Poly- Ac Oligosaccharide Ulva Sp. Mae Ffracsiynau O Echdynnu â Chymorth Ensym yn Modiwleiddio Metabolaeth Matrics Allgellog
Aug 30, 2022
Cysylltwchoscar.xiao@wecistanche.comam fwy o wybodaeth
Crynodeb:Ulva sp. gwyddys ei fod yn ffynhonnell cyfansoddion bioactif fel faniau, ond nid yw eu gweithgaredd biolegol ar fatrics allgellog ffibroblast dermol dynol (ECM) wedi'i adrodd yn dda. Yn y gwaith hwn, ymchwiliwyd i reoleiddio ECM am y tro cyntaf ar lefelau proteomig a thrawsgrifomig mewn ffibroblastau dermol arferol y croen dynol, ar ôl 48 h o ddeor gyda ffracsiynau poly- ac oligosaccharid o Ulva sp. a gafwyd ar ôl echdynnu a depolymerization gyda chymorth ensymau. Dangoswyd cynnydd ymlediad celloedd (hyd at a 68 y cant ) heb arddangos unrhyw effaith sytotocsig ar ffibroblastau yn 50 a 1000ug/ml gan y ddau ffracsiynau. Ar y lefel proteomig, roedd ffracsiynau polysacarid ar 1000 ug/ml yn gwella synthesis glycosaminoglycans (GAGs, hyd at plws 57 y cant), cyfanswm colagen, yn enwedig mathau I (hyd at plws 217 y cant) a Ⅲ, yn ogystal â'r synthesis a gweithgaredd MMP-1 (Matrix Metalloproteinase-1, hyd at plws 309 y cant). Mewn cyferbyniad, nid oedd ffracsiynau oligosaccharid yn cael unrhyw effaith ar synthesis GAGs ond yn dangos tebygrwydd ar gyfer colagenau a rheoleiddio MMP-1.fitamin piwritaniaid cAr y lefel trawsgrifiad, cadarnhaodd y gostyngiad mewn mynegiant COL1A1 a COL1A2, a chynnydd mynegiant COL3A1 a MMP-1 fodiwleiddio metaboledd ECM gan y ddau ffracsiwn. Mae ein hymchwil yn pwysleisio bod poly- ac oligosaccharid Ulva sp. mae ffracsiynau yn arddangos gweithgareddau biolegol diddorol ac yn cefnogi eu defnydd posibl ym maes adnewyddu croen ar gyfer cymwysiadau dermo-cosmetig gwrth-heneiddio.
Geiriau allweddol:colagen; matrics allgellog; ffibroblast dermol dynol; matrics metalloproteinase; gwymon; Ulva sp.
1. Rhagymadrodd
Llanw gwyrdd ar raddfa fawr a achosir gan Uloa sp. wedi bod yn rheolaidd yn Llydaw (Ffrainc) oherwydd ewtroffeiddio morol. Mae llinynnau o wymon gwyrdd yn cael effeithiau ecolegol andwyol dwys gan gynnwys newid strwythur yr ecosystem, lleihau bioamrywiaeth frodorol, a cholledion economaidd [1,2]. Ac eithrio defnydd fel diwygiad pridd, porthiant anifeiliaid, neu ddiraddiad syml trwy bydredd neu hylosgiad o ddigwyddiadau sownd, ychydig iawn sy'n hysbys am valorization Uloa sp. mewn iechyd dynol [1]. Fodd bynnag, mae Ulloa sp. yn ffynhonnell bwysig o gyfansoddion fel ulfanau. Evans, gall polysacaridau cellfur sylffad sy'n hydoddi mewn dŵr, sy'n cynnwys rhamnose, asidau wronig, a xylose yn bennaf, gynrychioli hyd at 36 y cant o bwysau sych Ulloa [3]. Y ddwy brif uned deusacarid ailadroddus o ulfan yw asidau aldobiuronig (asidau ulfanobiuronig), math A: -D-asid glwcwronig (1,4)-yn gysylltiedig â -L-rhamnose 3-sylffad, a math B: -L- asid iduronic (1,4) - wedi'i gysylltu â -L-rhamnose 3-sylffad. Mae mân deusacaridau aldoses, a elwir yn ulvanobioses (math U) hefyd i'w cael mewn ulfan[3.4]. Gall echdynnu ulfan o ran cnwd meintiol ac ansawdd amrywio'n sylweddol yn ôl y dulliau echdynnu a ffracsiynu a ddefnyddir ar gyfer y biomas. Mae wlfanau yn cael eu hechdynnu'n gyffredin mewn hydoddiant dyfrllyd ar dymheredd uchel (80-90 gradd ) y cyfeirir ati fel proses maceration. Fodd bynnag, gellir adennill Evans trwy dechnoleg werdd newydd o'r enw Echdynnu â Chymorth Ensym (EAE)[5]. Mae EAE yn caniatáu echdynnu cyfansoddion o ddiddordeb heb ddefnyddio amodau dadnatureiddio megis toddyddion neu dymheredd echdynnu uchel, ac mae ganddo fanteision amrywiol megis effeithlonrwydd catalytig uchel, penodoldeb uchel, amodau adwaith ysgafn, a chadwraeth gweithgareddau biolegol y cyfansoddion. Mae EAE hefyd yn gwella'r cynnyrch ac yn lleihau'r gost a'r defnydd o ynni o'i gymharu â phroses maceration clasurol [6-9]. Ar ôl echdynnu dyfrllyd o'r maceration neu broses newydd fel EAE, mae'r cyfoethogiad ulfan yn aml yn cael ei berfformio gan weithdrefn dyddodiad ethanolig [3]. Mae Ulvans wedi dangos nifer o weithgareddau biolegol in vitro ac in vivo megis imiwnofodyliad, gwrthocsidydd, gwrthganser, gwrthgeulo, gwrthhyperlipidemig, neu wrthfeirysol [3,5,10-14].sistancheMae nodwedd strwythurol Evans (graddfa sylffiad, patrwm sylffiad, cyfansoddiad monosacarid, cysylltiadau glycosidig, gradd canghennog, yn ogystal â phwysau moleciwlaidd) yn effeithio ar ei weithgaredd biolegol [3]
Mae heneiddio croen yn broses gymhleth gyda dwy broses gyflenwol: cynhenid (genetig, metaboledd cellog, ac ati) ac anghynhenid (amlygiad UV, llygredd, ysmygu tybaco, ac ati)[15-17]
Gall Cistanche gwrth-heneiddio
Mae'r defnydd o fioactifau gwymon fel ffynonellau cynhyrchion gwerth ychwanegol uchel ar gyfer y diwydiant dermo-cosmetig newydd ymddangos. Ymhlith y cyfansoddion bioactif hyn, mae gan ulfanau botensial uchel. Yn wir, mae gofynion defnyddwyr am gynhyrchion naturiol yn cynyddu yn y blynyddoedd diwethaf, sy'n gwneud cynhyrchion morol ac yn enwedig gwymon yn ffynhonnell ddiddorol o gynhwysion naturiol sy'n targedu harddwch ac iechyd croen [18-22]. Mae'r croen, targed cynhyrchion cosmetig, wedi'i wneud o dair prif haen sy'n gorgyffwrdd: epidermis, dermis, a hypodermis.beth yw cistancheMae'r dermis yn cynnal yr epidermis ac yn gartref i gelloedd croen pwysig a elwir yn ffibroblastau. Yn y bôn, mae ffibroblastau, prif gelloedd y dermis papilari a geir o dan yr epidermis, yn syntheseiddio a threfnu'r matrics allgellog (ECM). Mae'r ECM yn cynnwys macromoleciwlau amrywiol gan gynnwys colagenau (70 y cant o'r pwysau sych) yn bennaf math I a III, elastin (2-4 y cant), glycoproteinau (ffibronectin, laminin, ac ati), glycosaminoglycans (GAGs) naill ai'n sylffedig (heparan). sylffad, dermatan sylffad, sylffad keratan, sylffad chondroitin) a di-sulfated (asid hyaluronig), proteoglycans, a chydrannau diraddiol megis MMPs (Matrix Metalloproteinases)[23,24]. Mae colagen TypeI yn cynrychioli hyd at 80 y cant o gyfanswm colagen [25] ac mae'n un o brif gyfansoddion y dermis croen ECM; mae'n ymwneud ag elastigedd croen, hyblygrwydd a thensiwn. Mae colagen Math I yn heterotrimer, protein helics triphlyg, sy'n cynnwys dwy gadwyn cl ac un gadwyn c2 wedi'i godio gan enynnau COL1Al a COL1A2 [26]. Mae colagenau ffibrilaidd Math Iand II yn cynrychioli dros 90 y cant o gyfanswm colagen ac mae cysylltiad agos rhyngddynt â chroen [27,28]. Mae colagen Math II yn fwy cyffredin mewn croen ifanc na chroen oed ac mae'n ymwneud yn arbennig â gwella clwyfau [29,30]. Er mwyn sefydlu rhwydwaith moleciwlaidd ar gyfer cydosod ECM, mae GAGs yn gysylltiedig â phroteinau ac yn ffurfio proteoglycans (ee, decorin neu versican) sy'n rhyngweithio â cholagen math I [31] O fewn yr ECM, MMPs, sy'n ensymau o'r llwybr catabolaidd ECM, yn gysylltiedig, mewn ffurf gudd neu weithredol, â'u hatalydd meinwe o metalloproteinases a elwir yn TIMPs, sy'n rheoleiddio eu gweithgaredd [32]. MMP-1(collagenase-1) yw'r prif ensym sy'n gyfrifol am ddiraddiad colagen math I, a TIMP-1 yw ei atalydd priodol [334]. Mae ffibroblasts yn rheolyddion allweddol cartrefostasis ECM. Mae cydbwysedd a chyplu synthesis rhwng cydrannau ECM croen sy'n ymwneud ag anaboliaeth, megis colagenau typeI a II, GAGs, neu TIMPs, ac mewn cataboliaeth fel MMPs, yn caniatáu adnewyddu ac ailfodelu parhaus yr ECM hwn[25]. , y prif ganlyniad yw anghydbwysedd yn y rheoliad ECM gyda gostyngiad ymlediad ffibroblast, modiwleiddio lefelau cydrannau ECM gyda gostyngiad pwysig o synthesis colagen math I, secretion GAGs, a synthesis TIMP-1, a'r cynnydd mewn synthesis colagen math I. Lefel MMP-1 [24,35].
Am y tro, dim ond ychydig o astudiaethau sydd wedi ymchwilio i effaith Ulva sp. ffracsiynau ar fetaboledd celloedd croen ffibroblast ar lefelau proteomig a thrawsgrifomig[36-39]a, hyd yn hyn, ni chynhaliwyd astudiaeth gyflawn ar y lefel proteomig a thrawsgrifomig ar ffracsiynau poly-ac oligosaccharid Ulua sy'n deillio o'r broses EAE.Cistanche gwrth heneiddioYn y persbectif hwn, mae'r astudiaeth hon yn ymchwilio, in vitro, i effeithiau ffracsiynau poly- ac oligosaccharid o Ulva sp. yn deillio o dechnoleg werdd newydd EAE ar fetaboledd ffibroblastau dermol dynol. Astudiwyd eu heffeithiau ar amlhau a hyfywedd ffibroblast ac ar anaboliaeth ECM a chataboledd ar lefelau proteomig a thrawsgrifio er mwyn amlygu eu potensial mewn gofal croen (ee, gwrth-heneiddio).
2. Canlyniadau
2.1 Ffracsiynau Poly-ac Oligosaccharid o Ulva sp.
o EAE Arddangosyn Gwahanol Gyfansoddiad Biocemegol a Dosbarthiad Pwysau Moleciwlaidd
Manylir ar fecanweithiau cynhyrchu ffracsiynau poly- ac oligosaccharid yn yr adran Deunydd a Dulliau: "4.2 Cynhyrchu a Nodweddu Ffracsiynau Poly-ac Oligosaccharid". Dadansoddiadau nodweddu biocemegol manwl blaenorol (carbohydradau, asidau wronig, grwpiau sylffad, a phroteinau) a moleciwlaidd dosbarthiad pwysau'r ffracsiynau poly-ac oligosaccharid o Ulloa sp. yn deillio o EAE eu perfformio [36]. Mae’r data wedi’u cyfuno yn Nhabl 1.
Yn gryno, mae ffracsiynau polysacarid o ulfanau crai (UE) ac ulfanau dialyzed (DS-UE) yn cynnwys ulfanau pwysau moleciwlaidd uchel (faniau crai) gyda 23.5-37.4 y cant o garbohydradau,18.5-37. 0 y cant o asidau wronig,29.9-49.1 y cant o grwpiau sylffad, ac 10.5-12.8 y cant o broteinau. Roedd cyfansoddiad carbohydradau yn bennaf yn rhamnose (50 y cant) ac asid glwcwronig (11 y cant). Mae'r ffracsiwn DS-UE yn sylweddol gyfoethocach mewn ulfanau na'r ffracsiwn UE. Mae ffracsiynau oligosacarid, faniau depolymerized o HzO2 (DEP-HD PP-UE) a faniau depolymerized o resin Amberlite (DEP-AD PP-UE), yn cynnwys faniau pwysau moleciwlaidd isel gyda 24.4-30.4 y cant o garbohydradau ( rhamnose 44.9-55.4 y cant ac asid glwcwronig 7.5-11.0 y cant ), 21.6-30.8 y cant o asidau wronig, a 12.8-16.8 y cant proteinau.
Fodd bynnag, arweiniodd y broses depolymerization at golled rhannol o sylffadau (heb ei ganfod yn DEP-ADPP-a dim ond 6.6 y cant yn DEP-HD PP-UE). Dangosodd y dosbarthiad pwysau moleciwlaidd (Mw) o ffracsiynau oligosacarid Mw isel ar gyfartaledd o 8kDa ar gyfer DEP-HD PP-UE ac is ar gyfer DEP-AD PP-U gyda 1.5 kDa.
2.2 Ffracsiynau Poly-ac Oligosaccharid o Ulva sp. Ysgogi Gweithgaredd Metabolaidd Ond Peidiwch ag Effeithio ar Hyfywedd Fibroblasts
Aseswyd gweithgaredd metabolaidd ffibroblastau dermol dynol arferol (NHDF), 48h-agored i ffracsiynau Ulloa poly-ac oligosaccharid (50 a 100 ug/mL am 48 h) gan WST-1 (Ffigur 1). Yn yr arbrofion hyn (n=9), cynyddodd ffracsiynau Ullva o EAE amlder ffibroblastau hyd at plws 68 y cant o'i gymharu â rheolaeth.cistanche benefíciosCynnydd sylweddol mewn gweithgaredd metabolig (t<0.001)were observed="" for="" both="" ue="" and="" ds-ue="" at="" 50="" and="" 1000="" ug/ml.="" oligosaccharide="" fractions="" exhibited="" a="" higher="" and="" more="" significant="" rise="" of="" metabolic="" activity="" at="" 100="" ug/ml="" (p=""><0.001) than="" at="" 50="" ug/ml(no="" significance="" for="" dep-hd="" pp-ue="" and="" lower="" significance,=""><0.05, for="" dep-ad="">
Er mwyn pennu a oedd yr effeithiau hyn yn gysylltiedig â dim gwenwyndra cell, aseswyd hyfywedd celloedd a driniwyd ag echdyniad Ulou trwy fesur rhyddhad LDH (dehydrogenase lactate) gan ddefnyddio assay gradd CytoTox96 ar ôl 48 h o ddeor (n=3)(Ffigur 2). Dangosodd yr assay cytotoxicity nad oedd yr holl ffracsiynau'n arddangos unrhyw sytowenwyndra arwyddocaol o'i gymharu â'r rheolaeth.
2.3 Ffracsiynau Poly-ac Oligosaccharid o Ulva sp. Ysgogi Metabolaeth Matrics Allgellog mewn Fibroblasts
Gwerthuswyd effaith ffracsiynau Ulloa poly-a oligosaccharid ar synthesis glycosaminoglycans sulfated a di-sulfated (GAGs) ffibroblast gyda staen glas Alcian ar ôl 48 h o ddeor (n=4)(Ffigur 3). Dim ond ar 100 ug/mL y gwelwyd cynnydd synthesis sylweddol ar gyfer UE a DS-UE o ystyried y ddau sylffedig (p<0.01,+39% and="" +51%,respectively)="" and="" non-sulfated="" gags=""><0.05,+44% and="" +57%="">
Mae'n ddiddorol nodi bod DS-UE, y ffracsiwn ulfanau cyfoethocaf, wedi gwella synthesis GAGs fwyaf. Ar 50 ug/mL, cododd UE a DS-UE synthesis GAGs heb fod yn sylffad ond nid yn sylweddol (yn ogystal â 14.2 y cant a plws 22.7 y cant yn y drefn honno). Gostyngodd ffracsiynau oligosaccharide DEP-AD PP-UE ar 1000 ug/mL synthesis GAGs nad yw'n sylffad ond nid yn sylweddol (-3 y cant ), a gwellodd DEP-HD PP-UE synthesis GAGs ychydig ond nid yn sylweddol ar 100 ug/ mL (yn ogystal â 4.1 y cant ar gyfer sulfated a plws 10.9 y cant ar gyfer nonsulfated).
Gwerthuswyd cyfanswm synthesis colagen (Ffigur 4) gan assay Red Sirius ar ôl amlygiad i ffibroblastau 48 h i ffracsiynau Ulloa poly- ac oligosaccharid (n=7 ar 100 ug/mL ac n{5}} ar 50 ug/mL） .
Dangosodd yr holl ffracsiynau gynnydd dibynnol mewn synthesis colagen. Nodwyd dirywiad ymylol ac nid arwyddocaol mewn synthesis colagen ar gyfer yr holl ffracsiynau ar 50 ug/mL o'i gymharu â rheolaeth. Mewn cyferbyniad, ar 1000 ug/mL, cododd pob ffracsiwn gyfanswm synthesis colagen ac mewn modd arwyddocaol ar gyfer UE ( ynghyd â 22 y cant ,p<><0.01),and dep-hd=""><>
Gwerthuswyd effaith ffracsiwn EAE poly- ac oligosaccharid ar synthesis colagen math I (n=6) a synthesis MMP-1(n=4) gyda phrofion ELISA (Ffigur 5).
Roedd yr holl ffracsiynau'n gwella synthesis colagen math I a synthesis MP-1 ond nid bob amser yn arwyddocaol. Roedd cynnydd synthesis colagen Math I yn dibynnu ar ganolbwyntio. Canfuwyd bod ffracsiynau polysacarid, UE a DS-UE, ar 1000 ug/mL, yn sylweddol （p<05）increase type="" i="" collagen="" synthesis="" (+122%,="" and="" +217%="" respectively)="" and="" mmp-1="" synthesis="" (+309%="" and="" +169%="">
Effeithiau ffracsiynau Ulloa poly-ac oligosaccharid ar 100 ug/mL, ar ôl datguddiad ffibroblastau 48 h, ar synthesis colagenau math I(n=5) a math Ⅲ(n=4), ar y gwerthuswyd cynhyrchu MMP-1(n=6)a TIMP-1(n=5) gan ddadansoddiad Western blot (WB) gyda dull normaleiddio gan ddefnyddio'r dull protein lôn gyfan ( Ffigur 6).
Yn Ffigur 6a, e, a WB yn y drefn honno amlygodd gynnydd mewn colagen math I aeddfed （≈130kDa） a cholagen aeddfed math III （≈190 kDa）synthesis ar gyfer pob ffracsiynau. Datgelodd meintioli protein yn Ffigur 6c o golagen math I a Ffigur 6g o golagen math III gynnydd NS (ddim yn ystadegol arwyddocaol) yn eu synthesis ym mhresenoldeb poly-ac oligosaccharides Ulloa sp. ffracsiynau. Yn y cyfamser, roedd WB yn Ffigur 6b,d yn caniatáu i ni feintioli （t<05）increase of="" mmp-1="" production="" （≈50kda）for="" polysaccharide="" fractions="" and="" not="" significant="" for="" oligosaccharide="" ulloa="" eae-derived="" fractions="" dep-ad="" pp.="" ue="" and="" dep-hd="" pp-ue.="" wb="" quantification="" of="" timp-1="" production="" （≈20kda）,="" available="" in="" figure="" 6f,h,="" showed="" only="" a="" significant="" increase="" in="" presence="" of="" the="" dep-hd="" pp-ue="" fraction=""><0.05), while="" other="" fractions="" had="" no="" significant="">
Pennwyd gweithgaredd collagenase MMP-1 gan assay zymography ym mhresenoldeb ffracsiynau Ulloa poly- ac oligosaccharid ar 100 ug/mL （Ffigur 7a）, wedi'i feintioli, a'i gymharu â rheolaeth (Ffigur 7b), ar ôl datguddiad ffibroblastau 48h (n =4).
Datgelodd y canlyniadau fod poly-ac oligosaccharid Ulva sp. nid yw ffracsiynau wedi cynyddu gweithgarwch MMP-1 ffibroblastau yn sylweddol.
2.4.Poly-ac Oligosaccharid Ffracsiynau o Ulva sp. Modylu'n Wahanol Mynegiant Genynnau ECM o Fibroblastau
Astudiwyd effaith ffracsiynau poly- ac oligosaccharid Ulloa EAE ar lefelau cyflwr cyson mRNA sawl cydran matrics allgellog (COL1A1, COL1A2, COL3A1, MMP-1, a TIMP-1)(n =4)(Ffigur 8).
Gwelsom fod yr holl ffracsiynau ar 1000 ug/mL wedi gostwng yn sylweddol (t<0.01 and=""><05)col1a1 mrna="" steady-state="" levels="" (figure="" 8a).="" in="" contrast,="" we="" noted="" that="" all="" fractions="" increased="" mmp-1="" mrna="" level="" expression="" significantly="" (p="" <="" 0.05)="" for="" ue="" at="" both="" concentrations="" and="" ds-ue="" at="" 50="" ug/ml="" only="" (figure="" 8c).="" timp-1="" mrna="" steady-state="" level="" was="" not="" significantly="" changed,="" but="" dep-hd="" pp-ue="" and="" dep-ad="" pp-ue="" reduced="" it="" not="" significantly="" at="" 50="" ug/ml="" (figure="" 8e).="" the="" col1a2="" mrna="" steady-state="" level="" (figure="" 8b)="" is="" enhanced="" (ns)="" for="" both="" ue="" concentrations="" and="" ds-ue="" at="" 50="" ug/ml.="" however,="" it="" is="" lower="" at="" 1000="" ug/ml="" for="" ds-ue="" (ns),="" dep-hd="" pp-ue,="" and="" dep-ad="" pp-ue="" (only="" significant="" at="" 1000="" ug/ml="" for="" the=""><0.05). polysaccharide="" fractions,="" ue="" and="" ds-ue,="" raised="" col3a1="" mrna="" level="" expression="" significantly=""><0.05) at="" 1000="" ug/ml="" and="" at="" 50="" ug/ml="" for="" ue="" (ns="" for="" ds-ue)(figure="" 8d).="" oligosaccharide="" fractions,="" dep-hd="" pp-ue,="" and="" dep-ad="" pp-ue,="" at="" 1000="" ug/ml="" raised="" not="" significantly="" col3a1="" mrna="" level="" expression="" and="" reduced="" it="" at="" 50="" μg/ml（significant="" only="" for="" dep-ad=""><>
Mae Tabl2 yn dangos y canlyniadau cyfun ar lefel cyflwr cyson genyn mRNA ar ôl amlygiad ffibroblast i ffracsiynau ar 1000 ug/mL.
Mae Tabl 2 yn dangos bod UE wedi gostwng yn sylweddol (t<0.01)col1al and="" increased="" signifi-cantly=""><0.05) mmp-1="" and="" col3a1,="" and="" not="" significantly="" col1a2mrna="" steady-state="" levels.="" for="" ds-ue,="" dep-hd="" pp-ue,="" and="" dep-ad="" pp-ue,="" similar="" mrna="" steady-state="" levels="" with="" a="" decrease="" in="" col1a1=""><0.01), in="" col1a2(only="" significant=""><0.05 for="" dep-ad="" pp-ue),="" increase="" in="" col3a1="" (only="" significant=""><0.05 for="" ds-ue),="" increase="" in="" mmp-1(ns),="" and="" no="" significant="" change="" in="" timp-1="" mrna="" expression="" were="">
Mae'r erthygl hon Mar. Drugs 2021, 19, 156. https://doi.org/10.3390/md19030156 https://www.mdpi.com/journal/marinedrugs
