am ragor o wybodaeth:ali.ma@wecistanche.com

Sante Princiero Berlingerio^1,†, Junling He^2,†, Lies De Groef ³, Harold Taeter⁴, Tomas Norton⁴, Pieter Baatsen ⁵, Sara Cairoli⁶, Bianca Goffredo⁶, Peter de Witte ⁷, Lambertus van den Heuvel^1,8, Hans J. Baelde²ac Elena Levtchenko^1,*

^{Rhan I: Amlygiadau Arennol ac Ychwanegol Arennol mewn Pysgod Sebra Oedolion Model Cystinosis}

¹Labordy Neffroleg Pediatrig, KU Leuven, 3000 Leuven, Gwlad Belg; santeprinciero.berlingerio@kuleuven.be (SPB); Bert.vandenHeuvel@radboudumc.nl (LvdH)

²Adran Patholeg, Canolfan Feddygol Prifysgol Leiden, 2300 RC Leiden, Yr Iseldiroedd; J.He@lumc.nl (JH); j.j.baelde@lumc.nl (HJB)

³ Grŵp Ymchwil Datblygu ac Adfywio Cylched Niwral, KU Leuven, 3000 Leuven, Gwlad Belg; lies.degroef@kuleuven.be

⁴Grŵp o M3-BIORES, Is-adran Peirianneg Iechyd Anifeiliaid a Dynol, KU Leuven, 3000 Leuven, Gwlad Belg; harold.taeter@kuleuven.be (HT); tomas.norton@kuleuven.be (TN)

⁵Niwrobioleg Foleciwlaidd, VIB-KU Leuven, 3000 Leuven, Gwlad Belg; pieter.baatsen@kuleuven.be

⁶Adran Meddygaeth Pediatrig, Labordy Uned Biocemeg Metabolaidd, Ysbyty Plant Bambino Gesù, IRCCS, 00146 Rhufain, yr Eidal; sara.cairoli@opbg.net (SC); biancamaria.goffredo@opbg.net (BG)

⁷Labordy ar gyfer Bioddarganfod Moleciwlaidd, KU Leuven, 3000 Leuven, Gwlad Belg; peter.dewitte@kuleuven.be

⁸Adran Neffroleg Pediatrig, Canolfan Feddygol Prifysgol Radboud, 6525 GA Nijmegen, Yr Iseldiroedd

^*Gohebiaeth: elena.levtchenko@uzleuven.be; Ffôn.: ynghyd â 32-16-34-38-22

^† Cyfrannodd yr awduron hyn yn gyfartal at y gwaith hwn.

Crynodeb:Cystinosisyn glefyd enciliol awtosomaidd prin, anwelladwy a achosir gan fwtaniadau yn y genyn CTNS. Mae'r genyn hwn yn amgodio cystinosis cludwr cystin lysosomaidd, gan arwain at groniad cystin lysosomaidd ym mhob cell o'r corff, a'r arennau yw'r organau cyntaf yr effeithiwyd arnynt. Mae'r driniaeth bresennol â cysteamine yn lleihau croniad cystin ond nid yw'n gwrthdroi'r camweithrediad tiwbaidd procsimol, anaf glomerwlaidd, neu golliarennolswyddogaeth. Yn ein hastudiaeth flaenorol, rydym wedi datblygu model sebrafish o cystinosis trwy fwtaniad nonsens yn y genyn CTNS ac wedi dangos bod larfâu sebrafish yn ailadrodd yarenffenoteip a ddisgrifir mewn bodau dynol. Yn yr astudiaeth gyfredol, rydym yn nodweddu'r oedolyncystinosismodel sebrafish a gwerthuso effeithiau hirdymor y clefyd ararenac extrarenal organau trwy astudiaethau gweithgaredd biocemegol, histolegol, ffrwythlondeb a locomotor. Gwelsom fod yr oedolyncystinosispysgod sebra yn cyflwyno croniad cystin mewn organau amrywiol, newid morffoleg yr arennau, pigmentiad croen nam, llai o ffrwythlondeb, newid gweithgaredd locomotor, ac anomaleddau llygadol. Yn gyffredinol, mae ein data yn dangos bod yr oedolyncystinosisMae model sebrafish yn atgynhyrchu sawl ffenoteipiau dynol o gystinosis a gall fod yn ddefnyddiol ar gyfer astudio pathoffisioleg ac effeithiau hirdymor therapïau newydd.

Geiriau allweddol:arenclefyd;cystinosis; model sebrafish;arennolac extrarenal amlygiad; nodweddion ffenoteip oedolion

1. Rhagymadrodd

Cystinosisyn anhwylder storio enciliol awtosomaidd a achosir gan fwtaniadau yn y genyn CTNS sy'n amgodio cystinosis cyd-gludwr proton cystin lysosomal, gan gludo cystin o'r lwmen lysosomaidd i'r cytosol. Mae sawl organ yn gysylltiedig â'r afiechyd, megis cyhyrau, ceilliau, llygaid, ac ymennydd, ac ymhlith pawb,arennauyw'r organau cyntaf a'r rhai yr effeithiwyd arnynt fwyaf difrifol [1]. Yr amrywiad clinigol mwyaf aml a difrifol yw'r neffropathig babanodcystinosis, lle mae'r amlygiad clinigol cyntaf yn yarennolSyndrom Fanconi, a nodweddir gan gell epithelial tiwbaidd procsimol â nam

(PTE) adamsugniad gan arwain at golli wrinol o asidau amino, glwcos, proteinau pwysau moleciwlaidd isel i ganolraddol moleciwlaidd, a metabolion eraill. Mae'r difrod PTEC yn cael ei ddilyn gan gamweithrediad glomerwlaidd cynyddol ac, o'i adael heb ei drin, yn arwain at ddiwedd y cyfnodarenclefyd [1]. Mae'r dull therapiwtig presennol yn cynnwys cystein, sef amino thiol sy'n disbyddu cystin sy'n torri pont disulfide cystein, gan arwain at ffurfio cystein asid amino a disulfide cymysg cystein-cystein. Gall y moleciwl olaf hwn fod yn allexitlysosomesviatheaminoasidtransporterPQLC2[2]. Fodd bynnag, mae triniaeth â cysteamine, er ei fod yn lleihau cronni cystin lysosomaidd, yn gohirio datblygiad y clefyd [3-5] yn unig. Felly, mae dealltwriaeth bellach o'r pathogenesis ocystinosisac mae datblygu achosion newydd o'r system trais rhywiol yn dal ar yr agenda ymchwil. Mae sawl model anifeiliaid wedi'u datblygu er mwyn ail-ddangos y ffenoteip cystinosis [6,7]. Un o'r modelau a ddefnyddir fwyaf yw'r llygoden Ctns -/ - C57BL/6, sy'n datblygu croniad cystin a thiwbwlopathi procsimol ysgafn. Fodd bynnag, nid yw'n dangos difrod glomerwlaidd ac mae'r ffenoteip wedi'i ganfod yn dibynnu ar y cefndir genetig [8].

Hyd yn hyn, mae modelau sebrafish wedi dod yn arf deniadol ar gyfer ymchwilio i glefydau dynol oherwydd nifer o fanteision megis eu datblygiad cyflym, ffrwythlondeb uchel, cost cynnal a chadw is, ac argaeledd technolegau golygu genynnau hawdd eu cymhwyso [9]. Mewn astudiaeth flaenorol, fe wnaethom gyflwyno model larfa sebrafish congenig gyda threiglad nonsens homosygaidd yn yr exon 8 o'r genyn ctns−/ -, gan arwain at golled swyddogaethol o cystinosis [10], gan arwain at groniad cystin yn y corff cyfan, wedi cynyddu. anffurfiad larfa, datblygiad oedi, aarendifrod. Fodd bynnag, nid yw canlyniadau clefyd tymor hir mewn oedolion sebrafish wedi'u hastudio hyd yn hyn. Yn yr astudiaeth gyfredol, ein nod oedd nodweddu'rarennolac amlygiadau allanol yn y model sebrafish oedolion ocystinosis.

Cliciwch i OrganicCistanche at Glefyd Arennol

2. Canlyniadau

2.1. Systin yn Cronni mewn Ctns−/− Sebrafish

Cystinosisyn cael ei ystyried yn anhwylder aml-systemig sy'n arwain at groniad cystin ym mhob cell o'r corff. Yn ein gwaith blaenorol, canfuom fod cystinosis (ctns−/−) sebrafish yn dangos croniad cystin gan ddechrau o gam datblygiad y larfa ac mewn sawl organ hyd at 8 mis oed [9]. Er mwyn gwerthuso a yw ein model yn cynnal croniad cystin yng nghamau diweddarach y clefyd, fe wnaethom fesur lefelau cystin yn y corff cyfan,aren, ceilliau, llygaid, cyhyr, a'r ymennydd mewn 18-mis oed ctns−/− sebrafish o'i gymharu â sebrafish gwrywaidd math gwyllt sy'n cyfateb i oedran. Canfuom 54-gynnydd plyg yng nghynnwys cystin yn y corff cyfan (Ffigur 1A) a 146-cynnydd plyg yn yr aren (Ffigur 1B) o ctns−/− sebrafiish o gymharu â sebrafis gwyllt. Ar ben hynny, gwelsom groniad cystin helaeth yn y ceilliau, y llygaid, y cyhyr a'r ymennydd (Ffigur 1C-F) mewn ctns-/-sebrafish.

2.2. Amlygiad Arennol

2.2.1. Ctns−/− Difrod PTEC Presennol Sebrafish

Gan fod yarenyw'r organ yr effeithiwyd arni fwyaf difrifol, archwiliwyd nodweddion histolegol yr aren gan ddefnyddio staen Hematoxylin ac Eosin (H&E) a Cyfnodol Asid-Shiff (PAS). Fe wnaethom nodi presenoldeb chwydd cymylog, defnynnau eosinoffilig tebyg i hyaline, a gwagolau sytoplasmig yn y PTEC o ctns -/ - pysgod sebra (Ffigur 2B, D) ond nid mewn pysgod sebra gwyllt (Ffigur 2A, C). O bwys, ni chanfuwyd unrhyw ddifrod tiwbaidd distal. Arsylwyd crisialau cystine yn flaenorol yn PTEC fel gwagolau cytoplasmig gyda siapiau hirsgwar neu amrymorffaidd [11]. Felly, fe wnaethom ymchwilio i weld a oedd y strwythurau hyn hefyd yn bresennol mewn tiwbiau o sebrafish. Daethom o hyd i nifer o wagolau cytoplasmig yn y PTEC o ctns -/ - sebrafish trwy staenio glas toluidine (Ffigur 3B, D, wedi'i nodi â seren). Yn ogystal, daethom o hyd i ofod gwagolaidd gyda siapiau hirsgwar neu amrymorffaidd (Ffigur 3B, D, wedi'i nodi â phennau saethau). Fe wnaethom gadarnhau'r canfyddiad hwn trwy ficrosgopeg electron trawsyrru (TEM) (Ffigur 3F). Nid oedd y strwythurau hyn yn bresennol yn y PTEC o sebrafish math gwyllt (Ffigur 3A, C, E). Yn ddiddorol, yn ogystal â phresenoldeb gwagolau siâp amrymorffaidd, gwelsom golled rhannol o ffin y brwsh yn uwch-strwythur PTEC (Ffigur 3F).

Ffigur 1. Cynnwys cystin mewn homogenadau o fath gwyllt a ctns−/- pysgod sebra. (A-F) Cynnwys cystin yn y corff cyfan (A),aren(B), ceilliau (C), llygaid (D), cyhyr (E), ac ymennydd (F) mewn math gwyllt a ctns−/− 18-sebrafish gwrywaidd mis oed. Mynegir crynodiad cystin fel protein nmol/mg. Mae pob dot yn cynrychioli un pysgodyn sebra, ar gyfer cyfanswm o n=3 math o wyllt ac n=3 cents−/ - 18-sebrafish gwrywaidd mis oed; prawf t heb ei baru gyda chywiriad Welch, dwy gynffon: * p < 0.05;="" **=""><0.01; ns:="" not="" significant.="">

Ffigur 2.Arennauhistoleg mewn math gwyllt a ctns−/− sebrafish. (A, B) Delweddau cynrychioliadol oarennoltiwbiau o fath gwyllt (A) a ctns−/− (B) sebrafish mis oed. Manylion tiwbiau procsimol gyda defnynnau eosinoffilig tebyg i hyalin (pennau saethau du) a gwagolau sytoplasmig (*). Staenio H&E. Mae'r barrau graddfa yn cynrychioli 50 µm. (C,D) Delweddau cynrychioliadol o staen PAS o diwbiau arennol o fath gwyllt (C) a ctns−/− (D) 18-sebrafish mis oed. Manylion tiwbiau procsimol gyda defnynnau tebyg i hyalin (pennau saethau du) a gwagolau sytoplasmig (*). staenio PAS. Mae'r barrau graddfa yn cynrychioli 50 µm. PT: tiwbyn procsimol; DT: tiwbyn distal.

Ffigur 3.Arennaucrisialau cystin mewn PTECs math gwyllt a ctns−/− sebrafiish. (A,B) Cynrychiolwr toluidine delweddau lliw glas oarennoltiwbiau procsimol mewn math gwyllt (A) a ctns−/− (B) sebrafish mis oed. Mae'r barrau graddfa yn cynrychioli 50 µm. (C,D) Mae Ffigurau 3C, D yn dangos chwyddiad uwch o Ffigur 3A,B. Manylion tiwbiau procsimol arennol gyda gwagolau cytoplasmig ((D); *), bylchau gwagolar hirsgwar ac amrymorffaidd ((D); pennau saethau du). (E, F) Delweddau cynrychioliadol TEM o'r tiwbyn arennol procsimol o fath gwyllt (E) a ctns−/− 18-sebrafish mis oed (F). (F) Arsylwyd colled rhannol o ffiniau brwsh procsimaltibwl (PB) a chroniad o wagolau hirsgwar ac amlymorffaidd (*) yn y tiwbyn arennol procsimol o ctns -/ - sebrafish. Mae'r olygfa chwyddo uchel o'r petryal yn y gornel dde isaf yn dangos y gwagolau amrymorffaidd a gwagolyn mawr gyda segmentau ymyl pilen syth (llinell syth). Mae'r barrau graddfa yn cynrychioli 5 µm.

2.2.2. Ctns−/− Sioe Sebrafiish Hypertrophy Glomerwlaidd

Gan fod difrod glomerwlaidd fel arfer yn dilyn briwiau PTEC, fe wnaethom werthuso histoleg glomerwlaidd o'r pethau -/ - sebrafish, a gwelsom fod dynionsebra yn dangos helaethiad sylweddol o Bowman's capsiwl (Ffigwr 4B, B, nid Fig, tuft F) a gofod glomer F (4B), glomer tuft, E), a glomerwlaidd F (Ffigwr 4B, E) a gofod glomer F 4B (4B), glomer tuft, E). , G) o'i gymharu â sebrafish gwrywaidd tebyg i wyllt (Ffigur 4A, E–G). Cadarnhawyd yr un peth ar gyfer y glomerwlartuftin benywaidd yn cario'r treiglad ctns−/− (Ffigur 4F), a gwelwyd tuedd debyg ar fesuriadau gofod y Bowman a chapsiwl y Bowman (Ffigur 4E, G). Arsylwyd nad yw'n amlhau celloedd mesgaidd neu glomerwlosclerosis. Ar y delweddau TEM, ni welsom newidiadau ar y bilen islawr glomerwlaidd, elifiad proses traed podocyte, na chelloedd endothelaidd â ffenestri annormal yn glomerwli ctns-/- sebrafish (Ffigur 4D) o'i gymharu â sebra môr gwyllt (Ffigur 4C).

Ffigur 4. Morffoleg glomerwlaidd mewn math gwyllt ac mewn ctns−/− pysgod sebra. (A, B) Delweddau cynrychioliadol o glomerwlws math gwyllt (A) a ctns−/- (B) 18-pysgod sebra mis oed. staenio PAS. Mae'r barrau graddfa yn cynrychioli 50 µm. (C,D) Delweddau cynrychioliadol TEM o'r glomerwlws o bysgod sebra math gwyllt (ctns−/− (D) Mae'r bariau graddfa yn cynrychioli 1 µm. (E–G) Meintioli arwynebeddau capsiwl Bowman (E),). tuft glomerwlaidd (F), a gofod (G) Bowman o fath gwyllt a pysgod sebra yn y ddau ryw.

2.2.3. Ctns−/− Arddangosfa Sebrafiish Mwy o Apoptosis ar Lefel PTEC

Nesaf, rydym yn ymchwilio i weld acystinosismarwolaeth celloedd sbarduno yn ein model pysgod sebra [10,12]. Rydym yn perfformio caspase hollti -3 immunostaining yn yarennolmeinweoedd o fath gwyllt a ctns -/ - sebrafish a gwelsom gynnydd sylweddol yn lefelau protein caspase3 hollt yn PTEC o ctns - / - sebrafish (Ffigur 5B, D, G) o'i gymharu â sebrafish math gwyllt (Ffig, C) G) yn y ddau ryw. Roedd mynegiant caspase hollt -3 yn bresennol yn bennaf mewn celloedd yn dangos y gwagolau cytoplasmig amrymorffaidd (Ffigur 5B, D). Nid oedd unrhyw fynegiad o caspase hollt-3 yn bresennol mewn glomeruli, mewn math gwyllt a ctns−/− zebrafish (Ffigur 5E, F).

Ffigur 5. Mwy o apoptosis mewn PTECs gyda gwagolau mewn ctns−/− pysgod sebra. (A, B) Delweddau cynrychioliadol o'r caspase holltedig-3 imiwno'r tiwbiau o fath gwyllt (A) a ctns - hen bysgod sebra. Mae'r barrau graddfa yn cynrychioli 50 µm. (C,D) Mae'r paneli gwaelod yn dangos chwyddhad uwch o'r ardaloedd mewn blychau yn y paneli uchaf. Manylion PTECs gyda gwagolau sytoplasmig (*). Mae'r barrau graddfa yn cynrychioli 50 µm. (E, F) Delweddau cynrychioliadol o'r caspase holltedig-3 yn gwrthimiwneiddio glomerwlws o fath gwyllt (E) a ctns−/− (F) 18-pysgod sebra mis oed. Mae'r barrau graddfa yn cynrychioli 50 µm. (G) Meintioli'r caspase tiwbaidd-3 sy'n staenio arwynebedd positif mewn math gwyllt a pysgodyn sebra yn y ddau ryw. Mae pob dot yn cynrychioli un pysgodyn sebra, ar gyfer cyfanswm o n=3 math o bysgod gwyllt a ctns−/− 18-pysgodyn sebra mis oed. ANOVA dwy ffordd gyda phrawf gwahaniaeth lleiaf arwyddocaol Fisher (PLSD): ** p < 0.01;="" ***="" p=""><>

2.3. Amlygiadau Arennol Ychwanegol

2.3.1. Ctns−/− Sebrafiish Dangos Patrwm Croen Braith Hypopigmentaidd Nodweddiadol

Cystinosismae cleifion yn aml yn dangos heneiddio croen cynamserol, hypopigmentation, a gwallt melyn [1,13]. Yn ddiddorol, gwelsom batrwm smotiog hypopigment ar groen ctns−/− sebrafish, tra bod pysgod gwyllt yn cyflwyno'r patrwm streipiog du nodweddiadol. Mae'r ffenoteip yn bresennol yn y ddau ryw yn ystod eu hoes gyfan (Ffigur 6A, B). Er mwyn ymchwilio i'r gwahaniaeth mewn pigmentiad, gwnaethom staenio PAS ar y croen sebrafish a chanfuom fod ctns -/ - zebrafish yn arddangos dosbarthiad haen melanin yn yr epidermis wedi newid, a achosodd y patrwm smotiog golau (Ffigur 6C, D).

Ffigur 6. Patrwm croen smotiog wedi'i uwchbigmentu mewn ctns−/- pysgod sebra. (A, B) Lluniau cynrychioliadol o fath gwyllt (A) a ctns−/ - (B) 18-sebrafish mis oed. Mae'r barrau graddfa yn cynrychioli 0.5cm. Mae'r pennau saethau du yn dynodi'r gwahanol batrymau croen streipiog. (C,D) Lluniau lliw PAS o epidermis math gwyllt (C) a ctns−/− (D) 18-sebrafish mis oed. Mae'r pennau saethau du yn amlygu'r haen melanin. Mae'r ymyrraeth yn yr haen melanin yn bresennol mewn ctns -/ - (D) tra ei fod yn absennol mewn pysgod sebra gwyllt (C). Mae'r barrau graddfa yn cynrychioli 50 µ

2.3.2. Ctns−/− Sioe Pysgod Sebra Systiau Sbermatogenig Wedi'u Cyfoethogi mewn Sbermatosoa

Cystinosisyn effeithio ar swyddogaethau'r ceilliau, gan arwain at azoospermia ac anffrwythlondeb mewn cleifion gwrywaidd [14-16]. Mae tarddiad yr azoospermia yn dal yn aneglur, er bod sbermatogenesis wedi dangos ei fod yn gyfan ar lefel y ceilliau. Mewn cyferbyniad â chleifion gwrywaidd, mae menywod â cystinosis yn ffrwythlon [17]. Yn ein model pysgod sebra, mae ctns -/ - pysgod sebra yn ffrwythlon. Er mwyn ymchwilio i weld a yw treiglad ctns -/ - yn effeithio ar anatomeg y gaill, gwnaethom staenio PAS a chanfuom groniad cynyddol o sbermatosoa yn y systiau sbermatogenig mewn ctns - / - pysgod sebra

Ffigur 7. Systiau sbermatogenig wedi'u cyfoethogi mewn sbermatosoa mewn ctns−/- sebrafish. (A, B) Cynrychiolydd H&E wedi'u lliwio lluniau o gailliau o fath gwyllt (A) a ctns−/ - (B) 18-pysgodyn sebra mis oed. Mae staeniau glas tywyll a chrwn yn cynrychioli'r sbermatosoa a gronnwyd yn y codennau sbermatogenig (a ddangosir â'r sêr). Mae'r barrau graddfa yn cynrychioli 200 µm.

2.3.3. Ctns−/− Sioe Sebrafig Benywaidd Gostyngiad mewn Cynhyrchiad Wyau

Er mwyn ymchwilio i ymarferoldeb y system atgenhedlu, fe wnaethom fesur cynhyrchiant wyau a chanran yr wyau wedi'u ffrwythloni mewn math gwyllt a ctns−/- sebrafi. Canfuom fod ctns-/-benywod yn dangos cynhyrchiant wyau gostyngol (Ffigur 8A) a chanran is o wyau wedi'u ffrwythloni (Ffigur 8B) o gymharu â'r benywod gwyllt.

Ffigur 8. Cynhyrchu wyau a chanran yr wyau wedi'u ffrwythloni mewn pysgod gwyllt a ctns−/− pysgod sebra. (A) Mesurwyd cynhyrchiant wyau fel cyfanswm nifer yr wyau mewn math gwyllt a ctns−/− zebrafish 18-sebrafish mis oed. Mae'r gyfradd cynhyrchu wyau yn 1.941 yn uchel mewn pysgod sebra gwyllt o'i gymharu â ctns−/− pysgod sebra 18 mis oed (cymhareb cyfradd=1.941); 95 y cant CI (arffin is=1.165, arffin uwch=3.234); dadansoddiad atchweliad Poisson; p=0.011. (B) Mesurwyd canran yr wyau wedi'u ffrwythloni ar gyfanswm yr wyau. Mae tebygolrwydd yr wyau wedi'u ffrwythloni yn 3.504 yn uchel mewn pysgod sebra gwyllt o'i gymharu â ctns−/− 18-pysgodyn sebra mis oed (cymhareb ods=3.504); 95 y cant CI (arffin is=2.005, arffin uwch=6.124); Dadansoddiad atchweliad logistaidd; p < 0.001;="" ddim="" yn="" berthnasol:="">

2.3.4. Ctns−/− Lleihad mewn Gweithgaredd Locomotor Arddangosfa Pysgod Sebra

Ers canfod gwastraffu cyhyrau a gwendid yncystinosiscleifion, yn gyffredinol o'r ail ddegawd o fywyd [1,18], fe wnaethom werthuso gweithgaredd y locomotor yn ein model zebrafish. Fe wnaethom ddarganfod bod ctns -/ - pysgod sebra o'r ddau ryw yn dangos llai o weithgaredd locomotor o'i gymharu â pysgod sebra gwyllt, sy'n awgrymu swyddogaeth cyhyrau â nam (Ffigur 9). Fodd bynnag, ni ddatgelodd dadansoddiad histolegol o feinwe cyhyr ysgerbydol annormaleddau ymddangosiadol mewn ctns-/- pysgod sebra.