Gweithredu Promitotig Oenothera Biennis Ar Fibroblastau Dermol Dynol Senescent Rhan 1
Jul 04, 2023
Haniaethol: Mae cronni ffibroblastau dermol senescent yn gyrru heneiddio croen. Mae adfywiad amlhau yn un strategaeth i fodiwleiddio heneiddedd celloedd. Yn ddiweddar, gwnaethom adrodd ar union gyfansoddiad cemegol echdyniad hydroffilig diwylliannau celloedd Oenothera biennis (ObHEx) a dangosom ei briodweddau gwrth-heneiddio croen. Nod y gwaith hwn yw asesu ei effaith fiolegol yn benodol ar heneiddedd celloedd. Mae gweithredu ObHEx wedi'i werthuso ar ffibroblastau dermol dynol arferol sy'n destun heneiddedd cynamserol a achosir gan straen (SIPS) trwy ddadansoddiad proteomig hynod ddwfn, gan arwain at y proteome mwyaf byd-eang sy'n gysylltiedig â heneiddedd hyd yn hyn. Mae data sbectrometreg màs yn dangos bod y driniaeth ag ObHEx yn ailsefydlu lefelau o broteinau mitotig hanfodol, wedi'u dadreoleiddio'n gryf mewn celloedd senescent. I ddilysu ein canfyddiadau proteomeg, rydym wedi profi y gall ObHEx, yn rhannol, adfer y gweithgaredd o 'senescence-cysylltiedig-ß-galactosidase', y nodwedd mwyaf cyffredin o gelloedd senescent. Ymhellach, i asesu a yw uwch-reoleiddio lefelau protein mitotig yn trosi'n ailfynediad cylchred gell, mae arbrofion FACS wedi'u cynnal, gan ddangos adweithio bach ond arwyddocaol o amlhau celloedd senescent gan ObHEx. I gloi, mae’r proffilio proteome byd-eang dwfn sy’n gysylltiedig â heneiddedd a gyhoeddir yma yn darparu panel o gannoedd o broteinau wedi’u dadreoleiddio gan SIPS y gellir eu defnyddio gan y gymuned i ddeall heneiddedd ac effaith modulatwyr newydd posibl ymhellach. At hynny, tynnodd dadansoddiad proteomeg sylw at effaith pro-mitotig benodol ObHEx ar gelloedd senescent. Felly, rydym yn awgrymu ObHEx fel cynorthwyydd pwerus yn erbyn heneiddio sy'n gysylltiedig â heneiddio croen.
Gall glycoside cistanche hefyd gynyddu gweithgaredd SOD ym meinweoedd y galon a'r afu, a lleihau'n sylweddol y cynnwys lipofuscin a MDA ym mhob meinwe, gan ysbeilio radicalau ocsigen adweithiol amrywiol (OH-, H₂O₂, ac ati) yn effeithiol a diogelu rhag difrod DNA a achosir. gan OH-radicaliaid. Mae gan glycosidau ffenylethanoid Cistanche allu chwilota cryf o radicalau rhydd, gallu lleihau uwch na fitamin C, gwella gweithgaredd SOD mewn ataliad sberm, lleihau cynnwys MDA, a chael effaith amddiffynnol benodol ar swyddogaeth pilen sberm. Gall polysacaridau cistanche wella gweithgaredd SOD a GSH-Px mewn erythrocytes a meinweoedd yr ysgyfaint llygod senescent arbrofol a achosir gan D-galactos, yn ogystal â lleihau cynnwys MDA a cholagen yn yr ysgyfaint a phlasma, a chynyddu cynnwys elastin, wedi effaith sborion dda ar DPPH, ymestyn amser hypocsia mewn llygod senescent, gwella gweithgaredd SOD mewn serwm, ac oedi dirywiad ffisiolegol yr ysgyfaint mewn llygod senescent arbrofol Gyda dirywiad morffolegol cellog, mae arbrofion wedi dangos bod gan Cistanche y gallu gwrthocsidiol da ac mae ganddo'r potensial i fod yn gyffur i atal a thrin clefydau heneiddio'r croen. Ar yr un pryd, mae gan echinacoside yn Cistanche allu sylweddol i ysbeilio radicalau rhydd DPPH a gallant ysbeilio rhywogaethau ocsigen adweithiol, atal diraddio colagen a achosir gan radical rhad ac am ddim, ac mae hefyd yn cael effaith atgyweirio da ar ddifrod anion radical rhydd thymin.
Cliciwch ar Atodiad Cistanche Tubulosa
【Am ragor o wybodaeth:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】
Geiriau allweddol: dyfyniad hydrophilic Oenothera biennis; heneiddrwydd; ffibroblastau; proteomeg; sbectrometreg màs; diaPASEF; mitosis; heneiddio croen
1. Rhagymadrodd
Senescence yw prif achos heneiddio a chlefydau sy'n gysylltiedig ag oedran. Mae celloedd Senescent yn cael eu harestio ymledu fel ymateb i erydiad telomere ffisiolegol (senescence ailadroddol) neu i sbardunau straen gan gynnwys difrod DNA, straen ocsideiddiol, straen organelle, ac actifadu oncogene (heneiddedd cynamserol a achosir gan straen, SIPS) [1]. Er gwaethaf arestiad twf a achosir gan Ymateb i Niwed DNA (DDR), mae celloedd senescent yn dangos cyflwr metabolig uchel a gweithgaredd lysosomaidd, sy'n hanfodol ar gyfer eu gweithgaredd ysgrifenyddol cynyddol, a elwir yn ffenoteip secretory sy'n gysylltiedig â heneb (SASP) [2,3]. Mae ffactorau SASP yn cynnwys sawl teulu o broteinau hydawdd (interleukins, chemokines, ffactorau twf, proteasau wedi'u secretu) a phroteinau anhydawdd (cyfrinachol anhydawdd a chydrannau matrics allgellog) sy'n effeithio'n negyddol ar y meinwe o amgylch, gan gynhyrchu cyflwr llidiol gradd isel cronig.
Mae cronni ffibroblastau senescent yn y derma yn gyrru heneiddio croen, gan amharu ar gyfanrwydd y matrics allgellog (ECM) a swyddogaeth celloedd endothelaidd microfasgwlaidd cyfagos, melanocytes epidermaidd, a keratinocytes [4-6]. Mae'r tair prif strategaeth i wrthweithio heneiddedd yn cynnwys (i) clirio celloedd senescent trwy ysgogi apoptosis neu actifadu imiwn; (ii) modiwleiddio'r SASP a (iii) adweithio amlhau celloedd. Yn wir, er bod heneiddedd wedi'i ddisgrifio'n wreiddiol fel arestiad cylchred celloedd na ellir ei wrthdroi, mae tystiolaeth gyfredol yn awgrymu y gellir adfer amlhau [7-9].
Yn y senario hwn, mae cynhwysion sy'n gallu atal a / neu fodiwleiddio heneiddedd cellog o ddiddordeb mawr yn y maes cosmetig fel arfau gwerthfawr i wrthweithio heneiddio croen. Yn benodol, mae detholiadau sy'n deillio o'r rhywogaeth Oenothera biennis (O. biennis, Evening Primrose), sy'n perthyn i'r teulu Onagraceae, yn cael eu defnyddio'n draddodiadol ar gyfer cymwysiadau cosmetig oherwydd eu gweithgareddau gwrthlidiol a gwrthocsidiol [10]. Mae darnau methanolig a baratowyd o rannau o'r awyr a darnau dail dyfrllyd yn cynnwys asidau ffenolig a flavonoidau yn bennaf, tra bod darnau methanolig a geir o wreiddiau yn cynnwys sterolau a triterpenes yn bennaf [11]. Er bod gweithgareddau biolegol echdynion rhan o'r awyr alcoholig a hydroalcohol wedi'u dangos [12-14], y darnau a ddefnyddir amlaf o O. biennis yw'r olewau a geir o hadau, sy'n hynod gyfoethog mewn asidau brasterog. Yn wir, gan fod eu cynnwys uchel o asid linoleig (LA) ac asid -linolenig (GLA), mae olewau hadau O. biennis yn gwella gweithrediad priodol y croen ac, yn benodol, maent wedi dangos effeithiau buddiol mewn cleifion â dermatitis cronig [11, 15].
Yn fwy diweddar, cynigiwyd detholiadau a gafwyd o ddiwylliannau celloedd O. biennis i ddisodli darnau o blanhigion digymell yn llawn gan eu bod yn gymysgeddau metabolion eilaidd bio-gynaliadwy, heb halogion, a safonedig [16]. Yr union gyfuniad o'r cyfansoddion â'u heffaith synergaidd sy'n gyfrifol am weithgaredd cyffredinol detholiadau botanegol [17].
Yma, rydym wedi canolbwyntio ar y detholiad hydroffilig o ddiwylliannau celloedd O. biennis (ObHEx), sy'n gyfoethog mewn lignans a triterpenes, gan ei fod yn dangos eiddo gwrth-heneiddio croen wrth ei brofi mewn modelau in vitro ac ex vivo [18]. Datgelodd cymeriadu cemegol y darn hwn yn seiliedig ar sbectrometreg màs ei fod yn cynnwys sawl dosbarth o fetabolion eilaidd diddorol. Maent yn perthyn i lignans (salvadoraside a liriodendron) a triterpenes (asid muriatig, asid arjunolic, asid aspartic, a hederagenin), rhai ohonynt wedi bod yn gysylltiedig yn flaenorol â chynhyrchu pro-colagen I mewn ffibroblastau dynol [19,20]. Yn benodol, rydym wedi profi o'r blaen bod ObHEx yn hyrwyddo crebachiad colagen matrics, polymerization actin, a chynhyrchu proteinau ECM, a thrwy hynny wella cadernid croen ac elastigedd, trwy gynnydd ym mynegiant genynnau cadwyn golau Myosin kinase (MYLK).
Hyd yn hyn, nid yw mecanweithiau moleciwlaidd effeithiau ObHEx ar heneiddio croen a heneiddedd cellog, yn benodol, wedi cael eu hymchwilio. Nod y gwaith hwn yw archwilio gweithgaredd ObHEx ar ffibroblastau dermol dynol senescent. Defnyddiasom ddull proteomig tra-ddwfn sbectrometreg màs data-annibynnol i gael awgrymiadau o'r mecanwaith gweithredu a dulliau bio-orthogonaidd i'w ddilysu ac ymchwilio iddo (Ffigur 1).
2. Canlyniadau
Perfformiwyd heneiddedd cynamserol a achosir gan straen (SIPS) mewn ffibroblastau dermol dynol arferol (NHDF) trwy driniaeth â hydrogen perocsid (H2O2). Mae celloedd senescent a achosir gan straen ocsideiddiol yn fodel in vitro ardderchog ar gyfer ymchwil heneiddio a defnyddir H2O2 yn eang i'w gyflawni [21,22].
Er mwyn deall y llwybrau biolegol a newidiwyd gan ObHEx ar gelloedd NHDF seescent, defnyddiwyd dull proteomig hynod ddwfn. Cafodd SIPS a chelloedd rheoli eu trin neu beidio am 48 h gyda'r dyfyniad yn 0.01 y cant (p/v) oherwydd, o'r assay MTT a adroddwyd yn [18], mae hyn yn arwain at y crynodiad uchaf nad yw'n achosi unrhyw wenwyndra cell ar ôl deoriad 48 h.
Yna bu lysates celloedd yn destun treuliad tryptig a dadansoddiad MS/MS nano-UPLC. Er mwyn cael dyfnder optimaidd y proteome, cafwyd data sbectrometreg màs yn y modd Caffael Annibynnol Data (DIA), a oedd yn caniatáu meintioli cadarn o 9650 o broteinau (Tabl S1), gyda chyflawnrwydd data o 98 y cant. Mae ein hastudiaeth yn adrodd ar y dadansoddiad proteome mwyaf cyflawn o gelloedd senescent hyd yma.
2.1. Gwerthusiad Heneiddio Cynamserol a Achosir gan Straen (SIPS).
Yn gyntaf oll, gwnaethom wirio a oedd yr anwythiad heneiddedd yn NHDF yn llwyddiannus, gan ddadansoddi proteome byd-eang H2O a driniwyd NHDF gan sbectrometreg màs (MS) ac archwilio eu morffoleg yn ôl cytometreg llif.
2.1.1. Gwerthusiad SIPS yn ôl Sbectrometreg Màs (MS)
Er mwyn gwerthuso anwythiad SIPS, gwnaethom gymharu cyfanswm proteome celloedd NHDF a gafodd eu trin â H2O yn erbyn y rhai heb eu trin. Ymhlith y 3256 o broteinau a ddadreoleiddiwyd, canfuwyd bod nifer o fiofarcwyr heneiddedd wedi'u newid yn sylweddol (Ffigur 2A, B). Yn gyntaf, gwelsom uwch-reoleiddio'r biomarcwr o gelloedd senescent a ddefnyddir fwyaf, y 'ß-galactosidase sy'n gysylltiedig â senescence' (SA- -gal, GLB1). Mae lefelau cynyddol yr ensymau lysosomal GLB1 a Meinwe alpha-L-fucosidase (FUCA1), sydd hefyd wedi'u canfod wedi'u huwchreoleiddio gan MS, yn adlewyrchu'r cynyddiad nodweddiadol yng nghynnwys lysosomaidd celloedd senescent [23,24]. Yn wir, mae lysosomau yn ffafrio prosesau catabolaidd, sy'n darparu ynni a deunyddiau crai sy'n ofynnol gan secretion sy'n gysylltiedig â heneiddedd [25].
Yn ail, canfuwyd hefyd bod lefel protein serine / threonine-protein kinase ATR a serine-protein kinase ATM, y ddau yn ymwneud â signalau DDR, wedi cynyddu [26]. Mae DDR yn cael ei actifadu gan ddifrod DNA niwclear, sy'n gysylltiedig yn gyffredinol â sefydlu heneiddedd cellog, ac mae'n cydgyfeirio i actifadu atalydd tiwmor p53. Yn ogystal â hyn, arsylwyd hefyd y upregulation o amrywiadau histone 2A MACROH2A1 a MACRO2A2. Mae'r proteinau hyn yn cymryd rhan mewn ffurfiad ATR-ddibynnol o Ffocws Heterochromatin Cysylltiedig â Senescence (SAHFs), strwythurau cromatin trwchus ac ataliol sy'n nodweddiadol o gelloedd senescent [1,2,27].
Yn olaf, mae'r lefelau dadreoleiddiedig o Cyclin-Dibynnol Kinase Inhibitor 1A neu p21 (CDK1NA) a phrotein marciwr amlhau Ki-67 (MKI67) yn adlewyrchu arestiad cylch cell senescent yn y cyfnod G2 [28,29]. Yn wir, mae t21 yn cynyddu lefelau, a hyrwyddir gan lwybr p53 a achosir gan ddifrod gan DNA, ac yn atal y CDK2-cyclin E cymhleth. Mae hyn yn achosi dadffosfforyleiddiad protein retinoblastoma (RB), sydd yn ei gyflwr hypo-ffosfforylaidd yn atafaelu E2F, ffactor trawsgrifio sy'n ffafrio dilyniant y gylchred gell [2].
Y tu hwnt i'r marcwyr heneiddrwydd hyn y gwyddys amdanynt eisoes, mae dadansoddiad cyfoethogi llwybr ehangach o'r proteinau sydd wedi'u huwchreoleiddio fwyaf mewn celloedd rheoli H2O2 a gafodd eu trin yn erbyn actifadu llwybr p53/p21 a achosir gan ddifrod DNA (Ffigur 2C, Tabl S2). Yn lle hynny, mae proteinau sy'n gysylltiedig ag amlhau a mitosis yn cael eu dadreoleiddio, gan dynnu sylw at yr arestiad amlhau dilynol (Ffigur 2D, Tabl S3).
2.1.2. Gwerthusiad SIPS yn ôl Cytometreg Llif
Mae SIPS hefyd wedi'i gadarnhau gan ddadansoddiad cytometreg llif. Gwelsom gynnydd mewn ronynnedd cytoplasmig o gelloedd wedi'u trin H2O (Ffigur S1A, B), oherwydd y cynnydd yn nifer a maint y lysosomau mewn celloedd senescent. Mae hyn yn ganlyniad i'r cydbwysedd rhwng cronni graddol o lysosomau camweithredol a chynhyrchu rhai newydd [25]. Ar ben hynny, gwnaethom hefyd ganfod croniad mewn-lysosomaidd o aggresomes lipofuscin: mae'r twf hwn, sy'n gysylltiedig â chynyddiad o awtofflworoleuedd yn sianel llwybr band 525/50 nm y cytomedr llif, yn arwydd arall o heneiddedd sy'n gysylltiedig â chamweithrediad lysosomaidd (Ffigur S1C, D) [30].
2.2. OBHEx Proteinau Mitotig wedi'u Hadfer yn Rhannol wedi'u Isreoli mewn Celloedd Senescent NHDF
Roedd triniaeth OBHex yn gallu adfer yn rhannol y lefelau o 71 o broteinau a ddadreoleiddiwyd yn y cyflwr synhwyro (gwerth q-gwerth dwy ffordd ANOVA < 0.05). Yn fwy manwl gywir, dadreoleiddiwyd 46 o broteinau gan y darn a chafodd 25 eu huwchreoleiddio (Ffigur 3A, Tablau S4 a S5).
Mae dadansoddiad cyfoethogi adweithome o'r 46 o broteinau y gostyngwyd eu lefelau gan ObHEx yn awgrymu y gall y dyfyniad leihau actifadu llwybr p53 ac effeithio ar metaboledd ffosffatidylinositol a signalau Draenog, y canfuwyd eu newidiadau wrth heneiddio [31,32] (Ffigur 3B, Tabl S6).
O ran y 25 o broteinau wedi'u huwchreoleiddio, mae'r dadansoddiad cyfoethogi'n cyfeirio at adweithio llwybr cylchred celloedd mitotig ac, yn benodol, at ddad-ddirwyn DNA ac atgynhyrchu, cyddwysiad cromosom, a datrysiad chwaer gromatidau (Ffigur 3C, Tabl S7).
Mae dadansoddiad manwl yn dangos bod 18 o'r 25 o broteinau wedi'u hadfer yn clystyru'n gryf gyda'i gilydd (Ffigur 4A). Yn y clwstwr hwn, mae'n bosibl dirnad CDK1, holl is-unedau cyfadeilad condensin I (SMC2, SMC4, NCAPD2, NCAPH, ac NCAPG), tri phrotein sy'n gysylltiedig â chinetocore (KNTC1, NUF2, a TRIP13), pob un o'r chwe is-uned o'r cyfadeilad cynnal a chadw minichromosom atgynhyrchu (MCM) (MCM2-7) ynghyd ag IQGAP3, PBK, a DHFR.
Mae gallu ObHEx i adfer lefelau'r proteinau hyn yn rhannol wedi'i ddangos yn dda yn y lleiniau proffil yn Ffigur 4B: roedd lefelau mynegiant protein yn ddigyfnewid ar y cyfan yn y celloedd lluosogi a gafodd eu trin ai peidio â'r dyfyniad, wedi'u gollwng yn y celloedd senescent, ac wedi cynyddu'n rhannol ar ôl Triniaeth obHEx.
2.3. Cadarnhaodd Asesiadau Biolegol Fecanwaith Gweithredu Promitotig ObHEx
Y nodwedd fwyaf cyffredin ar gyfer celloedd senescent yw'r cynnydd mewn gweithgarwch SA{{{{{{{{{{{0}}}}gal) y gellir ei werthuso gan assay staenio. Mae ein canlyniadau'n dangos bod triniaeth H2O2 wedi arwain at gynnydd sylweddol yn nifer y celloedd SA- -gal positif (glas), o 4.7 y cant i 22.9 y cant (Ffigur 5A, B). Gostyngodd deori ObHEx weithgaredd SA- -gal yn sylweddol gyda gostyngiad o 38.4 y cant (p < 0.01).
Ar ben hynny, i asesu a yw adfer mynegiant protein mitotig gan ObHEx yn trosi i adweithio'r cylchred celloedd, cafodd y rheolaeth, a chelloedd senescent eu trin ai peidio gyda'r dyfyniad am 72 h a chynhaliwyd arbrofion Didoli Celloedd wedi'u Ysgogi Fflworoleuedd (FACS). Dangosodd canlyniadau celloedd henebol floc yng nghamau G2 / M y gylchred gell (36.8 y cant ), tra mai dim ond ffracsiwn llawer is o'r celloedd rheoli (7.2 y cant) oedd yn y cyfnodau hyn ers iddynt gyrraedd cydlifiad, yn unol â'r llenyddiaeth [] 33] (Ffigur 5C, D). Roedd trin celloedd senescent ag ObHEx yn gallu lleihau'r boblogaeth G2/M 4.3 y cant (p < 0.05). O sylwi, o'i gysylltu â'r gyfran cell henebraidd ar ôl SIPS (22.9 y cant ), gellid amcangyfrif bod y dihangfa G2/M yn 18.9 y cant . Mae'r un driniaeth ObHEx am 48 h wedi'i chynnal, ond nid oedd y canlyniadau'n arwyddocaol yn ystadegol.
【Am ragor o wybodaeth:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】
