Marcwyr Ansawdd Cistanches Herba Yn Seiliedig ar Berthynas Effaith Sbectrwm Gwrthocsidiol

Crynodeb: Amcan: Sefydlu dull ymchwil ar gyfer marcwyr ansawdd (marcwyr Q) oCistanches Herba(CH)yn seiliedig ar yperthynas gwrthocsidiol sbectrwm-effaith, gan ddarparu sail ar gyfer astudio ei sylweddau ffarmacolegol a rheoli ansawdd. Dulliau: Defnyddiwyd cromatograffaeth hylif tra-perfformiad (UPLC) i sefydlu proffiliau olion bysedd ar gyfer 10 swp o CH. Sefydlwyd model difrod ocsideiddiol celloedd gan ddefnyddio H2O2, a phenderfynwyd cynhwysedd gwrthocsidiol CH yn seiliedig ar y crynodiad ataliol hanner-uchaf o rywogaethau ocsigen adweithiol, yn ogystal â lefelausuperoxidedismuaseacatalasfeldangosyddion ffarmacolegol. Adeiladwyd y berthynas effaith sbectrwm trwy ddadansoddiad o'r prif gydrannau, dadansoddiad cydberthynas Pearson, a dadansoddiad atchweliad rhannol sgwariau lleiaf. Mae'rcydrannau gweithredolyn ddarostyngedig idilysiad ffarmacolegol. 

Canlyniadau:Sefydlwyd proffiliau olion bysedd ar gyfer CH gan ddefnyddio UPLC, gan nodi 17 uchafbwynt cyffredin. Yn seiliedig ar ddadansoddiad cydberthynas sbectrwm-effaith, dewiswyd naw cydran. Roedd canlyniadau dilysiad ffarmacolegol yn dangos bod asid geniposidig, 8-asid epiloganig,echinacoside,acteosid, isoacteoside, atubuloside Aarddangos gweithgaredd gwrthocsidiol mewn modd canolbwyntio-ddibynnol.

Casgliad: Archwiliodd yr astudiaeth hon nodau-Q ar gyfer CH yn seiliedig ar y berthynas effaith sbectrwm, gan ddarparu gwybodaeth gyfeirio ar gyfer ei sylfaen sylweddau ffarmacolegol a gwella safon ansawdd.

Geiriau allweddol:Cistanches Herba; Q-marcwr;perthynas sbectrwm-effaith; gwrthocsidiol

Cistanche deserticola yw'r coesyn cigog sych gyda dail cennog Cistanche deserticola YCMa neu Cistanche tubulosa (Schenk) Wight, planhigyn sy'n perthyn i'r teulu Cistanche deserticola orbaceae. Mae'n gynnes ei natur, melys a hallt ei flas; mae'n dychwelyd i meridians yr aren a'r coluddyn mawr; mae ganddo effeithiau maethlon yang aren, ailgyflenwi hanfod a gwaed, gwlychu'r coluddion a'r carthydd, ac mae'n feddyginiaeth bwysig ar gyfer tynhau'r aren ac ailgyflenwi hanfod [2-3]. Mae'r arennau'n storio hanfod, ac mae hanfod a gwaed yn dod o'r un ffynhonnell. Os yw hanfod a gwaed yn ddiffygiol, bydd yn effeithio ar weithgareddau bywyd cyffredinol y corff dynol; mae'r mêr sy'n cynhyrchu hanfod yn cael ei storio yn yr esgyrn, a'r ymennydd yw'r môr mêr. Os nad yw hanfod yr arennau'n ddigonol, bydd yr esgyrn yn colli eu maeth a bydd yr ymennydd yn ddiffygiol, gan arwain at newidiadau dirywiol esgyrn megis gwead rhydd, colli dannedd, colli cof, dementia, a llai o swyddogaeth imiwnedd [4-6]. Mae Cistanche deserticola yn cynnwys glycosidau ffenylethanoid, iridoidau, lignans a chydrannau strwythurol eraill, gan gynnwys echinacoside, verbascoside, verbascoside, asid genipinig, ac 8-asid epistryanig. , tubulin A, ac ati [7]. Mae rheolaeth ansawdd gyfredol Cistanche deserticola yn rhifyn 2020 o "Pharmacopoeia Gweriniaeth Pobl Tsieina" yn nodi cynnwys echinacoside a verbascoside yn unig, na all adlewyrchu'n llawn nodweddion gweithredu aml-gydran ac aml-darged meddygaeth Tsieineaidd traddodiadol. , nad yw'n ffafriol i'w reoli ansawdd a'i werthuso.

Er mwyn gwella lefel rheoli ansawdd meddygaeth Tsieineaidd traddodiadol a gwneud y gorau o werthusiad ansawdd meddygaeth draddodiadol Tsieineaidd, cynigiodd yr Academydd Liu Changxiao y cysyniad newydd o farciwr ansawdd (Q-marker) o feddyginiaeth Tseiniaidd traddodiadol [8]. Yn eu plith, "effeithiolrwydd" yw'r elfen graidd yn y "Pum Egwyddor" o Q-marker [9] ac mae hefyd yn greiddiol i'r gwerthusiad ansawdd o feddyginiaethau Tseiniaidd traddodiadol.

Yn wyneb statws ymchwil presennol y gydberthynas wael rhwng safonau ansawdd ac effeithiolrwydd cyffuriau, mae archwilio marcwyr Q o feddyginiaethau Tseiniaidd traddodiadol a sefydlu safonau ansawdd mwy gwyddonol a rhesymol yn arwyddocaol iawn i wella ansawdd meddyginiaethau Tsieineaidd traddodiadol. Mae'r berthynas sbectrwm-effaith yn cysylltu copaon cromatograffig olion bysedd meddygaeth Tsieineaidd traddodiadol â data ffarmacodynamig penodol i ddod o hyd i sylweddau effeithiol meddygaeth Tsieineaidd traddodiadol, a thrwy hynny adlewyrchu ansawdd cynhenid ​​meddygaeth Tsieineaidd traddodiadol [10]. Gall sefydlu model mathemategol effeithlonrwydd sbectrol egluro QMarker meddygaeth draddodiadol Tsieineaidd o safbwynt "golwg cyfannol", gan ddarparu mwy o gyfeiriadau ar gyfer rheoli ansawdd meddygaeth Tsieineaidd traddodiadol yn ddiweddarach, llunio safonau ansawdd, a sgrinio cynhwysion gweithredol. Mae'r astudiaeth hon yn defnyddio olion bysedd ynghyd â chyfradd hanner-ataliad rhywogaethau ocsigen adweithiol (ROS IC50), cynnwys superoxide dismutase (SOD) a catalase (CAT) i astudio perthynas sbectrwm-effaith meddygaeth Tsieineaidd draddodiadol, ac mae'n defnyddio dadansoddiad prif gydrannau. (PCA) ), dadansoddiad cydberthynas Pearson (CSP) a dadansoddiad atchweliad rhannol sgwariau lleiaf (PLS) i ddadansoddi marc-Q Cistanche deserticola yn gynhwysfawr i ddarparu sail ar gyfer ei reolaeth ansawdd.

1 deunydd

1.1 Sampl

Cynaeafwyd Cistanche deserticola o Yutian County, Xinjiang, a chanolfan blannu Arfer Amaethyddol Da (GAP) Cistanche deserticola ym Mongolia Fewnol. Fe'i nodwyd gan yr ymchwilydd Zhang Tiejun o Tianjin Pharmaceutical Research Institute Co, Ltd fel Cistanche tubulosa (Schenk) Wight a Cistanche deserticola.

YC Ma, dangosir gwybodaeth fanwl yn Nhabl 1.

1.2 Profi meddyginiaeth

Prynwyd Echinaceaside (rhif swp: 111670-201907, purdeb: 91.8%) a verbascoside (rhif swp: 111530-201914, purdeb: 95.2%) gan Sefydliad Rheoli Bwyd a Chyffuriau Tsieina; isorescoside (rhif swp: 61303-13 -7), salidroside (rhif swp: 10338-51-9), 8-asid epistrychnoic (rhif swp: 82509-41-9), asid genipinig (rhif swp: Z24A10X95926) , tuberose B (Rhif swp: 112516-04-08), 2- acetyl eugenol glycoside (Rhif swp: 94492-24-7) eu prynu oddi wrth Shanghai Yuanye Biotechnology Co, Ltd., purdeb Mwy na neu'n hafal i 98%; Prynwyd Cistanche glycoside A (Rhif swp: RHAID -20062806, purdeb: 98.51%), floridin A (rhif swp: MUST19110102, purdeb: 98.57%) gan Chengdu Mansite Biotechnology Co, Ltd; prynwyd asetonitrile pur cromatograffig ac asid fformig oddi wrth Tianjin Concord Technology Co, Ltd. Dŵr wedi'i Buro (Hangzhou Wahaha Group Co, Ltd). Fitamin E (VE, V8010, Cwmni Solarbio Beijing); dimethyl sulfoxide (DMSO, D2660-100ML, Cwmni Sigma yr Unol Daleithiau); CellTiter 96® pecyn canfod amlhau celloedd datrysiad sengl AQueous (G3580, Cwmni Promega yr Unol Daleithiau); Canfod CAT Prynwyd y pecyn (S0051), pecyn canfod gweithgaredd SOD (S0101M), a phecyn canfod ROS (S0033S) gan Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd.

1.3 Offerynnau

Cromatograff hylif perfformiad uchel iawn Waters H-class-PDA (Waters Company, UDA); cydbwysedd electronig Sartorius BT25S (Cwmni Sartorius, yr Almaen); H1650 cyflymder uchel centrifuge bwrdd gwaith (Hunan Xiangyi Labordy Offeryn Datblygu Co, Ltd); SpectraMax M5

Darllenydd microplate (Meigu Molecular Instrument Co., Ltd.); WYS-41XDY microsgop biolegol (Tianjin Micro-Instrument Optical Instrument Co., Ltd.).

1.4 cell

Celloedd arennau embryonig dynol Defnyddiwyd celloedd HEK 293 yn yr arbrawf hwn ac fe'u prynwyd o fanc celloedd yr Academi Gwyddorau Tsieineaidd.

2 ddull

2.1 Sefydlu map olion bysedd

2.1.1 Paratoi hydoddiant prawf: Pwyswch 2 g o ddeunydd meddyginiaethol Cistanche deserticola, ychwanegwch 10 gwaith swm y dŵr, gwres ac adlif 3 gwaith, 1 h bob tro, centrifuge ar 1.0 ×105r·min-1 am 15 munud (radiws allgyrchol yw 300 mm), Cyfunwch y supernatants a chrynhoi i wneud hydoddiant stoc gyda chrynodiad màs o 100 mg·mL-1, ei wanhau 10 gwaith, a'i hidlo trwy bilen hidlo microfandyllog 0.22 µm i'w chael.

2.1.2 Paratoi datrysiad cyfeirio cymysg

Cymerwch 8-asid epistrrychnig, salidroside, echinaceaside, cistanche glycoside A, asid genipinic, verbascoside, anthocyanoside A, isorbascoside, a 2'-acetyl eugenol. Mesurwyd sylweddau cyfeirio glycosid ac angioside B mewn symiau priodol a'u pwyso'n gywir. Ychwanegu hydoddiant methanol 50% i hydoddi a pharatoi hydoddiant sylwedd cyfeirio cymysg gyda chrynodiad màs o 20 µg·mL–1.

2.1.3 Cyflyrau cromatograffig

ACQUITY UPLC®BEH C18 colofn (100 mm × 2.1 mm, 1.7 µm); cam symudol yw asetonitrile (A) ~ 0.1% hydoddiant asid fformig (B), rhaglen elution graddiant (0 ~ 6 munud, 5% ~ 8% A; 6 ~ 10 munud, 8% ~ 15% A 10 ~ 13 munud, 15% ~ 19% A, 13 ~ 20 munud, 19% ~ 25% A); tonfedd canfod yw 237 nm; cyfradd llif yw 0.4 mL·min –1; tymheredd y golofn yw 40 gradd; cyfaint pigiad yw 3 µL.

2.1.4 Cyfeiriad dethol brig

Yn y cromatogram cromatograffaeth hylif uwch-berfformiad (UPLC) o Cistanche deserticola, dewiswyd y brig gyda'r gymhareb ardal brig fwyaf, amser cadw cymedrol, a gwahaniad da fel uchafbwynt cyfeirio'r sbectrwm olion bysedd. 2.1.5 Ymchwiliad methodolegol Prawf manwl: Cymerwch y sampl T1 a pharatowch y datrysiad prawf yn ôl y dull o dan 2.1.1. Chwistrellwch y sampl 6 gwaith yn barhaus a chofnodwch yr olion bysedd. Mae'r canlyniadau'n dangos mai arwynebedd cymharol brig pob cyfnod brig yw 0.10%~4.61%. , RSD yr amser cadw cymharol yw 0.08% ~ 1.32%, sy'n dangos bod gan yr offeryn drachywiredd da.

Prawf ailadrodd: Cymerwch y sampl T1 a pharatowch 6 sampl o'r datrysiad prawf yn gyfochrog yn ôl y dull o dan 2.1.1, a chwistrellwch y sampl yn barhaus. Mae'r canlyniadau'n dangos mai ardal brig cymharol RSD pob uchafbwynt cromatograffig yw 1.35% ~ 4.80%, a'r amser cadw cymharol RSD yw 0.10% ~ 1.80%, sy'n bodloni gofynion yr olion bysedd ac yn dangos bod yr ailadroddadwyedd o'r offeryn yn dda.

Prawf sefydlogrwydd: Cymerwch y sampl T1 a pharatowch yr ateb prawf yn ôl y dull o dan 2.1.1, chwistrellwch samplau i'w profi yn 0, 2, 4, 8, a 12 awr, a chofnodwch yr olion bysedd. RSD a gyfrifwyd ar gyfer arwynebedd brig cymharol pob uchafbwynt cromatograffig yw 0.53%~4.82%, a RSD yr amser cadw cymharol yw 0.09%~2.17%, sy'n bodloni'r gofynion o'r olion bysedd ac yn nodi bod y cynnyrch prawf yn sefydlog o fewn 12 awr.

2.2 Ymchwil ar effaith gwrthocsidiol Cistanche deserticola

2.2.1 Paratoi gwirodydd mamol Cistanche deserticola:Cymerwch y gwirod mam o dan eitem 2.1.1, ei hidlo a'i sterileiddio, a'i wanhau â chyfrwng diwylliant i'r crynodiad gofynnol cyn ei ddefnyddio.

2.2.2 Effeithiau Cistanche deserticola a rheolaeth gadarnhaol VE ar hyfywedd celloedd HEK 293

Sefydlwch y grŵp arferol (hongiad cell), grŵp gweinyddu Cistanche deserticola (25, 50, 100, 200, 400 µg·mL–1), grŵp VE (20, 40, 60, 80, 100 µmol·L–1), yr un Gosodwch 6 ffynnon ddyblyg ym mhob crynodiad a diwylliant am 24 awr. Ychwanegu 20 µL o adweithydd toddiant sengl CellTiter 96® AQueous i bob ffynnon i ganfod hyfywedd cell. Parhewch i feithrin am 2 awr. Defnyddiwch ddarllenydd microplate i ganfod gwerth amsugnedd (OD) pob ffynnon ar 490 nm. Cyfrifwch gyfradd goroesi celloedd yn ôl fformiwla (1). Cyfradd goroesi (%)=(grŵp arbrofol OD/grŵp gwag OD) × 100% (1)

2.2.3 Effaith Cistanche deserticola ar ROS a achosir gan H2O2 yng nghelloedd HEK 293

Rhannwyd y celloedd yn grŵp arferol (hongiad cell) a grŵp gweinyddu Cistanche deserticola (6.25, 12.5, 25, 50, 100 µg·mL–1 Cistanche deserticola a 60 µm·L–1 H2O2), a’u meithrin am 24 h. Dilynwch gamau'r pecyn canfod ROS ar gyfer gweithrediadau dilynol, arsylwch yn uniongyrchol y staenio celloedd trwy ficrosgop, a defnyddiwch ddarllenydd microplate i ganfod dwyster fflworoleuedd pob grŵp. Defnyddiodd gosodiadau paramedr donfedd cyffro o 488 nm a thonfedd allyriadau o 525 nm. Ailadroddwyd yr arbrawf dair gwaith.

2.2.4 Effaith Cistanche deserticola ar SOD a achosir gan H2O o gelloedd HEK 293

Rhannwch gelloedd yn grŵp normal (hongiad cell) a grŵp model

(60 µm·L–1 H2O2), grŵp VE (60 µm·L–1 VE a 60 µm·L–1 H2O2), grŵp gweinyddu Cistanche deserticola (100 µg·mL–1 Cistanche deserticola a 60 µm·L–1 H2O2 ), casglu'r celloedd ar ôl 24 h o feithriniad, ychwanegu hydoddiant paratoi sampl SOD i lyse'r celloedd, centrifuge ar 4 gradd, 12000 r·min-1 am 5 munud (radiws allgyrchol yw 300 mm), cymerwch y supernatant fel y sampl i'w brofi, dilynwch y pecyn canfod SOD Dilynwch y camau isod. Ailadroddwyd yr arbrawf dair gwaith.

2.2.5 Effaith Cistanche deserticola ar CAT a achosir gan H2O yng nghelloedd HEK 293

Dilynwch y dull o dan 2.2.4 a gweinyddu grŵp, ychwanegu hydoddiant lysis, centrifuge ar 4 gradd, 12000 r·min-1 am 10 munud (radiws centrifuge yw 300 mm), cymerwch y supernatant, a dilynwch gamau'r Pecyn canfod CAT. Gweithrediadau dilynol. Ailadroddwyd yr arbrawf dair gwaith.

2.2.6 Dadansoddiad ystadegol

SPSS 26. Defnyddiwyd meddalwedd 0 ar gyfer dadansoddiad ystadegol. Cynrychiolwyd pob grŵp o ddata gan (±±().) Gwnaed dadansoddiad un ffordd o amrywiant ar y data a oedd yn cydymffurfio â'r dosraniad normal.Os oedd yr amrywiannau'n gyfartal, defnyddiwyd y dull Gwahaniaeth Lleiaf Sylweddol Os oedd yr amrywiannau yn gyfartal yn anwastad, defnyddiwyd dull T3 Dunnett<0.05 was considered as a statistically significant difference.

2.3 Dadansoddiad cydberthynas effaith sbectrwm o wrthocsidydd Cistanche deserticola

2.3.1 PCA Safonwyd ardaloedd brig y brigau cyffredin o 10 sypiau o Cistanche deserticola sydd wedi sefydlu olion bysedd yn ôl gwerth Z, a'u gwneud yn fatrics data archeb 10 × 17, a fewnforiwyd i feddalwedd SPSS 26.0 ar gyfer PCA.

2.3.2 CSP Defnyddio SPSS 26.0 i gynnal dadansoddiad deunewidyn i astudio'r berthynas effeithlonrwydd sbectrol rhwng olion bysedd Cistanche deserticola a gwrthocsidyddion.

Mae profion arwyddocâd yn defnyddio prawf dwy ochr (T) gyda P<0.05 as the standard for statistically significant differences.

2.3.3 PLS Mewnforio canlyniadau arbrofol arwynebedd brig safonol Cistanche deserticola a gwrthocsidydd i feddalwedd SIMCA-P 14.1, gosod yr ardal brig fel y newidyn X, a gosod y mynegai ffarmacodynamig fel y newidyn Y i berfformio PLS.

2.4 Gwirio gweithgaredd gwrthocsidiol marciwr Q Cistanche deserticola

2.4.1 Paratoi gwirod mam cynhwysyn gweithredol

Pwyswch yn gywir symiau priodol o asid genipinig, 8-asid epiistrichnic, echinaceaside, verbascoside, isorebascoside, ac anthocyanoside A, ac ychwanegwch DMSO i'w hydoddi i 10 mmol·L–1 i'w rheoli. datrysiad cynnyrch.

2.4.2 Effaith cynhwysion actif ar sytowenwyndra HEK 293

Ar ôl i gelloedd HEK 293 gael eu deor am 24 awr, 100 µL o doddiannau cynhwysyn gweithredol o dan eitem 2.4.1 (0.781, 1.563, 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50, 100 µmol·L–1) o ychwanegwyd gwahanol grynodiadau at bob ffynnon, a pharhawyd i ysgogi. Ychwanegwyd adweithydd datrysiad sengl CellTiter 96® AQueous at y celloedd 24 awr yn ddiweddarach i ganfod hyfywedd celloedd.

2.4.3 Effaith gwrthocsidiol cynhwysion actif ar gelloedd HEK 293 a achosir gan H2O

Cafodd celloedd eu grwpio fel a ganlyn: grŵp arferol, grŵp model, grŵp VE wedi'u grwpio fel yn 2.2.4, grŵp arbrofol (0.781, 1.563, 3.125 µm·L–1 cynhwysyn gweithredol a 60 µm·L–1 H2O2), diwylliedig am 24 h. Darganfyddwch lefelau ROS mewngellol, cynnwys ensymau SOD a CAT yn ôl y dulliau o dan 2.2.3, 2.2.4 a 2.2.5 yn y drefn honno.

Gwasanaeth Cefnogol o Wecistanche

E-bost:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Ffôn:+86 15292862950

Siop Am Fwy o Fanylebau:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop