Astudiaeth Proteomig Meintiol Yn Datgelu Llwybr Fibrinogen mewn Clefyd Polycystig yr Afu
Nov 21, 2023
Crynodeb:(1) Cefndir: Mae clefyd yr afu polycystig (PLD) yn grŵp heterogenaidd o anhwylderau cynhenid a nodweddir gan ymlediad dwythell y bustl a datblygiad codennau sy'n deillio o cholangiocytes. Serch hynny, nid yw'r mecanwaith cystogenesis yn hysbys ar hyn o bryd ac mae'r driniaeth PLD wedi'i chyfyngu i drawsblannu afu. Mae angen dulliau therapiwtig newydd ac effeithlon. Yn y cyd-destun hwn, prif nod y gwaith presennol yw dod o hyd i lwybrau moleciwlaidd newydd, yn ogystal â thargedau therapiwtig newydd, sy'n rhan o'r broses sytogenesis hepatig. (2) Dulliau: Perfformiwyd proteomeg meintiol yn seiliedig ar dechnoleg SWATH-MS gan gymharu proteomau hepatig oMath Gwylltac iau mutant/polycystig mewn aclefyd yr arennau polycystig(PKD) model murine (Pkd1cond/cond; Tam-Cre−/+). (3) Canlyniadau: Fe wnaethom nodi nifer o broteinau wedi'u newid mewn digonedd, gyda thor-rheoliad deublyg i fyny neu i lawr-reoleiddiad ac un wedi'i addasup-gwerth yn gysylltiedig yn sylweddol â sytogenesis hepatig. Yna, gwnaethom gyfoethogi a dadansoddiad protein-protein gan nodi clwstwr yn canolbwyntio ar ffibrinogenau hepatig. Yn olaf, gwnaethom ddilysu detholiad o dargedau gan RT-qPCR,Blotio gorllewinol,ac imiwn-histocemeg, gan ddod o hyd i gydberthynas uchel â data proteomeg meintiol a dilysu'r cymhleth ffibrinogen. (4) Casgliadau: Nododd y gwaith hwn lwybr moleciwlaidd newydd mewn clefyd yr afu systig, gan amlygu'r cymhlyg ffibrinogen fel targed therapiwtig newydd posibl ar gyfer PLD.
Geiriau allweddol:PLD; SWATH; proteomeg meintiol; targedau therapiwtig
1. Rhagymadrodd
Clefyd yr afu polycystigMae (PLD) yn grŵp heterogenaidd o anhwylderau cynhenid a nodweddir gan ymlediad dwythell y bustl a datblygiad codennau sy'n deillio o cholangiocytes (celloedd epithelial o ddwythell y bustl). Mae'r codennau niferus yn lledaenu ac yn symud ymlaen trwy'r parenchyma afu gan gyfaddawdu ei swyddogaeth [1]. Mae PLDs yn cael eu hetifeddu ar ffurf drechol neu enciliol a gallant ddigwydd ar wahân (clefyd yr afu polycystig ynysigneuPLD) neu, yn fwy cyffredin, fel anamlygiad all-arennolo awtosomaiddclefyd yr arennau polycystig dominyddol oedolion(PKD) [2]. Ynclefyd yr arennau polycystig trech awtosomaidd(ADPKD), ~85% o'r cleifion yn datblygu codennau iau trwy gydol parenchyma hepatig a gall ei ddifrifoldeb amrywio o ychydig o godennau i systogenesis hepatig difrifol [3,4]. Yn y cyfamser, ynclefyd yr arennau polycystig enciliol awtosomaidd(ARPKD), gallai codennau'r afu ddatblygu, ond y prif gymhlethdod hepatig yw ailfodelu diffygiol o'r plât dwythellol â ffibrosis hepatig cynhenid [5,6]. Ar gyfer y ddau, PLD yw'r prif amlygiad extrarenal ac mae angen rheolaeth a thriniaeth glinigol [2,5]. Y prif ddull clinigol ar gyfer cleifion PLD yw lleihau eu symptomau clinigol. Rheoli cymhlethdodau dwythell y bustl yw'r brif nodwedd glinigol i'w rheoli, a'r strategaeth driniaeth derfynol fel arfer yw trawsblannu afu [7], gan nad oes triniaeth ffarmacolegol effeithiol ar gyfer PLD [2,5]. Mae llwybrau moleciwlaidd lluosog wedi bod yn gysylltiedig â'r afiechyd [8], megis secretion hylif cynyddol [9,10], amlhau [11], ffibrosis [12,13], diffygion ciliaraidd [14] ac eraill [7,8]; ond erys y prif fecanwaith ar gyfer cystogenesis i'w egluro. Mae angen nodi targedau therapiwtig newydd ar fyrder. Roedd yr holl astudiaethau hyn yn seiliedig ar astudiaethau moleciwlaidd gan ddefnyddio gwahanol offer moleciwlaidd clasurol: diwylliant celloedd 3D [7,8], immunohistochemistry [7-9,11,12], ELISA [9,11], microsgopeg electron trosglwyddo (TEM) [12] , immunocytochemistry [11], RT-qPCR (PCR meintiol amser real) [7,8,10,11] a blot Gorllewinol [7,8,10-12]. Gall mynd at yr astudiaeth o glefydau o safbwyntiau newydd, modelau anifeiliaid preclinical sefydledig, a manteisio ar dechnolegau newydd, fod o fudd wrth ddarganfod mecanweithiau moleciwlaidd newydd o glefyd i drosi darganfyddiadau moleciwlaidd yn therapïau newydd.
Cromatograffaeth hylif ynghyd â sbectrometreg màs tandem (LC-MS/MS) fu'r dechnoleg a ddefnyddir amlaf ar gyfer nodweddu proteomau afiechyd yn ogystal ag adnabod biofarcwyr clefyd posibl neu sgrinio cyffuriau [15,16]. Mae strategaeth sy'n dod i'r amlwg o'r enw SWATH-MS (caffaeliad ffenestr ddilyniannol o'r holl Sbectrometreg sbectra-màs darn-ion damcaniaethol) yn caniatáu meintioli trwybwn uchel, dibynadwy, atgynhyrchadwy gyda hyd at filoedd o broteinau wedi'u dadansoddi fesul sampl biolegol, a chyda'r posibilrwydd o berfformio ar yr un pryd. nifer fawr o brofion [16,17]. Ar gyfer y dechnoleg hon, mae'r samplau'n cael eu treulio â trypsin a'u dadansoddi gan gromatograffeg hylif ynghyd â chromatograffaeth màs tandem yn gweithio yn y modd Caffael Data-Annibynnol (DIA) fel y'i gelwir [16] (gweler Deunydd a Dulliau). Mae technoleg proteomeg cenhedlaeth nesaf SWATH-MS yn caniatáu meintioli'r proteome a nodi gwahaniaethau yn helaethrwydd protein mewn gwahanol samplau ac amodau.
Yn yr astudiaeth bresennol, gwnaethom gynnal dadansoddiad meintiol proteomig gwahaniaethol yn seiliedig ar dechnoleg SWATH-MS mewn clefyd yr afu polycystig o fodelau anifeiliaid mutant. Rydym yn adrodd ar restr o broteinau sydd ag arwyddocâd ystadegol o ddigonedd protein gwahaniaethol, a nodweddwyd gan wahanol ddadansoddiadau cyfoethogi a churadu data. Yn olaf, gwnaethom ddilysu data SWATH trwy nodi ac amlygu'r cymhleth ffibrinogen fel mecanwaith clefyd newydd a tharged therapiwtig newydd posibl ar gyfer PLD.
2. Defnyddiau a Dulliau
2.1. Model Murine
Yn yr astudiaeth hon, fe wnaethom ddefnyddio model anifail curiad amodol Pkd1 murine, y C57/BL6 k Pkd1cond/cond; Tam-Cre [18,19]. Defnyddiwyd model cre-llygoden fel Wild Types (WT), a'r Cre+ fel Mutant (KO). Cadarnhawyd genoteipiau gan PCR safonol, yn dilyn yr amodau a'r paent preimio a ddisgrifiwyd [18]. Roedd dileu Pkd1 bob amser ar ddiwrnodau ôl-enedigol 10 ac 11 (t10 a t11) gydag un chwistrelliad mewnperitoneol o tamoxifen (10 mg / 40 g) (Sigma®, St. Louis, MO, UDA Rhif T5648), wedi'i wanhau mewn olew corn (Sigma–Aldrich®, St. Louis, MO, UDA Rhif C8267), y ddau ddiwrnod ym mam y torllwythi i'w hysgogi. Cafodd yr anifeiliaid eu ewthaneiddio ar y diwrnod ôl-enedigol 30 (t30). Sefydlwyd y grwpiau gan wahanol unigolion a'u trefnu ar hap (ar hap) gan gadw cymhareb 1:1 rhwng gwrywod a benywod ym mhob grŵp. Defnyddiwyd nodweddion anatomegol i adnabod rhyw yr anifeiliaid. Cafodd y llygod eu cartrefu mewn cyfleuster di-batogenau (SPF) gan amodau sefydledig Prifysgol Santiago.
2.2. Echdynnu Protein a Threulio
Ar y pwynt aberthu p30, roedd yr afu/iau a ddyrannwyd yn cael eu storio ar −80 ◦C. Cafodd yr afu cyfan ei falu mewn nitrogen hylifol gan ddefnyddio morter wedi'i oeri â nitrogen hylifol (DD Biolab®, Barcelona, Sbaen Rhif 088763), gyda hanner y meinwe wedi'i neilltuo i echdynnu protein a'r hanner arall i echdynnu RNA. Paratowyd echdynion protein gyda byffer lyses RIPA (10 Mm TRIS, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0.1% SDS, 1% TRITON X-100 a 1% sodiwm deoxycholate). Ychwanegwyd atalyddion proteas a phosphatase 1% (Sigma® No. P8340 y No. P0044) hefyd. Aeth y lysate meinwe hwn trwy broses allgyrchu (am 30 munud ar 4 ◦C a 14,000 rpm). Yna cafodd y supernatant ei gofio a'i fesur gan assay protein Bradford (Bio-Rad® No. 5000001). Crynhowyd aliquots protein (100 µg) mewn band sengl mewn electrofforesis gel dodecyl sulfate-polyacrylamide 10% (SDSPAGE), wedi'i dorri a'i gyflwyno i'w dreulio â llaw fel y disgrifiwyd yn flaenorol [20]. Yn olaf, diddymwyd y peptidau a echdynnwyd mewn asid fformig 0.1% i'w dadansoddi ymhellach.
2.3. Proteomeg
2.3.1. DDA-Data
Dadansoddiad Dibynnol Dadansoddwyd 4 µL o bob sampl (dros 4 µg o brotein) gan ddull caffael dryll sy'n ddibynnol ar ddata (DDA) gan ficro-LC-MS/MS. Gwahanwyd y samplau gan system micro-LC Ekspert nLC425 (Eksigen®, Dulyn, CA, UDA) gan ddefnyddio colofn trap YMC-TRIART C18 gyda maint gronynnau 3 mm a maint mandwll 120 Å (YMC Technologies, Teknokroma, Barcelona, Sbaen) a cholofn Chrom XP C{{10}} mm × 0.30 mm, maint gronynnau 3 mm a maint mandwll 120 Å (Eksigen® ) ar gyfradd llif o 10 µL/munud. Y toddyddion a ddefnyddiwyd oedd hydoddydd A (dŵr, 0.1% asid ffurfig) a hydoddydd B (ACN, 0.1% asid fformig). Roedd y graddiant o 5% i 95% B am 30 munud, 5 munud ar 90% B ac, yn olaf, 5 munud arall ar 5% B ar gyfer cydbwysedd colofn, am gyfanswm amser o 40 munud. Y sbectromedr màs wedi'i gyplysu oedd sbectromedr màs pedwarpôl-TOF hybrid, 6600 (SCIEX®, Framingham, MA, UDA) yn gweithredu gyda system gaffael sy'n dibynnu ar ddata yn y modd ïon positif. Gan ddefnyddio'r sbectromedr màs, cynhaliwyd sgan arolwg 250 ms ar 400 i 1250 m/z ac yna arbrofion MS/MS ar 100 i 1500 m/z (25 ms o amser caffael) am gyfanswm amser cylchred o 2.8 s. Ychwanegwyd rhagsylweddion darniog at y rhestr allgáu deinamig am 15 s, cafodd unrhyw ïon â gwefr +1 ei eithrio o'r dadansoddiad MS/MS. Cyfunwyd a pherfformiwyd chwiliadau cronfa ddata amrwd MS gan ddefnyddio meddalwedd ProteinPilot v.5.0.1. (SCIEX®, Framingham, MA, UDA) gan ddefnyddio cronfa ddata llygoden-benodol UniProt Swiss-Prot. Mae angen nodi alkylation cystein iodoacetamide fel addasiad sefydlog a threuliad trypsin. Gosodwyd y gyfradd darganfod ffug (FDR) i 1 ar gyfer peptidau a phroteinau gyda sgôr hyder yn fwy na 99% [21].
2.3.2. Cynhyrchu'r Cyfeiriadau
Llyfrgell Sbectrol Perfformiwyd y llyfrgell sbectrol gan ddull DDA fel y disgrifir uchod, ond yn lle pob sampl annibynnol, perfformiwyd cronfa o bob grŵp gyda 4 µL o bob sampl (dros 4 µg o brotein) yn rhedeg er mwyn cael protein mwy cynrychioliadol adnabod yn y llyfrgell sbectrol. Lansiwyd yr holl ffeiliau crai gyda'i gilydd i gronfa ddata Uniprot i gael y llyfrgell sbectrol gan ddefnyddio'r amodau peilot protein a grybwyllwyd yn yr adran flaenorol.
2.3.3. Meintioli yn ôl SWATH a Dadansoddi Data
Perfformiwyd caffaeliad SWATH-MS gan ddefnyddio dull DIA. Defnyddiwyd 4 grŵp gyda 4 atgynhyrchiad biolegol fesul grŵp a 3 atgynhyrchiad technegol fesul sampl (gweler Tabl S1 am ragor o fanylion). Cafodd y meinweoedd eu dadansoddi ac, ym mhob achos, eu cymharu mewn amodau Math Gwyllt (o Pkd1cond/cond; Tam-Cre− mouse) a Mutant (o Pkd1cond/cond; Tam-Cre+ mouse). Cafodd 4 µg o brotein fesul sampl a chopïau technegol eu rhedeg gan ddefnyddio dull SWATH. Ar gyfer pob set o samplau, optimeiddiwyd lled y 100 ffenestr amrywiol yn unol â'r dwysedd ïonig a geir yn y llyfrgell DDA yn rhedeg gan ddefnyddio taenlen ffenestr newidiol Sciex SWATH. Felly, roedd y dull SWATH yn seiliedig ar gylchred o ailadroddiadau a oedd yn cynnwys caffael sganiau 100TOF MS/MS (400 i 1500 m/z, modd sensitifrwydd uchel, amser caffael 50 ms) o ffenestri ynysu o newidynnau dilyniannol gorgyffwrdd â lled. (gorgyffwrdd o 1 m/z) yn cwmpasu'r ystod màs 400 i 1250 m/z gyda sgan TOF MS blaenorol (400 i 1500 m/z, amser caffael 50 ms) ar gyfer pob cylchred. Cyfanswm yr amser beicio oedd 6.3 s.
2.3.4. Dadansoddi data
Cafodd yr holl broteinau yn y llyfrgell ïon a nodwyd gan ProteinPilot gyda FDR o dan 1% eu meintioli gan y dull SWATH. Unwaith y cafwyd samplau unigol, perfformiwyd yr aliniad sbectrol a'r echdynnu data wedi'i dargedu gan PeakView v.2.2. (SCIEX®, Framingham, MA, UDA) yn cyfateb i'r llyfrgell sbectrol gyfeirio fel y disgrifir isod [22-26]. Cafodd amseroedd cadw'r peptidau a ddewiswyd ar gyfer pob protein eu hail-alinio ym mhob rhediad yn ôl y peptidau iRT a oedd yn bresennol ym mhob sampl a chawsant eu hegluro ar hyd yr echelin amser cyflawn. Yna cynhyrchwyd y cromatogramau ïon a echdynnwyd ar gyfer pob ïon o'r darn a ddewiswyd; cafwyd yr ardaloedd brig ar gyfer y peptidau trwy ychwanegu ardaloedd brig ïonau'r darnau cyfatebol. Cyfrifodd PeakView FDR a sgôr ar gyfer pob peptid a neilltuwyd yn ôl y cydrannau cromatograffig a sbectra; dim ond peptidau â FDR o dan 5% a ddefnyddiwyd ar gyfer meintioli protein. Yn yr un modd, i gael yr ardaloedd ar gyfer meintioli protein fel swyddogaeth dwyster signal, dewiswyd hyd at 10 peptid fesul protein a saith darn fesul peptid. Cafodd yr holl peptidau a rennir ac a addaswyd eu heithrio rhag prosesu. Defnyddiwyd ffenestri pum munud a lled 30 ppm i echdynnu'r cromatogramau ïon.
2.3.5. Dadansoddiad Llwybr Signalau
Perfformiwyd dadansoddiad swyddogaethol gwahanol gan ddefnyddio proteinau a fynegwyd yn wahaniaethol i werthuso'r rhwydweithiau rhyngweithio mwyaf perthnasol, llwybrau cysylltiedig neu gydrannau cellog a phroteinau neu lwybrau cysylltiedig eraill. Defnyddiwyd rhifau derbyn protein UniProt (https://www.uniprot.org/, 28 Awst 2021). Roedd proteinau â gwahaniaethau mewn helaethrwydd protein yn destun: String® (https://string-db.org/, 25 Hydref 2021) gan ddefnyddio termau Gene Ontology (GO) a FunRich® (http://funrich.org/index.html , 21 Hydref 2021) i astudio rhwydweithiau protein a chysylltiad biolegol rhwng proteinau; ac i Reactome® (https://reactome.org/, 25 Hydref 2021) i astudio'r llwybrau sy'n gysylltiedig â phroteinau sydd wedi'u mynegi'n sylweddol neu ryngweithio â nhw.
2.4. Histoleg a Mesur Mynegai Systig
Roedd llabed mwyaf iau'r anifeiliaid bob amser yn sefydlog mewn paraformaldehyd (hydoddiant byffer paraformaldehyd 4%, pH=7, Labbox No. FORM-D0P-10K) dros nos am 4 ◦C. Yna cafodd yr iau eu dadhydradu â sylene ac ethanol ac yn olaf eu hymgorffori mewn paraffin. Casglwyd trawstoriadau o 4.5 µm. Ar gyfer hematocsilin-eosin (AU) a Masson trichrome staenio protocolau safonol yn cael eu defnyddio.
Ar gyfer meintioli, roedd sleidiau o adrannau hydredol o labed mwyaf yr afu bob amser yn cael eu cymryd fel delweddau cynrychioliadol, ac, o leiaf chwe adran wahanol i bob anifail, wedi'u delweddu o dan ficrosgop Olympus BX51 wedi'i gysylltu â Chamera Olympus DP70, ar gyfer meintioli'r mynegai systig a nifer o systiau. Cyfrifwyd meintioli'r ddau baramedr gydag offeryn meddalwedd Adnabod Cyst Awtomatig o'r enw CystAnalyser ( https://citius.usc.es/transferencia/software/cystanalyser , 1 Gorffennaf 2020) fel y disgrifiwyd yn flaenorol [35].
2.5. Cemeg Glinigol
Casglwyd gwaed cyn ewthanasia, a chafwyd serwm gan ddefnyddio tiwbiau BD Vacutainer SST II Advance. Mesurwyd serum alanine transaminase (ALT) a phosphatase alcalin (ALP) gan ddefnyddio System Cemeg ADVIA 2400 (Siemens Healthineers, Erlangen, yr Almaen).
2.6. Echdynnu RNA
Cafodd RNA ei ynysu fel y disgrifiwyd yn flaenorol [36] trwy ddefnyddio protocol TRIzol (TRI Reagent, Sigma®, St. Louis, MO, UDA, Rhif T9424), lle bu clorofform (Sigma® No. C2432) yn asiant dadnatureiddio ar gyfer y celloedd ac isopropanol (Sigma® No. 650447) oedd yr asiant gwaddodi ar gyfer RNA. Gwanhawyd y gwaddod mewn dŵr DEPC (Ambion®, Austin, TX, UDA, Rhif AM9920), sydd hefyd yn cynnwys 1% SUPERaseIn RNase Inhibitor (Thermo Fisher®, Waltham, MA, UDA, Rhif AM2694).
2.7. PCR Meintiol Amser Real
Cafodd un microgram o gyfanswm RNA yr afu ei drin â DNase I (Invitrogen®, Carlsbad, CA, UDA, Rhif 18068015). Yna, perfformiwyd trawsgrifio gwrthdro gyda phecyn System Synthesis Elfennau Cyntaf SuperScript® III (Invitrogen®, Rhif 18080051), a dadansoddiad mynegiant genynnau trwy PCR amser real meintiol gan ddefnyddio FastStart Universal SYBR GREEN Master (ROX) (Roche® No. 04913914001 ) mewn system Mx3005P (Agilent Technologies®, Santa Clara, CA, UDA). Dyluniwyd y paent preimio a ddefnyddiwyd ar gyfer yr astudiaeth hon gyda Primer 3 Plus (http://tiny.cc/pf928y, 11 Mawrth 2020) ac maent yn seiliedig ar y dilyniannau cyfeirio cDNA a gyhoeddwyd ym mhorwr genom Ensembl (http://www.ensembl.org /index.html, 11 Mawrth 2020). Mae dilyniannau llawn yr holl preimwyr a ddefnyddiwyd yn yr astudiaeth i'w gweld yn Nhabl S2. Defnyddiwyd y rhaglen ganlynol ar gyfer pob adwaith PCR cyflawn: cam dadnatureiddio gyda 30 s ar 95 ◦C; 45 cylch o 30 s ar 95 ◦C, 1 min ar 60 ◦C a 30 s ar 72 ◦C; ac yna cam oeri. Fel yr ydym wedi'i wneud yn flaenorol [36], rhedwyd pob sampl (n=6 ar gyfer pob grŵp) yn driphlyg ym mhob arbrawf. Dadansoddwyd y canlyniadau trwy'r dull meintioli absoliwt. O ganlyniad, defnyddiwyd cromlin safonol gyda chrynodiadau hysbys yn yr assay ac, yn ogystal, cafodd pob sampl ei normaleiddio i enyn mynegiant cyson. Yn yr astudiaeth hon, defnyddiwyd y genyn Gapdh (glyceraldehyde-3-ffosffad dehydrogenase) fel y genyn cadw tŷ.
2.8. Blotio Gorllewinol
Perfformiwyd profion blotio gorllewinol ar lysadau iau cyfan. Pennwyd cyfanswm cynnwys protein gan ddefnyddio assay protein Bradford (Bio-Rad®, Hercules, CA, UDA, Rhif 5000001) a’r un faint o bob protein (20–30 µg) oedd wedi'i ferwi ar 95 ◦C am 5 munud a'i wahanu mewn 10% SDS-PAGE o dan amodau lleihau. Defnyddiwyd Ysgol Protein Prestained PageRulerTM (Thermo Fisher®, Waltham, MA, UDA, Rhif 26616) fel y safon pwysau moleciwlaidd protein. Yn dilyn hynny, trosglwyddwyd y proteinau i bilenni nitrocellulose (Bio-Rad® No. 1620115). Er mwyn osgoi rhwymo amhenodol, rhwystrwyd y pilenni am 1 h ar dymheredd yr ystafell gan ddefnyddio datrysiad 2.5% BSA (NZYTech®, Lisboa, Portiwgal, Rhif MB046) ar gyfer proteinau ffosfforylaidd, neu SuperBlock Blocking Buffer (Thermo Fisher®, Waltham, MA, UDA, Rhif 37515). Yn dilyn hynny, cafodd y pilenni eu deor dros nos ar 4◦C gyda gwrthgyrff cynradd a'r tro nesaf yn cael eu golchi mewn 0.3% Tween-20 yn PBS. Yn olaf, cafodd y pilenni nitrocellulose eu deor am 1 h ar dymheredd ystafell gyda'r gwrthgyrff eilaidd sy'n gysylltiedig â HRP. Datblygwyd signalau gyda phecyn Sbstrad Chemiluminescent SuperSignal™ West Pico PLUS (Thermo Fisher®, Waltham, MA, UDA, Rhif 34580) neu becyn Sbstrad Blotio Gorllewinol PierceTM ECL (Thermo Fisher®, Waltham, MA, UDA Rhif 32109) ymlaen llaw i ddelweddu yn System Ddelweddu ChemiDoc™ (Bio-Rad®, Hercules, CA, UDA). Cafodd bandiau protein eu mesur gan ddefnyddio meddalwedd ImageJ® Lab (v 4.0.1, https://imagej.nih.gov/ij/, 26 Mawrth 2021). Cafodd lefelau densitometreg protein eu normaleiddio i broteinau cadw tŷ GAPDH neu -ACTIN. Ar gyfer pob grŵp. Defnyddiwyd N=6, ym mhob arbrawf.
Mae'r gwrthgyrff cynradd canlynol yn cael eu hail-ddefnyddio ar gyfer blotio Gorllewinol: gwrth-ANXA2 (1:500, Santa Cruz Biotechnology Inc.®, Dallas, TX, UDA #sc-28385), gwrth -SAMP (1:500, Santa Cruz Biotechnology Inc.®, Dallas, TX, UDA, Rhif sc-393948), gwrth-FIBB (1:500, Santa Cruz Biotechnology Inc.®, Dallas, TX, UDA, Rhif sc-271035), gwrth-FIBA (1:500, Santa Cruz Biotechnology Inc.®, Dallas, TX, UDA, Rhif sc-398806), gwrth-FIBG (1:500 , Santa Cruz Biotechnology Inc.®, Dallas, TX, UDA, Rhif sc-133157), gwrth-HAO2 (1:1000, Thermo Fisher®, Waltham, MA, UDA, Rhif 113442), gwrth-GAPDH (1:1000, Cusabio®, Houston, TX, UDA, Rhif CSB-RA009232A0HU) a gwrth- -ACTIN (1:1000, Cell Signaling Technology®, Danvers, MA, UDA, Rhif 8457), fel yn ogystal â'r gwrthgorff eilaidd Goat gwrth-Cwningen IgG HRP (1:5000, Thermo Fisher®, Waltham, MA, UDA, Rhif 31460) neu Goat gwrth-Llygoden IgG HRP (1:5000, Thermo Fisher®, Waltham, MA, UDA, Rhif 31430).
2.9. Imiwnohistocemeg a Meintioli
Ar gyfer imiwn-histochemistry, defnyddiwyd byffer citrad sodiwm pH=6 (Agilent Dako®, Glostrup, Denmarc Rhif S2369) ar gyfer adalw antigen a rhwystrwyd meinwe â gwanedydd gwrthgyrff (Agilent Dako® No. K8006). Y gwrthgorff a ddefnyddiwyd ar gyfer dadansoddiad imiwn-histocemegol oedd ffibrinogen (Agilent Dako® No. A0080), a'r system ganfod wedi'i chyfuno â HPR ar gyfer yr imiwn-ganfod. Yn olaf, perfformiwyd meintioli immunohistochemistry gan ddefnyddio'r swyddogaeth "Split channels" (sianel werdd) o feddalwedd Fiji-ImageJ® (https://imagej.net/software/fiji/, 13 Hydref 2021). Ar gyfer pob sampl, n Defnyddiwyd mwy na neu'n hafal i 6 delwedd.
2.10. Dadansoddiad Ystadegau
Data are presented as means ± SEM for all cases (bar or point plots). First, normal distribution was confirmed using the Kolmogorov–Smirnov test. A two-tailed t-test was used to determine the significance of differences between two groups. p < 0.05 was considered statistically significant. Furthermore, ** corresponds to p-values < 0.01 and *** to p-values < 0.001. All datasets were analyzed using GraphPad Prism software (version 9, https://www.graphpad.com/, 13 October 2021). For proteomic studies, a Student's t-test (using MarkerView software, 22 December 2017) was performed to compare the groups in pairs to identify proteins, which were significantly differentially represented using adjusted p-value < 0.05 (multiple correction FDR method) and fold change >2 fel torbwynt. Perfformiwyd dadansoddiad ystadegol aml-amrywedd heb oruchwyliaeth gan ddefnyddio dadansoddiad o'r prif gydrannau (PCA) i gymharu'r data ar draws y samplau.
Gwasanaeth Cefnogol Wecistanche - Yr allforiwr cistanche mwyaf yn Tsieina:
E-bost:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Ffôn:+86 15292862950
Siop Am Fwy o Fanylion:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
