Microsgopeg Dargludiad Ion Sganio O Glomerwlws Dynol Byw

Am ragor o wybodaeth:ali.ma@wecistanche.com

Ruslan Bohovyk1,2|Mykhailo Fedoriuk1,2|Elena Isaeva1,2|Andrew Shevchuk3|Oleg Palygin1|Alexander Staruschenko 1,4

1Adran Ffisioleg, Coleg Meddygol Wisconsin, Milwaukee, SyM, UDA2Adran Membranoleg Gellog, Sefydliad Ffisioleg Bogomoletz, Kyiv, Wcráin3Adran Meddygaeth, Coleg Imperial Llundain, Llundain, Canolfan Feddygol UK4Clement J. Zablocki VA, Milwaukee, WI, UDA

GohebiaethAlexander Staruschenko a Ruslan Bohovyk, Adran Ffisioleg, Coleg Meddygol Wisconsin, 8701 Watertown Plank Road, Milwaukee, WI 53226, USA.Emails: staruschenko@mcw.edu; rbogovik@gmail.com

Gwybodaeth ariannu Adran Materion Cyn-filwyr, Rhif Grant/Dyfarniad: I01 BX004024; Sefydliad Cenedlaethol y Galon, yr Ysgyfaint a'r Gwaed, Rhif Grant/Dyfarniad: P01 HL116264 a R35 HL135749; Cymdeithas Ffisiolegol America, Rhif Grant/Dyfarniad: Gwobr Gwella Gyrfa Ymchwil; Sefydliad Cenedlaethol Diabetes a Treulio aArennauClefydau, Rhif Grant/Dyfarniad: DK126720

Haniaethol

Mae difrod podocyte yn nodwedd o glefydau glomerwlaidd, fel glomerwlosclerosis segmentol ffocal, sy'n gysylltiedig yn nodweddiadol ag albwminwria amlwg a dilyniant patholeg arennol. Mae annormaleddau a cholled strwythurol podocyt hefyd yn gysylltiedig ag afiechyd newid lleiaf posibl ac yn fwy cyffredinclefyd yr arennau diabetig. Yma, fe wnaethom gymhwyso'r dechneg sganio microsgopeg dargludiant ïon (SICM) am y tro cyntaf i asesu'r bod dynol newydd ei ynysuglomerwlwstopoleg. Mae SICM yn rhoi cyfle unigryw i werthusoglomerwlwspodocytes yn ogystal â segmentau strwythurol neffron eraill gyda chydraniad microsgopeg electron ond mewn samplau byw. Yma dangosir cymhwysiad y dull SICM yn y dynol bywglomerwlws, sy'n darparu prawf o egwyddor ar gyfer dadansoddiad deinamig yn y dyfodol o morffoleg bilen a pharamedrau swyddogaethol amrywiol mewn celloedd byw.

Cliciwch i cistanche sgîl-effeithiau a Cistanche ar gyfer clefyd yr arennau

1. RHAGARWEINIAD

Glomerulusyn cynrychioli tuft o gapilarïau sydd wedi'u lleoli yn rhan mynediad y neffron, lle mae gwaed yn cael ei hidlo'n ddetholus ar draws y rhwystr hidlo glomerwlaidd sy'n cynnwys celloedd endothelaidd, pilen islawr glomerwlaidd, a podocytes. Mae prosesau cynradd ac eilaidd podocytau cyfagos yn cydblethu, gan greu diaffram hollt sy'n gorchuddio capilarïau glomerwli yn dynn. Mae gan y diaffram hwn forffoleg gymhleth ac mae'n ffurfio'r rhwystr terfynol ar gyfer hidlo gwaed gan gyfrannu at ddetholusrwydd maint a chaniatáu athreiddedd i foleciwlau sy'n llai nag albwmin. Adroddwyd am ostyngiad yn nifer y podocytau ac elifiad prosesau traed mewn glomerwlosclerosis segmentol ffocal, afiechyd newid lleiaf posibl, a neffropathi diabetig.1-3Ar ben hynny, gall colled podocytes ac addasiadau o'u pensaernïaeth fod yn amlwg yn ystod camau cynnar iawnarenafiechydon a all fod yn sail/gwaethygu eu dilyniant. Mae delweddu cydraniad uchel o morffoleg celloedd yn dod yn arf hanfodol a defnyddiol ar gyfer astudio strwythurau cellog a'r rôl y maent yn ei chwarae mewn gweithrediad celloedd a dilyniant clefydau.4 Mae sganio microsgopeg electron (SEM) yn ddull a ddefnyddir yn eang ar gyfer cynnal astudiaethau o'r fath. Er hynny, mae angen gweithdrefnau cymhleth lluosog ar gyfer paratoi sampl, sy'n ei gwneud yn amhosibl dadansoddi sampl byw.5 Felly, mae angen hanfodol i ddatblygu offer newydd i astudio newidiadau i morffoleg podocyte mewn samplau byw. Mae Microsgopeg Dargludiad Ïon Sganio (SICM) yn dechneg sy'n galluogi delweddu arwynebau celloedd byw cydraniad uchel gyda morffoleg gymhleth.6-8Mantais fawr y dull hwn yw cydraniad gofodol sy'n agos at sawl nanometr a amrediad Z (fertigol) hir, y gellir ei gymhwyso i samplau byw â morffoleg astrus o dan amodau ffisiolegol berthnasol. Mae SICM yn dechneg ddelweddu amlfodd y gellir ei chyfuno â thechnegau sefydledig eraill, dadansoddiad cydamserol a deinamig o forffoleg bilen, a pharamedrau swyddogaethol amrywiol, megis cyfaint celloedd, potensial pilen, ceryntau sianel ïon sengl, a hyd yn oed dynameg cyfadeiladau protein pilen. mewn celloedd byw.9-11 Yma, rydym yn darparu enghraifft o gymhwyso SICM i ddadansoddi morffoleg dynol bywglomerwlwsstrwythur.

Symptomau clefyd Cistanche-arennau

2. DEUNYDDIAU A DULLIAU

Ar gyfer yr arbrawf, gwnaethom ddefnyddio rhan o'r ardal cortigol o'r trawsblaniad dynol a daflwydarenyn cael ei ddyrannu a'i storio mewn hydoddiant cadwraeth Wisconsin ac yna'r deoriad mewn hydoddiant halwynog ffisiolegol ocsigenedig (PSS).12 Cafodd glomerwli arennol eu hynysu gan ddefnyddio techneg vibrodissociation fel y disgrifiwyd yn flaenorol.13 Mae'r dull hwn yn caniatáu i glomerwli arennol sydd wedi'i gadw'n dda gael ei ynysu'n gyflym oddi wrth boblarennau. Perfformio delweddu SICM, dynol newydd ei ynysuglomerwlwswedi'u cysylltu ag arwyneb gwydr poly-L-lysin wedi'i osod yn y siambr gell wedi'i lenwi â hydoddiant PSS. Gosodwyd samplau â llaw yn y cyfarwyddiadau xy o dan ficrosgop optegol gwrthdro Nikon TE2000-U (Nikon Instruments). Ar gyfer y stiliwr hercian, defnyddiwyd nanopibedau gwydr borosilicate delweddu SICM gyda gwrthiant o tua 100 MΩ, sy'n cyfateb i ddiamedr blaen amcangyfrifedig tua 120 nm. Tynnwyd nanopibedau gyda'r peiriant tynnu fflamio llorweddol/math brown P-97 (Sutter Instruments, Novato, CA). Llenwyd y nanopibedau gyda'r un hydoddiant PSS a ddefnyddiwyd ar gyfer y bath ac fe'u gosodwyd yn y cyfeiriad z gydag actiwadydd piezoelectrig. Mesurwyd y cerrynt ïon sy'n llifo trwy'r nanopibedau gyda mwyhadur clamp clwt Axopatch 700B (Axon Instruments) mewn modd clamp-foltedd a'i fonitro gan y rheolydd cyffredinol wedi'i addasu'n arbennig (ICAPPIC Ltd, UK), a oedd yn rheoli lleoliad sampl a phibed ar yr un pryd. 6 Cynhaliwyd pob arbrawf ar dymheredd ystafell (20-22 gradd ). Ar gyfer delweddu strwythurau astrus cymhleth megis prosesau traed podocytes yn yglomerwlws, fe wnaethom ddefnyddio modd cam cefn / hopian SICM sydd fwyaf perthnasol ar gyfer delweddu topograffeg celloedd byw gyda chydraniad uchel.6,14 Mae cam sengl yr egwyddor hercian yn cynnwys digwyddiad pan fydd y cerrynt cyfeirio yn cael ei fesur trwy leoli'r nanopipet ymhell uwchlaw'r sampl. Yna, mae'r nanopipette yn nesáu ar hyd yr echelin z i'r wyneb sampl nes bod lefel y cerrynt a fesurir yn disgyn i'r pwynt gosod rhagosodedig sy'n cyfateb i ~ 1.0 y cant -1.2 y cant o'r cerrynt cyfeirio. Ar hyn o bryd, mae'r dull yn cael ei derfynu, mae cyfesurynnau XYZ yr actiwadyddion piezo XY a Z yn cael eu cofnodi fel cyfesurynnau arwyneb y sampl ar gyfer y pwynt delweddu cyntaf, ac mae'r pibed yn cael ei dynnu'n ôl o'r wyneb. Yna mae'r weithdrefn hon yn ailadrodd ar bob pwynt delweddu unigol ar hyd yr echelin xy a bennir gan ddatrysiad rhagosodedig ac ystod ardal sgan. Ar gyfer Ffigur 1B, yr ystod sgan a datrysiadau delwedd oedd 30 µm × 30 µm a 512 px × 512 px, ac ar gyfer Ffigur 1C oedd 5 µm × 5 µm a 480 px × 480 px, yn y drefn honno. Perfformiwyd data topograffi amrwd SICM ac ôl-brosesu delweddau gan ddefnyddio meddalwedd dadansoddi microsgopeg SICM ImageViewer (ICAPPIC Ltd, DU).

FFIGUR 1 Cymhwyso delweddu microsgopeg Dargludedd Ion Sganio. A, Dynol newydd ei hynysuglomerwlwsynghlwm wrth yr wyneb gwydr poly-Llysine. Ar y chwith mae microbipét yn agosáu at wyneb y glomerwlws i berfformio delweddu SICM. B, Enghraifft o gydrannau rhwystr hidlo glomerulus, gan gynnwys podocyte a phrosesau traed wedi'u gorchuddio â llongau, wedi'u delweddu gan SICM. 45 min ar gyfer cyfanswm sgan arwynebedd (30 × 30 µm, cydraniad 512 × 512 picsel; newidiadau echel z 15 µm). C, Golygfa estynedig ar bensaernïaeth prosesau troed eilaidd podocyt dynol a ddatgelir gan SICM cydraniad uchel. 12 munud ar gyfer cyfanswm y sgan arwynebedd (cydraniad 5 × 5 µm, cydraniad 480 × 480 picsel; newidiadau echel z 3 µm). Dangosir bariau graddfa

3. CANLYNIADAU A TRAFODAETH

Mae ansawdd delwedd SICM yn debyg i SEM ac yn caniatáu archwiliad manwl gywir oglomerwlwsstrwythur arwyneb, gan gynnwys pibellau gwaed a podocytes, a phensaernïaeth y prosesau traed eilaidd.4 Yn ein hastudiaeth flaenorol, defnyddiwyd delweddu SICM i amcangyfrif y newidiadau strwythurol patholegol ym mhrosesau traed podocyte mewn llygod mawr neffropathi diabetig math 2 (T2DN).15 Rydym cynnal dadansoddiad cymharol o bensaernïaeth tri dimensiwn y rhwystr hidlo podocyte mewn llygod mawr nad ydynt yn ddiabetig a T2DN. Datgelodd ein data golled sylweddol o brosesau traed podocyte mewn glomeruli T2DN gan ddarparu gwerthusiad cywir ar gyfer newidiadau histopatholegol a ddigwyddodd mewn neffropathi diabetig sy'n sail i neffrinwria ac albwminwria yn y llygod mawr hyn.15Yma, am y tro cyntaf, dangoswyd dull llwyddiannus o asesu'r tri. - strwythur wyneb dimensiwn glomerwlws dynol byw, wedi'i ynysu'n ffres. Mae glomerwli arennol dynol yn strwythurau sfferig gyda diamedr o tua 300 µm16; felly, rhaid i flaen y bibed nesáu'n ofalus at frig y rhanbarth o ddiddordeb. Mae gan ein gosodiad SICM ystod sganiwr echel 25 µm z a 30 × 30 µm echelin xy, a oedd yn caniatáu i ni gael delwedd cydraniad uchel o ran fawr yglomerwlwswyneb. Mae'r amser caffael yn dibynnu'n gryf ar yr ystod sgan, datrysiad, a maint blaen yr electrod hercian. Ar gyfer delweddu celloedd byw mewn strwythurau cymhleth fel glomerwlws ynysig yn ffres, mae'r amser sganio'n amrywio o 10 i 50 munud fesul ffrâm (gweler chwedl y Ffigur am ragor o fanylion). Gall effaith gronnus yr ardal sganio fawr, cydraniad uchel, ac amrywiadau stocastig mewn systemau byw arwain at arteffactau delweddu a gynrychiolir fel symudiadau llorweddol a fertigol rhwng cylchoedd ailosod pibed gobeithiol. Sylwch, mewn geometregau cymhleth gyda'r newidiadau sydyn yn y lleoliadau arwyneb, y gallai'r amser caffael ac arteffactau delweddu, fel picsel tywyll neu ddrwg, gynyddu. Mae delwedd topograffi SICM (Ffigur 1A) yn dangos capilarïau glomerwlaidd wedi'u gorchuddio gan brosesau troed podocyt cynradd ac eilaidd sy'n amlwg yn amlwg. Mae SICM yn caniatáu caffael delweddau sampl gyda gwahanol ystodau sgan yn y raddfa nanomedr, gan gadw lefel cydraniad digonol.17 Mae Ffigur 1B yn cynrychioli pensaernïaeth prosesau troed eilaidd podocyt dynol a ddatgelir gan SICM cydraniad uchel. Gellir defnyddio dadansoddiad pellach o ddelweddau topograffi o'r fath i astudio newidiadau morffolegol ym mhrosesau traed podocyte o dan amodau patholegol ac mewn ymateb i amrywiol gymwysiadau cyffuriau.

Cymhwyso'r dechneg SICM ar gyfer ymchwilio i strwythur arwyneb tri dimensiwn y samplau meinwe meddal, gan gynnwysglomerwlwsa chelloedd podocyt, i ddechrau gan Nakajima et al4. Defnyddiodd yr awduronarentafelli i gymharu'r dechneg hon â SEM confensiynol. Yma, fe wnaethom ymestyn yr astudiaethau hyn i glomerwlws dynol byw. Gan ddefnyddio'r dull hwn, rydym yn datgelu potensial mawr y dechneg SICM ar gyfer archwiliad cyflym a dibynadwy o'rglomerwlwsrhwystr hidlo. Un o fanteision mawr SICM (yn ogystal â defnyddio samplau byw) yw nad oes angen gweithdrefnau paratoi sampl lluosog sydd eu hangen yn nodweddiadol ar gyfer delweddu microsgopeg EM, gan gynnwys dadhydradu a hydoddiant sefydlogi. Felly, mae SICM yn caniatáu osgoi crebachu samplau a welwyd gydag EM, a allai arwain at ddimensiynau gwirioneddol camarweiniol. Yn bwysig, mae SICM amser real ar glomeruli sydd newydd ei ynysu hefyd yn caniatáu profi deinameg symudiad prosesau traed mewn ymateb i amlygiad acíwt i gyffuriau o ddiddordeb. Yn olaf, gellir defnyddio pibed SICM i berfformio recordiadau clamp clwt o gerrynt un sianel.18At y diben hwn, ar ôl ail-greu'r map topograffi, caniataodd y meddalwedd caffael (ICAPPIC Ltd, UK) ar gyfer brêc rheoledig o'r gwydr SICM stiliwr hercian ar wyneb y siambr, gan leihau ymwrthedd microelectrod i'r amodau clamp-clamp (7 i 12 MΩ) a'i wneud yn addas ar gyfer y recordiad un sianel yn yr un arbrawf. Mae'r SICM yn caniatáu dewis union leoliad yr electrod clamp clwt ar wyneb y gell yn seiliedig ar ddata topograffigol trwy ddull fertigol a reolir yn dda gyda thrachywiredd nanomedr, gan arwain at ffurfio gigaseal cyswllt yn hawdd â'r bilen cellog o'r enw Smart Patch.19

I grynhoi, mae gan y dull a ddisgrifir yma botensial ardderchog ar gyfer astudio glomeruli a segmentau neffron eraill sydd newydd eu hynysu. Ar ben hynny, mae'n dangos ei bod yn bosibl defnyddio dynolarensamplau heb baratoi manwl i werthuso newidiadau morffolegol yn yr astudiaeth o batholegau.

Cistanche ar gyfer clefyd yr arennau

DIOLCHIADAU

Ariannwyd ymchwil yn labordy'r awduron gan yr Adran Materion Cyn-filwyr I01 BX004024, Sefydliad Cenedlaethol y Galon, yr Ysgyfaint a'r Gwaed R35 HL135749 a P01 HL116264, Sefydliad Cenedlaethol Diabetes a Treulio aArennauClefydau R01 DK126720, a Gwobr Gwella Gyrfa Ymchwil Cymdeithas Ffisiolegol America.

GWRTHDARO DIDDORDEB

Mae Dr. Andrew Shevchuk yn gyfranddaliwr ac yn derbyn y ffioedd ymgynghori gan ICAPPIC Ltd. Ni ddatganodd pob awdur arall unrhyw fuddiannau cystadleuol

CYFRANIADAU AWDUR

Ruslan Bohovyk: Cysyniadoli (cyfartal); Curadu data (arwain); Dadansoddiad ffurfiol (arwain); Ysgrifennu-drafft gwreiddiol (cyfartal); Ysgrifennu-adolygu a golygu (cyfartal). Mykhailo Fedoriuk: Curadu data (cefnogi); Dadansoddiad ffurfiol (cefnogol); Ysgrifennu-adolygu a golygu (cyfartal). Elena Isaeva: Cysyniadoli (cefnogi); Curadu data (cefnogi); Dadansoddiad ffurfiol (cefnogol); Ysgrifennu-drafft gwreiddiol (cymorth); Ysgrifennu-adolygu a golygu (cyfartal). Andrew Shevchuk: Cysyniadoli (cefnogi); Meddalwedd (cynhaliol); Ysgrifennu drafft gwreiddiol (cefnogol); Ysgrifennu-adolygu a golygu (cyfartal). Oleg Palygin: Cysyniadoli (cyfartal); Dadansoddiad ffurfiol (cefnogol); Methodoleg (cefnogol); Gweinyddu'r prosiect (cefnogi); Ysgrifennu-drafft gwreiddiol (cymorth); Ysgrifennu-adolygu a golygu (cyfartal). Alexander Staruschenko: Cysyniadoli (arwain); Gweinyddu'r prosiect (arweinydd); Adnoddau (arweinydd); Goruchwyliaeth (arweinydd); Ysgrifennu-drafft gwreiddiol (cyfartal); Ysgrifennu-adolygu a golygu (cyfartal).

DATGANIAD ARGAELEDD DATA

Mae'r data sy'n cefnogi canfyddiadau'r astudiaeth hon ar gael gan yr awdur cyfatebol ar gais rhesymol.