Meintioli Dirywiad Niwrit Gyda Chywirdeb Ac Effeithlonrwydd Gwell Mewn Model In Vitro O Glefyd Parkinson Rhan 2

Canlyniadau

Sefydlu model meithriniad celloedd o ddirywiad niwrit sy'n gysylltiedig â PD

Er mwyn datblygu dull ar gyfer ymchwilio i ddirywiad niwrit mewn model meithrin celloedd o PD, defnyddiwyd celloedd LUHMES diwylliedig, sef poblogaeth o gelloedd mesencephalic dynol anfarwoledig yn amodol. Ar ôl gwahaniaethu, mae celloedd LUHMES yn troi'n ôlmitotic, yn mabwysiadu proffil mynegiant genynnau sy'n nodweddiadol o niwronau dopaminrgig aeddfed, ac yn datblygu morffoleg niwronaidd gyda niwritau sy'n ymestyn hyd at 500 mm o hyd (Ffig. 1A; Lotharius et al., 2005; Scholz et al. , 2011; Kraemer et al., 2021).

Mae cysylltiad agos rhwng niwroddirywiad, cyflwr lle mae celloedd nerfol yn treiglo neu'n marw, â'r cof. Mewn modelau diwylliant celloedd, gallwn reoli'r amodau diwylliant i liniaru mynegiant niwroddirywiad a thrwy hynny wella perfformiad y cof.

Mae astudiaethau wedi dangos bod homeostasis celloedd nerfol yn chwarae rhan bwysig mewn goroesiad celloedd a swyddogaeth system. Gallwn wella sefydlogrwydd celloedd trwy reoli ffactorau megis maetholion a ffactorau twf yn y cyfrwng diwylliant. Ar yr un pryd, rhowch sylw i gynnal glendid a rheolaeth tymheredd yr amgylchedd diwylliant i atal celloedd rhag cael eu haflonyddu a'u difrodi gan yr amgylchedd.

Yn ogystal, yn y model diwylliant celloedd, gallwn hefyd chwistrellu rhai cyfansoddion neu gyffuriau i'r celloedd i leihau mynegiant niwrofodiwleiddio, a thrwy hynny wella cyfradd goroesi a pherfformiad cof y celloedd. Defnyddir y dechneg hon yn helaeth hefyd wrth astudio clefydau niwroddirywiol.

Yn fyr, mae niwroddirywiad yn cael effaith bwysig ar sefydlogrwydd celloedd a swyddogaeth system, ac mae technoleg diwylliant celloedd yn ddull ymchwil model da, a all gynnal archwiliad ac ymchwil manwl ar y berthynas rhwng niwroddirywiad a chof. Gallwn liniaru perfformiad niwrofodiwleiddio trwy feithrin rheolaeth amgylcheddol, chwistrellu cyffuriau i gelloedd, ac ati, i wella goroesiad celloedd a pherfformiad cof a darparu sylfaen fwy cynhwysfawr ar gyfer astudio clefydau niwroddirywiol. Gellir gweld bod angen i ni wella ein cof. Gall Cistanche wella ein cof yn sylweddol, oherwydd gall Cistanche hefyd reoleiddio cydbwysedd niwrodrosglwyddyddion, megis cynyddu lefel acetylcholine a ffactorau twf, sy'n bwysig iawn ar gyfer cof a dysgu. Yn ogystal, gall cig hefyd wella llif y gwaed a hyrwyddo darpariaeth ocsigen, a all sicrhau bod yr ymennydd yn derbyn digon o faeth ac egni, a thrwy hynny wella bywiogrwydd a dygnwch yr ymennydd.

Cliciwch gwybod atchwanegiadau i wella cof

Oherwydd rhinweddau optegol uwch gwydr o'i gymharu â phlastig, sefydlwyd y diwylliannau ar sleidiau gwydr sy'n cynnwys wyth siambr gyfryngau. Yn seiliedig ar adroddiadau blaenorol (Lotharius et al., 2005; Scholz et al., 2011; Kurowska et al., 2014), i ddechrau fe wnaethom geisio sefydlu diwylliannau ar sleidiau siambr wedi'u gorchuddio â PLO a ffibronectin; fodd bynnag, roedd diwylliannau o'r fath yn dangos diffygion ymlyniad a hyfywedd isel. O ganlyniad, gwnaethom brofi a fyddai gorchuddio â swbstradau ychwanegol yn gwella hyfywedd diwylliannau celloedd LUHMES a sefydlwyd ar arwynebau gwydr.

Sefydlwyd diwylliannau celloedd LUHMES ar sleidiau a oedd naill ai heb eu gorchuddio neu wedi'u gorchuddio â PLO a ffibronectin, PDL a laminin, neu gyfuniad o'r pedwar swbstrad. Datgelodd dadansoddiad o niwclysau hyfyw gan ficrosgopeg fflworoleuedd fod cotio sleidiau yn effeithio'n sylweddol ar hyfywedd y diwylliannau [Friedman x2 (3)=18, p, 0.0001], gyda dadansoddiadau cymhariaeth lluosog post hoc yn datgelu bod sleidiau wedi'u gorchuddio â chyfuniad o bob un o'r pedwar swbstrad a grybwyllwyd yn cynhyrchu cyfradd sylweddol uwch o gelloedd hyfyw o gymharu â sleidiau yn unig gorchuddio â PLO a ffibronectin (p= 0.0437; Ffig. 1B, C).

Ar ôl nodi'r swbstradau cotio gorau posibl ar gyfer meithrin celloedd LUHMES ar sleidiau gwydr, gwnaethom werthuso effeithiau dwysedd celloedd ar addasrwydd y diwylliannau ar gyfer mesuriadau dirywiad niwrit. Cafodd celloedd LUHMES eu meithrin mewn cyfrwng gwahaniaethu gyda dwyseddau platio o 57,500 o gelloedd y ffynnon, 115,000 o gelloedd fesul ffynnon, neu 230,{5}} o gelloedd fesul ffynnon, ac ar eu pumed diwrnod o wahaniaethu, y celloedd eu gosod gyda 4% PFA a'u delweddu gan ficrosgopeg cyferbyniad cam.

Arweiniodd dwysedd o 57,500 o gelloedd fesul ffynnon at ddiwylliannau â niwritau â rhwydwaith gwael a morffoleg niwrit afreolaidd, tra bod diwylliannau a sefydlwyd â dwysedd platio o 230,000 o gelloedd, er eu bod yn hyfyw, yn cynnwys dwyseddau niwrit yn rhy uchel ar gyfer mesur niwrit yn gywir. Mae dwysedd celloedd canolradd o 115, 000 o gelloedd fesul ffynnon a ddarperir hyfywedd uchel a darnau axon wedi'u gwahanu'n dda yn ffafriol i fesuriadau dirywiad niwrit gywir (Ffig. 1 D).

Er mwyn modelu dirywiad niwrit sy'n gysylltiedig â PD in vitro, fe wnaethom ddatgelu celloedd LUHMES gwahaniaethol i 6- OHDA, niwrotocsin a ddefnyddir yn eang sy'n hyrwyddo straen ocsideiddiol a dirywiad niwronau catecholaminergig (Bové a Perier, 20 12). Roedd amlygiad celloedd LUHMES gwahaniaethol i 6-OHDA yn hybu cynnydd dibynnol ar ddos ​​mewn dirywiad niwrit, gyda 5.0 mM 6-OHDA a 7.5 mM 6-OHDA yn achosi dirywiad niwrit cymedrol a difrifol, yn y drefn honno (Ffig .2F). Er mwyn mesur dirywiad niwrit mewn diwylliannau o gelloedd LUHMES sy'n agored i 6-OHDA, fe wnaethom ddefnyddio dull a ddyfynnwyd yn eang lle mae delweddau cyferbyniad cam o ddiwylliannau yn cael eu binareiddio, cyrff celloedd yn y delweddau yn cael eu tynnu'n ddigidol, ac algorithm dadansoddwr gronynnau o Cymhwysir ImageJ i fesur arwynebedd darnau niwrit. Yna mae'r ardaloedd niwrit tameidiog yn cael eu crynhoi a'u rhannu â chyfanswm yr ardal niwrit i bennu DI (Ffig. 2A–E; Sasaki et al., 2009; Kraemer et al., 2014; Di Stefano et al., 2015; Hill et al., 2015; Hill et al. ., 2018; Geisler et al., 2019).

Yn ôl y disgwyl, achosodd amlygiad celloedd LUHMES gwahaniaethol i 6- OHDA gynnydd dibynnol ar ddos ​​yn y DI (F(3,24)= 119.8, p=0.0001, R{ {8}}.9374; Ffig. 2G). Fodd bynnag, yn ystod y dadansoddiadau o gelloedd a oedd yn agored i 6-OHDA, gwelsom nifer o faterion a oedd i'w gweld yn effeithio'n negyddol ar gywirdeb ac effeithlonrwydd mesuriadau DI. Felly, ceisiasom optimeiddio'r dull cyffredin hwn ar gyfer perfformio mesuriadau DI, y cyfeiriwn o hyn ymlaen fel y dull DI traddodiadol, i gynhyrchu protocol sy'n hwyluso mesuriad mwy effeithiol o ddarniad niwrit.

Lleihau darnio artiffisial sy'n gysylltiedig â binarization micrograff

Wrth ddefnyddio'r dull DI traddodiadol, gwelsom yn aml broblem lle'r oedd niwroitiaid cyfan mewn delweddau cyferbyniad cam yn ymddangos yn dameidiog yn eu delwedd ddeuaidd cyfatebol (Ffig. 3A). Effeithiodd y darnio artiffisial hwn yn bennaf ar niwritau ag amlygrwydd isel. Felly, gwnaethom ymchwilio i weld a ellid lleihau'r mater trwy weithdrefnau sy'n gwella cyferbyniad delwedd. Er mwyn gwella cyferbyniad delwedd, fe wnaethom ni gipio delweddau o niwroitiaid yn gyntaf gan ddefnyddio amrywiaeth o ddwysedd golau i bennu lefel disgleirdeb delwedd a fyddai'n cynhyrchu'r cyferbyniad gorau posibl.

Yna cafodd delweddau a gipiwyd gyda'r arddwysedd golau gorau posibl eu gwella ymhellach ar y cyferbyniad trwy ddefnyddio ImageJ i gymhwyso LUT gyda gwerthoedd dwysedd lleiaf ac uchaf o 90 a 205, yn y drefn honno. Roedd ymgorffori'r gwelliannau cyferbyniad hyn yn darparu cynrychiolaeth gymedrol fwy cywir o'r niwroitiaid mewn delweddau deuaidd a gynhyrchir o ddelweddau cyferbyniad cam (Ffig. 3 B). Serch hynny, dangosodd dadansoddiad meintiol o ddelweddau deuaidd o niwroitiaid iach nad oedd y gwelliannau cyferbyniad yn lleihau darnio artiffisial yn sylweddol (p=0.9999; Ffig. 3D). Felly, gwnaethom ymchwilio nesaf a fyddai defnyddio delweddu imiwnfflworoleuedd yn cynhyrchu delweddau â gwrthgyferbyniad gwell a thrwy hynny yn hwyluso cynhyrchu delweddau niwrit deuaidd mwy cywir gyda llai o ddarniad artiffisial.

Cafodd y sleidiau a ddisgrifir yn Ffigur 2, sy'n dangos celloedd LUHMES sefydlog sy'n agored i grynodiadau amrywiol o 6- OHDA, eu himiwneiddio ar gyfer y protein cytoskeletal b III-tiwbwlin, delweddwyd gan ddefnyddio microsgopeg fflworoleuedd, a'u dadansoddi gan ymchwilydd dallu ar gyfer darnio artiffisial (Ffig .3C). Datgelodd dadansoddiad meintiol o ddelweddau deuaidd a gafwyd o ficrograffau fflworoleuedd a micrograffau cyferbyniad cam cyfatebol fod y math o ficrosgopeg yn effeithio ar lefelau darnio artiffisial [Friedman x2 (3)=15.44, p, 0.0001] . Yn benodol, cynhyrchodd micrograffau fflworoleuedd ddelweddau deuaidd gyda darniad artiffisial sylweddol is o gymharu â'r rhai o ficrograffau cyferbyniad cam (p=0.0016; Ffig. 3D).

O ganlyniad, esgorodd delweddau o ddiwylliannau iach sgoriau DI sylweddol is pan ddefnyddiwyd micrograffau fflworoleuedd yn hytrach na micrograffau cyferbyniad cam (F(1,8)= 131.4, p=0.{{12} }001, R2=0.1442; Ffig. 3E). At hynny, tueddiad cyffredinol nodedig yw bod y newid plyg rhwng gwerthoedd DI cymedrig sy'n gysylltiedig â diwylliannau iach (wedi'u trin â cherbyd) a diwylliannau sy'n arddangos dirywiad niwrit (5.0 neu 7.5 mM 6- wedi'i drin gan OHDA) yn fwy o'i fesur gan ddefnyddio micrograffau fflworoleuedd na phan geir o ficrograffau cyferbyniad cyfnod (Ffig. 3E). Digwyddodd hyn er gwaethaf micrograffau fflworoleuedd o ddiwylliannau â dirywiad niwrit cymedrol (a achosir gan amlygiad i 5 mM 6-OHDA) â sgorau DI sylweddol is na delweddau cyfnod cyfatebol oherwydd y gostyngiad mewn darnio artiffisial (p=0.0001 ,d=0.6312).

Optimeiddio paramedrau ar gyfer canfod niwrit tameidiog a chyfanswm niwrit
Mae'r dull traddodiadol ar gyfer perfformio mesuriadau DI yn cynnwys defnyddio'r ategyn Analyze Particles ar gyfer ImageJ gyda pharamedrau maint o 20 10,000 picsel i ganfod darnau niwrit. Fodd bynnag, gwelsom fod cyfran fawr o ddarnau niwrit heb eu canfod gan y dadansoddwr gronynnau wrth ddefnyddio'r paramedrau hyn a ddyfynnwyd yn eang (Shin et al., 2012; Di Stefano et al., 2015; Sasaki et al., 2016; Loreto et al. , 2020; Shin a Cho, 2020) i fesur dirywiad niwrit mewn micrograffau cyferbyniad cam o gelloedd LUHMES sy'n agored i 6-OHDA, a gynhyrchir fel y disgrifir yn Ffigur 2.

Felly, fe wnaethom ail-ddadansoddi delweddau o'r set ddata honno gan ddefnyddio gwahanol derfynau maint lleiaf ar gyfer canfod gronynnau i bennu'r paramedrau gorau posibl ar gyfer adnabod darnau niwrit. O asesiad ansoddol o ddelweddau deuaidd a gynhyrchir o ficrograffau cyferbyniad cam, roedd paramedrau maint o 5–10, 000 picsel yn gwella'r broses o ganfod darnau niwrit, ond roeddent hefyd yn gysylltiedig â cham-adnabod sŵn cefndir, arteffactau delwedd, neu rai bach eraill. deunydd nad yw'n niwroit fel darnau niwrit. O gymharu â'r paramedrau a ddefnyddir yn eang o 20–10,000 picsel, fodd bynnag, roedd paramedrau o 10–10,000 picsel yn gwella'r broses o ganfod darnau niwrit heb gynnydd amlwg o fawr mewn positifau ffug (Ffig. 4A). , chwith).

Perfformiwyd dadansoddiadau tebyg hefyd gyda delweddau deuaidd a gafwyd o ficrograffau fflworoleuedd o gelloedd LUHMES ag imiwn-labelu ar gyfer b III-tiwbwlin. Roedd paramedrau maint dadansoddwr gronynnau o 5–10,{3}} picsel yn hwyluso'r gwaith mwyaf sensitif o ganfod darnau niwrit a, chan fod y micrograffau fflworoleuedd yn cynnwys llai o falurion bach, nid oedd paramedrau o'r fath yn amlwg yn cynyddu cam-adnabod deunydd nad yw'n niwrit fel darnau niwrit (Ffig. 4A, ar y dde).

Mae'r dull traddodiadol ar gyfer perfformio mesuriadau DI, trwy ddefnyddio paramedrau maint dadansoddwr gronynnau o 20-10,000 picsel, yn eithrio gwrthrychau llai nag 20 picsel o fesuriadau darnau niwrit.

Fodd bynnag, mae gwrthrychau bach o'r fath fel arfer yn cael eu cynnwys yn anghywir yn y mesuriadau arwynebedd niwrit cyfan, gan fod y dull mesur DI traddodiadol yn cynnwys cyfrifo cyfanswm arwynebedd niwrit trwy grynhoi'r holl bicseli du yn y delweddau deuaidd. I oresgyn y mater hwn, fe wnaethom ddefnyddio'r ategyn Particle Remover ar gyfer ImageJ, a ysgrifennwyd gan ddatblygwr ImageJ Wayne Rasband, i dynnu gwrthrychau bach, nad ydynt yn niwroit o ddelweddau deuaidd. Arweiniodd cymhwyso'r ategyn hwn wrth berfformio mesuriadau DI gan ddefnyddio micrograffau cyferbyniad cam o gelloedd LUHMES sy'n agored i 6-OHDA, a gynhyrchwyd fel y disgrifir yn Ffigur 2, at gynnydd sylweddol mewn mesuriadau DI ar draws pob crynodiad o amlygiad i niwrotocsin (F(1) ,8)=83.43, p=0.0001, R2=0.0416).
Ymhellach, dangosodd rhyngweithiad arwyddocaol bod y cynnydd mewn DI a achoswyd gan ddefnyddio'r tynnu gronynnau wedi dod yn gryfach mewn crynodiadau uwch (F(1.881,15.05)=59.97, p=0.0001, R{ {8}}.0094; Ffig. 4B, C). Gwnaethom hefyd ddelweddu'r un sleidiau o gelloedd gan ficrosgopeg fflworoleuedd ac asesu effeithiau tynnu gronynnau bach ar fesuriadau DI a gafwyd o ficrograffau fflworoleuedd. Er bod tynnu gronynnau bach yn darparu gwerthoedd DI sy'n fwy cywir yn ddamcaniaethol, ar gyfartaledd nid oedd gwerthoedd o'r fath yn wahanol iawn i'r rhai a gafwyd heb ddefnyddio'r ategyn tynnu gronynnau wrth eu mesur gan ddefnyddio micrograffau fflworoleuedd (F(1,8)=2. 613, p=0.1446, R2=0.0013; Ffig. 4D).

Awtomeiddio mesuriadau DI o ficrograffau fflworoleuedd

Mae perfformiad mesuriadau DI gan ddefnyddio'r dull traddodiadol yn gofyn am brosesu delweddau diflas a llafurus, defnyddio'r offeryn llawrydd i dynnu cyrff celloedd unigol yn ddigidol a mesur ardaloedd niwrit tameidiog a chyfanswm niwrit o bob delwedd. Felly, ceisiwyd gwella effeithlonrwydd y dull trwy ysgrifennu macro sy'n awtomeiddio dadansoddiadau DI yn llawn. Er mwyn awtomeiddio tynnu soma, mae'r macro, o'r enw ANDI, yn gweithredu binareiddio delweddau o gnewyllyn celloedd, wedi'u labelu trwy'r staen niwclear DAPI, ac yna addasu'r ddelwedd ddeuaidd fel bod rhanbarthau niwclear trothwy yn cael eu helaethu i gwmpasu rhanbarth cyfan y soma. Mae delweddau o'r fath gyda niwclysau deuaidd a chwyddedig wedyn yn cael eu tynnu o ficrograffau fflworoleuedd cyfatebol o niwronau wedi'u himiwneiddio ar gyfer b III-tiwbwlin, gan gynhyrchu delwedd sy'n cynnwys niwroitiaid yn unig (Ffig. 5 A, B).

Er mwyn addasu ar gyfer meintiau niwclear amrywiol a achosir gan grebachu neu ddarniad niwclear sy'n gysylltiedig â niwroddirywiad, mae'r delweddau deuaidd o niwclysau yn cael eu hehangu trwy gyfuniad o ymlediadau ac erydiadau sy'n cyfuno darnau niwclear ac yn ehangu rhanbarthau deuaidd i feddiannu ardal sy'n fwy na somas celloedd LUHMES gwahaniaethol. . Yna mae delweddau sy'n cynnwys niwritau yn unig yn cael eu binareiddio ac yn destun dadansoddiad DI trwy gyfres o swyddogaethau awtomataidd (Ffig. 5C, D). Er mwyn gwerthuso cywirdeb y gweithrediadau macro sy'n gysylltiedig â thynnu soma o ddelweddau, gwnaethom gymharu'r sgoriau DI a gafwyd ar ôl tynnu cyrff celloedd â llaw o ficrograffau fflworoleuedd gan ddefnyddio offeryn llawrydd ImageJ (fel y dangoswyd yn flaenorol yn Ffig. 4D), i sgoriau DI a gynhyrchwyd o ddadansoddiadau o ddelweddau union yr un fath yn dilyn tynnu corff celloedd yn awtomatig gan ddefnyddio'r gweithrediadau tynnu soma a welir ym Macro ANDI. Datgelodd ein dadansoddiadau fod sgoriau DI a gyfrifwyd gan ddefnyddio tynnu corff celloedd awtomataidd yn cyfateb bron yn union yr un fath â mesuriadau DI a gafwyd o ddelweddau sy'n destun tynnu soma â llaw (r(34)=0.980, t, 0.0001; Ffig. 5E).

Er mwyn cynyddu cywirdeb y dadansoddiadau, fe wnaethom ymgorffori nifer o'r addasiadau a ddisgrifiwyd yn flaenorol sy'n gwella mesuriadau DI yn ANDI. Mae'r macro yn cynnwys gweithrediadau gwella cyferbyniad, defnyddio'r ategyn Particle Remover i dynnu deunydd nad yw'n niwrit o ddelweddau niwrit a mater nad yw'n niwclear o ddelweddau o niwclysau, a chanfod darnau niwrit gan ddefnyddio paramedrau maint o 5–10,000 ar gyfer yr ategyn Dadansoddi Gronynnau.

Tybiwyd gennym, gyda'i gilydd, y byddai defnyddio microsgopeg fflworoleuedd, gweithrediadau gwella cyferbyniad, tynnu gwrthrychau bach gyda'r peiriant tynnu gronynnau, a pharamedrau optimaidd ar gyfer canfod gronynnau yn cyfrannu at fesuriadau mwy cywir o ddirywiad niwrit. I brofi'r ddamcaniaeth hon, dadansoddwyd y delweddau cyferbyniad cam o gelloedd LUHMES a oedd yn agored i grynodiadau amrywiol o 6-OHDA, a gynhyrchwyd fel y disgrifir yn Ffigur 2, yn ôl sgôr dall a goddrychol gan ddefnyddio ystod gwerth rhwng 0. 0 ac 1.0, gyda gwerthoedd yn cynrychioli cyfran ymddangosiadol arwynebedd niwrit tameidiog. Yna fe wnaethom werthuso'r gydberthynas rhwng y sgoriau goddrychol a'r mesuriadau DI a gafwyd trwy'r dull traddodiadol, yn ogystal â'r gydberthynas rhwng y sgoriau goddrychol a'r mesuriadau DI a gafwyd gan ddefnyddio'r ANDI Macro.

Er bod cydberthynas rhwng mesuriadau DI a gafwyd gan ddefnyddio'r dull traddodiadol â sgoriau goddrychol (r {{0}}.7850, p,0.0001; Ffig. 5F), esgorodd y Macro ANDI mesuriadau a oedd yn cydberthyn yn llawer cryfach â graddfeydd goddrychol (r 2=0.978, p, 0.0001; Ffig. 5G). Datgelodd cymariaethau ystadegol uniongyrchol fod y sgoriau a gafwyd drwy'r ANDI Macro yn cydberthyn yn sylweddol gryfach â graddfeydd goddrychol na'r sgoriau a gafwyd drwy'r dull traddodiadol (z=6.626, p, 0.0001; Ffig. 5F, G). Datgelodd dadansoddiadau pellach fod y macro yn hwyluso perfformiad mesuriadau DI gyda gwelliant cadarn a sylweddol mewn effeithlonrwydd amser. Roedd angen amser cyfartalog o 12.75 s ar gyfer pob delwedd a ddadansoddwyd ar gyfer dadansoddiadau DI a gyflawnwyd gan ddefnyddio Macro ANDI, o'i gymharu ag amser cyfartalog o 5.27 munud fesul delwedd a ddadansoddwyd trwy'r dull traddodiadol [Friedman x2 (1)=9, p {{22} }.0027]. Gyda'i gilydd, mae'r canlyniadau hyn yn dangos bod ANDI yn cynhyrchu cenhedlaeth gyflym o fesuriadau DI sydd, o gymharu â sgoriau a gafwyd trwy'r dull traddodiadol, yn agosach at y dirywiad y mae ymchwilwyr yn ei ganfod o ddadansoddiad ansoddol o ddelweddau niwrit.

Ar ôl pennu cywirdeb ac effeithlonrwydd y Macro ANDI ar gyfer mesur dirywiad niwrit mewn celloedd LUHMES gwahaniaethol sy'n agored i 6-OHDA, gwnaethom werthuso addasrwydd y macro ar gyfer arbrofion yn cynnwys modelau meithrin celloedd eraill. Cynhaliwyd astudiaeth beilot gyntaf i asesu cywirdeb ANDI wrth berfformio mesuriadau DI gan ddefnyddio micrograffau o ddiwylliannau sympathetig cynradd wedi'u himiwneiddio ar gyfer b III-tubulin a DAPI. Yn ddiddorol, fodd bynnag, mae cyrff celloedd niwronau sympathetig yn fwy na rhai celloedd LUHMES gwahaniaethol, ac felly ni wnaeth y gweithrediadau yn ANDI sy'n ymwneud â thynnu soma awtomataidd ddileu'r soma gyfan (data heb ei ddangos).

Er mwyn goresgyn y mater hwn, fe wnaethom ddiwygio ANDI i gynnwys blwch deialog sy'n galluogi defnyddwyr i ddewis maint y tynnu soma trwy reoli'r nifer o weithiau y mae micrograffau deuaidd o niwclysau yn cael eu hamledu. Yna defnyddiwyd y fersiwn hon o ANDI, fersiwn 1.1, i berfformio mesuriadau DI o ficrograffau yn darlunio niwronau sympathetig iach, wedi'u trin â cherbydau neu niwronau sympathetig dirywiol sy'n agored i hydrogen perocsid. Rhoddodd delweddau o niwronau a oedd yn agored i hydrogen perocsid sgorau DI sylweddol uwch o gymharu â delweddau o niwronau a driniwyd gan gerbydau (F(1,3)=71.2, p=0.0035, R2=0 .9301; Ffig. 6A, C). At hynny, gwnaethom gymharu'r sgoriau DI hyn a gafwyd gan ddefnyddio mesuriadau ANDI i DI a gafwyd o'r un set ddelweddau ar ôl tynnu cyrff celloedd â llaw o ficrograffau fflworoleuedd gan ddefnyddio offeryn llawrydd ImageJ. Nid oedd unrhyw wahaniaeth arwyddocaol yn y sgorau DI a gyfrifwyd ar ôl tynnu soma â llaw o gymharu â sgoriau a gafwyd gan ddefnyddio ANDI (F(1,3)=0.1082, p=0.7639, R2=0. 0000; Ffig. 6A–C). Cadarnhaodd profion post hoc hefyd nad oedd sgoriau DI a gafwyd gan ddefnyddio ANDI yn sylweddol wahanol yn achos niwronau heb eu trin (p=0.0972) ac yn achos niwronau sy'n agored i hydrogen perocsid (p=0. 9986).

Ymhellach, roedd sgorau DI a gynhyrchwyd o ANDI yn cyfateb bron yn union yr un fath â sgoriau DI a gafwyd ar ôl tynnu cyrff celloedd â llaw o ficrograffau cyfatebol (r(34)=0.991, p, 0.0001). Mae'r data hyn yn dangos bod ANDI yn addas ar gyfer mesur dirywiad niwrit mewn diwylliannau o niwronau cynradd, gyda gweithrediadau tynnu soma y gall y defnyddiwr eu haddasu i gyd-fynd â gwahanol fathau o niwronau. Yn ogystal, mae canfod darnau niwrit mewn diwylliannau sy'n agored i hydrogen perocsid yn dangos cymhwysedd y macro i'w ddefnyddio mewn arbrofion sy'n cynnwys dirywiad niwrit a achosir gan ffynonellau heblaw 6-OHDA. Er mwyn gwirio ymhellach y defnydd o ANDI i ganfod dirywiad niwrit sy'n gysylltiedig ag achosion amrywiol, gwnaethom hefyd ddefnyddio'r macro i fesur dirywiad niwrit mewn micrograffau o ddiwylliannau neu ddiwylliannau sy'n cydymdeimlad iach sy'n destun tynnu'n ôl NGF. Yn ôl y disgwyl, esgorodd delweddau o ddiwylliannau a oedd yn destun tynnu NGF yn ôl werthoedd DI sylweddol uwch o gymharu â delweddau o ddiwylliannau iach (F(1,2)= 287, p= 0.0035, R2=0. 958; Ffig. 6D, E). Gyda'i gilydd, mae'r canfyddiadau hyn yn dangos y gellir defnyddio ANDI i ganfod dirywiad niwritau sy'n gysylltiedig ag amrywiaeth o gyd-destunau biolegol.

Gan fod staenio ar gyfer TH yn cael ei ddefnyddio'n gyffredin i ddelweddu niwronau catecholaminergig, fe wnaethom hefyd werthuso addasrwydd micrograffau sy'n darlunio staenio TH ar gyfer mesur dirywiad niwrit gan ddefnyddio ANDI. Roedd diwylliannau niwronau sympathetig iach a gafodd eu trin â thoddiant cerbyd neu niwronau sympathetig dirywiol a oedd yn agored i hydrogen perocsid yn sefydlog ac yn destun labelu immunofluorescence ar gyfer TH a b III-tubulin, yn ogystal â gwrth-staenio ar gyfer DAPI. Yna cafodd delweddau neurit yn darlunio staenio ar gyfer twbwlin TH neu b III, a delweddau cyfatebol o gnewyllyn yn cynnwys labeli DAPI, eu dal mewn meysydd golygfa tebyg. Dienyddiwyd ANDI, a dewiswyd y delweddau sy'n cynnwys staenio TH neu staenio b III-tiwbwl fel y delweddau niwrit. Datgelodd ein dadansoddiadau fod sgoriau DI a gafwyd gan ddefnyddio delweddau o staenio TH yn cydberthyn yn gryf iawn â sgoriau a gafwyd o ddelweddau o staenio b III-tiwbwlin (r(28)= 0.962, p, 0.0001; Ffig .6F, G). Mae'r data hyn yn dangos y gall ANDI gael mesuriadau DI cywir gan ddefnyddio gweithdrefnau staenio amgen sy'n labelu'r cyfan o niwritau, megis imiwn-labelu ar gyfer TH.

Er mwyn dangos defnyddioldeb y dull gwell ar gyfer perfformio mesuriadau DI mewn arbrawf gwyddonol, defnyddiwyd y dull newydd i asesu rôl JNK mewn dirywiad niwrit ocsideiddiol a achosir gan straen mewn celloedd mesencephalic dynol. Cafodd celloedd LUHMES gwahaniaethol eu trin ymlaen llaw am 1 awr gyda'r atalydd JNK SP600125 neu doddiant cerbyd. Yna cafodd y celloedd eu trin am 24 awr gyda 6- OHDA i achosi straen ocsideiddiol neu gyda hydoddiant cerbyd. Roedd celloedd sefydlog yn destun imiwn-labelu ar gyfer staenio b III-tiwbwlin a DAPI, a defnyddiwyd ANDI i gael mesuriadau DI o ficrograffau fflworoleuedd. Er bod diwylliannau heb rag-driniaeth gyda'r atalydd JNK yn dangos dirywiad niwrit ar ôl dod i gysylltiad â 6-OHDA, arweiniodd ataliad JNK at ostyngiad amlwg a sylweddol mewn 6- dirywiad niwrit a achosir gan OHDA (p= 0.0001 , d= 2.0209; Ffig. 7). Mae'r canfyddiadau hyn yn cefnogi rôl allweddol ar gyfer signalau JNK mewn dirywiad niwrit a achosir gan straen ocsideiddiol mewn celloedd mesencephalic dynol, ac yn bwysig, maent yn dangos defnyddioldeb ein dull newydd o gynhyrchu darganfyddiadau gwyddonol trwy hwyluso mesur cyflym a chywir o ddirywiad niwrit.

Trafodaeth

Mae dirywiad niwrit yn gysylltiedig ag amrywiaeth o gyflyrau niwropatholegol, ond nid yw'r mecanweithiau moleciwlaidd sy'n sail i ddirywiad niwritau yn cael eu deall yn llwyr o hyd. Mae dulliau sy'n hwyluso dadansoddiad cywir ac effeithlon o ddirywiad niwrit yn hanfodol i adnabod yn llwyddiannus y ffactorau newydd sy'n rheoleiddio'r digwyddiad cellog pwysig hwn. Yn yr astudiaeth bresennol, rydym yn datgelu ffynonellau gwall lluosog sy'n gysylltiedig â dull a ddefnyddir yn gyffredin ar gyfer mesur dirywiad niwrit. Rydym yn adrodd ar ddata arbrofol sy'n cefnogi addasiadau gweithdrefnol y gellir eu gweithredu i leihau gwall dadansoddi DI, ac mae addasiadau o'r fath yn cael eu hymgorffori mewn macro ImageJ newydd i ddarparu offeryn ar gyfer dadansoddiadau DI cyflym, cywir a gwrthrychol gan ddefnyddio meddalwedd ffynhonnell agored a rhad ac am ddim. Ar ben hynny, rydym yn dangos sut y gellir cymhwyso'r dull gwell i fesur dirywiad niwrit mewn model meithrin celloedd o PD, anhwylder lle mae darnio echelinol mewn niwronau dopaminergig yn ddigwyddiad cyfnod cynnar sy'n rhagflaenu colled niwronau yn y pen draw (Tagliaferro a Burke, 2016) .

Yn yr astudiaeth bresennol, rydym yn dangos defnyddioldeb y Macro ANDI wrth fesur dirywiad niwrit mewn model meithrin celloedd o PD sy'n cynnwys celloedd LUHMES gwahaniaethol sy'n agored i 6-OHDA.

Rydym yn adrodd ar ganfyddiadau arbrofol sy'n cefnogi'r swbstradau gorau posibl y dylid sefydlu'r diwylliannau arnynt, yn ogystal â dangos y dwysedd platio sydd fwyaf priodol ar gyfer dadansoddiadau dirywiad niwritaidd. Mae sawl mantais i ddefnyddio'r system fodel hon i astudio dirywiad niwrit. Mae'r celloedd yn datblygu niwritau sydd â rhwydwaith da ac sydd fel arfer yn .500 mm o hyd, ac mae'r diwylliannau'n agored i niwroddirywiad a achosir gan fodelau niwrotocsin clasurol o PD megis 6-OHDA, 1-methyl{4 }}ïon phenylpyridinium (MPP1), a rotenone (Lotharius et al., 2005; Zhang et al., 2014; Smirnova et al., 2016; Kraemer et al., 2021). At hynny, mae tarddiad dynol celloedd LUHMES yn cynyddu trosglwyddadwyedd canfyddiadau sy'n gysylltiedig â'r model, ac mae'r anfarwoli amodol yn hwyluso cynhyrchu a lluosogi diwylliannau'n gyflym (Scholz et al., 2011). Felly, ynghyd â dadansoddiadau awtomataidd a berfformiwyd gan ddefnyddio ANDI, gellir defnyddio celloedd LUHMES i wneud darganfyddiadau newydd yn ymwneud â dirywiad niwrit sy'n gysylltiedig â PD tra'n hwyluso trwybwn llawer uwch o'i gymharu â dadansoddiadau anawtomaidd a gyflawnir gyda diwylliannau niwronau cynradd.

Mae nifer o grwpiau ymchwil wedi cynnal dadansoddiadau DI gan ddefnyddio delweddau cyferbyniad cam i gael mewnwelediad i ffactorau sy'n rheoleiddio dirywiad niwritaidd (Press a Milbrandt, 20{{10}}9; Kraemer et al., 2014 ; Di Stefano et al., 2015; Hill et al., 2018; Geisler et al., 2019). Yma, rydym yn adrodd ar anfantais bwysig sy'n gysylltiedig â'r dull hwn a ddefnyddir yn eang ar gyfer mesur dirywiad niwrit: mae binareiddio delweddau cyferbyniad cam yn achosi i gyfran sylweddol o niwritiaid cyfan ymddangos yn dameidiog. Er bod lefel y cyferbyniad y gellir ei gyflawni wrth ddal micrograffau yn amrywio yn dibynnu ar y system microsgop sydd ar gael i ymchwilwyr, mae'r mater hwn yn hollbresennol ymhlith amrywiol grwpiau ymchwil, gan fod DI o 0.2 yn cael ei dderbyn yn gyffredin fel trothwy yr ystyrir bod diwylliannau'n dirywio uwchlaw iddo. axons, a'r rhan fwyaf o adroddiadau gwyddonol sy'n cynnwys mesuriadau DI o ficrograffau cyferbyniad cam wedi adrodd am sgoriau DI ar gyfer niwronau iach rhwng 0.1 a 0.3 (Sasaki et al., 2009, 2016; Di Stefano et al., 2015; Hill et al., 2018; Loreto et al., 2020). Mae ein dadansoddiadau DI a gafwyd o ficrograffau fflworoleuedd, yn ogystal â sgoriau goddrychol gan ymchwilwyr dallu, yn nodi nad yw darniad niwrit 10-20% yn gyffredin mewn diwylliannau niwronau iach. Yn hytrach, dim ond 2.5% o ddarnio niwrit a welir ar gyfartaledd mewn diwylliannau o'r fath. Felly, mae ein canfyddiadau yn tanlinellu'r angen am ddulliau sy'n gwella cywirdeb dadansoddiadau dirywiad niwrit trwy leihau'r ffynhonnell gyffredin ac arwyddocaol hon o wallau mesur.

Er bod mwyafrif yr astudiaethau sy'n cynnwys mesuriadau DI wedi defnyddio delweddau cyferbyniad cam i gyflawni'r dadansoddiadau o ddirywiad niwrit, mae sawl grŵp ymchwil wedi perfformio mesuriadau DI yn ddiweddar gan ddefnyddio delweddau o niwronau wedi'u imiwneiddio ar gyfer ffilamentau sytosgerbydol fel polypeptid cyfrwng niwroffilament neu b -b-tubulin (Wakatsuki et al., 2011; Li et al., 2017; Pease-Raissi et al., 2017; Hernandez et al., 2018; Sundaramoorthy et al., 2020). Fodd bynnag, mae pa fath o ficrosgopeg sydd fwyaf addas ar gyfer mesuriadau dirywiad niwrit wedi parhau i fod yn aneglur, gan fod angen ymchwiliadau i ddeall a yw newidiadau yn y broses o leoli’r proteinau cytosgerbydol hyn yn ystod dirywiad niwritau yn modelu’n briodol gyfanswm y newidiadau ym morffoleg niwrit, yn ogystal ag i werthuso’r i ba raddau y mae mesuriadau DI a gafwyd gyda micrograffau fflworoleuedd yn cyfateb i fesuriadau tebyg a gafwyd o ficrograffau cyferbyniad cam. Yma, rydym yn dangos bod micrograffau fflworoleuedd sy'n darlunio staenio b III-tiwbwl nid yn unig yn cynrychioli darniad niwrit yn gywir, ond hefyd yn hwyluso mesuriadau DI yn fwy cywir oherwydd eu cyferbyniad uwch a llai o dueddiad i ddarnio artiffisial ar finarization. Felly, mae ein canlyniadau'n tynnu sylw at ddefnyddioldeb defnyddio staenio twbwlin b III i fesur dirywiad niwrit.

Ymhlith yr astudiaethau cyhoeddedig sy'n cynnwys dadansoddiadau DI i fesur dirywiad niwrit, mae'r paramedrau maint a chylchrededd a adroddwyd a ddefnyddir i ganfod darnau niwrit wedi amrywio'n sylweddol. Er enghraifft, defnyddiodd astudiaeth ddiweddar yn ymwneud ag asesu dirywiad niwrit mewn niwronau hippocampal diwylliedig baramedrau maint o 4–900 picsel (Li et al., 2017), tra bod astudiaeth yn cynnwys niwronau DRG diwylliedig yn defnyddio paramedrau canfod o 0–10,000 picsel (Wakatsuki et al., 2011). Un rheswm posibl dros amrywiad o'r fath yw bod effeithiolrwydd paramedrau maint dadansoddi gronynnau wrth ganfod darnau niwrit yn amrywio yn dibynnu ar gydraniad y ddelwedd gan fod y paramedrau maint ar gyfer canfod gronynnau yn gysylltiedig ag unedau picsel. Yn anffodus, nid yw'r rhan fwyaf o astudiaethau cyhoeddedig sy'n cynnwys dadansoddiadau DI yn cynnwys disgrifiad o'r cydraniad delwedd a ddefnyddiwyd ar gyfer y dadansoddiadau. Felly, bu angen sefydlu paramedrau dadansoddi safonol trwy brotocol sy'n datgelu manylion pwysig yn llawn fel y datrysiad delwedd a argymhellir. Yma, rydym yn adrodd mai'r paramedrau a ddyfynnir amlaf ar gyfer canfod darnau niwrit, 20-10, 000 picsel (Shin et al., 2012; Di Stefano et al., 2015; Sasaki et al., 2016; Loreto et al., 2016; al., 2020; Shin a Cho, 2020), yn arwain at gyfrannau mawr o ddarnau niwron heb eu canfod. Mae lleihau'r maen prawf maint lleiaf ar gyfer canfod darnau niwrit yn gwella sensitifrwydd canfod darnau, tra ar yr un pryd yn cynyddu nifer yr arteffactau delwedd a malurion nad ydynt yn niwroit sy'n cael eu canfod ar gam fel darnau niwrit. Wrth chwilio am baramedrau a fyddai'n cydbwyso sensitifrwydd canfod orau a chyfraddau positifrwydd ffug, fe wnaethom nodi paramedrau dadansoddi 10-10,000 fel rhai sy'n darparu'r darganfyddiad mwyaf cywir o ddarnau niwrit mewn delweddau deuaidd a gafwyd o ficrograffau cyferbyniad cam, tra mae paramedrau 5–10,000 yn hwyluso'r broses fwyaf cywir o ganfod darnau niwrit mewn delweddau deuaidd a geir o ficrograffau fflworoleuedd. Er bod y penderfyniadau hyn wedi'u gwneud gan ddefnyddio cydraniad delwedd o 1280 1024, dylai paramedrau o'r fath hefyd alluogi canfod darnau niwrit yn gywir mewn delweddau a gipiwyd ar gydraniad arall sy'n cynnwys maint fertigol o 1024 picsel, megis cydraniad sgrin lawn cyffredin {{ 27}}, gan y byddai niwronau a ddarlunnir mewn delweddau o'r fath o faint picsel tebyg.

Mae nifer o grwpiau ymchwil wedi defnyddio maen prawf maint lleiaf wrth ffurfweddu paramedrau dadansoddi gronynnau er mwyn osgoi cynnwys malurion bach, nad ydynt yn niwroit, mewn mesuriadau darnau niwrit (Shin et al., 2012; Cosker et al., 2013; Di Stefano et al., 2015; Sasaki et al., 2016; Li et al., 2017; Loreto et al., 2020; Shin a Cho, 2020; Sundaramoorthy et al., 2020). Fodd bynnag, mae astudiaethau o'r fath wedi cynnwys mater bach, nad yw'n ddarniog, yn anghywir yn y mesuriadau o gyfanswm arwynebedd niwrit, gan fod mesuriadau o'r fath yn cael eu sicrhau trwy grynhoi arwynebedd pob picsel du yn y ddelwedd. Yma, rydym yn dangos defnyddioldeb yr ategyn Particle Remover i gael gwared ar falurion bach, nad ydynt yn dameidiog o'r ddelwedd cyn dadansoddi DI. Cynyddodd y defnydd o'r ategyn yn sylweddol sensitifrwydd mesuriadau dirywiad niwrit a gafwyd o ddelweddau cyferbyniad cam. Felly, mae ein canlyniadau'n amlygu gwerth yr ategyn Particle Remover ar gyfer ymchwilwyr sy'n cynnal dadansoddiadau DI gan ddefnyddio micrograffau cyferbyniad cam. Yn ddiddorol, roedd micrograffau fflworoleuedd yn cynnwys llai o falurion bach, di-niwrit, ac felly, gellid defnyddio maen prawf maint is o bum picsel i ganfod darnau. Er nad oedd tynnu gronynnau o falurion nad ydynt yn niwroit o lai na phum picsel o ran maint yn effeithio'n sylweddol ar fesuriadau DI a gafwyd o ficrograffau fflworoleuedd, mae gweithrediadau o'r fath yn darparu gwerthoedd sydd yn ddamcaniaethol yn fwy cywir ac felly wedi'u cynnwys yn ANDI.

Gan fod yn rhaid cynnal dadansoddiadau DI gan ddefnyddio delweddau sy'n cynnwys niwritiaid yn unig, mae cymhwyso'r dull dadansoddi wedi'i gyfyngu'n bennaf i'w ddefnyddio gyda systemau meithrin sy'n gallu cael gwared ar gyrff celloedd, megis diwylliannau allblannu lle gellir torri cyrff celloedd yn gorfforol (Catenaccio et al. , 2017; Shin a Cho, 2020) neu ddiwylliannau mewn dyfeisiau microhylifol sy'n hwyluso gwahanu adrannau soma ac axon (Cosker et al., 2013; Pease-Raissi et al., 2017; Tan et al., 2018). Fel arall, gellir cyflawni dadansoddiadau DI gyda diwylliannau datgysylltiedig trwy lafur diflas a llafurus sy'n gysylltiedig â thynnu celloedd celloedd yn ddigidol o ficrograffau (Kraemer et al., 2014). Yn yr astudiaeth bresennol, rydym yn datgelu bod ANDI yn galluogi perfformiad mesuriadau DI o ficrograffau sy'n cynnwys celloedd LUHMES sy'n ddatgysylltu ac wedi'u dosbarthu'n fosaidd ar draws system feithrin 2D. Mae ein canfyddiadau hefyd yn dangos bod ANDI yn hwyluso gostyngiad 24-plyg yn yr amser sydd ei angen i gyflawni'r dadansoddiadau, a'r gweithrediadau yn ANDI sy'n ymwneud â chanlyniadau dadansoddi cynnyrch DI tynnu soma sy'n cyfateb 98% â dadansoddiadau tebyg a gyflawnwyd yn dilyn tynnu soma â llaw gan ddefnyddio'r offeryn llawrydd ImageJ. Felly, mae'r macro yn cynyddu effeithlonrwydd y dadansoddiadau yn sylweddol trwy berfformio tynnu soma awtomataidd trwy broses nad yw'n aberthu cywirdeb, ac mae gweithrediadau o'r fath yn ehangu addasrwydd y dull ar gyfer dadansoddi diwylliannau datgysylltiedig â chyrff celloedd a ddosbarthwyd yn fosaidd.

Yn ogystal â hwyluso tynnu corff celloedd yn awtomataidd o ddelweddau, mae ANDI yn cynnwys nifer o ddiwygiadau i'r dull traddodiadol o berfformio dadansoddiad DI, gan gynnwys defnyddio micrograffau fflworoleuedd, paramedrau dadansoddi gronynnau diwygiedig, a defnyddio'r peiriant tynnu gronynnau i gael gwared ar falurion bach, nad ydynt yn niwrit. o ddelweddau. Mae ein canfyddiadau'n dangos bod yr optimeiddiadau hyn gyda'i gilydd yn rhoi gwerthoedd DI sy'n agosach at werthoedd bras a geir trwy sgorio dallu a goruchwylio. Felly, yn ogystal â lleihau'n sylweddol yr amser sydd ei angen i gyflawni'r dadansoddiadau, mae ANDI yn hwyluso mesuriadau DI sydd, o'u cymharu â'r dull traddodiadol, yn adlewyrchu'n fwy cywir y dirywiad niwritaidd y mae ymchwilwyr yn ei weld yn ôl y dadansoddiad delwedd ansoddol.

Un anfantais i'r dull traddodiadol o gynnal dadansoddiadau DI yw bod dadansoddiadau o'r fath yn gofyn am hyfforddiant yn y defnydd o ImageJ fel bod y defnyddiwr yn gyfarwydd â set ddiflas o weithrediadau ImageJ. Ar ben hynny, er mwyn cyflawni'r dadansoddiadau'n effeithlon, mae angen hyfforddiant pellach i'r defnyddiwr gyflawni dadansoddiadau swp neu ysgrifennu sgriptiau i lled-awtomataidd gweithredu camau penodol. Trwy awtomeiddio'r dadansoddiad yn llawn, mae ANDI yn hwyluso mesuriadau DI mewn ychydig gamau yn unig sy'n ymwneud â lawrlwytho a gweithredu'r macro. Er mwyn cynyddu cyfeillgarwch defnyddwyr, mae'r macro yn cynnwys cod i ddarparu rhyngwyneb ar gyfer dewis cyfeiriaduron sy'n cynnwys delweddau i'w dadansoddi, yn ogystal ag i hwyluso allbwn delweddau canlyniad a thablau data i gyfeiriadur o ddewis y defnyddiwr. Ar ben hynny, mae'r sgript yn cynnwys nifer o nodweddion a gynlluniwyd i atal anghywirdebau mesur neu gamgymeriadau defnyddwyr, gan gynnwys clirio canlyniadau ImageJ blaenorol yn awtomataidd; dileu gwybodaeth graddfa delwedd i sicrhau bod mesuriadau'n cael eu perfformio'n gywir gan ddefnyddio unedau picsel; cyfluniad priodol o osodiadau lliw ImageJ, gosodiadau mesur, a pharamedrau dadansoddwr gronynnau; cyflwyniad neges gwall os yw defnyddwyr yn dewis cyfeiriaduron yn anghywir sy'n cynnwys niferoedd anghyfartal o ddelweddau yn darlunio staenio b III-tiwbwlin a staenio DAPI; disgrifiadau log yn nodi cynnydd dadansoddi; a chodio i atal bygiau sy'n gysylltiedig â chynhyrchu ffeiliau .ini awtomataidd gan Windows 10. Gyda'i gilydd, mae'r nodweddion hyn yn gwneud dadansoddiadau DI yn fwy hawdd eu defnyddio, a allai feithrin diddordeb mewn astudiaethau sy'n ymwneud â dirywiad niwrit.

Er mwyn dangos ei ddefnyddioldeb mewn arbrawf, gwnaethom ddefnyddio ANDI i werthuso cyfraniadau JNK i ddirywiad niwrit mewn diwylliannau celloedd LUHMES sy'n agored i 6-OHDA. Mae JNK yn kinase sy'n cael ei ysgogi gan straen yr adroddwyd ei fod yn allweddol i ddirywiad niwrit mewn niwronau ymylol o darddiad nonprimate (Shin et al., 2012), ond mae angen astudiaethau pellach i ddeall rôl y kinase mewn dirywiad niwrit mewn celloedd dynol mesencephalic . Yma, rydym yn dangos bod atal JNK yn amddiffyn celloedd mesencephalic dynol yn sylweddol rhag dirywiad niwrit sy'n gysylltiedig â straen ocsideiddiol. Mae canfyddiadau o'r fath nid yn unig yn datgelu rôl bwysig i JNK mewn dirywiad niwrit sy'n gysylltiedig â model o glefyd dynol ond hefyd yn enghraifft o ddefnyddioldeb ANDI ar gyfer perfformio dadansoddiad delwedd awtomataidd a gwrthrychol i wneud darganfyddiadau gwyddonol newydd.

Er bod ANDI wedi'i gynllunio i ddechrau i hwyluso mesuriad cyflym a chywir o ddirywiad niwrit mewn diwylliannau o gelloedd LUHMES gwahaniaethol sy'n agored i 6-OHDA, mae ein canfyddiadau hefyd yn nodi y gellir defnyddio'r macro i ganfod dirywiad niwrit a achosir gan achosion eraill, megis amlygiad i hydrogen perocsid neu dynnu'n ôl niwrotroffin. Yn ogystal, mae fersiwn 1.1 o'r macro yn cynnwys blwch deialog sy'n galluogi ymchwilwyr i addasu'r gweithrediadau tynnu soma ar gyfer niwronau o feintiau penodol. Mae ein data hefyd yn cefnogi y gellir defnyddio dulliau staenio ar wahân i imiwn-labelu ar gyfer b III-tiwbwlin i fesur dirywiad niwrit yn gywir. Er ein bod yn argymell defnyddio astudiaethau peilot i wirio cywirdeb mesuriadau DI wrth ddefnyddio ANDI gyda mathau o gelloedd neu ddulliau staenio nad ydynt wedi'u profi o'r blaen, mae'r canfyddiadau hyn yn cefnogi bod y macro yn offeryn amlbwrpas cyffredinol ar gyfer mesur dirywiad niwrit mewn niwronau diwylliedig. Gan nad yw ANDI wedi'i optimeiddio ar gyfer mesur dirywiad niwrit mewn meinwe, dim ond ar gyfer dadansoddi dirywiad niwrit sy'n gysylltiedig â chelloedd diwylliedig yr ydym yn argymell ei ddefnyddio ar hyn o bryd. Fodd bynnag, mae'r cod ar gyfer ANDI ar gael i'r cyhoedd ac felly gall fod yn ddefnyddiol hefyd i ymchwilwyr sydd â diddordeb mewn addasu'r sgript i weddu i astudiaethau in vivo neu gymwysiadau eraill.

I gloi, mae'r erthygl hon yn cyflwyno data sy'n datgelu ffynonellau gwallau cyffredin sy'n gysylltiedig â dull a ddefnyddir yn eang ar gyfer mesur dirywiad niwrit. Defnyddiwyd dulliau arbrofol i wella'r dull, ac ymgorfforwyd gwelliannau o'r fath mewn macro ImageJ ffynhonnell agored am ddim y gellir ei ddefnyddio i wneud dadansoddiad cyflym, cywir a gwrthrychol o ficrograffau fflworoleuedd ar gyfer dirywiad niwritaidd. Mae ein canfyddiadau yn datgelu effeithiolrwydd ANDI ar gyfer meintioli dirywiad niwrit mewn micrograffau sy'n darlunio model meithrin celloedd o PD, yn ogystal â darparu prawf o'r egwyddor y gall y macro ganfod dirywiad niwrit sy'n gysylltiedig â chyd-destunau biolegol eraill. Bydd y macro hawdd ei ddefnyddio yn lleihau'r amser sydd ei angen ar ymchwilwyr i ddysgu sut i fesur darnio niwritau tra'n cynyddu trwybwn a chywirdeb astudiaethau sy'n gwerthuso ffactorau sy'n sail i ddirywiad niwrit. Mae'r ANDI Macro ar gael yn yr URL canlynol: https://github.com/kraemerb/kraemerlab.

Cyfeiriadau

1. Aarsland D, Creese B, Politis M, Chaudhuri KR, Ffytche DH, Weintraub D, Ballard C (2017) Dirywiad gwybyddol mewn clefyd Parkinson. Nat Parch Neurol 13:217–231.

2. Adalbert R, Coleman AS (2013) Adolygiad: patholeg axon mewn anhwylderau niwroddirywiol sy'n gysylltiedig ag oedran. Neuropathol Appl Neurobiol 39:90–108.

3. Bové J, Perier C (2012) Modelau o glefyd Parkinson yn seiliedig ar niwrotocsin. Niwrowyddoniaeth 211:51–76.

4. Catenaccio A, Llavero Hurtado M, Diaz P, Lamont DJ, Wishart TM, Court FA (2017) Dadansoddiad moleciwlaidd o gyd-reoleiddio echelinol-cynhenid ​​a glial-gysylltiedig o ddirywiad axon. Cell Marwolaeth Dis 8: e3166.

5. Cosker KE, Pazyra-Murphy MF, Fenstermacher SJ, Segal RA (2013) niwrotroffinau sy'n deillio o darged yn cydlynu trawsgrifio.

6. Di Stefano M, Nascimento-Ferreira I, Orsomando G, Mori V, Gilley J, Brown R, Janeckova L, Vargas ME, Worrell LA, Loreto A, Tickle J, Patrick J, Webster JRM, Marangoni M, Carpi FM, Pucciarelli S, Rossi F, Meng W, Sagasti A, Ribchester RR, et al. (2015) Mae cynnydd mewn mononucleotid nicotinamid rhagflaenydd NAD (NMN) ar ôl anaf yn hyrwyddo dirywiad echelin. Marwolaeth Cell yn Wahanol 22:731–742.

7. Fukui K (2016) Mae rhywogaethau ocsigen adweithiol yn achosi dirywiad niwritau cyn sefydlu marwolaeth celloedd. J Clin Biochem Nutr 59:155–159.

8. Geden MJ, Deshmukh M (2016) Dirywiad Axon: cyd-destun yn diffinio llwybrau gwahanol. Curr Opin Neurobiol 39:108–115.

9. Mae Geisler S, Doan RA, Cheng GC, Cetinkaya-Fisgin A, Huang SX, Höke A, Milbrandt J, DiAntonio A (2019) Vincristine a bortezomib yn defnyddio mecanweithiau penodol i fyny'r afon i actifadu dirywiad axon dibynnol SARM cyffredin. rhaglen. Mewnwelediad JCI 4:e129920.

10. Hernandez DE, Salvadores NA, Moya-Alvarado G, Catalaneg RJ, Bronfman FC, Court FA (2018) Mae dirywiad axonal a achosir gan excitotoxicity glwtamad yn cael ei gyfryngu gan necroptosis. J Cell Sci 131:jcs214684.

For more information:1950477648nn@gmail.com