SLC37A2, Moleciwlein sy'n Gysylltiedig â Ffosfforws yn Cynyddu Mewn Celloedd Cyhyrau Llyfn yn yr Aorma Calchedig

calcheiddiad fasgwlaiddyn ffynhonnell fawr oclefyd cardiofasgwlaiddmewn cleifion â chlefyd cronig yn yr arennau.Hyperffosffademiayn arwain at fwy o fewnlifiad ffosfforws mewngellol, sy'n arwain at gynnydd mewn celloedd tebyg i osteoblast yn y celloedd cyhyrau llyfn fasgwlaidd. Mae PiT-1 yn cludo ffosffad mewn celloedd cyhyrau llyfn fasgwlaidd. Fodd bynnag, nid yw mecanwaith calcheiddio fasgwlaidd yn cael ei ddeall yn llwyr. Ymchwiliodd yr astudiaeth hon i foleciwlau ymgeisiol cysylltiedig â ffosfforws heblaw PiT-1. Fe wnaethom ddamcaniaethu bod moleciwlau sy'n gysylltiedig â ffosfforws sy'n perthyn i'rhydoddyn-gludydd(SLC) byddai uwch-deulu yn cymryd rhan mewn calcheiddiad fasgwlaidd. O ganlyniad i ddadansoddiad micro-arae DNA, fe wnaethom ganolbwyntio ar SLC37A2 a dangos bod mynegiant mRNA o'r celloedd hyn yn cynyddu ar gelloedd cyhyrau llyfn aortig wedi'u calcheiddio (AoSMC). Adroddwyd bod SLC37A2 yn cludo cyfnewidiadau glwcos-6-ffosffad/ffosffad a ffosffad/ffosffad. Dangosodd dadansoddiad in vitro nad oedd llid ar AoSMC yn effeithio ar SLC37A2expression. Cynyddodd mynegiant mRNA SLC37A2 a phrotein mewn AoSMC wedi'i galcheiddio. Yn vivo, dangosodd dadansoddiad bod mynegiant mRNA SLC37A2 yn yr aorta oclefyd cronig yn yr arennauroedd llygod mawr yn cydberthyn â genynnau marciwr osteogenig. At hynny, mynegwyd SLC37A2 yn yr ardal calcheiddio fasgwlaidd ynllygod mawr clefyd cronig yn yr arennau. O ganlyniad, rydym yn dangos bod SLC37A2 yn un o'r moleciwlau sy'n cynyddu gydacalcheiddiad fasgwlaiddin vitro ac in vivo.

Geiriau Allweddol: SLC37A2,calcheiddiad fasgwlaidd, celloedd cyhyrau llyfn aortig,clefyd cronig yn yr arennau, hyperffosffademia

CLICIWCH YMA I GAEL DYFYNIAD O'R CYLCH ORGANIG NATURIOL GYDA 25% ECHINACOSIDE A 9% ACTEOSIDE AR ​​GYFER SWYDDOGAETH YR AREN

Gwasanaeth Cefnogol Wecistanche - Yr allforiwr cistanche mwyaf yn Tsieina:

E-bost:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Ffôn:+86 15292862950

Siop Am Fwy o Fanylion:

https://www.xjcistanche.com% 2fcistanche-siop

Fel y nifer o gleifion gydaclefyd cronig yn yr arennau(CKD) yn cynyddu, nifer y cleifionangen dialysisbydd yn cynyddu hefyd. Y rhan fwyaf o farwolaethau mewn cleifion sy'n dioddefdialysisyn ddyledus iafiechydon cardiofasgwlaiddfelmethiant y galon, anhwylderau serebro-fasgwlaidd, neu gnawdnychiant myocardaidd. (,2) Prif ffynhonnell oclefyd cardiofasgwlaiddyw calcheiddiad ectopig,() annormaledd a achosir gan ffurfio a dyddodiad crisialau calsiwm ffosffad mewn meinweoedd meddal. (4 6) Ffactorau amrywiol megis llid. straen ocsideiddiol, a chynnydd mewn lefelau calsiwm plasma (Ca) a ffosfforws (P) yn gysylltiedig â dilyniant calcheiddiad fasgwlaidd. Ymhlith y ffactorau hyn, mae hyperffosffademia yn cael ei gysylltu gryfaf â chalchiad fasgwlaidd. (7.8) Mae hyperffosffademia yn cael ei achosi gan gymeriant gormodol o P ym mhresenoldeb gweithrediad arennol gostyngol. Felly, mae angen i gleifion sy'n cael dialysis gyfyngu ar gymeriant P. (79-12) Fodd bynnag, adroddwyd bodcalcheiddiad fasgwlaiddeisoes yn symud ymlaen pan ddechreuir dialysis; fe'i gwelwyd hefyd mewn cleifion â CKD cyfnod cynnar pan nad yw hyperffosffademia yn amlwg. (3) O ganlyniad, mae'n bwysig atal calcheiddiad fasgwlaidd mewn cleifion â CKD cyfnod cynnar i wella prognosis bywyd.

sy'n arwain at fewnlifiad cynyddol o P i gelloedd cyhyrau llyfn fasgwlaidd (VSMC). Mae mewnlifiad P yn cael ei wneud trwy PiT-1, cludwr ar wyneb cellbilen VSMC. Mae PiT- yn aelod o'r superfamily cludwr hydoddyn (SLC), sy'n cynnwys cludwr sodiwm ffosffad wedi'i amgodio gan SLC20A1.04 PiT- yn cludo ffosffad ar draws cellbilenni Na-ddibynnol ac yn dilyn hynny mwyneiddiad matrics oherwydd lefelau p uwch.) Fel mewngellol. Mae lefelau P yn cynyddu, mae VSMC yn dechrau mynegi ffactorau trawsgrifio osteogenig, fel ffactor trawsgrifio cysylltiedig â rhediad 2 (Runx2)(16) Dilynir yr effaith hon gan fynegiant cynyddol o genynnau osteoblast-benodol, megis osteopontin ac osteocalcin. Yn ogystal, lleihau mynegiant proteinau llyfn cyhyrau-benodol. megis protein cyhyrau llyfn 22-0 (SM22-0), yn digwydd. O ganlyniad, mae VSMC yn cael ei drawsnewid yn gelloedd tebyg i osteoblast. (1718) Mae astudiaethau clinigol diweddar wedi dangos bod lefelau calsiwm yn y gwaed. mae gronynnau protein (CPP), sy'n cynrychioli gronynnau coloidal calsiwm ffosffad, yn cynyddu gyda swyddogaeth arennol yn lleihau. (19-21) Ymhellach, adroddwyd am gydberthynas â lefelau CPP a P gwaed.2o2i) Mae'n bosibl y gall y CpP ysgogi dilyniant calcheiddiad fasgwlaidd.22-24)

Fodd bynnag, arsylwyd calcheiddiad fasgwlaidd mewn cleifion â CKD cyfnod cynnar â lefelau P plasma arferol. (13) Yn ogystal.PiT-1 mRNA yn cael ei fynegi yn hollbresennol ym mhob meinwe. Felly gall moleciwl arall weithredu'n bennaf ym maes calcheiddiad fasgwlaidd. Mae adroddiadau bodllidyn hyrwyddo calcheiddiad fasgwlaidd. Ffactorau llidiol fel interleukin (IL)-1B, IL-6, a ffactor-alffa necrosis tiwmor (TNF-a) a achosir gan wahaniaethu VSMC i gelloedd tebyg i osteoblast(2s26) Mae TNF-a yn achosi calcheiddiad fasgwlaidd drwy'r llwybr cAMP, sy'n chwarae rhan mewn gwahaniaethu osteoblast.2728) Mae IL-6 yn rheoleiddio amrywiol lwybrau sy'n arwain at galcheiddio fasgwlaidd VSMC2-31) Ymhellach. Mae IllB, IL-6, a TNF-a hefyd yn ffactorau sy'n gysylltiedig â mwy o galcheiddiad fasgwlaidd a achosir gan lefelau p uchel.3233) Fodd bynnag. nid yw data cyfredol yn esbonio mecanwaith fasgwlaidd yn llawn

calcheiddiad a achosir gan y ffactorau hyn. Fe wnaethom ddamcaniaethu y gallai fod moleciwlau eraill sy'n gysylltiedig â P fel y rhai yn yr uwchdeulu SLC, yn ymwneud â chalcheiddio fasgwlaidd. Fe wnaethom ganolbwyntio ar broteinau pilen yn uwch-deulu SLC ac ymchwilio i foleciwlau posibl sy'n gysylltiedig â P heblaw PiT-1 ar gyfer cymryd rhan mewn calcheiddiad fasgwlaidd. At hynny, archwiliwyd y berthynas rhwng moleciwlau ymgeisydd a chalchiad fasgwlaidd mewn fideo ac in vivo.

Defnyddiau a Dulliau

Diwylliant celloedd. Cafwyd celloedd cyhyraumoothmooth dynol arferol (AoSMC) gan Lonza (Basel, y Swistir) Cafodd AoSMC ei feithrin yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Cynhaliwyd AoSMC mewn cyfrwng twf (cyfrwng gwaelodol celloedd cyhyrau llyfn wedi'i ategu â serwm buchol ffetws 5% (FBS), ffactor twf epidermaidd, inswlin, ffactor twf ffibroblast-B, a gentamicin / amphotericin-B). Roedd y cyfryngau'n cael eu newid bob yn ail ddiwrnod. Tyfwyd AoSMC mewn deorydd 5% CO llaith ar 37 gradd a'i gynnal nes cyrraedd cydlifiad ac yna ei ddefnyddio mewn arbrofion.

Calcified AoSMC.Calcification of AoSMC wedi'i gymell fel y disgrifiwyd yn flaenorol.435) Cafodd AOSMC eu meithrin yng nghyfrwng Eagle wedi'i addasu ag Dulbecco wedi'i ategu â 15% FBS a phenisilin-streptomycin a'u meithrin â 2.6 mM P am 3, 6, 9, 12 a 14 diwrnod. Addaswyd y crynodiad P gan y byffer P NaH, PO/Na, a HPO. pH 7.2). Nid oedd AoSMCs eraill wedi'u meithrin â 2.6 mM P.

Micro-arae DNA. Defnyddiwyd cyfanswm RNA samplau AoSMC wedi'u meithrin a heb eu meithrin â 2.6 mM P. Cyfanswm RNA 5.0 ug ei ddadansoddi gan ddefnyddio micro-arae DNA (Agilent Technologies, Tokyo. Japan). SurePrint G3 Dynol GE 8 x 60k ver. 2 Defnyddiwyd Microarray i archwilio tua 26,000 o enynnau. Cyfrifwyd y gymhareb trwy rannu lefel mynegiant AoSMC wedi'i feithrin â 2.6 mM am 12 diwrnod â lefel mynegiant AoSMC heb ei feithrin â 2.6 mM P

Micro-arae DNA

Defnyddiwyd cyfanswm RNA samplau AoSMC wedi'u meithrin a heb eu meithrin â 2.6 mM P. Cyfanswm RNA 5.0 ug ei ddadansoddi gan ddefnyddio micro-arae DNA (Agilent Technologies, Tokyo. Japan). SurePrint G3 Dynol GE 8 x 60k ver. 2 Defnyddiwyd Microarray i archwilio tua 26,000 o enynnau. Cyfrifwyd y gymhareb trwy rannu'r lefel mynegiant ar AoSMC diwylliedig â 2.6 mM am 12 diwrnod â'r lefel mynegiant ar AoSMC heb ei feithrin gyda 2.6 mM P.Expression o SLC37A2 mewn llid fasgwlaidd. Er mwyn ysgogi ymateb ymfflamychol yn AoSMC, cafodd celloedd eu meithrin â chyfrwng twf nes iddynt gyrraedd cydlifiad ac yna eu trin â lipopolysacaridau ugmL (LPS)(LPS) o escherichia coli O111:B4; Sigma, St. Louis, MO) ar gyfer 24 a 72 hebddynt. 2.6 mM P. Ni chafodd AoSMC eraill eu meithrin â dadansoddiad adwaith cadwyn polymeras (PCR) amser real. Tynnwyd cyfanswm RNA o AoSMC a gafodd ei drin ag LPS am 24 a 72 h a chelloedd heb eu trin ag LPS. Perfformiwyd PCR meintiol amser real gwyrdd SYBR gan ddefnyddio cDNA wedi'i syntheseiddio a set preimiwr priodol ar gyfer pob genyn targed gyda system PCR amser real aStepOnePlus (Applied Biosystems, FosterCity, CA). Roedd y dilyniannau preimio fel a ganlyn: IL dynol-6.5-AATTCGGTACATCCTCGACGG-3' a 5-GCCATCTTTGGAAGGTTCAGG-3'; dynol SLC37A2,5TCACTTTAGTGCCAAGGAGGC-3' a 5CCATTGGTGTAGTCAGAGACG-3'; glyseraldehyde-3-ffosffad dehydrogenase (GAPDH5'-CTGCACCAACTGCTTAGC- a 5-CTTCTGGGIGGCAGTGATGGC-3.IL-6 a SLC37A2 lefelau mynegiant mRNA eu cyfrifo ar ôl normaleiddio gyda GAPDH.Expression o SLCcified SLCcified. Echdynnwyd cyfanswm o AoSMC heb ei feithrin gyda chelloedd 2.6 mM P a AoSMC wedi'u meithrin gyda 2.6 mM P am 3, 6, 9, 12, a 14 diwrnod. Perfformiwyd PCR amser real gan ddefnyddio'r cDNA wedi'i syntheseiddio. a ganlyn: human Runx2, 5-TGAGCCGCTTCTCCAACCC-3', a 5-CTCTGGCTTTGGGAAGCCG{67}} Cyfrifwyd lefelau mynegiant mRNA Runx2 a SLC37A2 ar ôl normaleiddio gydag APPH.

Dadansoddiad blotio gorllewinol.

Casglwyd cyfanswm protein o samplau AoSMC a feithrinwyd o dan yr un amodau a ddefnyddir ar gyfer dadansoddiad PCR amser real. Cafodd y samplau hyn eu lysio gan ddefnyddio halwynog wedi'i glustogi Tris (pH 75) wedi'i ategu â 5% NP-40 a choctel atalydd proteas 1%. Mesurwyd y samplau crynodiad protein gan ddefnyddio Pecyn Assay Protein BCA (Thermo FisherScientific.Waltham, MA). ac addaswyd y crynodiad trwy blotio gorllewinol, gwahanwyd 10 ugs o brotein mewn gel polyacrylamid 10% gan ddefnyddio electrofforesis gel sodiwm dodecyl sylffad-polyacrylamid. Cafodd y bilen ei thrin â gwrthgorff SLC37A2 (Novus Biologicals, Centennial, CO) neu wrthgorff GAPDH (GeneTex, Irvine, CA) fel y prif wrthgyrff, wedi'i deor â gwrthgyrff cyfunedig Rabbit lgG Horseradish peroxidase (R&D Systems, Minneapolis, MN) fel y gwrthgorff eilaidd a delweddu gan ddefnyddio Amersham ECL Select (GE Healthcare. Buckinghamshire, Lloegr) a dadansoddwr delweddau goleuol (LAS-1000 a mwy, FUNIFILM, Tokyo, Japan). Cafodd y band ei feintioli gan ddefnyddio lmgel.

Arbrofol

Cymeradwywyd pob protocol astudio gan Bwyllgor Moeseg Prifysgol Hyogo, Ysgol Gwyddorau Dynol a'r Amgylchedd. Prynwyd llygod mawr Sprague-Dawley gwryw deuddeg wythnos oed gan Japan SLC (Shizuoka, Japan). Roedd llygod mawr yn cael eu cynnal ar gylchred 12-golau, 12-h tywyll (09:00-21:00) ac yn caniatáu mynediad am ddim i fwyd a dŵr pur iawn.

Mae'r dietau arbrofol yn cynnwys diet rheoli P (1.0% P, 0.6Ca, 20% protein), diet adenine (0.75% adenine) , 1.0% P, 0.6%Ca, 2.5% protein), diet P(LP) isel (0.2% P,0) .6% Ca, 10%protein), a diet P (HP) uchel (1.0% P, 0.6% Ca, 10% protein) yn seiliedig ar ddeiet AIN93-G (Dwyreiniol Burum, Tokyo, Japan) gyda casein fel y ffynhonnell protein.3637) Adroddwyd bod diet protein isel yn hyrwyddo calcheiddiad fasgwlaidd mewn llygod mawr gyda methiant arennol a achosir gan adenin, felly perfformiwyd cyfyngiad protein.3738)Cyn grwpio, roedd pob llygod mawr (n Cafodd=23) ddiet MF safonol (Burum Oriental) am wythnos i ymgynefino. Yn 13 wythnos oed, rhannwyd llygod mawr yn 2 grŵp: y grŵp rheoli (n=5) a'r grŵp CKD a achosir gan adenin (n=18). Derbyniodd y grŵp rheoli ddeiet rheoli P am 6 wythnos . Derbyniodd y grŵp CKD a achosir gan adenin y diet adenin am tua 3 wythnos ac yna fe'i rhannwyd ymhellach yn 2 is-grŵp: y grŵp CKD-LP (n=8) neu'r grŵp CKDHP (n=10). Derbyniodd llygod mawr y grŵp CKD-LP a grŵp CKD-HP y diet LP a diet HP am 3 wythnos, yn y drefn honno yn ystod y cyfnod arbrofol, cofnodwyd cymeriant bwyd bob dydd. Yn ystod y diet adenin, casglwyd samplau gwaed o wythïen y gynffon rhwng 10:00 AC a 11:{{{{00 AM unwaith yr wythnos tan yr ail wythnos, ac wedi hynny unwaith bob 2 ddiwrnod i fonitro lefelau plasma. Yn ystod y diet LP neu ddeiet HP, casglwyd samplau gwaed unwaith yr wythnos. Casglwyd samplau wrin a chofnodwyd cyfaint wrin unwaith yr wythnos. Cafodd llygod mawr eu haberthu ag anesthetig gan ddefnyddio isoflurane (Wako Pure Chemical Industries. Osaka Japan) a laparotomies. Casglwyd samplau gwaed a gymerwyd o'r fena cava israddol a thoracoabdominal aorta i'w dadansoddi.

Mynegiant SLC37A2 ar yr aorta.

Defnyddiwyd tua thraean o'r aorta thoracoabdom a gasglwyd i ddelweddu calcheiddiad a chynnal gwrthimiwnedd. Cafodd yr aorta ei fewnosod mewn paraffin a thorrwyd adrannau 4-um. Cafodd rhannau eu staenio gan ddefnyddio Dull Von Kossa ar gyfer Pecyn Calsiwm (Polysciences. Warrington, PA) yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. cynhaliwyd dadansoddiad immunostaining gydag adrannau cyfresol. Deorwyd yr adrannau â gwrthgorff SLC37A2 dros nos am 4 gradd ac yna eu trin â Histofine Simple Stain Rat MAX-POMULTI) (Biowyddorau Nichirei, Tokyo, Japan) am 30 munud ar dymheredd ystafell. Wedi hynny, cafodd adrannau eu trin â phecyn swbstrad DAB (Nichirei).

Tynnwyd cyfanswm RNA o weddill yr aorta thoracoabdominaidd wedi'i rewi. Perfformiwyd PCR amser real gan ddefnyddio'r cDNA wedi'i syntheseiddio. Roedd y dilyniannau preimio fel a ganlyn: osteo-pontin llygod mawr, 5ACCCATCTCAGAAGCAGAATC-3' a 5ATCCATGGTCATGGCTTTC-3' a; llygoden fawr SLC37A2,5-TAGTCCCAGCTTCGAGTACGG-3' a 5'-CTGATGGGCTTTCTGGACATG{12}}.Cafodd lefelau mynegiant mRNA osteopontin a SLC37A2 eu cyfrifo ar ôl normaleiddio gyda GAPDH

Dadansoddiad ystadegol.

Cyflwynir data fel y cymedr + SE. Dadansoddwyd y gwahaniaethau rhwng grwpiau gan ddefnyddio'r prawf-t. Mewn arbrofion AoSMC calchedig a achosir gan ffosffad, dadansoddwyd gwahaniaethau gan ddefnyddio dadansoddiad un ffordd o amrywiant a ddilynwyd gan ddull Dunnett. Yn yr arbrofion model CKD, dadansoddwyd gwahaniaethau gan ddefnyddio prawf K ruskal-Wallis a ddilynwyd gan y dull Steel-Dwass. Penderfynwyd ar gyfernodau cydberthynas (rs) gan ddefnyddio prawf rheng cyfernod cydberthynas Spearman. Ar gyfer pob prawf. gwerthoedd p dwy gynffon<0.05 were considered statistically significant.