Rhagfynegi Rôl LncRNA mewn Heneiddio Arennau Ar Sail Dilyniannu RNA Ⅱ

Cydberthynas lncRNA Gm43360 a'i mRNAs targed posibl

Dewiswyd LncRNA Gm43360 i'w astudio oherwydd ei fod yn cysylltu dau rwydwaith cydfynegi lncRNA-mRNA. Roedd cydberthynas gadarnhaol rhwng lefel mynegiant Adra1a (rho=0.8650, p=0.026) a lefel Gm43360, Csnk1a1 (casein kinase 1A1) yn negyddol (rho{{12) }}.8084, p=0.0084) (Ffig. 5a). Er mwyn gwirio ymhellach gydberthynas lncRNA Gm43360 a'i darged posibl mRNAs Adra1a a Csnk1a1, dyluniwyd plasmid gorfynegiant o lncRNA Gm43360 yn yr astudiaeth hon. Gostyngodd mynegiant Csnk1a1 yn ôl y disgwyl, a gostyngodd mynegiant Adra1a hefyd, ond nid yn sylweddol. Nesaf, gwnaethom fwrw lncRNA Gm43360 i lawr gan siRNA i ganfod a effeithiwyd ar fynegiant ei mRNAs targed. Yn ôl y disgwyl, cynyddwyd Csnk1a1 mewn celloedd dymchwel lncRNA Gm43360 o'i gymharu â'r grŵp rheoli negyddol siRNA (Ffig. 5b). Yn ddeg, fe wnaethom ganfod rôl lncRNA Gm43360 yn y gylchred gell. Dangosodd canlyniadau'r pecyn cyfrif celloedd-8 (CCK-8) fod lncRNA Gm43360 yn hybu hyfywedd celloedd (Ffig. 5c). Dangosodd y canlyniadau fod lncRNA Gm43360 wedi cynyddu canran y celloedd cyfnod S ac wedi gostwng canran y celloedd cyfnod G1 o'i gymharu â'r rheolaeth negyddol (Ffig. 5d). Roedd proteinau te p53 a p21 yn ymwneud â rheoleiddio'r cylchred celloedd ac felly'n nodau heneiddio celloedd. Gostyngwyd lefelau mynegiant t53 a p21 yn sylweddol yn y grŵp gorfynegiant o gymharu â'r grŵp rheoli. Cynyddwyd lefelau mynegiant p53 a t21 yn sylweddol yn y grŵp siRNA o'i gymharu â'r grŵp rheoli siRNA (Ffig. 5e). Gostyngodd gorfynegiant lncRNA Gm43360 nifer y celloedd gal-positif SA, a chynyddodd celloedd -gal-positif yn y grŵp o transfect Gm43360 (Ffig. 5f). Gyda'i gilydd, roedd y canlyniadau hyn yn dangos bod lncRNA Gm43360 yn atal heneiddio celloedd epithelial tiwbaidd arennol trwyatal mynegiant Csnk1a1.

CLICIWCH YMA I GAEL DYFYNIAD O'R CYLCH ORGANIG NATURIOL GYDA 25% ECHINACOSIDE A 9% ACTEOSIDE AR ​​GYFER SWYDDOGAETH YR AREN

Trafodaeth

Yn yr astudiaeth hon, gwnaethom werthuso data mynegiant mRNA o arennau llygoden hen ac ifanc a chynnal dadansoddiadau bio-wybodaeth a ddatgelodd swyddogaethau'r mRNAs a fynegwyd yn afreolus. Gwelsom 347 o mRNAs wedi'u huwchreoleiddio a 355 o mRNAs wedi'u dadreoleiddio yn ogystal â 130 o lncRNAs wedi'u huwchreoleiddio a 91 o lncRNAs wedi'u hisreoleiddio ynhen arennau llygoden o gymharu ag arennau llygoden ifanc. Yn ogystal, dangoswyd bod yr mRNAs hyn yn ymwneud â llwybrau sy'n gysylltiedig â heneiddio, megisffosfforyleiddiad ocsideiddiol, llwybr signalau AMPK, llwybr signalau Wnt, llwybr signalau Rap1, a chlefyd sy'n gysylltiedig ag oedran, a ddangosodd swyddogaethau mRNAs a fynegwyd yn wahaniaethol yn pathogenesis heneiddio arennol.

Mae'r noncoding hir RNA NEAT1 yn ffactor amddiffynnol yn natblygiad ffibrosis yr arennau mewn celloedd epithelial tiwbaidd arennol [21]. Trwy gyd-ddigwyddiad, yn ein canlyniadau dilyniannu, mynegwyd lncRNA NEAT1 ar lefelau is yn arennau llygod oedrannus nag mewn llygod ifanc, sy'n gyson â chanfyddiadau blaenorol. Mae LincRNA-Gm4419 yn cyflymu llid a ffibrosis trwy fecanweithiau cyfryngol llidus NF-kB / NLRP3 mewn neffropathi diabetig [22]. Yn ein canlyniadau dilyniannu, canfuom hefyd fod mynegiant Gm4419 yn uwch yn arennau llygod oedrannus nag mewn llygod ifanc, ond nid oedd gwahaniaeth arwyddocaol. Mae LncRNA Gm43360 wedi'i leoli ar gromosom 5 (Chr5: 122494022-122,494,908, 2887 bp). Yn ôl Porwr Genom UCSC, mae Gm43360 wedi'i leoli yng nghanol y genyn codio protein Atp2a2. Fodd bynnag, ni chafwyd unrhyw adroddiadau am gyfranogiad lncRNA Gm43360 mewn clefydau hyd yn hyn. Yn yr astudiaeth hon, roedd dymchwel lncRNA Gm43360 yn hyrwyddo heneiddedd celloedd epithelial tiwbaidd arennol. Yn ogystal, fe wnaethom nodi llawer o lncRNAs a fynegwyd yn wahaniaethol yn y canlyniadau dilyniannu ac ymchwilio iddynt.

Dosbarthwyd LncRNAs yn cis-reoleiddio neu draws-reoleiddio yn seiliedig ar fecanweithiau rheoleiddio lncRNA. Gallai lncRNAs cis-actio ddylanwadu ar fynegiant genynnau cyfagos trwy ddibynnu ar elfennau cis-actio, megis hyrwyddwyr, enhancers, a dilyniannau rheoleiddio, sef pellteroedd rhwng lncRNAs ac mRNAs o lai na 100 kb. Mae lncRNAs traws-weithredol yn cyfeirio at lncRNAs sy'n gadael y safle trawsnewid ac yn gweithredu mewn safleoedd pell (hy, mae'r pellter rhwng lncRNAs ac mRNAs yn fwy na 100 kb) [23]. Mae'r lncRNA MAAT yn cynyddu mynegiant y genyn cyfagos Mbnl1 trwy fodiwl cis-reoleiddio [24]. Mae'r lncRNA Pnky yn chwarae rhan fel rheolydd traws-weithredol mewn datblygiad cortigol [25]. Yn yr astudiaeth hon, roedd perthynas drawsreoleiddiol rhwng lncRNA Gm43360 a Csnk1a1. Mae Csnk1a1 yn genyn atal tiwmor [26] sy'n amgodio protein sy'n cymryd rhan yn y cylchred celloedd a'r broses rhannu celloedd [27]. Mae is-reoleiddio Csnk1a1 yn achosillidiol sy'n gysylltiedig â heneiddeddymateb gydag arestiad twf mewn tiwmorau colorefrol [26]. Cafodd Csnk1a1 ei isreoleiddio pan gafodd Gm43360 ei uwchreoleiddio; felly, mae'n debygol bod lncRNA Gm43360 yn cymryd rhanheneiddio arennauganrheoleiddio mynegiant Csnk1a1.

Casgliadau

Ein hymchwiliad i'r rhwydwaith cydfynegi lncRNA-mRNA ynheneiddio arennaudatgelu y gallai lncRNA, lncRNA Gm43360, chwarae rhan amddiffynnol mewn heneiddio arennau ac ehangu ein dealltwriaeth o'r mecanweithiau sydd ynghlwm wrthheneiddio arennau

Defnyddiau a dulliau

Prynwyd samplau o lygod C57BL/6J gwrywaidd ifanc (3-mis oed) a hen (24-mis oed) o Ganolfan Anifeiliaid Arbrofol Prifysgol Xiamen a chawsant eu magu mewn amgylchedd safonol. Roedd gan bob llygod fynediad am ddim i fwyd a dŵr. Roedd y llygod yn gyfarwydd â'r cyfleuster newydd am fis cyn iddynt gael eu haberthu. Anestheteiddiwyd y llygod ag urethane trwy chwistrelliad mewnperitoneol ar ddogn o 750 mg/kg cyn casglu sbesimen. Aberthwyd llygod ifanc a hen ar yr un diwrnod.Aren llygoden weddillioldefnyddiwyd meinwe ar gyfer dilyniannu ym mhob assay. Perfformiwyd RNA-seq a histopatholeg ararennau ar wahâno'r un llygoden. Casglwyd meinwe arennau o lygod. Cafodd un aren ei drochi ar unwaith mewn fformalin clustogog 10% niwtral ar gyfer mewnblannu adran ddilynol, a rhannwyd yr aren arall yn sawl meinwe a'i rhoi ar unwaith mewn nitrogen hylif ac yna'i storio ar -80 gradd. Cefnogwyd yr astudiaeth gan Bwyllgor Moeseg Ysbyty Cysylltiedig Cyntaf Prifysgol Xi'an Jiaotong (Shaanxi, Tsieina) (Rhif 2018-G-164). Cyflawnwyd yr holl ddulliau gan y canllawiau a'r rheoliadau moeseg anifeiliaid. Cynhaliwyd yr astudiaeth hon yn unol â chanllawiau ARRIVE.

Histopatholeg yr arennau

Cafodd samplau meinwe arennol o lygod ifanc a hen eu gosod mewn hydoddiant paraformaldehyd 10% dros nos. Roedd deg o'r adrannau wedi'u dadhydradu, wedi'u mewnblannu â pharaffin, ac wedi'u rhannu'n 4-µm o drwch. Perfformiwyd staenio trichromatig PAS a Masson gan ddefnyddio protocolau safonol. Cafodd delweddau eu dal gan y camera, a mesurwyd yr ardal staenio-bositif. Cyfrifwyd yr ardal ar gyfer delweddau camera histopatholeg gyda Image-Pro Plus 6.0.

staenio SA‑ -gal

Dadansoddwyd gweithgarwch SA{{0}}gal gan ddefnyddio pecyn staenio gal SA{- -(Cell Signaling Technology #9860) yn unol â phrotocol y gwneuthurwr. Mesurwyd yr ardal o staenio positif, a chyfrifwyd celloedd gal-positive SA gan ddefnyddio Image-Pro Plus 6.0.

Adeiladu a dilyniannu llyfrgell echdynnu RNA

Samples (each 5 mice in young and old mice) were used for lncRNA and mRNA expression analyses. Young mice were numbered 3M1, 3M2, 3M3, 3M4, and 3M5, and old mice were numbered 24M1, 24M2, 24M3, 24M4, and 24M5. Total RNA was extracted using Trizol reagent (thermofsher, 15,596,018) following the manufacturer's instruction. The total RNA quantity and purity were analyzed of Bioanalyzer 2100 and RNA 6000 Nano LabChip Kit (Agilent, CA, USA, 5067−1511), and high-quality RNA samples with RIN number>7.0 eu defnyddio i adeiladu llyfrgell dilyniannu. Ar ôl echdynnu cyfanswm RNA, purwyd mRNA o gyfanswm RNA (5ug) gan ddefnyddio Dynabeads Oligo (dT) (Thermo Fisher, CA, UDA) gyda dwy rownd o buro. Yn dilyn puro, rhannwyd yr mRNA yn ddarnau byr gan ddefnyddio catïonau deufalent ar dymheredd uchel (Modiwl Darnio Magnesiwm RNA (NEB, cath. e6150, UDA) o dan 94 gradd 5-7 min). Yna cafodd y darnau RNA hollt eu trawsgrifio o chwith i gael y cDNA gan SuperScript™ II Reverse Transcriptase (Invitrogen, cath. 1,896,649, UDA), a ddefnyddiwyd nesaf i syntheseiddio DNA ail-sownd â label U ag E. coli DNA polymeras I ( NEB, cat.m0209, UDA), RNase H (NEB, cat.m0297, UDA) a dUTP Ateb (Termo Fisher, cat.R0133, UDA). Yna ychwanegwyd sylfaen A at bennau di-fin pob llinyn, gan eu paratoi ar gyfer clymu i'r addaswyr mynegrifol. Roedd pob addasydd yn cynnwys bargodiad sylfaen T ar gyfer clymu'r addasydd i'r DNA darniog â chynffon A. Cafodd addaswyr mynegai deuol eu clymu i'r darnau, a pherfformiwyd dewis maint gyda gleiniau AMPureXP. Ar ôl y driniaeth ensym UDG gwres-labile (NEB, cat.m0280, UDA) o'r DNAs ail-sownd â label U, ymhelaethwyd ar y cynhyrchion ligated â PCR gan yr amodau canlynol: dadnatureiddio cychwynnol ar 95 gradd am 3 munud; 8 cylch dadnatureiddio ar 98 gradd am 15 s, anelio ar 60 gradd am 15 s, ac estyniad ar 72 gradd am 30 s; ac yna estyniad terfynol ar 72 gradd am 5 munud. Hyd mewnosod cyfartalog y llyfrgelloedd cDNA terfynol oedd 300±50 bp. Yn olaf, gwnaethom berfformio'r dilyniant pen pâr 2 × 150 bp (PE150) ar Illumina Novaseq ™ 6000 (LC-Bio Technology CO., Ltd., Hangzhou, Tsieina) yn unol â phrotocol y gwneuthurwr [28].

Dadansoddiad biowybodeg Dilyniant a hidlo Darlleniadau Glân

Llyfrgell cDNA a adeiladwyd gan dechnoleg o'r RNA cyfun osamplau arennauo lygod yn dilyniannu a rhedeg gyda'r llwyfan dilyniant Illumina NovaseqTM 6000. Gan ddefnyddio dull paru RNA-seq Illumina, fe wnaethom ddilyniannu'r trawsgrifiad, gan gynhyrchu cyfanswm o ddarlleniadau pen pâr 2 × 150 bp. Mae darlleniadau a geir o'r peiriannau dilyniannu yn cynnwys darlleniadau amrwd sy'n cynnwys addaswyr neu seiliau o ansawdd isel a fydd yn effeithio ar y cydosod a'r dadansoddiad canlynol. Felly, i gael darlleniadau glân o ansawdd uchel, cafodd darlleniadau eu hidlo ymhellach gan Cutadapt [29] (https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/, version:cutadapt-1.9). Roedd y paramedrau fel a ganlyn:

1) tynnu darlleniadau sy'n cynnwys addaswyr;

2) tynnu darlleniadau sy'n cynnwys polyA a poly;

3) dileu darlleniadau sy'n cynnwys mwy na 5% o niwcleotidau anhysbys (N);

4) cael gwared ar ddarlleniadau o ansawdd isel sy'n cynnwys mwy nag 20% ​​o seiliau ansawdd isel (gwerth Q Llai na neu'n hafal i 20).

Dilyswyd ansawdd deg dilyniant gan ddefnyddio FastQC [30] (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/ fastqc/, 0.11.9). gan gynnwys cynnwys C20, C30, a GC y data glân. Ar ôl hynny, cynhyrchwyd cyfanswm o G bp o ddarlleniadau pen pâr wedi'u glanhau. Mae’r data dilyniant crai wedi’u cyflwyno i setiau data Omnibws Mynegiant Genynnau NCBI (GEO) gyda’r rhif derbyn GSE154223.

Y genom/anodiad cyfeirio oedd Mus_musculus.GRCm38. Ffynhonnell a fersiwn yr anodiad genyn a ddefnyddiwyd ar gyfer dadansoddiadau oedd Ensembl_v88.

Gwasanaeth trawsgrifiadau

Yn gyntaf, defnyddiwyd Cutadapt [29] i gael gwared ar y darlleniadau a oedd yn cynnwys halogiad addasydd, seiliau o ansawdd isel, a seiliau amhenodol. Cafodd ansawdd deg dilyniant ei fwydo'n fawr gan ddefnyddio FastQC (http://www.bioinformatics.Babra ham.ac.uk/projects/fastqc/). Fe ddefnyddion ni Bowtie2 [31] a Hisat2 [32] i fapio darlleniadau i genom llygoden. Cafodd darlleniadau wedi'u mapio o bob sampl eu cydosod gan ddefnyddio StringTie [33]. Deg, pob trawsgrifiad osamplau arennaueu huno i ail-greu trawsgrifiad cynhwysfawr gan ddefnyddio sgriptiau Perl. Ar ôl i'r trawsgrifiad terfynol gael ei gynhyrchu, defnyddiwyd StringTie [33] ac edgeR [34] i amcangyfrif lefelau mynegiant pob trawsgrifiad.

Adnabod LncRNA

Yn gyntaf oll, taflwyd trawsgrifiadau a oedd yn gorgyffwrdd ag mRNAs hysbys a thrawsgrifiadau byrrach na 200 bp. Yna fe wnaethom ddefnyddio CPC [35] a CNCI [36] i ragfynegi trawsgrifiadau gyda photensial codio. Pob trawsgrifiad gyda sgôr CPC<-1 and CNCI score<0 were removed. The remaining transcripts were considered as lncRNAs.

Dadansoddiad genynnau dadansoddi a fynegir yn wahaniaethol (DGEs).

StringTie [33] was used to perform expression levels for mRNAs and lncRNAs by calculating FPKM [37]. Genes differential expression analysis was performed by DESeq2 software between two different groups (and by edgeR between two samples) [34, 38]. The genes with the parameter of q value below 0.6 and absolute fold change>Ystyriwyd 2 yn enynnau a fynegwyd yn wahaniaethol.

Rhagfynegiad genynnau targed a dadansoddiad swyddogaethol o lncRNAs

Er mwyn archwilio swyddogaeth swyddogaeth lncRNAs, rydym yn rhagweld y genynnau cis-targed o lncRNAs. Gall LncRNAs chwarae rhan cis wrth weithredu ar enynnau targed cyfagos. Yn yr astudiaeth hon, dewiswyd genynnau codio mewn 100,000 i fyny'r afon ac i lawr yr afon gan sgript Perl. Yna, gwnaethom ddangos dadansoddiad swyddogaethol o'r genynnau targed ar gyfer lncRNAs trwy ddefnyddio'r sgriptiau BLAST2GO [39]. Y cyswllt gorchmynion llawn â'r parth cyhoeddus oedd Jie-Li/README.md yn y prif · dandan-li/Jie-Li (github.com).

Categorïau ontoleg genynnau (GO) a dadansoddiad Gwyddoniadur Genynnau a Genomau Kyoto (KEGG).

Perfformiwyd y dadansoddiad biowybodeg ar gyfer dilyniannu RNA gan ddefnyddio offer OmicStudio (http://www.omicsudio.cn/tool). Defnyddiwyd dadansoddiad cyfoethogi swyddogaethol Ontoleg Genynnau (GO) a dadansoddiad cyfoethogi Gwyddoniadur Genynnau a Genomau Kyoto (KEGG) [37-39] i ddadansoddi swyddogaethau biolegol y genynnau targed a ragwelir. Mae dadansoddiad GO yn egluro'r prif brosesau biolegol trwy dair agwedd: cyfansoddiad celloedd, swyddogaethau moleciwlaidd, a phrosesau biolegol (http://www.geneontology.org/). Mae'r dadansoddiad cyntaf yn rhoi'r holl enynnau a fynegwyd yn wahaniaethol a genynnau cefndirol yng nghronfa ddata GO. Mae pob eitem yn cael ei mapio, mae nifer y genynnau ym mhob eitem yn cael ei gyfrifo, a defnyddir y dosraniad hypergeometrig i gynnal profion rhagdybiaeth i gael gwerth P y canlyniad cyfoethogi. Po isaf yw'r gwerth P, y mwyaf arwyddocaol yw'r canlyniad cyfoethogi. Adnodd cronfa ddata yw KEGG sy'n dadansoddi'r mRNAs a fynegir yn wahaniaethol yn ôl bioleg enetig i archwilio llwybrau pwysig sy'n ymwneud â genynnau targed ( https://www.genome.jp/kegg/ ). Mynegir y canlyniadau gan werthoedd-p; po isaf yw'r gwerth-p, y mwyaf arwyddocaol yw'r canlyniad cyfoethogi.

qRT-PCR

Defnyddiwyd GAPDH fel y rheolaeth mewndarddol. Yna, cyfrifwyd lefelau mynegiant cymharol genynnau anhysbys. Dyluniwyd a syntheseiddiwyd pob paent preimio yn benodol ar gyfer yr arbrawf hwn. Mae preimio ar gyfer GAPDH wedi'u masnacheiddio. Nodwyd penodoldeb paent preimio Adra1a a Csnk1a1 gan frig sengl y gromlin doddi.

Adeiladu rhwydwaith coexpression mRNA-lncRNA

Roedd trawsreoleiddio yn seiliedig ar ymchwil, ac yna cyfrifwyd yr egni traws. Po leiaf oedd yr egni traws, yr uchaf yw'r posibilrwydd o rwymo. Yna, cyfrifwyd cyfernod cydberthynas mRNA-lncRNA hefyd. Adeiladwyd y rhwydwaith mRNA-lncRNA trwy ddewis cyfernod cydberthynas Spearman sy'n fwy na 0.9. Adeiladwyd y rhwydwaith coexpression mRNA-lncRNA gan ddefnyddio meddalwedd Cytoscape (v3.7.1).

Diwylliant celloedd

Cafodd celloedd epithelial tiwbaidd procsimol arennol y llygoden (MRPT-EpiCs) eu meithrin mewn anifeiliaid canolig cell epithelial (EpiCM-a, Cat. #4131) yn cynnwys 2% o serwm buchol ffetws (FBS, Cat. #0010) ac Atodiad Twf Cell epithelial-anifail (EpiCGS-a, Cat. #4182) heb wrthfiotigau mewn deorydd llaith ar 37 gradd a 5% CO2. Newidiwyd y cyfrwng diwylliant bob 2-3 diwrnod. Roedd y celloedd yn y cyfnod twf logarithmig yn is-ddiwylliedig pan gyrhaeddodd y twf 90%. Cafodd y daliant cell a dreuliwyd gan trypsin ei hadu i 6-blatiau ffynnon gyda 2*104 -5*104 o gelloedd ym mhob ffynnon. Roedd y celloedd a ddefnyddiwyd ar gyfer trawsnewid i gyd rhwng cenedlaethau 2 a 5.

Adeiladu plasmid a thrawsnewidiad celloedd

Adeiladwyd y plasmid gorfynegiant lncRNA Gm43360 gan GeneChem (Shanghai, Tsieina). Yr asgwrn cefn plasmid oedd GV658, a gyrrodd hyrwyddwr CMV fynegiant lncRNA. Darperir y dilyniant niwcleotid wedi'i glonio yn y deunydd atodol. Ar gyfer dymchwel lncRNA Gm43360, RHAID i dri lncRNA ENS00000197656-targedu siRNAs (lncRNA Gm43360- siRNA1, 5'-CCUUCACUCCAGCUGGUAATT-3'; lncRNA Gm43360-siRNA2, 5'-CCCUGUCACUCA Cafodd UGAAGUUTT-3'; a lncRNA Gm43360-siRNA3, 5'-GGUCAAAUAACUCAAUGGGTT-3') eu dylunio a'u syntheseiddio yn GenePharma (Shanghai, Tsieina). Yn ôl protocol y gwneuthurwr, trosglwyddwyd celloedd â 2500 ng o plasmid neu 100 pmol o siRNA gyda 6 µl o Adweithydd Trawsnewid Lipofectamine™ 2000 (Invitrogen, UDA) fesul ffynnon. Canfuwyd lefelau mynegiant RNA a phrotein ar 48 h ar ôl trawsnewid, ac ailadroddwyd pob arbrawf o leiaf dair gwaith. Defnyddiwyd PCR meintiol amser real i ddilysu effeithlonrwydd gorfynegiant lncRNA Gm43360 a dymchwel.

Dadansoddiad o blotiau gorllewinol

Golchwyd celloedd diwylliedig â PBS oer iâ, ychwanegwyd 120 µl o glustogfa RIPA (Calon, Tsieina), ac ychwanegwyd atalydd proteas a PMSF (Heart, China) am 30 munud ar rew. Ar ôl casglu celloedd mewn gwahanol diwbiau microcentrifuge, mesurwyd y crynodiad protein. Ychwanegwyd byffer llwytho at bob sampl ac yna ei ferwi am 7 munud. Gwahanwyd tri deg microgram o'r sampl gan 12% SDS-PAGE (Beyotime, Tsieina) a'i electro-drosglwyddo i bilenni PVDF (Thermo Fisher, UDA). Yna, rhwystrwyd y pilenni gyda 5% o laeth. Deorwyd y pilenni â gwrthgyrff sylfaenol penodol: gwrth-p21 (1:1000, Abcam, ab109199), gwrth-p53 (1:1000, Proteintech, 10442-1-AP), a gwrth-GAPDH (1:3000, Profintech). , 60004-1-Ig) dros nos ar 4 gradd . Ar ôl golchi gyda TBST, deorwyd pilenni ag gwrthgorff eilaidd am 1 awr ar dymheredd ystafell. Arsylwyd bandiau protein gan ddefnyddio pecyn cemiluminescence (Millipore, UDA). Defnyddiwyd mynegiant GAPDH i normaleiddio lefelau protein.

Assay amlhau celloedd

Pennwyd cynhwysedd amlhau celloedd gan assay pecyn cyfrif celloedd-8 (CCK-8). Pedwar deg wyth awr ar ôl trawsnewid, ychwanegwyd 90 µl o gyfrwng newydd a 10 µl o doddiant CCK-8 at bob ffynnon (Beyotime, C0042). Cafodd y celloedd eu deor am 1-4 h ar 37 gradd mewn 5% CO2 a'u mesur ar 450 nm gan ddarllenydd microplate cyffredinol (Bio-Tek, UDA).

Dadansoddiad cytometrig llif

Cafodd celloedd eu platio mewn 6-platiau ffynnon y diwrnod cyn y trawsfudiad. Pedwar deg wyth awr ar ôl trawsgludiad, cafodd y celloedd eu trypsineiddio a'u centrifugio ar 1000 rpm am 5 munud. Yna, gosodwyd y celloedd mewn 70% ethanol ar 4 gradd am o leiaf 4 h. Ar ôl centrifugio, ychwanegwyd hydoddiant staenio RNase A a propidium ïodid (PI) at y celloedd, ac yna deorwyd y celloedd am 30 munud ar dymheredd ystafell yn y tywyllwch. Dadansoddwyd celloedd lliw te gan ddefnyddio NovoCyte ACEA (Biowyddorau, UDA).

Dadansoddiad ystadegol

Cyflwynir y data mesur yn ôl y dosraniad normal fel y cymedr ±SD. Penderfynwyd ar y gwahaniaeth rhwng y ddau grŵp gwahanol gan ddefnyddio profion t Myfyriwr dwy gynffon heb bâr, ac ystyriwyd bod gwerth-p < 0.05 yn ystadegol arwyddocaol. Gwnaed yr holl gyfrifiadau gan ddefnyddio GraphPad Prism 8 (GraphPad Software, Inc., USA).

Cyfeiriadau

1. Docherty MH, O'Sullivan ED, Bonventre JV, Ferenbach DA. Senescence Cellular yn yr Arennau. J Am Soc Nephrol. 2019; 30(5):726–36.

2. Partridge L, Deelen J, Slagboom PE. Wynebu heriau byd-eang heneiddio. Natur. 2018; 561(7721):45–56.

3. Pan JX. Mae LncRNA H19 yn hyrwyddo atherosglerosis trwy reoleiddio llwybrau signalau MAPK a NF-kB. Eur Parch Med Pharmacol Sci. 2017; 21(2):322–8.

4. Wasson CW, Abignano G, Hermes H, Malaab M, Ross RL, Jimenez SA, Chang HY, Feghali-Bostwick CA, Del Galdo F. hir di-godio RNA HOTAIR yn gyrru EZH 2-actifadu myofibroblast dibynnol mewn systemig sglerosis trwy ysgogiad miRNA 34a-ddibynnol o NOTCH. Ann Rheumatic Dis. 2020; 79(4): 507–17.

5. Luo J, Wang K, Yeh S, Sul Y, Liang L, Xiao Y, Xu W, Niu Y, Cheng L, Maity SN, et al. Mae LncRNA-p21 yn newid y gwahaniaethiad niwroendocrin canser y prostad a achosir gan antiandrogen enzalutamide trwy fodiwleiddio'r signalau EZH2 / STAT3. Cymmun Nat. 2019; 10(1): 2571.

6. Wang Y, Yang L, Chen T, Liu X, Guo Y, Zhu Q, Tong X, Yang W, Xu Q, Huang D, et al. Mae lncRNA MCM3AP-AS1 newydd yn hyrwyddo twf carsinoma hepatogellog trwy dargedu echel miR-194-5p/FOXA1. Cancr Mol. 2019; 18(1):28.

7. Wu YY, Kuo HC. Rolau a rhwydweithiau swyddogaethol o RNAS nad yw'n godio yn pathogenesis clefydau niwroddirywiol. J Biomed Sci. 2020; 27(1):49.

8. Li Z, Wang Z. Heneiddio Arennau a Chlefyd sy'n Gysylltiedig â Heneiddio. Adv Experiment Med Biol. 2018; 1086: 169–87.

9. Wang X, Vrtiska TJ, Avula RT, Walters LR, Chakkera HA, Kremers WK, Lerman LO, Rheol AD. Mae oedran, swyddogaeth yr arennau, a ffactorau risg yn gysylltiedig yn wahanol â chyfeintiau cortigol a medwlaidd yr aren. Arennau Int. 2014; 85(3):677–85.

10. Lin Q, Hou S, Dai Y, Jiang N, Lin Y. LncRNA HOTAIR yn targedu miR-126-5p i hybu dilyniant clefyd Parkinson drwy RAB3IP. Biol Chem. 2019; 400(9): 1217–28.

Gwasanaeth Cefnogol Wecistanche - Yr allforiwr cistanche mwyaf yn Tsieina:

E-bost:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Ffôn:+86 15292862950

Siop Am Fwy o Fanylion:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop