Rhan 1: Mae Acteoside yn Atal Osteoclastogenesis Cyfryngol RANKL Trwy Atal Ymsefydlu C-Fos A Llwybr NF- KB A Gwanhau Cynhyrchu ROS
Mar 05, 2022
Cyswllt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-bost:audrey.hu@wecistanche.com
Seung-Youp Lee1,2., Keun-Soo Lee3.¤, Sea Hyun Yi2., Sung-Ho Kook, Jeong-Chae Lee22,3*
Haniaethol
Mae nifer o astudiaethau wedi nodi bod cytocinau llidiol yn gyfryngwyr pwysig ar gyfer osteoclastogenesis, gan achosi atsugniad esgyrn gormodol ac osteoporosis.Acteoside o berlysiau cistanche, mae gan brif gyfansoddyn gweithredol Rehmannia glutinosa, a ddefnyddir yn eang mewn meddygaeth Dwyreiniol draddodiadol, botensial gwrthlidiol a gwrthocsidiol. Yn yr astudiaeth hon, canfuwyd hynnyacteosidllesteirio gwahaniaethu a ffurfio osteoclast yn sylweddol o macroffagau mêr esgyrn (BMMs) a macroffagau RAW264.7 a ysgogwyd gan ysgogydd derbynnydd ligand ffactor niwclear-kappaB (NF-kB) (RANKL).Acteosideroedd rhag-driniaeth hefyd yn atal osteoclastau aeddfed rhag atsugniad esgyrn mewn modd dos-ddibynnol. Gwanhaodd Acteoside (10 mM) actifadu p38 kinase wedi'i ysgogi gan RANKL, kinases allgellog a reoleiddir gan signal, a kinase terfynell c-Jun N, a hefyd ataliodd actifadu NF-kB trwy atal ffosfforyleiddiad yr is-uned p65 a'r atalydd kBa. Yn ogystal, mae cynnydd wedi'i gyfryngu gan RANKL yn y mynegiant o c-Fos a ffactor niwclear celloedd T wedi'u actifadu, cytoplasmig 1 (NFATc1), ac mewn cynhyrchu necrosis ffactor-a tiwmor, interleukin (IL)-1b , ac mae'n debyg bod IL-6 wedi'u rhwystro gan ragdriniaeth acteoside. Ymhellach, llafaracteosidllai o golled esgyrn a achosir gan ofariectomi a chynhyrchiad cytocin llidiol i reoli lefelau. Mae ein data yn awgrymu bod acteoside yn atal gwahaniaethu osteoclast ac aeddfedu rhag rhagflaenwyr osteoclastig trwy atal actifadu kinases protein a ysgogir gan RANKL a achosir gan RANKL a ffactorau trawsgrifio fel NF-kB, c-Fos, a NFATc1. Gyda'i gilydd, mae'r canlyniadau hyn yn awgrymu y gallai acteoside weithredu fel asiant gwrth-atsugno i leihau colled esgyrn trwy rwystro gweithrediad osteoclast.
Rhagymadrodd
Mae asgwrn yn cael ei ailfodelu'n gyson gan weithgaredd osteoclast cytbwys ac osteoblast [1]. Mae osteoclastau yn deillio o gelloedd rhagflaenol hematopoietig y llinach monocyte/macrophage, tra bod osteoblastau o'r llinach mesenchymal [2]. Gall actifadu osteoclast annormal neu leihau osteoblastogenesis amharu ar homeostasis esgyrn, gan achosi clefydau fel osteoporosis, arthritis, a chanser esgyrn yn y pen draw [3,4]. Mae osteoporosis yn glefyd esgyrn cyffredin sy'n arwain at risg uwch o dorri asgwrn. Mae'r math mwyaf cyffredin o osteoporosis yn cael ei achosi gan ddiffyg estrogen mewn menywod menopos. Gall meddyginiaethau fel corticosteroidau a gwrth-epileptig hefyd achosi anghydbwysedd rhwng atsugniad esgyrn a ffurfio, a all arwain at osteoporosis [5].
Mae llawer o atalyddion gwrth-adferol gan gynnwys bisffosffonadau, calcitonin, estrogen, a modulatyddion derbynyddion estrogen dethol wedi'u defnyddio i drin osteoporosis. Mae'r atalyddion hyn yn cynnal màs esgyrn trwy atal swyddogaeth osteoclast [6]. Therapi amnewid estrogen yw'r driniaeth fwyaf poblogaidd i atal a thrin osteoporosis ôlmenopawsol. Fodd bynnag, gall therapi amnewid estrogen hirdymor gynyddu'r risg o ganserau endometrial a chanser y fron. Felly, mae llawer o ymchwilwyr wedi canolbwyntio eu hymdrechion ar ddatblygu asiant gwrth-adfer newydd nad oes ganddo sgîl-effeithiau [7-10]. Gan fod osteoclastau yn gweithredu mewn atsugniad esgyrn, mae atal osteoclastau yn benodol wedi cael ei ystyried fel y prif darged mewn nifer o astudiaethau.
Mae osteoclastau yn gelloedd anferth aml-niwclear a ffurfiwyd gan ehedyddion mononiwclear y teulu monocyte / macrophage trwy amlhau dilyniannol, gwahaniaethu, ac ymasiad celloedd rhagflaenol hematopoietig [11]. Mae ffactor ysgogol cytref Macrophage (M-CSF) ac ysgogydd derbynnydd ffactor niwclear (NF) -kB (RANK) ligand (RANKL) yn ffactorau hanfodol ar gyfer gwahaniaethu osteoclast [12]. Yn ogystal, mae nifer o cytocinau llidiol, megis ffactor necrosis tiwmor (TNF) ac interleukin (IL)-1b, yn cyfrannu at osteoclastogenesis trwy fodiwleiddio anwythiad RANKL, osteoprotegerin, a M-CSF [7,13]. Mae rhwymiad RANKL i wyneb y gell yn golygu bod derbynnydd RANK yn cynnwys cymhlygion ffactorau cysylltiedig RANKL/RANK/TNFR (TRAF) sy'n actifadu NF- kB a chinasau protein a weithredir gan mitogen (MAPKs), gan gynnwys c- Jun N-terminal kinase (JNK), t38 kinase, a kinase allgellog sy'n gysylltiedig â signal (ERK) [14]. Mae'r actifadu hwn yn chwarae rhan allweddol wrth gyfryngu gwahaniaethu osteoclast, actifadu, a goroesi. Mae RANKL hefyd yn actifadu mynegiant ffactorau trawsgrifio fel ffactor niwclear celloedd T wedi'u actifadu, cytoplasmig 1 (NFATc1), a c-Fos, sy'n hanfodol ar gyfer datblygiad osteoclast [7,9]. Felly, ystyrir mai signalau RANKL yw'r prif darged o gyfryngau gwrth-atsugno sy'n atal actifadu osteoclast a cholli esgyrn.
Acteosideyw prif gyfansoddyn gweithredol Rehmannia glutinosa, a ddefnyddir yn eang mewn meddygaeth Dwyreiniol traddodiadol [15,16]. Mae Acteoside yn gwrthocsidydd cryf ac mae ganddo weithgareddau gwrth-hepatotocsig, gwrthlidiol a gwrth-nociceptive [17-20]. Canfuom yn flaenorol fod acteoside yn lleihau gweithgaredd tyrosinase a biosynthesis melanin trwy reoleiddio signalau ERK [21], yn amddiffyn rhag difrod gingival wedi'i gyfryngu gan rywogaethau ocsigen adweithiol (ROS) [22], ac yn atal difrod celloedd wedi'i gyfryngu gan mycotocsin [23]. Mae'r effeithiau hyn yn gysylltiedig yn agos â gallu niwcleosidau i gael gwared ar ROS a rheoleiddio signalau trwy gyfrwng MAPK. Yn benodol, awgrymir ROS i gyfryngu llwybrau signalau a achosir gan RANKL a digwyddiadau cellog mewn osteoclastau. Roedd cyn-driniaeth â gwrthocsidyddion yn atal actifadu NF-kB, ERK, ac IkBa a achosir gan RANKL, a thrwy hynny atal osteoclastogenesis [24]. Roedd y canfyddiadau hyn yn awgrymu'n gryf, yn ogystal â gweithgaredd gwrthlidiol, bod gweithgaredd gwrthocsidiol yn hanfodol ar gyfer asiant gwrth-atsugno, felly gall acteoside atal osteoclastogenesis a achosir gan RANKL.
Yn yr astudiaeth bresennol, gwnaethom archwilio a yw acteosid yn cael effaith therapiwtig ar golli esgyrn. Fe wnaethom archwilio effeithiau acteoside ar wahaniaethu osteoclast ac atsugniad esgyrn a'r mecanweithiau cellog cysylltiedig gan ddefnyddio systemau arbrofol in vitro ac in vivo.
Mae cistanche acteoside yn atal osteoclastogenesis a achosir gan RANKL
Defnyddiau a Dulliau
Datganiad Moeseg
Cymeradwywyd arferion gofal a defnydd anifeiliaid gan Bwyllgor Moeseg wrth Ofalu a Defnyddio Anifeiliaid Labordy Prifysgol Genedlaethol Chonbuk (Rhif Trwydded CBU 2010-0007). Cynhaliwyd yr holl arbrofion yn yr astudiaeth hon yn unol â chanllawiau Pwyllgor Gofal a Defnydd Anifeiliaid y Brifysgol.
Llygod, Cemegau, a Nwyddau Labordy
Prynwyd llygod ICR benywaidd pedair wythnos oed gan Orient Bio Inc. (Seoul, Korea) a'u cadw yn 2261uC a 5565 y cant o leithder ar gylchred golau/tywyll 12 h gyda mynediad am ddim i fwyd a dŵr. Roedd acteoside (3,4-dihydroxy-bphenethyl-Oa-rhamnopyranosyl-(1R3)-4-O-caffeoyl-bD-glucopyranoside; C29H36O15) (Ffig. S1) wedi'i ynysu oddi wrth ddail Rehmannia glutinosa. Cafodd Acteoside ei hydoddi mewn halwynog wedi'i glustogi â ffosffad (PBS) cyn ei ddefnyddio. Prynwyd RANKL, TNF-a, IL-1b, IL-6, ac M-CSF oddi wrth R&D Systems (Minneapolis, MN, UDA). Cafwyd gwrthgyrff penodol i c-Fos, p65, p-p65, p-ERK, ERK, JNK, p-JNK, NFATc1, IkBa, p-IkBa, a b-actin gan Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, UDA ). Prynwyd gwrthgyrff ar gyfer p-p38 a p38 gan Cell Signaling Technology (Danvers, MA, UDA). Prynwyd Pecynnau EIA Assay Calsium ac Osteocalcin (OC) gan BioAssay Systems (Hayward, CA, UDA) a Biofeddygol Technologies (Stoughton, MA, UDA), yn y drefn honno, i bennu paramedrau biocemegol serwm. Defnyddiwyd pecyn asesu ffosffatas asid sy'n gwrthsefyll tartrad llygoden (TRAP) (Systemau Imiwnodiagnostig, Scottsdale, AZ, UDA) hefyd i fesur lefel TRAP5b serwm. Oni nodir yn wahanol, cafwyd cemegau ychwanegol gan Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, UDA), a daeth nwyddau labordy o SPL Life Sciences (Pochun, De Korea).
Diwylliannau Cell
Cafwyd celloedd mêr esgyrn o'r tibiae a femora o lygod ICR benywaidd 6 wythnos oed yn ôl dulliau a ddisgrifiwyd yn flaenorol [25]. Deorwyd y daliant mêr esgyrn mewn dysgl feithrin 100-mm ym mhresenoldeb M-CSF 50 ng/ml. Ar ôl 3 diwrnod, defnyddiwyd celloedd ymlynol fel macroffagau mêr esgyrn (BMMs) i ysgogi gwahaniaethu osteoclastig. Cafodd rhai celloedd mêr esgyrn eu deor hefyd am 48 h heb M-CSF, a chafodd celloedd ymlynol eu meithrin mewn cyfrwng gwahaniaethu osteoblast, fel y disgrifir mewn man arall [25]. Cafodd celloedd macrophage RAW264.7 eu meithrin yng nghyfrwng addasedig Eagle's Dulbecco (DMEM) wedi'i ategu â serwm buchol ffetws 10 y cant (FBS), 2 mM L- glutamine, a gwrthfiotigau. Defnyddiwyd y celloedd hyn fel llinell gell cyfatebol ar gyfer BMMs i archwilio effaith acteoside ar osteoclastogenesis.
Gwahaniaethu Osteoclastig a staenio TRAP
Cafodd BMMs eu trin ymlaen llaw gyda chrynodiadau amrywiol (0–50 mM) oacteosidam 2 awr cyn ysgogi gyda 100 ng/ml RANKL. Disodlwyd cyfryngau diwylliant â chyfryngau ffres ar ddiwrnodau 2 a 5. Ar ôl 7 diwrnod o ddeori, gosodwyd y diwylliannau mewn paraformaldehyd wedi'i glustogi gan PBS 4 y cant a'u staenio â TRAP gan ddefnyddio pecyn Sigma Aldrich yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Cafodd celloedd TRAP-positif eu cyfrif gan ddefnyddio microsgopeg optig, ac ystyriwyd bod celloedd sy'n cynnwys 3 neu fwy o gnewyllyn yn osteoclastau. Roedd celloedd RAW 264.7 hefyd yn agored i RANKL 100 ng/ml ar ôl rhag-drin ag acteoside am 2 h, ac ar ôl 7 diwrnod o ddeori, proseswyd y celloedd ar gyfer staenio TRAP.
Mesur Hyfywedd Celloedd
Pennwyd hyfywedd celloedd gan ddefnyddio adweithydd halen tetrazolium sy'n hydoddi mewn dŵr (WST)-8. Yn gryno, cafodd celloedd BMM neu RAW264.7 wedi'u meithrin mewn cyfrwng twf sy'n cynnwys 10 y cant FBS a gwrthfiotigau eu trin ag acteosid 10 mM neu gyfansoddyn ffenolig fel quercetin, luteolin, apigenin, neu epigallocatechin-3-gallate (EGCG). Ychwanegwyd adweithydd WST-8 i'r diwylliannau ar ôl 48 awr o ddeor. Ar ôl deori am 4 h ychwanegol, mesurwyd amsugnedd penodol WST-8- ar 450 nm gan ddefnyddio darllenydd microplate (Packard Instrument Co., Downers Grove, IL, UDA).
Assay Adsugniad Esgyrn
Ataliwyd BMMs (16105 o gelloedd/ml) mewn a-MEM sy'n cynnwys 50 ng/ml M-CSF a 100 ng/ml RANKL, yna wedi'u rhannu ar draws 24-plât ffynnon wedi'i orchuddio â nanocrystalau calsiwm ffosffad (OAAS{{6} }; Is-haen Assay Activity Osteoclast, Oscotec Inc., Choongnam, De Korea) ar ddwysedd o 26104 o gelloedd/cm2 gyda acteoside a hebddo. Ar ôl deori am 7 diwrnod, tynnwyd y celloedd o'r platiau gyda 5 y cant o sodiwm hypoclorit, a gwelwyd ffurfio pyllau o dan ficrosgop optig. Mesurwyd yr ardal a atsugnwyd hefyd gan ddadansoddwr delwedd a'i fynegi fel canran o'r gwerth rheoli.
Dadansoddiad Blotiau Gorllewinol
Paratowyd lysates protein cyfan mewn byffer lysis fel y disgrifir mewn man arall [26]. Paratowyd proteinau cytosolig a niwclear fel y disgrifiwyd yn flaenorol [25]. Gwahanwyd symiau cyfartal o brotein gan 12-15 y cant SDS-TUDALEN a'u blotio ar bilenni polyvinyl difluoride. Archwiliwyd y blotiau â gwrthgyrff cynradd dros nos yn 4uC cyn deor â gwrthgorff eilaidd mewn byffer blocio am 1 awr. Roedd y blotiau
wedi'i ddatblygu gyda chemiluminescence gwell (Amersham Pharmacia Biotech Inc., Swydd Buckingham, DU) ac yn agored i ffilm pelydr-X (Eastman-Kodak Co., Rochester, NY, UDA).
MAPK Assay Gweithgaredd
Roedd celloedd yn pretreated gydaacteosidam 2 awr ac yna wedi'i ysgogi gyda RANKL am-30 munud ychwanegol. Penderfynwyd ar weithgareddau MAPK gan ddefnyddio pecynnau profi imiwnometrig, megis y pecyn assay kinase p-p38 (Assay Designs, Inc., MI, USA), pecyn assay ensymau p-ERK (Assay Designs), a phecyn ELISA brechdanau p-SAPK/JNK (Technoleg Signalau Cell, MA, UDA). Roedd yr holl weithdrefnau'n dilyn cyfarwyddiadau'r gwneuthurwr, a chafodd amsugnedd ei fesur gan ddarllenydd microplate.
Assay Symud Symudedd Electrofforetig (EMSA)
Perfformiwyd adweithiau rhwymo DNA-protein am 30 munud ar dymheredd yr ystafell, gyda phrotein 10-15 mg mewn byffer 20 ml yn cynnwys 1 mg/ml BSA, 0.5 mg/ml poly (dI-dC), 5 y cant glyserol , 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 10 mM Tris-Cl (pH 7.5), 50 mM NaCl, 30, 000 cpm o [a-32P] oligonucleotides label-label dCTP, a'r darn Klenow o DNA polymeras. Gwahanwyd y samplau ar geliau polyacrylamid 6 y cant, a gafodd eu sychu a'u hamlygu i ffilm pelydr-X (Eastman Kodak Co.) am 12-24 h ar 270uC. Y dilyniannau preimio oligonucleotide penodol ar gyfer NF-kB oedd 59-AAG GCC TGT GCT CCG GGA CTT TCC CTG GCC TGG A-39 a 39-GGA CAC GAG GCC CTG CTG AAA GGG ACC GGA CCT GGA A -59.
Assay Luciferase NF-kB
Trawsnewidiwyd macroffagau RAW264.7 mewn 24-platiau ffynnon â 0.8 mg fector gohebydd kB-luciferase gan ddefnyddio 2 ml o Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, UDA) yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Ar 24 h ar ôl trawsgludiad, ysgogwyd y celloedd â RANKL ym mhresenoldeb ac absenoldeb acteoside am 24 h. Cafodd celloedd eu hailddarparu mewn byffer lysis gohebydd 100 ml
(Promega, Madison, SyM, UDA). Rhoddwyd yr un faint o samplau protein mewn 96-microblatiau ffynnon a'u cymysgu â swbstrad luciferase. Mesurwyd luminescence trwy ddefnyddio luminometer microplate (MicroLumat Plus LB 964, Berthold Technologies, Bad Wildbad, yr Almaen). Yn yr arbrawf hwn, defnyddiwyd peptid atalydd NF-kB athraidd (BIOMOL, Butler Pike, PA, UDA) fel atalydd kB positif.
Mesur Cytocinau
Cafodd celloedd BMM neu RAW264.7 eu hysgogi gyda RANKL ym mhresenoldeb acteosid mewn 24-blatiau meithrin ffynnon. Ar ôl 48 h o ddeori, casglwyd ac aseswyd supernatants meithrin gan ELISA gan ddefnyddio pecynnau OptEIATM penodol TNF-a-, IL-1b- ac IL-6-yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr.
Trawsgrifio Gwrthdroi Amser Real- Adwaith Cadwyn Polymerase (RT-PCR)
Pennwyd mynegiant mRNA o farcwyr osteoclastig, megis c-Fos, NFATc1, a TNF-a, gan RT-PCR amser real. Yn gryno, echdynnwyd cyfanswm RNA o macroffagau gydag adweithydd Trizol yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr (Invitrogen). Cafodd cDNA ei syntheseiddio ag 1 mg o gyfanswm RNA gan ddefnyddio SuperScript Reverse Transcriptase II a paent preimio (Invitrogen). Defnyddiwyd Power SYBR Green PCR Master Mix (Biosystems Cymhwysol, Foster City, CA, UDA) i ganfod y casgliad o gynnyrch PCR yn ystod beicio gyda system canfod dilyniant ABI 7500 (Biosystemau Cymhwysol). Ar ôl dadnatureiddio ar 95uC am 10 munud, roedd PCR
perfformio gan ddefnyddio deugain 3-cylchred cam o ddadnatureiddio ar 95uC am 15 eiliad, anelio ar 60uC am 1 eiliad, ac estyniad ar 72uC am 30 eiliad. Perfformiwyd yr holl adweithiau PCR mewn triphlyg o leiaf, a normaleiddiwyd y lefelau mynegiant i'r genyn cadw tŷ HPRT yn yr un adwaith. Defnyddiodd yr astudiaeth hon yr un dilyniannau paent preimio a ddisgrifir mewn mannau eraill [7].
Mesur ROS Mewngellol
Paratowyd hydoddiant stoc o 29,79-dichlorodihydrofluorescein-diasetate (DCFH-DA) (579- mM; Calbiochem, Darmstadt, yr Almaen) yn DMSO a'i storio ar 220uC yn y tywyllwch. Yn gryno, cafodd BMMs (106 cell/ml mewn 6-blatiau ffynnon) eu meithrin gyda 50 ng/ml M-CSF am 24 awr ac yna eu trin â chrynodiadau amrywiol (0-10 mM) oacteosid2 awr cyn ysgogiad gyda 100 ng/ml RANKL. Ar ôl 1 h o gyd-deoriad, deorwyd y celloedd hyn gyda 25 mM DCFH-DA am 30 munud. Cofnodwyd fflworoleuedd gwyrdd o 29,79-dichlorofluorescein (DCF) ar 515 nm (FL 1) gan ddefnyddio system FACS VantageH (Becton-Dickinson, San Jose, CA, UDA), a 10,000 cyfrifwyd digwyddiadau fesul sampl.
Sefydlu Osteoporosis a Achosir gan Ovariectomi
Defnyddiwyd llygod ICR benywaidd (6 wythnos oed) ar gyfer yr astudiaeth hon. Derbyniodd llygod lawdriniaeth ffug (Sham, n =10) neu lawdriniaeth ovariectomized (OVX, n=20) o dan anesthesia. Wythnos ar ôl llawdriniaeth, rhannwyd y llygod OVX ar hap yn 2 grŵp o 10 llygod yr un: OVX dwyochrog ac OVX dwyochrog wedi'i ategu â 200 ml
PBS yn cynnwys acteosid 1 mM ar lafar (grŵp AC). Roedd acteosid y geg yn cael ei roi unwaith bob 3 diwrnod am 8 wythnos ar ôl llawdriniaeth, a
rhoddwyd yr un faint o PBS i'r grwpiau Sham ac OVX. Ar ôl 1 diwrnod o'r weinyddiaeth ddiwethaf, aberthwyd llygod ac yna dadansoddwyd paramedrau biocemegol mewn serwm a 3-strwythur esgyrn dimensiwn.
Penderfynu Paramedrau Biocemegol Serwm
Casglwyd samplau gwaed trwy dyllu cardiaidd a chasglwyd serwm trwy allgyrchiad. Storiwyd samplau serwm ar 280uC ar gyfer dadansoddiadau o baramedrau biocemegol. Amcangyfrifwyd lefelau serwm IL-1b ac IL-6 drwy ddefnyddio’r pecyn ELISA fel y disgrifir uchod, tra bod gweithgarwch ffosffatase alcalïaidd (ALP) yn cael ei bennu drwy ddefnyddio assay colorimetrig biocemegol sy’n mesur faint o p. -nitrophenol a gynhyrchir o swbstrad ffosffad p-nitrophenol, fel y disgrifir mewn man arall [27]. I amcangyfrif biofarcwyr ffurfiant esgyrn ac atsugniad, pennwyd lefelau serwm OC, calsiwm a TRAP5b hefyd yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwyr.
Dadansoddiadau o Strwythur Esgyrn a Pharamedrau Morffometrig
Cafodd femora llygod (grwpiau Sham, OVX, ac AC) eu dyrannu a'u llenwi â halwynog ffisiolegol ar gyfer profion mecanyddol. Mesurwyd cryfder mecanyddol y ffemwr fel y disgrifir mewn man arall [28]. Cofnodwyd y llwyth torri asgwrn fel y grym brig mewn newtonau ar y pwynt y mae siafft ganol toriad y forddwyd dde. Yn ogystal, dadansoddwyd ffemwr ysgafn pob anifail yn histo-morphometrically gan ddefnyddio system tomograffeg microgyfrifiadur (micro-CT) (system pelydr-X microfocus SkyScan 1076, Kontich, Gwlad Belg). Yn gryno, cafodd yr esgyrn mewn storfa fformaldehyd 4 y cant eu sychu'n arwynebol ar feinwe papur cyn eu lapio mewn ''cling-film'' plastig neu mewn paraffilm, i atal sychu yn ystod sganio. Rhoddwyd pob asgwrn wedi'i lapio â phlastig mewn tiwbiau ewyn plastig/polystyren a gafodd eu gosod yn fertigol yn llorweddol yn siambr sampl sganiwr 1076 ar gyfer
delweddu micro-CT. Cyflawnwyd y sganio gan ddefnyddio foltedd ffynhonnell 100 kV a cherrynt ffynhonnell 140 mA gyda chydraniad o 35 mm.
Ail-grewyd modelau tri dimensiwn o esgyrn trabeciwlar y forddwyd gan ddefnyddio fersiwn SkyScan CT Analyzer 1.11. Mae'r paramedrau strwythurol megis dwysedd esgyrn trabeciwlaidd mwynau (BMD, g/cm3), cyfaint esgyrn y cant (cyfaint esgyrn (BV) / cyfaint meinwe (TV), y cant ), trwch (Tb.Th, mm), gwahanu (Tb.Sp Yna mesurwyd , mm), a rhif (Tb.N, 1/mm).
Assay Gwahaniaethu Osteogenig a Mwyneiddio Celloedd mêr esgyrn wedi'u meithrin mewn {{{{10}}} platiau meithriniad ffynnon wedi'u trin â DAG (10 nM dexamethasone, asid asgorbig 50 mM, a 20 mM b-glyceroffosffad) yn y presenoldeb acteoside 10 mM. Ar ôl 2 wythnos o wahaniaethu, gosodwyd y celloedd ag ethanol oer iâ 70 y cant (cyfrol / cyfaint) am 1 awr a'u staenio â 0.2 y cant alizarin coch S mewn dŵr distyll am 30 munud ar dymheredd yr ystafell. Ar ôl i'r celloedd gael eu cadw a'u sychu yn yr aer, gwerthuswyd y platiau meithrin celloedd gan ficrosgopeg ysgafn gan ddefnyddio microsgop gwrthdro (Nikon TS100, Japan). I fesur faint o liw coch, cafodd y staen ei guddio â 10 y cant acetyl pyridinium clorid trwy ysgwyd am 20 munud a mesurwyd yr amsugnedd ar 560 nm. Mesurwyd faint o galsiwm a adneuwyd yn yr haenau celloedd hefyd gan ddefnyddio pecyn Calsiwm C (Wako Chemical Inc. Osaka, Japan) yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Yn ogystal, pennwyd mynegiant marcwyr mRNA asgwrn-benodol, megis ffactor trawsgrifio cysylltiedig â rhediad-2 (Runx2), osterix, sialoprotein asgwrn (BSP), ac OC gan RT-PCR amser real. Dyluniwyd paent preimio oligonucleotide o'r marcwyr hyn gyda meintiau cynnyrch yn llai na 200 bp gan ddefnyddio Primer Express Software 3.0 (Biosystemau Cymhwysol) fel y disgrifir mewn man arall [27].
acteoside cistanche yn rhoi hwb i ffurfiant esgyrn
Canlyniadau
Mae Acteoside yn Atal Ffurfiant Osteoclast gan Macrophages mewn modd sy'n dibynnu ar ddos
I wirio effaith acteoside ar wahaniaethu BMM i osteoclastau, cafodd y celloedd eu meithrin â chrynodiadau amrywiol (0 - 20 mM) o acteoside am 7 diwrnod ym mhresenoldeb 50 ng/ml M- CSF a 100 ng/ml RANKL. Gostyngodd Acteoside nifer yr osteoclastau mewn modd sy'n dibynnu ar ddos. Pan fydd y celloedd yn pretreated gyda 10 mM acteoside am 2 f, gostyngodd y nifer osteoclast gan 43 y cant o'i gymharu â chelloedd ategu gyda M-CSF a RANKL (Ffig. 1 A). Mae Ffig. 1B yn dangos y gwahaniaethiad osteoclast wedi'i gyfryngu gan RANKL a'i ataliad trwy driniaeth gyfunol ag acteosid. Yn gyson â'r canlyniad hwn, gostyngodd pretreatment acteoside y gwahaniaethu a ysgogwyd gan RANKL o gelloedd RAW264.7 a ffurfio osteoclast (Ffig. 1C a D). Pan gymharwyd potensial gwrth-osteoclastig acteoside ar BMMs â photensial gwrth-osteoclast nifer o gyfansoddion ffenolig ar yr un crynodiad (10 mM), dangosodd luteolin y gweithgaredd uchaf (Ffig. 2A). Fodd bynnag, gostyngodd luteolin, quercetin, neu apigenin ei hun hyfywedd y celloedd (Ffig. 2 B). Roedd yr holl gyfansoddion yn atal gwahaniaethu osteoclastig gan RAW264.7 macroffagau gyda'r gweithgareddau cymharol canlynol: luteolin. quercetin=apigenin .
Cistanche acteoside Yn atal Osteoclast
