2, p-smad3 yn sylweddol, a gostyngwyd mynegiant protein smad7 yn y grŵp TGF-p1. Yn y TC (25) , 50, 75, 100 昭/mL) grwpiau cyffuriau, y smad/ (Ffigur 6A), p-smad2 (Ffigur 6B), smad 3 (Ffigur 6C), p -smad3 (Ffigur 6D) mynegiadau yn sylweddol is na'r hyn yn y grŵp TGF-p1 (卩 < 0.01), ac smad7 (Ffigur 6E) mynegiant protein yn uwch na'r hyn y grŵp TGF-S1 (p < 0.01) (Ffigur 6).
Ar yr un pryd, mesurwyd yr ymadroddion ot smad 2, smad3, p-smad2, p-smad3 a smad7 protein ar ôl ymyrraeth echinacoside ac acteoside ar HSC. Fel y dangosir yn Ffigurau 7 ac 8 roedd lefelau mynegiant protein smad2, smad3, p-smad2 a p-smad3 wedi'u hatal yn sylweddol (p < 0.05="" neu="" p="">< 0.01="" ),="" roedd="" lefel="" mynegiant="" protein="" smad7="" yn="" uwch="" (p="">< 0.01),="" o'i="" gymharu="" â="" grŵp="" tgf-="" p="" 1="" (ffigurau="" 7="" ac="">
3. Trafodaeth
Ffibrosis yr afu yw un o brif achosion morbidrwydd a marwolaethau ledled y byd, ond mae opsiynau therapiwtig cyfyngedig iawn ar gael ar hyn o bryd ar gyfer y cyflwr hwn, felly, mae'n bwysig iawn inni geisio targedau posibl ar gyfer ymyrraeth therapiwtig i atal datblygiad ffibrosis yr afu [] 16]. Yn ddiweddar, mae ymchwilwyr wedi canfod bod gan wahanol feddyginiaethau llysieuol hepatoprotective o effeithiau gwrth-ffibrotic. Mae llawer o TCHMs fel pils Fufang Biejia Ruangan [17] a Xiao-chai-hu decoction (shosaiko i yn Japan) [18,19] wedi cael eu defnyddio'n eang i drin ffibrosis hepatig yn Tsieina, Korea, a Japan ers miloedd o flynyddoedd. Mae C. tubulosa yn cynnwys amrywiaeth o gydrannau gweithredol gan gynnwys CPhGs, iridoids, a polysacaridau. Fel un o seiliau defnydd effeithiol C. tubulosa, mae gan CPhGs weithgaredd hepatoprotective rhagorol, ond mae gwybodaeth gyfyngedig am effeithiau gwrth-ffibrotic CFfCs a'i gyfansoddion cysylltiedig. Yn yr astudiaeth hon, fe wnaethom ymchwilio i sut mae CPhGs, echinacoside ac acteoside yn atal actifadu HSC ac yn rhwystro'r llwybr signalau yn TGF-p1/snaad fel cyfryngau ffibrosis gwrth-hep a tic posibl mewn vitro.
Bydd anaf i'r afu o unrhyw etioleg yn y pen draw yn arwain at actifadu HSCs, sy'n cael eu trawswahaniaethu i gelloedd tebyg i myofibroblast ffibrogenig [20]. Hynny yw, myofibroblasts
yn deillio o actifadu ac amlhau HSCss [21], ac fe'i hystyrir yn gyfryngwr ffurfio ffibrosis hepatig. Am y rheswm hwn, gwnaethom gynnal astudiaethau in vitro i gymharu cyfraddau hyfywedd celloedd HSCs sy'n agored i CPhGs, echinacoside ac acteoside. Dangosodd y canlyniadau mai effaith ataliol acteoside ar HSC oedd y cryfaf, a bod effaith CPhGs yn well nag effaith echinacoside. Roedd CPhGs, echinacoside a sera meddyginiaethol acteoside i gyd yn atal lledaeniad HSC mewn modd a oedd yn dibynnu ar ddos.
Mae LDH yn ensym cytoplasmig mewn celloedd byw, ac ni all dreiddio i'r gellbilen o dan amgylchiadau arferol. Pan fydd celloedd yn cael eu difrodi, mae athreiddedd y bilen yn cynyddu a chaiff LDH ei ryddhau i'r tu allan i'r gell. Fel arfer, gall LDH ganfod graddau difrod celloedd [{{0}}]. Dangosodd yr ymchwiliad fod gweithgaredd LDH CPhGs, echinacoside a serwm meddyginiaethol acteoside ond yn dangos cynnydd bach o'i gymharu â'r grŵp rheoli celloedd, ac nid oedd y gwahaniaeth yn ystadegol arwyddocaol (p> 0.05), sy'n dangos bod y rhan fwyaf o'r gellbilen yn cynnal eu cyfanrwydd. , ac nid yw ataliad HSCs gan CPhGs, echinacoside ac acteoside yn ganlyniad i wenwyndra cellog amhenodol.
Pan fydd anaf i'r afu yn digwydd, gall hepatocytes actifedig ryddhau TGF-pi sydd yn ei dro yn actifadu HSC-T6, felly, mae gan TGF-pi berthynas agos â ffibrosis [25-27]. Yn yr astudiaeth hon, gellid ystyried CPhGs, echinacoside ac acteoside fel strategaeth therapiwtig ddeniadol ar gyfer atal lledaeniad HSC ar ôl i HSCs gael eu hysgogi â wTGF-pi in vitro. Rydym yn dyfalu y gellir defnyddio CPhGs, echinacoside ac acteoside fel math o driniaeth a / neu atal ffibrosis yr afu, ac atal ffurfio ffibrosis cynnar yr afu. Mae ffurfio ffibrosis hepatig yn broses gymhleth o gynnwys aml-ffactor ac amlgell. Yn y broses patholegol hon, mae'r rhyngweithiadau cell-gell, cytocinau cell a matrics cell yn rhwydwaith feichus. Yn y rhwydwaith hwn, gellir rheoleiddio datblygiad ffibrosis hepatig trwy wahanol lwybrau a dulliau signalau. Mae TGF-pi yn ysgogydd clasurol HSC ac yn gyfryngwr allweddol yn pathogenesis ffibrosis yr afu [28]. Gall CPhGs, echinacoside ac acteoside atal mynegiant mRNA a phroteinau sy'n gysylltiedig â llwybr TGF-pi/smad mewn HSCs.
Mae TGF-pi yn cyflawni ei effeithiau cellog trwy'r llwybr signalau smad, ac fe'i hystyriwyd yn gyfryngwr allweddol yn natblygiad ffibrosis yr afu a llid. Ar ôl rhwymo TGF-pi i'r derbynnydd TGF-p-math II, mae'r derbynnydd math II kinase yn ffosfforyleiddio parth GS y derbynnydd math I TGF-p, gan arwain at actifadu'r derbynnydd math I [29]. Trwy weithred p-smad2 a p-smad3 mewn dau weddillion serine ym motiff SSXS eu terfynell C, mae adweithiau i lawr yr afon o'r llwybr signalau smad yn cael eu gweithredu gan actifadu derbynnydd math I [30]. Mae P-smad2 a p-smad3 yn ffurfio cyfadeiladau oligomeric gyda smad4, yna'n mynd i mewn i'r cnewyllyn ac yn cyflawni eu gweithgaredd trawsgrifio biolegol. Felly, mae proteinau smad yn trosglwyddo signalau yn uniongyrchol o'r derbynnydd kinase i'r cnewyllyn [3i]. Ar y llaw arall, mae smad7 wedi'i gyfuno'n gadarn â derbynnydd TGF-pi, gan arwain at anallu smad 2/3 i gael ei actifadu yn ogystal ag atal y llwybrau trawsgludo signal [32]. Gall Smad7 weithredu i atal y p-smad2 a p-smad3, trawsleoli niwclear cyfadeiladau smad wedi'u actifadu, ac actifadu (CAGA) (9) -MLP-Luc, gan arwain at lai o fynegiant colagen I ac ataliad llwyr o drawsgludiad signal TGF-p [33,34]. Dangosodd ein canlyniadau y gall CPhGs, echinacoside ac acteoside leihau mynegiadau mRNA smad2 a smad3, a chynyddu mynegiant mRNA smad7; atal mynegiant protein smad2, p-smad2, smad3 a p-smad3, ac uwch-reoleiddio mynegiant protein smad7, gan awgrymu bod CPhGs, echinacoside ac acteoside hefyd yn chwarae rhan wrth atal actifadu HSC ac felly'n atal ffibrosis hepatig, gan amlygu gwrth-ffibrotic posibl mecanwaith.
Dangoswyd mai dilyniant effeithiau hepatoprotective y tri asiant profi oedd acteoside > CPhGs > echinacoside. Er mwyn egluro ymhellach y rhesymau dros y gwahaniaethau yn y mecanwaith y mae CPhGs, echinacoside ac acteoside yn amddiffyn rhag ffibrosis yr afu, dadansoddwyd eu strwythurau cemegol. Mae'n ymddangos bod y moiety glycoside alcohol phenethyl yn strwythur hanfodol ar gyfer yr effaith hepatoprotective [35]. Mae Acteoside (C29H36Oi5) yn glycoside dwbl, ac mae echinacoside (C35H46O20) yn triglycoside, hy, mae gan echinacoside glycoside ychwanegol yn ei strwythur o'i gymharu ag acteoside, sy'n arwain at gynnydd yn ei faint gofodol. Mae hepatoprotective neu ataliad gweithgaredd HSC o acteoside yn well na gweithgaredd echinacoside, a all fod oherwydd bodolaeth rhwystr sterig.
amddiffyn yr afu: cistanche extract
4. Adran Arbrofol
4.1. Cemegau ac Adweithyddion
Prynwyd TGF-pi gan Peprotech (Rocky Hill, NJ, UDA). Prynwyd llinell gell HSC-T6 gan Wuhan Procell Gene Bio-technology Co, Ltd (Wuhan, Tsieina). Prynwyd Dimethyl sulfoxide (DMSO) gan Sigma Inc. (St. Louis, MO, UDA). Cynhyrchwyd paent preimio Smad2, smad3 a smad7 gan Gwmni Biolegol a Thechnolegol Shanghai Sangon (Shanghai, Tsieina). Prynwyd pecyn synthesis cDNA llinyn cyntaf Revert Aid gan Thermo Scientific (Shanghai, Tsieina). Prynwyd pecyn PCR gwyrdd Quantifast SYBR oddi wrth QIAGEN GmbH (Hilden, yr Almaen). p-smad2 (ser465/467) gwrthgorff, Smad3 (C67H9) mAb cwningen a p-smad3 (ser423/425) mAb cwningen eu prynu oddi wrth Cell Signaling Technology (Boston, MA, UDA). Prynwyd gwrthgorff Smad7 gan Boster (Wuhan, Tsieina). Prynwyd gwrthgorff polyclonaidd Smad2 a gwrthgorff monoclonaidd p-actin gan Proteintech (Wuhan, Tsieina). Daethpwyd o hyd i wrthgorff cynradd gan ddefnyddio hydoddiant gwrthgorff 2 radd (Alc-Phos. Cyfunol, Gwrth-gwningen) a hydoddiant gwrthgyrff 2 radd (Alk-Phos. Conjugated, Anti-mouse) a brynwyd gan Invitrogen™ (Carlsbad, CA, UDA). Daeth pecyn assay dehydrogenase lactate o Sefydliad Biobeirianneg Nanjing Jiancheng (Nanjing, Tsieina).
4.2. Deunydd Planhigion
Casglwyd C. tubulosa o Tulufan, yn rhanbarth ymreolaethol Xinjiang Uirghur yn Tsieina, ym mis Mai 2006. Nodwyd y deunyddiau planhigion fel C. tubulosa gan Jiang He, Sefydliad Materia Medica o Xinjiang. Adneuwyd sbesimen taleb yn Sefydliad Materia Medica o Xinjiang yn Tsieina.
4.3. Ynysu a Phuro CPhGs a'i Gyfansoddion
Echdynnwyd rhisomau sych a sleisio o C. tubulosa (6.0 kg) yn olynol deirgwaith o dan adlif gyda 70 y cant ethanol (4.8 L), ac yna tynnwyd y toddydd o'r echdynion cyfun i i gynhyrchu'r echdyniad ethanol (1.146 kg). Cafodd yr echdynion ethanol eu puro gan resin AB-8 i gael echdyniad crai ffenyl ethanol glyc os ides (CPhG s). Ar ôl hydoddi d mewn dŵr, cafodd y weithred allanol ei buro gan gromatograffaeth resin macroporous AB-8 ad amsugno i gael cyfanswm ochrau glyco ffenyl ethanol o C. tubulosa (CPhGs, 210 g). Cymhwyswyd CPhGs ar golofn ODS OP{{1{0}} a'u hanwybyddu'n olynol gyda chymysgeddau o MeOH—H?.(0:1 -^1:0). Cyfunwyd Elua tes yn bum is-ffracsiwn yn ôl ymddygiad TLC gan ddefnyddio'r system hydoddydd CHCh-MeOH-H?.(6:4:0.5). Cafodd smotiau eu delweddu ar ôl chwistrellu gyda 1 y cant FeCih .Cafodd ffracsiynau amrywiol eu puro dro ar ôl tro gan gromatograffaeth colofn Sephadex LH -20 gyda methanol yn eluent, a chafodd dau glycosid ethanol ffenyl eu hynysu o'r CPhGs. Cadarnhawyd eu strwythurau fel echinacoside (C35H46O20) ac acteoside (C29H36O15) gan ddefnyddio MS, 1H-, a MC-NMR [35], y pennwyd purdebau i fod yn 99.17 y cant a 98.92 y cant, yn y drefn honno, gan UV-HPLC. Dangosir strwythurau echinacoside ac acteoside yn Ffigur 9.
4.5. Penderfyniad Meintiol o GPhGs
Cromatograffaeth hylif (HPLC) (LC{{{{{{250}}Cyflogwyd offeryn HPLC, Shimadzu Co., Kyoto, Japan) i ddadansoddi cynnwys echina coside a cteoside yn y CPhGs. Defnyddiwyd colofn ODS Phenomenex Gemini (250 x 4.6 mm, 5|^m) ar 30 gradd . Defnyddiwyd cyfnod symudol isocratig yn cynnwys methanol-acetonitrile-1 y cant o asid asetig (15:10:75, v/v/v) am rediad o 40 munud, ar gyfradd llif o 0.6 mL/min, gyda UV canfod ar 334 nm.
4.6. Diwylliant Cell
Cafodd celloedd HSC eu meithrin yng nghyfrwng addasedig Eagle's (Glwcos Uchel) Dulbecco (DMEM, Beijing, Tsieina) wedi'i ategu gan serwm buchol ffetws o 10 y cant (FBS, Gibco, Carlsbad, CA, UDA), 10 0 IU/mL penisilin a 100 ^g/mL streptomycin (HyClone, Logan, UT, UDA) mewn deorydd llaith ar 37 gradd gyda 5 y cant o CO2. Roedd y celloedd hyn yn cael eu his-feithrin yn rheolaidd gan ddatrysiad trypsin 0.25 y cant (1x) (HyClone, Logan, UT, UDA) a newidiwyd y cyfrwng bob 2 ddiwrnod. I ddechrau, cafodd celloedd eu meithrin gyda DMEM yn cynnwys 10 y cant FBS am 48 h. Yna disodlwyd y cyfrwng gyda DMEM heb FBS i newynu'r celloedd am 12 h. Cafodd y celloedd hyn eu lluosogi am 48 h ac Ar ôl 48 h, cafodd serwm ei newynu gyda 0.5 y cant FBS am 12 awr cyn ychwanegu 5 ng/mL TGF-&1,
4.7. Penderfynu Gwerthoedd IC50
Ar ôl deori dros nos mewn cyfrwng newyn yn cynnwys {{0}}.5 y cant FBS, cafodd celloedd HSC eu hadu mewn 96-plât ffynnon ar ddwysedd o 5 x 104 cell/mL am 24 h. Cafodd celloedd HSC eu trin â CPhGs, echinacoside ac acteoside mewn crynodiadau gwahanol (0, 3.90625, 7.8125, 15.625,31.25, 62.5, 125, 250, a 500 ^ g/mL) am 48h. Roedd gan bob crynodiad bedair ffynnon. Ar ddiwedd y driniaeth, mae 20 卩L MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid] (Sigma; 5 mg/mL) a chafodd y celloedd eu deor am 4 awr arall. Ychwanegwyd DMSO (200 rL) at bob ffynnon ar ôl tynnu'r supernatant. Ar ôl ysgwyd y plât am 10 munud ar ysgydwr, cafwyd y gwerthoedd IC50 trwy fesur yr amsugnedd ar donfedd 490 nm gan ddefnyddio offeryn labelu ensymau (Benchmark PLUS, Hercules, CA, UDA), gwnaed y assay hwn yn driphlyg. Gwerthoedd IC50 CPhGs, echinacoside ac acteoside oedd 119.125, 520.345 a 6.999 Rg/mL, yn y drefn honno.
4.8. Yr Effeithiau Atal Ymledol Celloedd a Hyfywedd Celloedd
Roedd celloedd HSC yn agored i grynodiadau gwahanol o CPhGs (25,50,100 Rg/mL), echinacoside (125,250,500 Rg/mL) ac acteoside (1.5,3, 6 Rg/mL). Rhoddwyd crynodiadau gwahanol o CPhGs, echinacoside ac acteoside ar y plât mewn pedair ffynnon yn olynol a'u deor am 48 h. Pennwyd effeithiau ataliad amlhau celloedd a lefel hyfywedd celloedd (yn seiliedig ar fesur gweithgaredd LDH a ryddhawyd o gelloedd difrodi i'r uwchnatur [36]) gan assay MTT. Cyfrifwyd y gyfradd atal gan ddefnyddio'r fformiwla ganlynol [37]:
Cyfradd atal ( y cant ) " [1 — (amsugnedd cyfartalog y grŵp arbrofol/amsugnedd cyfartalog y grŵp rheoli gwag)] x 100 y cant
Yn ôl cyfarwyddyd y pecyn,
LDH (U/L) {{0}} (OD wedi'i fesur — rheoli OD)/(OD safonol — blankOD) x 0.2 mmol/L x 1000
Dangosodd ein hastudiaeth ragarweiniol nad oedd CPhGs, echinacoside ac acteoside yn effeithio ar hyfywedd celloedd.
4.9. Gweithgareddau Gwrth-Amleidiol gan TGF-^1
Ystyrir ers tro bod HSC a weithredir gan TGF-p1 yn gysylltiedig â ffibrosis yr afu, a chynigiwyd ataliad ar gyfer twf HSC fel dull ar gyfer trin ffibrosis yr afu [36,38]. Pennwyd effeithiau gwrth-ymledol CPhGs, echinacoside ac acteoside ar HSCs a weithredwyd gan TGF-p1 gan assay MTT [39]. Gan ddefnyddio'r gweithdrefnau a'r crynodiadau o gyffuriau fel y disgrifir, y
roedd grwpiau arbrofol yn cynnwys y grŵp rheoli, grŵp TGF-pi, TGF-pi a gwahanol grwpiau cyffuriau crynodiad. Cafodd pob grŵp cell ac eithrio'r grŵp rheoli eu meithrin gyda DMEM yn cynnwys 5.0 ng/mL TGF-p1 (heb FBS) am 24 h. Cyfrifwyd gweithgaredd ataliol ar amlhau celloedd fel 100 x (amsugno cyfansawdd wedi'i drin - amsugno golau cefndir) / (amsugno'r model - amsugnedd golau cefndir).
4.10. Adwaith Cadwyn Polymerase-Trawsgrifio Cwith (RT-PCR)
Pennwyd lefel mynegiant mRNA smad2, smad3 a smad7 gan PCR amser real. Er mwyn pennu mynegiant mRNA mewn celloedd HSC, cafodd y celloedd (5 x 104 cell) eu hadu mewn platiau chwe ffynnon gyda 3.0 mL DMEM gyda 10 y cant FBS a'u deor dros nos ar 37 gradd a 5 y cant CO2. Ar ôl i gyfryngau diwylliant gael eu newid i DMEM di-serwm, ychwanegwyd CPhGs (100,50,25 卩g/mL), echinacoside (500,250,125 昭/mL) ac acteoside (6, 3,1.5 ^g/mL) at y ffynhonnau. Ar ôl deori am 48 h gyda CPhGs a chyfansoddiadau monomer, echdynnwyd cyfanswm RNA gan ddefnyddio adweithydd TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, UDA) a'i gynhyrfu'n egnïol â chlorofform am 15 s. Ar ôl caniatáu iddo sefyll ar dymheredd ystafell am 3 munud, cafodd y lysate ei allgyrchu ar 12,000 xg am 15 munud ar 4 gradd . Cafodd RNA yn y cyfnod dyfrllyd ei waddodi ag isopropanol, a throsglwyddwyd y cyfnod dyfrllyd uchaf i diwb microcentrifuge newydd. RNA ei waddodi drwy ychwanegu 0.75 y cant ethanol, ac ar ôl hynny y tiwb microcentrifuge a centrifuge ar 12,000 xg ar 4 gradd am ddim mwy na 5 munud. Tynnwyd y supernatant a sychwyd yr RNA ar dymheredd ystafell am 5-10 mun. Dyluniwyd y paent preimio (Sangon) gan ddefnyddio Swp Primer 3, ac fe'u rhestrir yn Nhabl 4. Cafodd y canlyniadau eu normaleiddio i mRNA y genyn cadw tŷ p-actin fel rheolaeth fewnol ac fe'u cyflwynir fel lefelau mRNA cymharol. Perfformiwyd adweithiau gyda 8 |^L iQ SYBR Green Supermix, 1 10 pM primer pair, 8.5 dŵr distyll, a 2.5 rL cDNA.
Perfformiwyd pob adwaith cadwyn polymeras o dan yr amodau canlynol: 95 gradd am 3 munud, yna 40 cylch o 10 s ar 95 gradd, 30 s ar 55 gradd, a 10 s ar 55 gradd -95 gradd ar gyfer estyniad, ac yna un mesuriad fflworoleuedd. Disgrifiwyd y canlyniadau terfynol gyda'r gwerthoedd cymharol (2_AACt). Perfformiwyd y cyfrifiad a'r dadansoddiad gan System Canfod PCR Amser Real iQ5.
4.11. Dadansoddiad Blotiau Gorllewinol
Paratowyd echdynion celloedd cyfan gan ddefnyddio byffer Radioimmunoprecipitation Assay (RIPA) (Thermo Fisher Scientific, Inc.) gydag atalydd proteas Halt 1 y cant ac atalydd atalydd ffosffatase Halt 1 y cant (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Defnyddiwyd cyfanswm y protein i ganfod smad2, p-smad2, smad3, p-smad3 a smad7. Cafodd y crynodiad protein ei fesur a'i feintioli gan ddull Bradford. Gwahanwyd protein (10-30 Rg) ar gel SDS-PAGE 10 y cant a'i drosglwyddo i bilenni fflworid polyvinylidene (PVDF) (Millipore, Boston, MA, UDA). Cafodd pilenni eu rhwystro am 1 awr ar dymheredd ystafell gyda albwmin serwm buchol 5 y cant, a'r gwrthgyrff cynradd (gwrthgorff polyclonaidd smad2, gwrthgorff p-smad2, mAb cwningen smad3 a mAb cwningen p-smad3, gwanhau 1:1000; cwningen mAb o smad7, 1 :200 gwanhau, gwrthgorff monoclonaidd p-actin, gwanhau 1:5000) wedi'u deor ar 4 gradd dros nos. Mae'r Alk-Phos cyfatebol. deorwyd gwrthgyrff eilaidd cyfun ar dymheredd ystafell. Yn olaf, golchwyd y pilenni dair gwaith gyda saline 1 x Tris-HCl gyda 0.1 y cant Tween 20, a chafodd signalau eu sganio a'u delweddu gan System Ddelweddu GEL DOC XR (Bio-Rad, Hercules, CA, UDA). Perfformiwyd dadansoddiad densitometrig ar y proteinau o ddiddordeb a'i normaleiddio i p-actin gan feddalwedd GEL DOC Image Studio (Bio-Rad). defnyddiwyd p-actin fel y rheolaeth fewnol.
4.12. Dadansoddiad Ystadegol
Mynegwyd data fel modd 土 gwyriad safonol (SD). Cynhaliwyd dadansoddiadau ystadegol gan ddefnyddio meddalwedd SPSS 16.0 (Prifysgol Feddygol Xinjiang). Defnyddiwyd dadansoddiad probit i ddadansoddi gwerthoedd IC50. Cyfrifwyd arwyddocâd gwahaniaeth gan brawf ANOVA unffordd, ac ystyriwyd bod gwerthoedd â p < 0.05="" yn="" ystadegol="">
5. Casgliadau
I gloi, mae CPhGs o C. tubulosa a'i gydrannau echinacoside ac acteoside yn dangos effeithiau gwrth-ffibrotic sylweddol. Yn eu plith, gweithgaredd acteoside yw'r mwyaf pwerus, tra bod gweithgaredd y CPhGs rhwng y ddau gyfansoddyn. Mae'n bosibl mai atal actifadu signalau TGF-p1/Smad yw'r mecanwaith sylfaenol y mae CPhGs yn ei ddefnyddio i amddiffyn rhag clefyd cronig yr afu sy'n gysylltiedig â ffibrosis, ac echinacoside ac acteosid yw sail deunydd gwrth-ffibrotic effeithiol C. tubulosa.
Diolchiadau:Cefnogwyd yr ymchwil hwn gan Sefydliad Cenedlaethol Gwyddoniaeth Naturiol Tsieina (81260624). Hoffai'r awduron fynegi eu diolch diffuant i'r Athro Tao Liu am wella'r ysgrifennu yn y papur hwn.
Cyfraniadau Awdur:TL, JZ, S.-PY, LM a S.-LZ a greodd a dyluniodd yr arbrofion. Dadansoddodd S.-PY, TL a JZ y data. Ysgrifennodd S.-PY a JZ y llawysgrif. Adolygodd TL, LM a JZ y llawysgrif. Darllenodd a chymeradwywyd y llawysgrif derfynol gan bob awdur.
Gwrthdaro Buddiannau:Nid yw'r awduron yn datgan unrhyw wrthdaro buddiannau.
Cyfeiriadau
1. Subramoniam, A. ; Pushpangadan, P. Datblygu ffytomeddygaeth ar gyfer clefydau'r afu. Ind. J. Pharmacol. 1999, 31,166-175.
2. Friedman, SL Mecanweithiau clefyd: Mecanweithiau ffibrosis hepatig a goblygiadau therapiwtig. Nat. Clin. Ymarfer. Gastroenterol Hepatol. 2004,1, 98-105. [CrossRef] [PubMed]
3. Friedman, SL; Rhôl, FJ; Boyles, J.; Bissell, DM Lifosytau hepatig: Prif gelloedd cynhyrchu colagen iau llygod mawr arferol. Proc. Natl. Acad. Sci. UDA 1985, 82, 8681-8685. [CrossRef] [PubMed]
4. Friedman, SL; Bansal, MB Gwrthdroi ffibrosis hepatig一 Ffaith neu ffantasi? H叩atoleg 2006, 43, S82-S88. [CrossRef] [PubMed]
5. Ahmad, A. ; Ahmad, R. Deall mecanwaith ffibrosis hepatig a dulliau therapiwtig posibl. Saudi J. Gastroenterol. 2012,18,155-167. [CrossRef] [PubMed]
6. Pedr, H. ; Cigfran; Zhang, LB Orobanchaceae Ventenat. Yn Flora of China, 23ain arg.; Pwyllgor Golygyddol Flora of China: Academi Gwyddorau Tsieineaidd, Beijing, Tsieina, 2013; tt. 1-16.
7. Tseiniaidd Pharmacopoeia Comisiwn Glanweithdra Gweriniaeth Pobl Tsieina. Pharmacopoeia Tsieineaidd; Rhan 1; Tŷ Cyhoeddi'r Diwydiant Cemegol: Beijing, Tsieina, 2010; p. 126.
8. Li, J. ; Huang, D.; Ef, L. Effaith roucongrong (Herba Cistanches Deserticolae) ar wenwyndra atgenhedlu mewn llygod a achosir gan glycoside o Leigongteng (Radix et Rhizoma Tripterygii). J. Traddodiad. Gên. Med. 2014, 34, 324-332. [CrossRef]
9. Xing, Y. ; Liao, J.; Tang, Y. ; Zhang, P.; Tan, C. ; NIH.; Wu, X. ; Li, N. ; Jia, X. Atalyddion agregu platennau ac ACE o Tamarix hohenackeri Bunge (planhigyn gwesteiwr Herba Cistanches) sy'n tyfu yn Xinjiang. Ffarmacon. Mag. 2014,10,111-118. [PubMed]
10. Jia, Y; Guan, Q. ; Jiang, Y.; Salh, B. ; Guo, Y. ; Tu, P. ; Du, C. Lledaeniad colitis a achosir gan sodiwm sylffad dextran mewn llygod trwy echdyniad wedi'i gyfoethogi gan echinacoside o Cistanche tubulosa. Phytother. Res. 2014, 28, 110-119. [CrossRef] [PubMed]
11. Wong, HS; Mae Ko, KM Herba Cistanches yn ysgogi beicio redox glutathione cellog gan rywogaethau ocsigen adweithiol a gynhyrchir o resbiradaeth mitocondriaidd mewn cardiomyocytes H9c2. Pharm. Biol. 2013, 51, 64-73. [CrossRef] [PubMed]
12. Martin, A. ; Clynes, M. Asid phosphatase: Endpoint ar gyfer profion gwenwyndra in vitro. Cell Vitro. Dev. Biol. 1991, 27, 183-184. [CrossRef]
13. Lechuga, CG; Hernandez-Nazara, ZH; Dominguez Rosales, JA; Morris, ER; Rincon, AR; Rivas-Estilla, AC; Esteban-Gamboa, A.; Mae Rojkind, M. TGF-01 yn modylu mynegiant matrics metalloproteinase-13 mewn celloedd stelate hepatig trwy fecanweithiau cymhleth sy'n cynnwys p38MAPK, PI3-kinase, AKT, a p70S6k. Yn. J. Physiol. Ffisiol yr Afu Gastrointtest. 2004, 287, G974-G987. [CrossRef] [PubMed]
14. Nguyen, J. ; Tang, SY; Nguyen, D.; Mae Alliston, T. Load yn rheoleiddio ffurfio esgyrn a mynegiant Sclerostin trwy fecanwaith sy'n ddibynnol ar TGFp. PLoS ONE 2013, 8, e53813. [CrossRef] [PubMed]
15. Pessah, M. ; Marais, J.; Prunier, C. ; Ferrand, N.; Lallemand, F.; Mauviel, A. ; Mae Atfi, A. C-Jun yn cysylltu â'r Sgïo oncoprotein ac yn atal gweithgaredd trawsgrifio Smad2. J. Biol. Cemeg. 2002, 277, 29094-29100. [CrossRef] [PubMed]
16. Ding, N. ; Yu, RT; Subramaniam, N.; Sherman, MH; Wilson, C.; Rao, R. ; Leblanc, M.; Coulter, S.; Efe, M. ; Scott, C.; et al. Mae derbynnydd Fitamin D / cylched genomig SMAD yn gatiau ymateb ffibrotig hepatig. Cell 2013,153, 601-613. [CrossRef] [PubMed]
17. Yang, FR; Ffang, BW; Lou, JS Effeithiau Pills Fufang Biejia Ruangan ar ffibrosis hepatig mewn vivo ac in vitro. Byd J. Gastroenterol. 2013,19, 5326-5333. [CrossRef] [PubMed]
18. Sakaida, I. ; Hironaka, K.; Kimura, T.; Terai, S.; Yamasaki, T.; Okita, K. Meddygaeth lysieuol Mae Sho-saiko-to (TJ-9) yn cynyddu metalloproteinases matrics mynegiant (MMPs) gyda mynegiant llai o atalydd meinwe metalloproteinasau (TIMPs) mewn cell stellate llygod mawr. Gwyddor Bywyd. 2004, 74, 2251-2263. [CrossRef] [PubMed]
19. Chen, M. ; Chen, J.; Tsai, C. ; Wang, W.; Chang, D.; Tu, DG; Hsieh, HY Rōl TGF-01 a cytocinau yn y gwaith o fodiwleiddio ffibrosis yr afu gan Sho-saiko-to mewn model rhwymedig dwythell llygod mawr/s. J. Ethnopharmacol. 2005, 97, 7-13. [CrossRef] [PubMed]
20. Bolarin, DM; Asin, marcwyr biocemegol y CE, cydrannau allgellog mewn ffibrosis yr afu a sirosis. Nig. QJ Hosp. Med. 2007,17, 42-52. [CrossRef] [PubMed]
21. Kong, D.; Zheng, S.; Lu, Y. Ffynhonnell a rôl myofibroblasts mewn ffibrosis yr afu. Gên. Ffarmacol. Tarw. 2011, 27, 297-300.
22. De Lavor, MSL; Binda, NS; Fukushima, FB; Caldeira, FMC; Da Silva, JF; Silva, Prif Swyddog Meddygol; de Oliveira, KM; Martins Bde, C.; Torres, BB; Rosado, IR; et al. Model ail-darlifiad isgemia mewn llinyn asgwrn cefn llygod mawr: Astudiaeth signalau hyfywedd celloedd ac apoptosis. Int. J. Clin. Exp. Pathol. 2015, 8, 9941-9949. [PubMed]
23. Bahadar, H. ; Maqbool, F. ; Niaz, K. ; Abdollahi, M. Gwenwyndra nanoronynnau a throsolwg o fodelau arbrofol cyfredol. Iran Biomed. J. 2016, 20, 1-11. [PubMed]
