Effeithiau A Mecanweithiau Amddiffynnol Procyanidins Ar Glefyd Parkinson Yn Vivo Ac In Vitro Rhan 2

Cysylltwchoscar.xiao@wecistanche.comam fwy o wybodaeth

2.7.Effeithiau Cyfrifiaduron Personol ar Straen Oxidative o Zebrafish Larae Wedi'i Drin â MPTP

Gostyngodd trin larfa pysgod sebra gyda PCs y cynnydd mewn ffurfiant ROS mewngellol a achosir gan MPTP (Ffigur 7a,b). Ar ben hynny, dangosodd canlyniadau'r asesiad perocsidiad lipid fod datguddiad PC （16 ug/mL） wedi rhwystro'r lefelau MDA a achosir gan MPTP mewn larfa pysgod sebra (Ffigur 7c). Yn ogystal, cafodd y gostyngiad a achosir gan MPTP mewn gweithgaredd GSH-Px ei wrthdroi gan driniaeth PC （16 ug/mL） (Ffigur 7d), a PCs (4,8, a 16 ug/mL) gostyngiadau cynyddol a achosir gan MPTP mewn CAT a SOD gweithgaredd (Ffigur 7e,f).

Figure 7. Effects of PCs on oxidative stress of zebrafish larvae treated with MPTP. (a)ROS levels were measured by fluorescent microscopy and imaging analysis;(b)ROS levels were measured via imageJ software;(c) MDA levels;(d) GSH-Pxactivity;(e)CATactivity;(f) SOD activity. F and p values of the one-way analysis of variance are presented above each chart.The results of Tukey's post hoc test are presented for selected comparisons: ns, p>0.05;*,p<><0.01;***, p=""><0.001; the="" error="" bars="" are="">

Os gwelwch yn dda cliciwch yma i ddysgu mwy

2.8. Effeithiau cyfrifiaduron personol ar Nr2/ARE Patlhroay yn Laroa Zebrafish a achosir gan MPTP

Roedd trin larfa pysgod sebra gyda PCs yn tanlinellu'r rhagosodiad bod actifadu llwybrau Nr2/ARE yn gysylltiedig ag eiddo amddiffynnol trwy gyfrwng PC. Cafodd mynegiant marcwyr Nrf2, HO-1, NQO1, GCLC a GCLM ei uwchreoleiddio gan driniaeth PCs o gymharu â datguddiad MPTP yn unig (Ffigur 8a-e).

Figure 8. Effects of PCs on Nrf2/ARE pathway in MPTP-induced zebrafish larvae. (a) Nrf2 levels;(b)HO-1 levels;(c)NQO1 levels;(d) GCLClevels;(e) GCLM levels. F and p values of the one-way analysis of variance are presented above each chart. The results of Tukey's post hoc test are presented for selected comparisons: ns,p>0.05;*,p<><><0.001:the error="" bars="" are="">

3. Trafodaeth

Mae cyfrifiaduron personol yn arddangos galluoedd sborionu radical cryf a gweithgaredd gwrthocsidiol, ac mae straen ocsideiddiol, a achosir gan y genhedlaeth ormodol o ROS neu / a'r system amddiffyn gwrthocsidiol â nam, yn chwarae rhan hanfodol yn PD[37-39]. Fodd bynnag, mae'n aneglur a all PCs chwarae rôl niwro-amddiffynnol trwy effeithiau gwrthocsidiol. Nod yr ymchwil hwn oedd ymchwilio i fecanwaith moleciwlaidd cyfrifiaduron personol yn erbyn modelau PD a achosir gan MPP plus /MPTP.

Gall cistanche wella imiwnedd

Yn yr astudiaeth hon, o'i gymharu â'r grŵp MPP plus /MPTP yn unig, cododd cyfrifiaduron personol yn sylweddol lefel gweithgaredd ensymau gwrthocsidiol (gan gynnwys GSH-Px, CAT, a SOD) a gostyngodd lefelau ROS a MDA. Mae'r canfyddiadau cyfredol yn gyson ag astudiaeth flaenorol sy'n awgrymu bod atodiad PC isel trwy ddeiet yn gwella gweithgareddau GSH-Px, CAT, a SOD mewn perchyll wedi'u diddyfnu [40]. Mae astudiaeth arall hefyd yn awgrymu bod cyfrifiaduron personol yn cynyddu gweithgareddau CAT a SOD yn sylweddol ac yn lleihau cynnwys MDA, gan wella ansawdd sberm gafr[41]. Mae'r canfyddiadau hyn yn awgrymu bod PCs yn cael effaith amddiffynnol ar niwed ocsideiddiol i gelloedd nerfol. Yn ogystal, fe wnaeth cyfrifiaduron personol wella hyfywedd celloedd o'i gymharu â'r grŵp MPP plus -unig mewn celloedd PC12 a ysgogwyd gan MPP plus, cynnydd sylweddol yn y cyfanswm pellter a symudwyd, a gostyngodd TH plws dwysedd celloedd o'i gymharu â'r grŵp MPTP mewn larfa pysgod sebra a achosir gan MPTP. Mae'r data hyn yn dangos bod cyfrifiaduron personol yn cael effaith amddiffynnol ar gelloedd nerfol.

Gwelsom ymhellach fod cyfrifiaduron personol wedi cynyddu'n sylweddol groniad Nrf2 niwclear o'i gymharu â chroniad MPP plus yn unig mewn celloedd PC12. Yn wir, mae cyfrifiaduron personol wedi uwchreoleiddio lefelau mynegiant NQO1, HO-1, GCLM, a GCLC[42] yn sylweddol. Ar ben hynny, defnyddiwyd tawelu Nfr2gene trwy Nrf2 siRNA i ymchwilio i rôl actifadu Nrf2/ARE mewn niwroamddiffyniad wedi'i gyfryngu gan PCs yn erbyn difrod ocsideiddiol a achosir gan MPP a mwy: nododd celloedd a drosglwyddwyd gan Nrf ostyngiad amlwg mewn mynegiant Nrf2. Canfu'r astudiaeth gyfredol hon hefyd fod taro Nrf2 wedi diddymu amddiffyniad cyfryngol PCs yn erbyn MPP ynghyd â namau wedi'u trin yn hyfywedd celloedd ac effeithiau gwrthocsidiol cyfrifiaduron personol. Mae'r canlyniadau hyn yn gyson ag astudiaeth flaenorol sy'n awgrymu bod gwella gweithrediad y llwybr Nrf2 / ARE yn cyfrannu at niwro-amddiffyniad [43].

Mae llwybr Nrf2/ARE yn llwybr gwrthocsidiol arwyddocaol [44-46]. Fel arfer, mae Nrf2 yn byw yn y cytoplasm, lle mae'n rhwym i'r protein ataliol, Keapl [47,48]. Pan fydd celloedd yn cael straen ocsideiddiol, mae Nrf2 yn daduno o Keap1, yn cychwyn y system amddiffyn gwrthocsidiol mewndarddol, ac wedyn yn trawsleoli i'r cnewyllyn [46,49,50]. Yna mae'n rhyngweithio ag ARE i actifadu cyfres o enynnau amddiffynnol celloedd a gwrthocsidiol, gan gynnwys GCLC, GCLM, NQO1, a HO-1 [51-54]. Mewn ymateb i straen ocsideiddiol, mae Nrf2 yn daduno o Keap1 yn y cytosol ac yna'n cael ei drawsleoli i'r cnewyllyn, gan rwymo'r dilyniant ARE i actifadu trawsgrifio genynnau cryoprotective [{53-58]. Mae'r canlyniadau cyfredol yn dangos y gall PCs actifadu'r llwybr Nrf2/ARE, trosglwyddo Nrf2 o'r cytoplasm i'r cnewyllyn, cronni yn y cnewyllyn, dadreoleiddio mynegiant GCLC, GCLM, NOO1, a HO-1 a gwella gallu celloedd i wrthsefyll straen ocsideiddiol. Yn wir, gall llwybr Nrf2/ARE gynrychioli targed ffarmacolegol o gyfrifiaduron personol ar gyfer atal PD.

4. Defnyddiau a Dulliau

4.1. Cyfansoddion Cemegol ac Adweithyddion

Prynwyd asiantau MPP plus ac MPTP oddi wrth Sigma (St. Louis, MO, UDA), a chafwyd y Cell Counting Kit-8 gan Beyotime (Shanghai, Tsieina). Cafwyd y pecynnau diagnostig PCs, 2', 7/-Dichlorofluorescin diacetate, MDA, GSH-Px, SOD, a CAT gan Solarbio (Beijing, Tsieina). Prynwyd y Pecyn Adweithydd RNAiso Plus, PrimeScriptTMRT gyda Rhwbiwr gDNA, a SYBRPremix Ex TaqTMⅡI gan Takara (Shiga, Japan); cafwyd y Nrf2-siRNA, control-siRNA, a Lipofectamine 2000 gan GenePharma (Shanghai, Tsieina). Yn olaf, cafwyd y gwrthgyrff cynradd, Nrf2, HO-1, GCLC, GCLM, NAD(P)H: NQO1, Lamin B, GAPDH, Antityrosine Hydroxylase (TH), a gwrthgyrff eilaidd cyfatebol gan Proteintech (Wuhan, Tsieina). ).

4.2.Diwylliant Cell

Cafwyd celloedd PC12 o'r Casgliad Cenedlaethol o Ddiwylliannau Celloedd Dilysedig. Cynhaliwyd y celloedd yn DMEM ynghyd â serwm buchol ffetws 10 y cant a phenisilin-streptomycin (100 U / mL; 100 ug / mL) mewn deorydd atmosffer llaith ar 37 gradd gyda 5 y cant CO2 [59].

4.3. Assay Hyfywedd Celloedd

Deorwyd celloedd PC12 (1 × 104 celloedd / ffynnon) gyda 1,2or4ug / mLof PCsor deprenvl (30 μM) am 24 h, ac yna deorwyd gyda 1.5 mM MPP a mwy am 24 h. Nesaf, ychwanegwyd 10 μL o doddiant Pecyn Cyfrif Cell-8 at bob ffynnon a'i ddeor am 1 awr. Mesurwyd yr amsugnedd ar 450 nm [60].

4.4. Cynnal a Chadw Pysgod

Rhoddwyd cymeradwyaeth foesegol ar gyfer defnydd anifeiliaid gan bwyllgor cadwraeth a defnydd anifeiliaid y ganolfan anifeiliaid arbrofol, Prifysgol Zhejiang (ZJU20200125). Cafwyd pysgod sebra oedolion (straen AB) o ganolfan anifeiliaid labordy Prifysgol Zhejiang (Hang Zhou, Tsieina) a'u cynnal ar 28 ± 1 gradd o dan gylchredau golau 14h / 10 awr tywyll. Roedd y pysgod yn cael eu bwydo Artemia nauplii ddwywaith y dydd [61]. I gynhyrchu embryonau, gosodwyd pysgod sebra llawndwf mewn tanciau bridio dros nos ar gymhareb 1:1 gwrywaidd: benywaidd. Ysgogwyd silio ar ôl i'r goleuadau gael eu troi ymlaen y bore wedyn a'u cwblhau mewn 2 h. Codwyd embryonau mewn dŵr embryo （13.7 mM NaCl, 540 μM KCl, 25 uM Na2HPOA44 uM KHPOA, 300 uM CaCl2, 100 μM MgSO, 420 μM NaHCO3, pH 7.28 〉

4.5. Mesur ROS

I fesur cynhyrchiad ROS, roedd celloedd PC12 (2 × 104 cell/ffynnon) yn agored i 1,2 neu 4 ug/mL o gyfrifiaduron personol neu deprenyl （30 μM） am 24 h ac yna wedi'u deor â 1.5 mM MPPt am 24 awr 【64】. Roedd y celloedd yn agored i hydoddiant diacetate 10 μM 2',7'-Dichlorofluorescin mewn amodau tywyll am 30 munud; yna tynnwyd yr hydoddiant llifyn, a golchwyd y celloedd â halwynog wedi'i glustogi â ffosffad (PBS)3 gwaith. Arsylwyd y delweddau o'r celloedd gan ddefnyddio microsgop confocal sganio laser Olympus (Olympus, prifddinas Tokyo, Japan). Mesurwyd dwyster fflworoleuedd y celloedd gan ddefnyddio meddalwedd Image J v1.8.0 (Olympus, prifddinas Tokyo, Japan). Mynegir y canlyniadau fel canran o arwynebedd y rhanbarthau ROS yn y grŵp rheoli.

I fesur cynhyrchiant ROS, roedd y larfa pysgod sebra 3 diwrnod ar ôl ffrwythloni (dpf) yn agored i deprenyl （40 μM） neu 4,8 neu 16 ug/mL o gyfrifiaduron personol gyda neu heb 400 μM MPTP am 4 diwrnod. Trosglwyddwyd larfa pysgod sebra ar 7 dpf i blât ffynnon 24-(10 larfa fesul grŵp), wedi'i drin â hydoddiant diasetad 20 μM 2',7'-Dichlorofluorescin, a'i ddeor am 60 munud yn y tywyllwch ar 28.5 gradd [65 ]. Yna golchwyd y larfa deirgwaith gyda chyfrwng embryo i gael gwared ar ormodedd o 2',7'-Dichlorofluorescin diacetate. Arsylwyd y delweddau o'r larfa lliw gan ddefnyddio microsgop confocal sganio laser Olympus. Defnyddiwyd meddalwedd Image J i fesur dwyster fflworoleuedd y larfa unigol. Mynegir y canlyniadau fel canran o arwynebedd y rhanbarthau ROS yn y grŵp rheoli. 4.6.Asesu MDA, GSH-Px, SOD, a CAT

Roedd celloedd PC12 (2 × 104 celloedd / ffynnon) yn agored i 1,2 neu 4 ug/mL o gyfrifiaduron personol neu deprenyl (30 μM) am 24h, ac yna'n cael eu deor â 1.5 mM MPP a mwy am 24 awr. Yna, ychwanegwyd 1 ml o echdyniad at gelloedd 4 × 10 gradd, a thorrwyd celloedd gan allgyrchu ultrasonic ar 8000 rpm ar 4 gradd am 10 munud. Yna rhoddwyd y supernatant ar iâ i'w brofi, ac ychwanegwyd adweithyddion ar gyfer pennu MDA, GSH-Px, SOD, a CAT, yn y drefn honno. Ailadroddwyd pob mynegai yn driphlyg.

Cafodd y larfa pysgod sebra ar 3dpf eu deor â deprenyl （40 μM） neu4,8 neu 16 ug/mL o gyfrifiaduron personol gyda neu heb 400 μM MPTP am 4 diwrnod. Yna, cafodd 0.05 g o feinwe larfa pysgod sebra a 0.5 ml o echdyniad eu homogeneiddio mewn baddon iâ ac yna eu centrifugio ar 4 gradd am 10 munud. Rhoddwyd y supernatant ar iâ i'w brofi. Ychwanegwyd adweithyddion wedyn ar gyfer pennu MDA, GSH-Px, SOD, a CAT, yn y drefn honno. Ailadroddwyd pob mynegai yn driphlyg.

4.7. Paratoi Protein Cell Gyfan, Cytoplasmig a Niwclear

Ar gyfer echdynnu protein celloedd cyfan, casglwyd celloedd a'u deor â byffer lysis RIPA yn cynnwys 1 y cant PMSF a choctel atalydd proteas 1 y cant am 30 munud ar rew. Roedd lysates celloedd yn cael eu centrifugio, a chafodd y supernatant ei gasglu a'i storio. Ar gyfer paratoi ffracsiynau isgellog, proseswyd samplau celloedd gan ddefnyddio'r pecyn echdynnu protein niwclear a sytoplasmig. Assayiwyd y cynnwys protein gan ddefnyddio assay BCA (Beyotime, Shanghai, China).

4.8. Trawsnewidiad siRNA Nrf2

Defnyddiwyd Nrf2-siRNA i ddymchwel Nrf2. Trawsnewidiwyd celloedd PC12 â Nrf2-siRNA (80 nM) neu control-siRNA gan ddefnyddio Lipofectamine 2000, yn ôl y llawlyfr. 4.9.Blotio'r Gorllewin

Cafodd samplau protein eu datrys gan SDS-PAGE a'u trosglwyddo i bilenni polyvinylidene di-fluoride (PVDF). Roedd y blots yn agored i wrthgyrff cynradd priodol: Nrf2, Keap1, HO-1, NQO1, GCLC, GCLM, Lamin B, GAPDH a gwrthgyrff eilaidd cyfun peroxidase. Delweddwyd bandiau protein gan ddefnyddio ECL (Beyotime, Shanghai, China) ynghyd ag adweithyddion canfod blotio Gorllewinol [36,43].

4.10.Prawf Behaioral Locomotor

Cafodd y larfa pysgod sebra ar 3dpf eu deor â deprenyl （40 μM） neu 4,8 neu 16 ug/ml o gyfrifiaduron personol gyda neu heb 400uM MPTP am 4 diwrnod. Yna gosodwyd y pysgod sebra 7 dpf ar 24-blatiau ffynnon (1 pysgodyn i bob ffynnon a 12 larfa fesul grŵp), a chofnodwyd cyfanswm pellter nofio pob pysgodyn dros 10 munud. Cafodd ymddygiad Sebrafish ei fonitro a'i ddadansoddi gan ddefnyddio system olrhain fideo awtomataidd (Any-maze 4.73, Stoelting, Wood Dale, IL, UDA)[66].

4.11.Echdynnu RNA Cyfanswm, Trawsgrifio Gwrthdro, ac Adwaith Cadwyn Polymeras Amser Real Meintiol

Echdynnwyd RNA gan ddefnyddio RNAiso Plus gan ddilyn cyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Cafodd RNA ei drawsgrifio o chwith gan ddefnyddio Pecyn Adweithydd PrimeScriptTMRT gyda Rhwbiwr gDNA, gan ddilyn cyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Perfformiwyd dadansoddiad PCR amser real meintiol ar system PCR Amser Real ViATM 7 Biosystems Cymhwysol gan ddefnyddio SYBRPremix Ex TaqTM II (Takara, Shiga, Japan). -defnyddiwyd actin fel genyn cyfeirio a chyfrifwyd mynegiant genynnau cymharol gan ddefnyddio'r dull 2-△Ct. Rhestrir y dilyniannau preimio a ddefnyddiwyd yn yr ymchwil yn Nhabl 1.

4.12. Sebrafish Antityrosine Hydroxylase(TH)Imiwnoddynoli Mynydd Cyfan

Cafodd larfa pysgod sebrabysgod ar 1 dpf eu deor â deprenyl （40 μM） neu 4,8 neu 16 ug/mL o gyfrifiaduron personol gyda neu heb 400 uM MPTP am 2 ddiwrnod (10 swp pysgod/grŵp). Gosodwyd y larfa gyda 4 y cant o baraformaldehyd yn PBS am 30 munud. Ar ôl cael eu sefydlogi, cawsant eu trin ar gyfer imiwno-gynnal mynydd cyfan o TH [67]. Ar dymheredd ystafell, cafodd 2 y cant (v/o) serwm cig oen a 0.1 y cant (w/ø) albwmin serwm buchol (BSA) eu rhwystro mewn Tween halwynog â byffer ffosffad-20(PBST) am 1 h. Yna cawsant eu hamlygu yn y byffer blocio i wrthtyrosingwrthgorff hydroxylase (1: 200 wedi'i wanhau, Proteintech) am 2 awr, ac yna ei rinsio 6 gwaith gyda PBST. Perfformiwyd y cam gwrthimiwnedd mownt cyfan olaf trwy staenio byffer gyda 488 o wrthrabbit gafr (1:500) am 1 awr a'i olchi eto gyda PBST. Ar ôl digon o ddatblygiad lliw, cafodd y pysgod sebra eu gosod yn fflat gyda 3.5 y cantmethylcellwlosa delweddwyd gan ddefnyddio microsgop confocal sganio laser Olympus.

4.13. Dadansoddiad Ystadegol

Defnyddiwyd dadansoddiad un ffordd o amrywiant (ANOVA) ac yna prawf cymharu lluosog Tukey i gymharu dulliau gwahanol grwpiau. Defnyddiwyd Graphpad Prism v6.01(GraphPad Software, San Diego, CA, UDA) ar gyfer dadansoddi ystadegol a phlotio'r graffiau.

5. Casgliadau

I gloi, mae ein canfyddiadau'n dangos bod PCs yn cael effeithiau niwro-amddiffynnol trwy actifadu'r llwybr Nrf2/ARE a'i lawr yr afondadwenwynoagwrthocsidiol ensymau. Gyda'i gilydd, mae'r mewnwelediadau hyn yn awgrymu y gallai cyfrifiaduron personol fod yn ddefnyddiol ar gyfer trin PD.

Daw'r erthygl hon o Molecules 2021, 26, 5558. https://doi.org/10.3390/molecules26185558 https://www.mdpi.com/journal/molecules