Rhan 2: Moleciwl Anafiadau Arennau-1 A yw'n Dderbynnydd Posibl ar gyfer SARS-CoV-2

Am fwy o wybodaeth. cyswllttina.xiang@wecistanche.com

Amlygiadau clinigol o coronafirws

1. Mae'r cyfnod magu yn hir, a'r prif symptomau yw twymyn, blinder, dolur gwddf, a pheswch. Gall y dwymyn fod yn dwymyn uchel, yn dwymyn gymedrol, neu'n dwymyn isel;

2. Nid yw babanod a'r henoed yn nodweddiadol ac yn aml mae gwichian a dyspnea yn cyd-fynd â nhw. Mewn achosion difrifol, gall difrod aml-system ddigwydd;

3. Mae'r peswch sych yn y cyfnod cynnar yn bennaf paroxysmal a difrifol, yn debyg i'r pas, sy'n effeithio ar gwsg a gweithgareddau; yn y cyfnod diweddarach, mae'r peswch yn sbwtwm, mae'r sputum yn ddieflig, weithiau'n cynnwys ychydig bach o waed, ac mae gwichian yn cyd-fynd â rhai;

4. Mae gan rai cleifion symptomau ysgafn ac efallai na fydd ganddynt dwymyn. Mae gan y rhan fwyaf o gleifion brognosis da, ac mae nifer fach o gleifion yn ddifrifol wael neu hyd yn oed yn marw;

5. Syndrom trallod anadlol acíwt, sioc septig, asidosis metabolig anhydrin, a chamweithrediad ceulo.

Sut i atal y coronafirws newydd, gwella'ch imiwnedd eich hun yw'r ffordd fwyaf effeithiol i bobl frwydro yn erbyn y firws. Gelwir Cistanche, sydd wedi cael ei ddefnyddio fel trysor maethlon ers yr hen amser, yn "anialwchginseng" ac mae'n frenin hybu imiwnedd. Cistanche - Brenin Hybu Imiwnedd

Mae ymchwil feddygol fodern wedi profi, yn ogystal â swyddogaethau maethu a chryfhau'r corff, bod Cistanche yn cael effeithiau iachaol sylweddol wrth atal tiwmorau, gwrth-heneiddio, gwrth-arhythmia, atal apoptosis, a gwella imiwnedd. ffafr.

Mae'rcyfanswm glwcosidau Cistancheyw cydrannau gweithredol ginseng i reoleiddio swyddogaeth imiwnedd, a all wella swyddogaeth imiwnedd nid yn unig i bobl arferol ond hefyd i bobl â swyddogaeth imiwnedd isel.

Mae arsylwi clinigol wedi cadarnhau bod gan Cistanche effaith iachaol benodol ar diwmorau malaen, ac mae ganddo'r effaith amlwg o gynyddu leukocytes. Gall cymryd ginseng yn ystod radiotherapi a chemotherapi leihau effeithiau gwenwynig a sgîl-effeithiau radiotherapi a chemotherapi, cyflymu'r broses o atgyweirio meinwe sydd wedi'i niweidio, ac atal leukopenia;

Trafodaeth

I ymladd yn erbyn yPandemig{0}} COVID, dealltwriaeth ddofn o sutSARS-CoV-2goresgyn celloedd dynol yn cael ei warantu. Mae astudiaethau wedi nodi haint uniongyrchol o SARS-CoV-2 yn yarenyn ychwanegol at yr ysgyfaint (Braun et al., 2020; Farkash et al., 2020). Fodd bynnag, ACE2 yw'r unig dderbynnydd a gydnabyddir yn dda o hyd a allai gyfryngu'r goresgyniad hwn. Ar ben hynny, tropiaeth arennol SARS-CoV-2 a chysylltiediganaf i'r arennauymddangos yn anesboniadwy gan y lefel gymharol is o ACE2 ar ymlediad firaol (Kuba et al., 2005). Yma, mae ein hastudiaeth yn awgrymu bod KIM1, biomarcwr sydd wedi'i uwchreoleiddio'n sylweddol ar gyfer anaf i'r arennau (Yang et al., 2015), yn cyfryngu goresgyniad arennau SARS-CoV-2 fel derbynnydd.

Gwelsom hefyd fod SARS-CoV-2-RBD yn clymu i KIM1 gydag affinedd uwch nag un SARS-CoV-RBD a MERS-COV-RBD, sydd fwy na thebyg yn sail i heintiad cryfach SARS-CoV-2 (Rabaan et al, 2020); felly, mae'n werth ailedrych ar yr haint arennol a rolau KIM1 yn y clefydau anadlol difrifol hyn. Yn nodedig, mae ein canlyniadau'n awgrymu safleoedd rhwymol penodol KIM1 ac ACE2 ar RBD firaol, felly mae'n werth ymchwilio a yw KIM1 ac ACE2 yn cyfryngu goresgyniad SARS-CoV yn yr organau hyn a sut. Yn ogystal, gan fod KIM1 wedi'i endocytosi trwy lwybrau sy'n ddibynnol ar clathrin (Zhao et al., 2016), byddai hefyd yn ddiddorol archwilio ymhellach y broses ddibynnol KIM ar ôl ymlyniad firaol i'r gellbilen.

ACE2 yw'r derbynnydd a astudiwyd fwyaf ar gyfer SARS-CoV-2, ac eto nid yw'n darged therapiwtig delfrydol ar gyfer COVID-19, gan ei fod wedi'i fynegi'n eang mewn organau lluosog ac mae'n chwarae rhan hanfodol wrth reoleiddio pwysedd gwaed ac atal anaf i'r galon/arennau (Imai et al., 2005; Li et al., 2020d). Mewn cyferbyniad, mae gan KIM1 gysylltiad cryfach â gweithrediad yr arennau a chaiff ei fynegi'n uchel dim ond ar ôlanaf arennol(Kondratowicz et al, 2011; Yuan et al, 2015; Costafreda a Kaplan, 2018), sy'n ei wneud yn darged therapiwtig mwy penodol ac efallai hefyd yn fwy diogel ar gyfer cleifion COVID-19 â chlefydau'r arennau.

I grynhoi, mae ein data yn awgrymu rôl hanfodol KIM1 mewn tropiaeth arennol SARS-CoV-2 fel derbynnydd posibl ar gyfer SARS-CoV-2. Yma, rydym yn cynnig model o 'gylch dieflig' wedi'i gyfryngu gan KIM1 ac ACE2 (Ffigur 5G), a allai esbonio tropiaeth arennol SARS-CoV-2 mewn-19 cleifion COVID. Yn ystod cam cychwynnol goresgyniad SARS-CoV-2, mae'r lefel ffisiolegol uwch (Ffigur Atodol S1) ac affinedd rhwymol (Tabl Atodol S1) yn golygu mai ACE2 yw'r prif darged, nad yw'n benodol i'r arennau. Fodd bynnag, ar ôl i AKl a achosir gan firws ddechrau, mae'r KIM1 sydd wedi'i uwchreoleiddio'n sylweddol yn hyrwyddo'n gyflym haint firaol eilaidd wedi'i gyfryngu gan KIM1 ac ACE2, sy'n fwy penodol i'r arennau, ac o ganlyniad yn gwaethygu difrod i'r arennau mewn cylch dieflig (Ffigur 5G). Gall dulliau a all dorri'r rhyngweithio rhwng SARS-CoV-2 a KIM1, gan gynnwys gwrthgyrff gwrth-KIM1, atalyddion moleciwlaidd bach, a pheptidau antagonist sy'n deillio o KIM, daflu goleuni ar COVID-19 triniaeth.

Defnyddiau a dulliau

Defnyddiau

Recombinant SARS-CoV-2-RBD (T80302) was obtained from Genscript. Antagonist peptide 1 (AP1, SCSLFTCQNGIV, purity >95%) and antagonist peptide 2 (AP2, SCSLFTCQNGGGWF, purity >95 y cant ) wedi'u syntheseiddio'n gemegol gan Genscript. Cafwyd gwrthgorff gwrth-llygoden-lgG (p/n 18-8816-33) a gwrth-gorff gwrth-gwningen-lgG (p/n 18-8817-33) o Rockland. IgG gyda SureBeads" Prynwyd gleiniau magnetig Protein G (J2112LB-02) gan Bio-Rad. Roedd DAPI (D9542) gan Sigma. Roedd Alex Flour 594 â'r label phalloidin (C2205S) o Beyotimes. Gwrthgyrff yn erbyn KIM1 (NBP{{ Defnyddiwyd 15}}, Novus Biologicals), Flag (F1804, Sigma), HA (H6908, Sigma), ac ACE2 (2115-1-AP, Proteintech).

Caffael a dadansoddi proffiliau mynegiant KIM1 ac ACE2

Er mwyn cael y proffiliau trawsgrifio a phrotein cynhwysfawr o KIM1 ac ACE2 ar gyfer meinweoedd dynol, casglwyd a dadansoddwyd y data trawsgrifio a phroffiliau protein yn seiliedig ar imiwn-histocemeg o Atlas Protein Dynol (HPA, https://www.proteinatlas.org), a ddangosodd y mynegiant a lleoleiddio proteinau dynol ar draws meinweoedd ac organau, yn seiliedig ar ddilyniant dwfn o RNA (RNA-seq) o 37 meinwe arferol ac imiwn-histocemeg ar ficro-araeau meinwe sy'n cynnwys 44 math o feinwe (Uhlen et al., 2015). Cofnodwyd meinwe HPA RNA-seq o'r genyn codio protein fel trawsgrifiadau codio protein cymedrig fesul miliwn (pTPM), sy'n cyfateb i werthoedd cymedrig samplau o bob meinwe. Dadansoddwyd lefelau mynegiant protein yn seiliedig ar histoleg â llaw yn bedair lefel (heb eu canfod, isel, canolig ac uchel). Yn Ffigur Atodol S1, rhestrir y 10 lefel trawsgrifio meinwe uchaf a lefelau mynegiant protein yn seiliedig ar histoleg o KIM1 ac ACE2, yn y drefn honno, a cheir crynodeb o broffil mynegiant gorgyffwrdd KIM1 ac ACE2.

Efelychiadau tocio moleciwlaidd a dynameg

Cynhaliwyd dociau trwy Z-Dock (http://zdock. umassmed.edu/). Strwythurau crisial SARS-CoV-RBD (PBD ID 2AJF), ​​SARS-CoV-2-RBD (PDB ID 6MOJ), MERS-COV-RBD (PDB ID 4L3N), ACE2 (PDB ID 1R42), a KIM1 Ig Defnyddiwyd parth V (PDB ID 5DZO) i chwilio am fodelau rhwymol posibl. Dewiswyd y cyfadeiladau protein â'r sgôr orau ar gyfer yr efelychiadau deinameg moleciwlaidd canlynol, a gynhaliwyd gan weinydd Desmond a'u dadansoddi gan Pymol2.3 a Maestro11.8.012. Cymhwyswyd y diagram efelychiadau dynameg 50 ns i astudio paramedrau deinamig y cyfadeiladau protein . Cyfrifwyd ynni rhydd rhwymol MM-GBSA gan HawkDock (Misini lgnjatovic et al., 2016).

Gwyriad sgwâr cymedrig gwraidd (RMSD) ac amrywiad sgwâr cymedrig gwraidd (RMSF)

Defnyddiwyd RMSD i amcangyfrif y newid cyfartalog mewn dadleoli detholiad o atomau ar gyfer ffrâm benodol fel y disgrifiwyd (Li et al., 2011). Cynhaliwyd RMSF i astudio'r newidiadau dadleoli yn y gadwyn brotein (Li et al., 2011) .

Modelau llygoden AKI a qPCR

Perfformiwyd anaf I/R ar lygod C57BL/6 fel y disgrifiwyd gennym yn flaenorol (Chen et al, 2015, 2017). Ar gyfer AKI a achosir gan cisplatin, chwistrellwyd cisplatin pwysau corff 30 mg/kg yn fewnberitoneol i 8-lygod gwrywaidd wythnos oed, ac aberthwyd llygod 3 diwrnod yn ddiweddarach. Casglwyd samplau gwaed ac arennau i'w dadansoddi ymhellach, gydag n=4 ar gyfer pob grŵp anifeiliaid arbrofol. Cafodd cyfanswm RNA ei ynysu oddi wrth yr arennau gan RNAiso Plus (TaKaRa) a'i drawsgrifio'n ôl yn cDNA gan ddefnyddio system synthesis llinyn gyntaf M-MLV (Invitrogen). Aseswyd digonedd trawsgrifiadau genynnau penodol gan qPCR. Darperir preimwyr a ddefnyddiwyd yn yr astudiaeth (Tabl Atodol S4).

Yn adeiladu

Plasmidau mynegiant mamalaidd ar gyfer dynol KIM1, KIM1 Ig V (gweddillion KIM1 aa 20-127), KIM1 △lg V (KIM1 cwtogi heb weddillion aa 20-127), KIM1-CFP, KIM1 lg V-CFP, ACE2, SARS-CoV-2-RBD(SARS-CoV-2-S gweddillion aa 319-541), SARS-CoV-2-S, SARS-CoV{{20} }}Crëwyd RBD-YFP, a TIM4-YFP. Cafodd cynhyrchion ymhelaethu PCR o'r darnau cDNA cyfatebol eu clonio i fector pRK seiliedig ar hyrwyddwr sy'n cynnwys naill ai HA neu dag FLAG. Roedd plasmidau cysylltiedig â SARS-CoV yn anrhegion caredig gan Dr. PHWang ym Mhrifysgol Shandong.

Diwylliant celloedd a thrawsnewidiad

Cafodd llinell gell tiwbaidd yr arennau dynol HK-2 (a gafwyd o China Centre for Type Culture Collection) ei meithrin mewn cyfryngau DMEM/F12 (Hyclone) yn cynnwys 17.5 mM o glwcos a 10 y cant o serwm buchol ffetws. Er mwyn gwerthuso effaith SARS-CoV-2 ar gelloedd, trosglwyddwyd celloedd HK-2 â SARS-CoV-2-S a SARS-CoV-2-plasmidau RBD ac yna casglwyd ar eu cyfer canfod ymhellach.

Cyd-IP

Cafodd celloedd HK{0}}/HEK293T (1 × 10) a nodwyd eu gosod mewn byffer cyn-lysis 1 ml (25 mM Tris-HCl, pH7.4,150mM NaCl, 1 y cant NP-40, 1mM EDTA, 5 glyserol y cant), sy'n cael ei lunio ar gyfer profion tynnu i lawr ac IP ac fel byffer golchi ar gyfer gleiniau. Ar gyfer IP, roedd lysate cell wedi'i imiwnoprecipitated gyda'r gwrthgorff a nodwyd neu'r gG priodol gyda gleiniau magnetig SureBeadsTM Protein G dros nos yn 4C. Ar ôl golchi gyda byffer cyn-lysis sy'n cynnwys 500 mM NaCl, cafodd y gleiniau eu berwi mewn byffer llwytho a bu'n destun imiwnoblotting (Wan et al., 2017).

Assay FRET

Canfuwyd rhyngweithio mewngellol rhwng KIM1 a SARS-CoV-2-RBD gan assay safonol yn seiliedig ar FRET (Karpova a McNally, 2006) gan ddefnyddio KIM{5}}CFP a SARS-CoV-2-RBD-YFP . Yn gryno, cafodd plasmidau mynegiant mamalaidd yn mynegi KIM1-CFP neu KIM1 Alg V-CFP eu cyd-drawsgludo â SARS-CoV-2-RBD-YFP i-293gelloedd T. Ar gyfer canfod sy'n seiliedig ar sbectroffotomedr fflworoleuedd, cafodd celloedd eu casglu a'u gorchuddio 24 awr ar ôl y trawsgludiad, a chanfuwyd y lysad gan Sbectroffotomedr Fflworoleuedd F-2700 (Hitachi) trwy sgan tonfedd(500-600nm) a sgan amser (435 /527 nm, cyffro/allyriad). Ar gyfer canfod confocal, cafodd celloedd eu delweddu gyda microsgop confocal Leica TCS SP8 o dan lens gwrthrychol pŵer uchel (40 ×) (sianel CFP: 435/485 nm, cyffro / allyriad; sianel YFP : 485/527nm, cyffro / allyriad; Sianel FRET: 435/527 nm, cyffro / allyriad) (Li et al, 2020b). Roedd cyd-drawsnewid CFP a YFP heb ei gyfuno wedi'i gynnwys fel rheolaeth negyddol fel y disgrifiwyd (Karpova a McNally, 2006). Canfuwyd rhyngweithio rhwng KIM1 a'i ligand TIM4 gan assay FRET fel rheolaeth gadarnhaol (Rong et al, 2011).

Cyfryngodd CRISPR-Cas9-cyfryngu o KIM1

Defnyddiwyd y protocolau seiliedig ar CRISPR-Cas ar gyfer peirianneg genom fel y disgrifiwyd (Zhang et al., 2017). Darperir dilyniannau targed RNA canllaw ar gyfer KIM1 (Tabl Atodol S4).

Labelu FITC a microsgopeg confocal

Perfformiwyd label FITC fel y disgrifiwyd gennym yn flaenorol (Li et al, 2020b; Zhang et al., 2020). Yn gryno, deorwyd SARS-CoV-2-RBD â FITC (cymhareb molar 1:5) dros nos, ac yna ychwanegwyd NHCl 5 mM i atal yr adwaith a diffodd y FITC nad oedd yn adweithio. Cafodd yr hydoddiant ei ddialyzed ddwywaith a'i lyoffileiddio i'w ddefnyddio ymhellach.

Cafodd celloedd HEK293T (5×109) neu gelloedd HK-2 (1×107) eu deor â FITC am ddim neu FITC-SARS-CoV{8}}RBD （100ug/ml ar gyfer 2. Ar gyfer profion mewnoli ar sail peptid, ychwanegwyd AP1 neu AP2 (50μM) ar y cyd â FITC-SARS-CoV-2-RBD (100 ug/m). Ar ôl gosod fformaldehyd 4 y cant (w/v), cafodd cellbilenni eu staenio ag Alex Flour 594 wedi'i labelu â phalloidin (2ug/ml), a chafodd y niwclysau eu staenio gan DAPI (1ug/m), ac yna eu delweddu gyda Leica TCS SP8 microsgop confocal. Ar gyfer pob grŵp, cafodd o leiaf 100 o gelloedd o bum maes o dan lens gwrthrychol pŵer uchel (64 ×) eu cynnwys yn yr asesiad. Cyflwynwyd delweddau cynrychioliadol. Cynhaliwyd meintioli delweddau gan ImageJ1.8.0.

Profion hyfywedd celloedd

Roedd celloedd wedi'u platio ar 3000-4000 o gelloedd y ffynnon mewn 96-blatiau ffynnon. Ar gydlifiad 80 y cant, cafodd celloedd sydd wedi'u deor â SARS-CoV-2-RBD （100 ug/ml） eu trin gyda neu heb AP1 neu AP2 (10,50,100 μM）. Ar ôl hynny, ychwanegwyd MTT 10ul (5 mg/ml) at bob un

yn dda ar gyfer 4h, tynnwyd y cyfrwng, ac ychwanegwyd DMSO. Cafodd amsugno wedi'i fesur ar 490nm ei normaleiddio i'r grŵp rheoli priodol.

Dadansoddiad ystadegol

Mynegwyd data fel cymedrig±SD. Aseswyd gwahaniaethau sylweddol gan brawf Myfyriwr dwy gynffon. Gwerth P dwy ochr<0.05 was="" considered="" statistically="" significant.="" analyses="" were="" performed="" with="" excel="" 2017="" and="" graphpad="" prism="">