Bach Ond Cryf - Ecsosomau, Negeswyr Rhynggellog Newydd mewn Niwroddirywiad Rhan 1

Crynodeb Syml:

Nanoronynnau biolegol yw ecsosomau a adnabuwyd yn ddiweddar fel negeswyr rhynggellog. Maent yn cynnwys llwyth o lipidau, proteinau, ac RNA. Gallant drosglwyddo eu cynnwys nid yn unig i gelloedd yn y cyffiniau ond hefyd i gelloedd o bell.

Offeryn cyfathrebu rhynggellog sydd newydd ei ddarganfod yw ecsosomau a all ryddhau fesiglau bach a thyner i gelloedd cyfagos, gan ddosbarthu rhai proteinau, sylweddau signalau, a sylweddau eraill i gelloedd cyfagos. Gall y sylweddau hyn helpu celloedd i newid eu cyflwr a hyd yn oed effeithio ar dwf, datblygiad, metaboledd, ac agweddau eraill ar gelloedd eraill. Yn ystod y blynyddoedd diwethaf, mae astudiaethau wedi dangos bod exosomau yn chwarae rhan bwysig yn swyddogaeth yr ymennydd dynol, yn enwedig wrth gynnal a gwella'r cof.

Yn gyntaf, gall exosomes hyrwyddo trosglwyddo signal rhwng niwronau. Mae trosglwyddo gwybodaeth rhwng niwronau yn un o'r amodau angenrheidiol ar gyfer gweithrediad arferol y system nerfol, ac mae exosomes yn chwarae rôl negeswyr, a all wneud trosglwyddo gwybodaeth rhwng niwronau yn llyfnach, a thrwy hynny wella gwybyddiaeth a chof yr ymennydd.

Yn ail, gall ecsosomau hefyd reoleiddio metaboledd niwronau. Yn y broses o niwronau yn cynhyrchu ac yn rhyddhau exosomes, mae nifer fawr o brosesau metabolig yn cymryd rhan, sy'n hyrwyddo cydbwysedd a rheoleiddio metaboledd celloedd. Gall y prosesau hyn nid yn unig wella gallu niwronau ond hefyd helpu i gael gwared ar wastraff metabolaidd a moleciwlau niweidiol a chadw celloedd yr ymennydd yn iach.

Yn olaf, gall ecsosomau hefyd helpu niwronau i atgyweirio difrod. Mae llawer o broteinau ac asidau niwclëig a gludir gan exosomes yn fuddiol i dwf celloedd, atgyweirio ac adfywio, a gallant hyrwyddo atgyweirio ac adfywio niwronau, a thrwy hynny wella gallu goroesi celloedd yr ymennydd a chryfhau canolfannau cof a galluoedd gwybyddol.

I grynhoi, mae perthynas agos rhwng exosomau a chof. Gallwn newid cof plant trwy ddechrau gyda diet. Gall arwain strwythur dietegol plant yn weithredol a bwyta mwy o fwydydd sy'n llawn cynhwysion buddiol fel asidau brasterog, proteinau a fitaminau hyrwyddo cynhyrchu a rhyddhau exosomau, a thrwy hynny helpu plant i wella eu dysgu a'u galluoedd cof. Gall plant hefyd gael rhai gemau hyfforddi ymennydd ac ymarferion i herio ac ymarfer eu meddwl, ysgogi potensial ecsosomau, a chwarae rôl well. Gellir gweld bod angen i ni wella cof, a gall Cistanche wella cof yn sylweddol oherwydd bod Cistanche yn ddeunydd meddyginiaethol Tsieineaidd traddodiadol gyda llawer o effeithiau unigryw, ac un ohonynt yw gwella cof. Daw effeithiolrwydd Cistanche o'r gwahanol gynhwysion gweithredol y mae'n eu cynnwys, gan gynnwys asid tannig, polysacaridau, glycosidau flavonoid, ac ati. Gall y cynhwysion hyn hybu iechyd yr ymennydd mewn sawl ffordd.

Cliciwch Gwybod i wella cof tymor byr

Mae'r gallu unigryw hwn yn eu grymuso i fodiwleiddio ffisioleg celloedd derbyn. Yn yr ymennydd, mae ecsosomau yn chwarae rhan mewn clefydau niwroddirywiol fel clefyd Alzheimer, clefyd Parkinson, a sglerosis ochrol amyotroffig.

Crynodeb:

Mae ecsosomau o darddiad endosomaidd yn un dosbarth o fesiglau allgellog sy'n bwysig mewn cyfathrebu rhynggellog. Mae ecsosomau yn cael eu rhyddhau gan bob cell yn ein corff ac mae gan eu cargoconsing o lipidau, proteinau, ac asidau niwclëig ôl troed sy'n adlewyrchu eu tarddiad rhiant.

Mae gan y cargo ecsosomaidd y pŵer i fodiwleiddio ffisioleg y celloedd derbyn yng nghyffiniau'r celloedd neu'r celloedd sy'n rhyddhau o bell. Mae harneisio potensial ecsosomau yn dibynnu ar burdeb paratoi ecsosom.

Felly, mae llawer o ddulliau arwahanu wedi'u datblygu ac rydym yn darparu crynodeb cryno o sawl dull. Er gwaethaf y neilltuaeth a achosir gan y rhwystr gwaed-ymennydd, nid yw celloedd yn y CNS yn imiwn rhag dylanwadau ymwthiol ecsosomaidd. Ecsosomau niwronau ac gliarelease, yn aml mewn modd sy'n dibynnu ar weithgaredd.

Darperir disgrifiad byr o ecsosomau a ryddhawyd gan wahanol gelloedd yn yr ymennydd a'u rôl wrth gynnal homeostasis CNS. Dilysnod nifer o glefydau niwroddirywiol yw cronni agregau protein. Mae astudiaethau diweddar yn awgrymu rôl cyfathrebwr rhynggellog exosomau wrth ledaenu protein wedi'i gam-blygu gan ddweud ymlediad patholeg.

Yn yr adolygiad hwn, rydym yn trafod y cyfraniadau posibl a wneir gan ecsosomau yn natblygiad clefyd Alzheimer, clefyd Parkinson, a sglerosis ochrol amyotroffig.

Mae deall cyfraniadau a wneir gan ecsosomau at bathogenesis niwroddirywiad yn agor y maes ar gyfer defnyddio ecsosomau fel cyfryngau therapiwtig ar gyfer dosbarthu cyffuriau i'r ymennydd gan fod ecsosomau yn croesi'r rhwystr gwaed-ymennydd.

Geiriau allweddol: exosomes; niwronau; celloedd glial; system nerfol ganolog (CNS); clefydau niwroddirywiol; clefyd Alzheimer; clefyd Parkinson; sglerosis ochrol amyotroffig.

1. Rhagymadrodd a Safbwynt Hanesyddol

Mae cyfathrebu rhynggellog o ddiddordeb mawr ar gyfer datblygiad embryonig, adfywio / disodli epithelia, gametogenesis, a chynnal homeostasis.

Nodwyd nifer o fecanweithiau cyfathrebu cell-gell fel endocytosis / ecsocytosis a blebiau cytoplasmig ymwthiol gan ddefnyddio astudiaethau uwch-strwythurol a biocemegol [1-3]. Nodwyd chwaraewr arall, fesiglau allgellog, ond ni werthfawrogid eu rôl mewn cyfathrebu rhynggellog ar unwaith [4].

Darganfuwyd fesiglau allgellog yn serendipaidd yn ystod ymchwiliad i ryddhau ensymau plasma-gysylltiedig â philen, ecto-ATPase, ac ecto-50-niwcleotidase i gyfrwng meithriniad celloedd. Ym 1981, fe wnaeth gweithwyr Tramsand feithrin llinellau celloedd arferol a neoplastig o lygoden a tharddiad dynol mewn cyfrwng di-serwm oherwydd roedd yn hysbys bod gan serwm weithgaredd catalytig ATPase a50-nucleotidase.

Ar ôl cael gwared ar gelloedd arnofiol a malurion, cafodd y cyfrwng cyflyredig ei ganoli ar gyflymder o 310,000 × g am 90 munud mewn rotor Spinco Ti-70 a chafodd y pelenni eu harchwilio o dan y microsgop electron. Darganfuwyd dwy boblogaeth o fesiglau allgellog wedi'u hamgáu â philen, un â diamedr cyfartalog rhwng 500 a 1000 nm ac ail boblogaeth lai â diamedr o ~40 nm.

Roedd y fesiglau hyn, a ddisgrifiwyd i ddechrau fel "fesiglau exfoliated" gan awduron, yn cynnwys 50-50-gweithgaredd enzymatig niwcleotidase ac ATPase. Yn ogystal, roedd y fesiglau exfoliated yn cynnwys RNA a ffosffolipidau a oedd yn wahanol i'r celloedd rhiant a philen plasma rhiant, yn y drefn honno.

Roedd deori fesiglau wedi'u exfoliated o gelloedd C6 glioma â niwroblastomacells 32P-prelabeled yn ysgogi dad-ffosfforyleiddiad proteinau niwroblastoma gyda rhyddhau ffosfforws am ddim â radiolabelu (32P) ar yr un pryd.

Sefydlodd y data hyn nad oedd y fesiglau exfoliated yn gludwyr gwastraff cellog yn unig (ensymau) ond bod ganddynt swyddogaeth ffisiolegol. Bathodd Tram a chydweithwyr y term exosomau i ddisgrifio'r "fesiglau exfoliated" [5] (erthygl seereview gan [6] ar gyfer hanes fesiglau allgellog cyn 1981). Rai blynyddoedd yn ddiweddarach, astudiodd dau grŵp ymchwil yn annibynnol dynged y derbynnydd transferrin mewn microsgopeg electron reticulocytes [7-9].

Nid oes angen transferrin ar reticulocytes sy'n aeddfedu, felly maent yn derbynyddion transferrin. Sylwodd y ddau grŵp fod reticulocytes diwylliedig yn rhyddhau fesiglau bach o ~50 nm mewn diamedr i'r gofod allgellog.

Roedd y fesiglau bach hyn yn cynnwys derbynyddion trosglwyddo heb eu diraddio. Yn 1987, defnyddiodd Johnston a chydweithwyr y term exosomes i ddisgrifio fesiglau bach sy'n cynnwys derbynyddion transferrin [10]. Yn dilyn y blynyddoedd hyn, gwireddwyd potensial ecsosomau fel negeswyr rhynggellog newydd a all fodiwleiddio ffisioleg celloedd targed.

Yn ddiddorol, mae genesis ecsosomau yn cael ei gychwyn ag endocytosis (proses a nodwyd ym 1883; a adolygwyd gan [3]) mewn celloedd ac mae rhyddhau ecsosom i ofod mewngellol yn defnyddio'r broses ecsocytosis. Ers eu darganfyddiad cychwynnol, rydym bellach yn gwybod bod ecsosomau yn is-fath o fesiglau allgellog o darddiad endocytig gydag ystod maint o 40-160 nm mewn diamedr [11].

Dangosodd astudiaethau Tracer fod macromoleciwlau wedi'u endocytos mewn goresgyniadau neu byllau wedi'u gorchuddio â blew (hy wedi'u gorchuddio â chlathrin) ar wyneb y gell. Mae'r invaginations hyn yn y pen draw yn gwahanu oddi wrth y bilen plasma ac yn cael eu canfod yn y cytoplasm.

Ar ôl colli blew (hy, clathrin), mae fesiglau wedi'u gorchuddio â endocytos yn dod yn llyfn ac yn asio ag endosomau cynnar ar gyfer naill ai ailgylchu'n gyflym yn ôl i wyneb y gell (ailgylchu endosomau yn Ffigur 1) [12] neu undergomaturation i ffurfio endosomau hwyr.

Mae endosomau cynnar a hwyr yn gweithredu fel "canolfannau didoli" i gyfeirio eu cynnwys yn briodol: (i) ar gyfer cludiant yn ôl i'r rhwydwaith traws-Golgi (hy, adalw endosome-i-TGN) [13,14]; (ii) i lysosomau ar gyfer diraddio cynhyrchion macromoleculesto syml i'w hailddefnyddio o fewn y gell [15,16]; a/neu (iii) i'w hailgylchu i wyneb y gell trwy gyrff amlfeicwlaidd [17].

Yn ystod aeddfedu endosomau cynnar i mewn i endosomau, mae'r bilen endosom fewnol yn cael ei goresgyn, gan arwain at ffurfio fesiglau mewnluminal (sydd bellach wedi'u dynodi'n ecsosomau). Mae macromoleculessuch penodol fel proteinau cytosolig, asidau niwclëig, a lipidau yn cael eu didoli i mewn i ecsosomau sy'n datblygu.

Mae endosomau hwyr sy'n llawn ecsosomau yn cael eu nodi fel cyrff amlfeicwlaidd sy'n mudo tuag at y bilen plasma. Ar ôl ymasiad â'r bilen plasma, mae cyrff amlfeicwlaidd yn rhyddhau exosomau i'r gofod allgellog trwy'r broses ecsocytosis (Ffigur 1) [18,19]. Mae is-set fawr o broteinau sy'n cael eu recriwtio'n ddilyniannol yn chwarae rôl bendant yn y broses o endocytosis i endosomau cynnar, aeddfedu endosomes i lateendosomau, a'u tynged mewngellol dilynol (a adolygwyd gan [17,18,20]).

Amlygir pwysigrwydd y proteinau hyn gan eu colled a/neu dreiglad(au) sy'n achosi clefydau amrywiol. Er enghraifft, mae proteinau Strumpellin a SWIP yn rhan o'r cymhleth WASH sy'n cymryd rhan mewn polymerization actin, yn ogystal ag ymholltiad a didoli endosome. Mae mwtaniadau yn y genyn Strumpellin yn achosi paraplegia sbastig etifeddol, a nodweddir gan ddirywiad niwronau modur [21].

Mae treiglad un pwynt (Pro1019Arg) yn y protein SWIP yn ansefydlogi cymhlyg WASH. Mae'r cyfadeilad WASH ansefydlog yn atal masnachu mewn pobl endolysosomaidd, gan achosi clystyru o endosomau. Mae traffig endosomaidd diffygiol yn effeithio ar wybyddiaeth a gweithrediad niwronau motor, gyda symptomau'n cael eu disgrifio fel arafwch meddwl ansyndromig [22,23].

Yn y cytoplasm, mae ecsosomau yn tarddu o endosomau gan ddefnyddio'r cymhlethion didoli endosomaidd sydd eu hangen ar gyfer cludiant (ESCRT), a elwir hefyd yn fecanwaith biogenesis ecsosomaidd sy'n ddibynnol ar ESCRT (a adolygwyd gan [18,20]).

Adroddodd dau grŵp yn annibynnol biogenesis cyfryngol hylifol o ecsosomau, mecanwaith sy'n annibynnol ar ESCRT. Dau lipid a nodwyd yn yr astudiaethau hyn oedd bis (monoacylglycero) ffosffad / asid phatidic lysobisphos (BMP / LBPA) a ceramid [29,30].

Mae Rab31 yn fecanwaith annibynnol arall ar ESCRT ar gyfer biogenesis ecsosomaidd yn y cytoplasm. Mae actifadu Rab31 yn ysgogi ffurfio fesiglau intraluminal [31]. Mae yna fecanwaith arall nad yw'n cael ei drafod na'i archwilio'n ddigonol ar hyn o bryd.

Mae'r mecanwaith hwn yn seiliedig ar arsylwadau uwch-strwythurol a wnaed rhwng diwedd y 1950au a'r 1970au a ddangosodd y gall cnewyllyn celloedd fod yn safle tarddiad cyrff aml-fesigl sy'n llawn fesiglau bach. Efallai bod y fesiglau bach a ddisgrifiwyd yn yr astudiaethau hyn yn ecsosomau ond ni fathwyd y term exosome bryd hynny. Gwelodd Kilarski a Jasinski broses a elwir yn blebio niwclear neu allwthiadau niwclear yng nghelloedd pledren nofio pysgod y draenog, Perca fluviatilis L. (Ffigur 2a) [24] gyda chynnwys tebyg i niwcleolarkaryoplasm [32].

Nododd yr awduron hyn y gall gwaedu niwclear gael ei ysgogi trwy dynnu nwy o bledren nofio pysgod clwydo [24]. Mae'n ymddangos bod rhinwedd i'r broses o ganu niwclear fel man cychwyn esosomau wedi'u cyfoethogi ag asidau niwclëig a/oriboniwcleoprotein.

Llenwyd blebiau niwclear â fesiglau bach a ddeilliodd o blygiadau sengl o bilen fewnol y blebiau niwclear (Ffigur 2b), proses debyg i ffurfio fesiglau mewnluminal mewn endosomau. Blebs niwclear wedi'u llenwi â 'fesiglau bach' yn y pen draw wedi'u gwahanu oddi wrth niwclysau i ddod yn rhan o'r cytoplasm (Ffigur 2c).

Cyfeiriodd Kilarski a Jasinski at blebs niwclear fel cyrff amlfeicwlaidd yn eu llawysgrif oherwydd diffyg terminoleg well. Yn anfwriadol, gallai'r awduron hyn fod wedi bod yn iawn gan fod astudiaethau dilynol wedi adrodd am bresenoldeb cyrff amlfeicwlaidd mewn cnewyllyn o gelloedd [33]. Mae gan y bleibau niwclear sydd wedi'u llenwi â fesiglau bach forffoleg sy'n debyg i gyrff amlfesgellog sy'n tarddu o endosomau yn y cytoplasm (Ffigurau 1 a 2).

Oherwydd tebygrwydd cyrff amlfeicwlaidd niwclear â niwcleocapsid firaol, canolbwyntiodd ymchwilwyr eu sylw ar firoleg a ffenomen caniadu niwclear ac ni chafodd ei swyddogaeth gellog ei harchwilio'n llawn [34].

Waeth beth fo'r modd biogenesis, mae ecsosomau yn cynnwys haen ddeuol alipid ac yn cynnwys cynnwys macromoleciwlaidd sy'n cynnwys lipidau, proteinau, a niwcleicasidau.

Mae rhai o'r macromoleciwlau yn gyffredin i ecsosomau sy'n tarddu o bob cell a chânt eu dosbarthu fel marcwyr ecsosomaidd ac fe'u defnyddir fel arf cadarnhau i wahaniaethu rhwng ecsosomau a fesiglau allgellog eraill. Mae macromoleciwlau unigryw sy'n bresennol mewn exosomesoftyn adlewyrchu eu tarddiad rhiant ac felly maent yn debygol o gael eu dynodi fel biofarcwr(s).

Mae pob cell yn rhyddhau ecsosomau i'r gofod allgellog. O'r gofod allgellog, mae ecsosomau yn dod o hyd i'w ffordd i mewn i hylifau biolegol amrywiol ac yn cyrraedd celloedd yn lleol ac o bell. Mae celloedd sydd wedi'u meithrin mewn vitro yn rhyddhau eu hesosomau i gyfryngau diwylliant. Mae rhyddhau ecsosomau yn barhaus i'r gofod allgellog yn gwneud diwylliant yn gyfrwng hylifol a biolegol yn ffynhonnell gyfoethog ar gyfer ynysu ecsosomau.

Mae exosomau yn cynnwys swm sylweddol o RNAS codio a di-godio, darnau DNA genomig dwy haen, a DNA mitocondriaidd. Tramiau a chydweithwyr oedd y rhai cyntaf i ddisgrifio presenoldeb RNA mewn "fesiglau wedi'u exfoliated", cymysgedd o ecsosomau a microfesiglau.

Fe wnaethon nhw benderfynu bod "fesiglau neu exosomau exfoliated" yn cynnwys 5% RNA [5]. Valadi a chydweithwyr oedd y cyntaf i ddadansoddi inexosomau wedi'u pecynnu RNAs yn systematig. Roedd yr RNAS exosomal yn cynnwys mRNAs y gellir eu cyfieithu a microRNAs (miRs) [35].

Dosbarth o RNAS nad yw'n godio (ncRNAs) yw microRNAs. Maent yn ~22 niwcleotidau o hyd ac yn rheoleiddio mynegiant genynnau ar y lefel ôl-drawsysgrifol trwy rwymo i 30-drerionsau heb eu cyfieithu o'u RNAS negeseuol targed [36]. Yn ddiddorol, nid yw rhai miRNAs sydd wedi'u cyfoethogi mewn ecsosomau yn cael eu canfod yn y rhiant-gelloedd sy'n awgrymu system ddidoli / pecynnu RNA ddetholus yn ystod biogenesis esosomau [35,37].

Yn wahanol i gelloedd, ychydig iawn o RNA ribosomaidd, os o gwbl, sydd mewn ecsosomau ond maent yn cynnwys darnau tRNA [38]. Mae didoli RNA yn ecsosomau yn dibynnu ar (1) protein cysylltiedig â chymhlethdod tawelu a achosir gan RNA (RISC), (2) dilyniannau RNA a phroteinau tywys, (3) ychwanegiadau niwcleotid ar 30 pen y miRNAs, (4) argaeledd cellog miRNAs, a (5) ceramid [39,40].

Credwn fod blebbing niwclear yn broses gellog arall sy'n caniatáu didoli RNA, cyfadeiladau protein RNA, a DNA genomig yn esosomau mewn ffordd wahaniaethol. Mae nifer o resymau dros y safbwynt hwn: (1) roedd cynnwys 'fesiglau mewnluminal' yn debyg i garyoplasm niwcleol [32]. 'fesiglau' mewn cyrff niwclearmultivesicular (MVB II) eu cyfoethogi â RNA, proteinau asidig a sylfaenol, andhence awduron yn ystyried ' fesiglau intraluminal' fel safle synthesis RNA yn ychwanegol tonucleolus [41].

Proteins present in the vesicles may have been RNA-binding proteins and Dicer1 that were detected in exosomes [42] (unpublished data, Kumari Lab, Kansas State University, Manhattan, KS, USA). (2) Considering the nucleus as a site of exosome biogenesis can explain the presence of RNAs including precursor miRNAs (unpublished data, Kumari Lab) and double-stranded genomic DNA fragments ranging from 100 bp to >ecsosomau 10 kbin [43–47].

Gyda llaw, dim ond mewn exosomes sy'n deillio o linellau celloedd canser ac nid celloedd normal [47] y canfuwyd DNA genomig. Mae gan gelloedd canser cromatin annormal o ganlyniad i aildrefnu/trawsleoli cromatin ac efallai ploidy [48] a all achosi darnio genomigDNA mewn niwclysau celloedd canser. Mae'n hawdd ymgorffori'r darnau DNA hyn i MVB math II (ac ecsosomau) sy'n datblygu yn y niwclysau. (3) Mae'r modd o 'fesigl bach'biogenesis mewn blebiau niwclear a ddisgrifiwyd gan Kilarski a Jasinski [24] yn debyg i ffurfiant fesiglau mewnluminal mewn endosomau hwyr yn y cytoplasm.

Credwn yn gryf fod presenoldeb DNA genomig mewn ecsosomau yn patholegol ac felly gellir defnyddio ei bresenoldeb mewn ecsosomau fel offeryn diagnostig ar gyfer datblygu celloedd annormal (neu ganser) yn y corff. (4) Mae'r cynnydd sy'n ddibynnol ar weithgaredd yn nifer yr ecsosomau a ryddhawyd gan gelloedd [49] yn debyg i gelloedd nwy a ddangosodd fwy o waedu niwclear wrth dynnu nwy o bledren nofio pysgod clwydo [24].

Yn fwy diweddar, canfuwyd proteinau mitocondriaidd a DNA yn esosomau plasma rhai cleifion canser, ac mae eu presenoldeb yn gysylltiedig ag ymosodol canser [50,51].

Gwelir dadansoddiad mitocondriaidd yn aml mewn celloedd dirywiol [52,53]. Gall cristae mitocondriaidd sy'n cael ei ryddhau o'r mitocondria sy'n dirywio gael ei fewnoli gan gyrff amlfeicwlaidd ac yn y pen draw cânt eu pecynnu inexosomau.

Cefnogir y syniad hwn gan ddelweddau uwch-strwythurol o gelloedd lymffoblastoid dynol a lwmen acini'r brostad babŵn a oedd â 'microfesiclau' (neu ecsosomau) yn deillio o ddadansoddiad cristae mitocondria [54].

Ar sail y drafodaeth uchod a’r dystiolaeth arbrofol gefnogol, cynigiwn fod natur heterogenaidd ecsosomau yn tarddu o fiogenesis cyrff amlfeicwlaidd ac allosomau cysylltiedig mewn gwahanol leoliadau isgellog ac nid yn gyfan gwbl yn y cytoplasm yn unol â’n cred bresennol. Gall ein cynnig esbonio heterogeneity exosomes yn ogystal â diffyg cyfatebiaeth rhwng cyfrifiadau damcaniaethol a data arbrofol ar nifer y RNAs bach neu foleciwlau protein sydd wedi'u cynnwys o fewn un exosome wedi'i buro o serwm [55].

Yn seiliedig ar gyfrifiadau damcaniaethol gan ddefnyddio maint ecsosom cyfartalog, rhagwelodd Li a chydweithwyr y byddai pob ecsosom yn cynnwys tua 70–25,000 moleciwlau RNA neu brotein bach.

Fodd bynnag, dangosodd eu data arbrofol bresenoldeb un moleciwl RNA fesul serwm puredig ecsosom [55]. Mae ein damcaniaeth yn gofyn am archwiliad pellach o blebbing niwclear, cyrff niwclearaml-siclaidd, a biogenesis o exosomau RNA/riboniwcleoprotein-cynnwys cyrff amlfeicwlaidd innuclear.Mae lipidau yn rhan bwysig o bilenni ecsosomaidd ac yn cael eu dosbarthu'n anghymesur rhwng y ddwy daflen bilen ecsosomaidd. Mae cyfansoddiad lipid yn wahanol rhwng y rhiant-gellbilen a'r bilen exosome.

Yn gyffredinol, lipidau sydd wedi'u cyfoethogi mewn ecsosomembranau yw micro-barthau rafftio lipidau sffingomyelin, ceramid, colesterol a cholesterol-gyfoethog, ganglioside GM3, lipidau annirlawn, a phosphatidylserine [56-58]. Mae proteinau exosomaidd yn cynnwys y rhai sy'n gyffredin i'r rhan fwyaf o ecsomomau yn ogystal â phroteinau unigryw i riant-gell benodol.

Mae cynnwys protein yr holl ecsosomau yn cael ei gyfoethogi'n gyffredinol ar gyfer targedu ac ymasiad proteinau fel tetraspaninau, integrinau, chaperoneproteinau, e.e., proteinau sioc gwres (Hsp60, Hsp70, a Hsp90), y proteinau masnachu pilenni HSP bach, proteinau Rab, GTPasau ARF, atodiadau, a proteinau sy'n ymwneud â ffurfio cyrff amlfeicwlaidd fel ALIX a TSG101 [59].

Mae astudiaethau mwy diweddar yn awgrymu presenoldeb proteinau sy'n rhwymo RNA sy'n ffurfio cymhlygion protein RNA mewn exosomau [38]. Mae nifer o brosesau cellog sy'n sicrhau bod proteinau'n cael eu llwytho i fyny i exosomes(1) yn fecanweithiau ESCRT ar gyfer proteinau gyda rhai addasiadau ôl-gyfieithu penodol megis ubiquitination, methylation arginine wedi'i ysgogi gan Wnt, ocsidiad, ffosfforyleiddiad, glycosyleiddiad, a citrullination; (2) awtophagi wedi'i gyfryngu gan warchodwr (CMA) sy'n dibynnu ar y rhyngweithio rhwng protein 71 kDa cytras sioc gwres (HSC70) a phroteinau â KFERQmotif.

Ar ôl rhwymo HSC70 i broteinau â motiff KFERQ, mae proteinau'n cael eu targedu at gyrff amlfeicwlaidd. Mae awtoffagi a chyfryngir gan warchodwr fel arfer yn gweithredu ar gyfer diraddio proteinau mewn lysosomau. Mae data mwy diweddar yn awgrymu bod CMA yn chwarae rhan mewn rhyddhau ecsosomaidd a lledaenu agregau protein mewn rhai clefydau niwroddirywiol [60-63].

Bu cynnydd esbonyddol mewn ymchwil ecsosomaidd ers y 1990au a chynhyrchwyd llawer o ddata ar gargo ecsosomaidd. Mae cronfeydd data wedi'u creu i ddarparu crynodeb o gargo ecsosomaidd cyn iddi fynd yn rhy anodd rheoli setiau data mawr.

Mae ailadroddadwyedd y data cyhoeddedig ar ecsosomau yn rheswm arall gan fod y rhan fwyaf o labordai yn defnyddio amrywiadau o wahanol ddulliau a ddatblygwyd i ynysu ecsosomau. Er enghraifft, mae Vesiclepediais yn grynodeb wedi'i guradu â llaw o gargo moleciwlaidd (lipid, RNA, a phrotein) a nodwyd mewn gwahanol ddosbarthiadau o fesiglau allgellog [64]. Mae Vesiclepedia yn adnodd gwerthfawr i ymchwilwyr.

Mae'r gronfa ddata Vesiclepedia ar gael i'r cyhoedd ac mae'n galluogi defnyddwyr i ymholi a lawrlwytho data cargo exosome yn seiliedig ar feini prawf chwilio a gofnodwyd gan ddefnyddwyr. Mae EV pedia, Exocarta, ExoRbase, ac EV miRNA yn gronfeydd data ychwanegol sy'n catalogio proteinau exosomal ac RNA [64].

Mae'r cronfeydd data yn cael eu gyrru gan anodiadau cymunedol. Mae'r data sydd wedi'i guradu yn y cronfeydd data hyn yn cael ei sicrhau trwy ynysu ecsosomau gan ddefnyddio amrywiaeth o wahanol dechnegau gwahanu nad ydynt wedi'u cynnwys yn y gronfa ddata.

Gall cynnwys cargo ecsosomaidd felly amrywio yn seiliedig ar y dull ynysu a ddefnyddir, gan arwain at rywfaint o amwysedd yn y canlyniadau a adroddir. Er mwyn gwella atgynhyrchu a thryloywder arbrofol, datblygwyd set offer EV-TRACK cronfa wybodaeth ffynhonnell agored. Mae EV-TRACK yn cwmpasu paratoi ecsosom dataon a nodweddu exosome [65].

Nodwedd allweddol o EV-TRACKis EV-METRIC sy'n cyflwyno adrodd ar baramedrau arbrofol fel canran o gydrannau cyflawn o restr o naw [66]. Penderfynwyd ar y cydrannau hyn gan gonsortiwm EVTRACK a barnwyd eu bod yn angenrheidiol ar gyfer dehongli data ac atgynhyrchu data arbrofol yn ddiamwys. Felly, cynlluniwyd EV-METRIC i gynorthwyo ymchwilwyr ac adolygwyr i ddarparu trosolwg cynhwysfawr o'r data.

2. Dulliau Presennol ar gyfer Ynysu Ecsosomaidd

Mae ecsosomau yn adnodd cyfoethog ar gyfer darganfod biofarcwyr ac ar gyfer strategaethau therapiwtig newydd gan gynnwys meddygaeth adfywiol. Yr hyn sy'n hollbwysig i lwyddiant y nodau hyn yw ynysu ecsosomau pur drwy ddull atgynhyrchu.

Mae ynysu ecsosomau swyddogaethol gymwys yn arbennig o hanfodol ar gyfer cymwysiadau therapiwtig posibl. Mae ecsosomau wedi'u puro o hylifau biolegol amrywiol fel gwaed, plasma, hylif serebro-sbinol, poer, wrin, a llaeth. Mae gan bob hylif biolegol wahanol nodweddion ffisegol a chemegol y mae angen eu hystyried cyn ynysu ecsosomaidd.

Mewn rhai achosion, efallai y bydd angen rhagofalon penodol ar gyfer ynysu ecsosomaidd. Penderfynydd arall sy'n dylanwadu ar y dull o ynysu ecsosom yw cymhwyso exosomau wedi'u puro yn y pen draw.

Hyd yn hyn, mae dulliau ynysu sawl ecsosom wedi'u datblygu ac mae rhai ohonynt yn seiliedig ar nodweddion ecsosomaidd megis eu maint, dwysedd, gwefr arwyneb, a phroteinau sy'n gysylltiedig â'r arwyneb exosome (Ffigur 3) [67].

Rhestrir rhai o'r dulliau ynysu exosome a ddefnyddir ar hyn o bryd yn Nhabl 1. Nid yw'r rhan fwyaf ohonynt yn ddulliau annibynnol ac mae angen camau prosesu ôl-sampl ymlaen llaw arnynt. Mae dulliau amlwg yn cael eu trafod yn fyr isod.

Ffigur 3. Dulliau a ddefnyddir yn gyffredin ar gyfer ynysu ecsosomaidd a'u cymwysiadau i lawr yr afon. Mae nifer o ddulliau a ddatblygwyd hyd yma ar gyfer ynysu ecsosomaidd yn seiliedig ar eu dwysedd bywiog, Cynllun 1, 13, a 1.19 g/mL, mireiniwyd y dull allgyrchu (UC) ymhellach i ynysu paratoadau pur o ecsosomau yn seiliedig ar eu dwysedd bywiog trwy orswcros uwch-ganlifiad isopycnig neu raddiant dwysedd ïodicsanol (DG).

Er mwyn cael gwared â chynnwys protein uchel mewn proteinwria, cyfunwyd y dull ultracentrifugation â chromatograffaeth eithrio maint (SEC). Arweiniodd cyfyngiadau amser sy'n gysylltiedig â'r dull ultracentrifugation at ddatblygiad y dull hidlo (UF).

Roedd pasio samplau gwanedig fel cyfrwng meithrin ac wrin trwy grynhoydd nano neu ficro-bilen yn caniatáu puro ecsosomaidd. Gwnaeth clocsio pilenni ac adferiad protein ecsosomaidd gwael y dull hwn yn amhoblogaidd ar gyfer cymwysiadau i lawr yr afon fel ynysu RNA a chymwysiadau trwybwn uchel.

Datblygodd dull arall i ynysu ecsosomau o ddialysis hidlo hydrostatig hylifsis biolegol gwan iawn (HFD *) ar y cyd â centrifugation. Yn y dull HFD, mae'r sampl yn cael ei dialyzed trwy bilen dialysis gyda thoriad o bwysau moleciwlaidd 1000 kDa o dan bwysau hydrostatig, gan ganiatáu i macromoleciwlau diangen gael eu tynnu o'r sampl ac mae ecsosomau yn cael eu hadennill trwy allgyrchu.

Datblygwyd y dull dyddodiad ecsosomaidd yn seiliedig ar hydoddedd neu wasgaredd a chydgrynhoi i brosesu sawl sampl ar yr un pryd. Mae pecynnau masnachol ar gyfer puro ecsosom yn seiliedig ar y strategaeth hon.

Yn y dull hwn, cymysgir orascites wrin â polyethylen glycol (PEG) 6000 neu mewn cyfuniad â phrotamin (ynghyd â PEG35,000) a'u deor naill ai dros nos neu 1 awr ar rew.

Mae cymysgedd tyrbid T canlyniadol yn cael ei allgyrchu i adfer ecsosomau a ddefnyddir ar gyfer dadansoddiadau RNA a phrotein i lawr yr afon. Adweithyddion eraill a ddefnyddir ar gyfer dyddodiad ecsosomau yw (1) 0.1M sodiwm asetad pH 4.75 (dull halltu) (NaAc), (2) a4-cyfaint plyg o aseton oer (−20 ◦C) ( Dyodiad Toddyddion Organig Protein a'i dalfyrru asPROSPR), (3) a chymysgedd o PEG a hydoddiant dextran (hyd at 1.5%) (dull dau gam sy'n caniatáu gwahanu proteinau oddi wrth ecsosomau).

Arweiniodd adnabod proteinau arwyneb ecsosomaidd at ddatblygu dulliau dal imiwnaffinedd gan ddefnyddio gwrthgyrff i broteinau arwyneb ecsosomaidd megis Tim4, anecsin, EpCAM, protein arwyneb ecsosomaidd cyffredin, CD63, a phroteinau sioc gwres (rhyngweithiad affinedd). Manteisiwyd ar affinedd lectin (sy'n clymu glycoproteinau ar wyneb ecsosomau) andheparin (sy'n clymu i broteoglycanau sylffad heparan ar wyneb ecsosom) i ddulliau ynysu ecsosomaidd.

Defnyddiwyd sawl platfform fel gleiniau magnetig, micro-awgrymiadau silica monolithig hydraidd iawn, arwyneb platiau plastig, hidlwyr seliwlos, hidlwyr affinedd pilen, agarosesorbent, a dyfeisiau microhylifol ar gyfer dulliau puro ecsosom seiliedig ar affinedd ac mae ganddynt rinweddau gwahanol i'w defnyddio mewn diagnostig, prognostig, fel systemau dosbarthu cyffuriau, a chanfod a dadansoddi cargo forexosomal.

Addaswyd gyda chaniatâd Konoshenko MY, Lekchnov EA, Vlassov AV, Laktionov PP. Ynysu fesiglau allgellog: Methodolegau cyffredinol a'r tueddiadau diweddaraf.Biomed Res Int. 2018 Ionawr 30; 2018: 8545347. doi: 10.1155/2018/8545347. PMID: 29662902; PMCID:PMC5831698; Hawlfraint © 2022 Maria Yu. Mae Konoshenko et al.

Mae hon yn erthygl mynediad agored a ddosberthir o dan y Creative Commons Attribution License, sy'n caniatáu defnydd anghyfyngedig, dosbarthu ac atgynhyrchu mewn unrhyw gyfrwng, ar yr amod bod y gwaith gwreiddiol yn cael ei ddyfynnu'n gywir [67].

For more information:1950477648nn@gmail.com