Mae Stx2 yn Ysgogi Mynegiant Genynnau Gwahaniaethol Ac Yn Tarfu ar Genynnau Rhythm Circadian yn y Tiwbwl Procsimol

Crynodeb: Escherichia coli sy'n cynhyrchu tocsin Shiga(STEC) yn achosi namau tiwbaidd procsimol yn yr aren. Fodd bynnag, nid yw ffactorau a newidiwyd gan docsin Shiga (Stx) o fewn y tiwbynau cyfagos wedi'u dangos eto. Fe wnaethom bennu derbynnydd Stx Gb3 mewn arennau murine a dynol a chadarnhau mynegiant y derbynnydd yn y tiwbiau cyfagos. Stx2-chwistrellu meinweoedd arennau llygoden aRoedd Stx2-yn trin celloedd epithelial tiwbaidd procsimol arennol cynradd dynol(RPTEC) a pherfformiwyd dadansoddiad micro-arae. Fe wnaethom gymharu araeau murine ac araeau RPTEC a dewiswyd genynnau 58 cyffredin sy'n cael eu mynegi'n wahaniaethol yn erbyn rheolaeth (0 h, dim tocsin-drin). Canfuom mai'r genyn a fynegwyd fwyaf oedd GDF15, a allai fod yn gysylltiedig â cholli pwysau a achosir gan Stx. Dangosodd genynnau sy'n gysylltiedig â gweithgareddau Stx2 a adroddwyd yn flaenorol fel src kinase Ie llwybr ffosfforyleiddiad actifadu ymateb protein heb ei blygu (UPR) ac ymateb straen ribotocsig (RSR) fynegiadau gwahaniaethol. Ar ben hynny, mynegwyd genynnau cloc circadian yn wahanol, gan awgrymu aflonyddwch rhythm circadian arennol a achosir gan Stx. Roedd cludwr tiwbaidd procsimol Na+ - a reoleiddir gan rythm circadian SGLT1 (SLC5A1) wedi'i is-reoleiddio, gan ddangos dirywiad swyddogaethol tiwbaidd agos, a datblygodd llygod glwcoswria yn cadarnhau camweithrediad tiwbaidd agos. Mae Stx2 yn newid mynegiant genynnau mewn tiwbiau murineaidd a phrocsimol dynol trwy weithgareddau hysbys ac aflonyddwch rhythm circadaidd sydd newydd ei ymchwilio, a all arwain at gamweithrediad tiwbaidd agos.

Geiriau allweddol:tocsin Shiga math 2 (Stx2);tiwbyn procsimol arennol; llygoden; cell epithelial tiwbaidd procsimol arennol dynol (RPTEC); micro-arae; rhythm circadian

Cyfraniad Allweddol:Dadansoddwyd genynnau a fynegwyd yn wahanol o Stx2-arennau llygoden wedi'u trin a chelloedd tiwbaidd procsimol sylfaenol dynol. Yn ogystal â genynnau yr effeithiwyd arnynt yn flaenorol gan Stx, dangoswyd bod genynnau sy'n gysylltiedig â rhythm circadaidd yn newid eu mynegiant ac roedd ganddynt ddylanwad yn y ffwythiant tiwbaidd procsimol.

1. Rhagymadrodd

Escherichia coli sy'n cynhyrchu tocsin ShigaMae haint (STEC) yn achosi symptomau difrifol syndrom uremig hemolytig (HUS), a ddiffinnir gan y triawd o fethiant arennol acíwt, thrombocytopenia, ac anemia hemolytig [1]. Credir bod tocsinau Shiga (Stxs) yn chwarae rhan fawr wrth niweidio celloedd yn y clefyd heintus hwn. Mae histopatholeg arennol nodweddiadol HUS yn cynnwys iawndal glomerwlaidd a thiwbaidd megis dyddodiad ffibrin capilari o fewn glomeruli a necrosis tiwbaidd, yn y drefn honno [1,2]. Mae camweithrediad cynharach yn digwydd yn y tiwbiau procsimol o gleifion sydd wedi'u heintio â STEC wedi'i adrodd trwy ddadansoddi wrin. Mae'r tiwbaidd procsimol swyddogaethol marcwyr wrinolN-acetyl glucosaminidase(NAG) a 2 microglobwlin (2MG) o wrin cam acíwt o gleifion HUS cysylltiedig STEC O{157- neu O{{{}}yn cynyddu'n fawr, gan awgrymu camweithrediad tiwbaidd procsimol cynnar [3].

Mae Stxs, gan gynnwys Stx2, yn cynnwys un is-uned A a phum is-uned B (tocsin A1B5), lle mae is-uned A yn meddu ar weithgaredd ensymatig sy'n puro adenine 4324 o rRNA 28S o is-uned ribosom y 60S, tra bod angen is-unedau B i rwymo celloedd cynnal trwy globotriaosylceramide. (Gb3). Mae nifer o ddylanwadau hysbys y mae Stxs yn eu rhoi ar y celloedd. (I) Trwy rwymo i'w dderbynnydd Gb3, mae'r tocsin yn ennyn trawsgludiad signal trwy Src-teulu kinase Ydy [4,5]. Ar ôl rhwymo'r derbynnydd, mae Stxs yn mewnoli i'r gell trwy endocytosis ac yn cael eu cludo'n ôl i'r ER. Mae Stxs yn mynd trwy'r endosome a'r offer Golgi lle mae'r is-uned A yn cael ei hollti rhwng darnau catalytig A1 a therfynell A2 gan furin [6], er bod darnau A1 ac A2 yn dal i fod yn gysylltiedig â bond desylffid. Mae tocsin yn cyrraedd yr ER a gellir lleihau'r bond disulfide; yna, mae darn A1 o holotoxin yn cael ei ryddhau [7,8]. Dyma pryd mae dylanwad gan (II) straen ER yn digwydd gyda darnau tocsin dynwared protein heb eu plygu, sy'n achosi ymateb protein heb ei blygu (UPR). Mae is-uned A a B yn gallu rhwymo Bip, sy'n arwydd o achosi straen ER [9,10]. Mae'r darn A1 holltog yn cael ei drawsleoli i'r cytoplasm ac yn diberfeddu adenin o 28S rRNA i (III) atal synthesis protein. Mae'r addasiad y mae Stxs yn ei achosi i 28S rRNA yn cymell (IV) ymateb straen ribotocsig (RSR), sy'n actifadu rhaeadru signalau i lawr yr afon [11]. Mae'n hysbys bod dylanwadau (II) a/neu (IV) yn achosi trawsgrifiad genynnau penodol (V) sy'n arwain at secretiad cytocin [12]. Hefyd, mae (II) a (IV) yn ymwneud ag (VI) apoptosis a achosir gan Stxs [13-15].

Mae arbrofion in vitro gan ddefnyddio tiwbiau procsimol dynol a modelau llygoden in vivo yn cysylltu iawndal tiwbaidd procsimol â Stxs yn gryf. Mae diwylliannau cynradd a llinellau celloedd tiwbiau procsimol dynol yn agored iawn i Stxs ac yn arddangos rhyddhau cytocin a marwolaeth celloedd, gan gynnwys apoptosis [16-20]. Mae celloedd epithelial tiwbaidd procsimol arennol cynradd dynol (RPTECs) yn mynegi'r derbynnydd Gb3, yn agored iawn i docsinau Shiga, ac fe'u defnyddiwyd mewn llawer o erthyglau i ddadansoddi adweithiau biolegol megis ataliad synthesis protein, cynhyrchu cytocin ac anwythiad apoptosis [17,20] . Dangosodd llygod wedi'u chwistrellu â thocsin Shiga math 1 (Stx1) glucosuria, sy'n dangos bod y tiwbyn procsimol yn ail-amsugno glwcos yn is [21]. Mae'r rhain yn awgrymu gwenwyndra Stxs i'r tiwbynau cyfagos in vitro ac in vivo. Mewn modelau llygoden sydd wedi'u heintio â STEC, canfyddiadau aml mewn histopatholeg yw necrosis o gelloedd epithelial tiwbaidd a chelloedd sloughed o fewn lwmen y tiwbynau procsimol [22-24]. Mae llygod wedi'u chwistrellu gan Stx wedi'u puro (naill ai Stx1 neu Stx2) hefyd yn cyflwyno sloughing o'r tiwbiau procsimol gyda niwclysau cymharol gyfan [25-27].

Er bod iawndal i'r tiwbiau procsimol sy'n gysylltiedig â chwistrelliad Stx neu haint STEC wedi'u disgrifio'n swyddogaethol ac yn histolegol, nid yw targedau genynnau sy'n gysylltiedig â briwio tiwbiau cyfagos wedi'u dangos eto.

Yma, dadansoddwyd mynegiadau genynnau yn Stx2-arennau llygoden wedi'u chwistrellu a Stx2-diwylliant celloedd epithelial tiwbaidd procsimol arennol sylfaenol dynol (RPTEC) i ddangos newidiadau genynnau sy'n gysylltiedig â tiwbyn a achosir gan Stx2.

2. Canlyniadau

2.1. Stx2-Patholeg Arennau Llygoden wedi'i Chwistrellu

Er mwyn adnabod patholeg arennol murine cysylltiedig Stx, cafodd darnau meinwe arennol o lygod wedi'u chwistrellu Stx eu staenio â Periodic Acid-Schiff (PAS). Mae staen pinc cryf clir ar ochr luminal celloedd epithelial tiwbaidd yn dynodi glycocalyx ffin brwsh, sy'n nodweddiadol o'r celloedd tiwbaidd procsimol. Rydym yn pennu celloedd / niwclysau y tu allan i glycocalyx (o fewn y gofod luminal) fel rhai ar wahân i gelloedd cyfagos a philenni islawr (hy, celloedd sloughed). Yn Ffigur 1B (8 h post Stx2), C, a D (48 h post Stx2), mae celloedd sloughed gyda niwclysau cymharol gyfan yn cael eu dangos gyda saethau. Gwelsom hefyd falurion celloedd o fewn y lwmen tiwbaidd procsimol (penawdau Ffigur 1). Ar ôl gweinyddu Stx2, ymddangosodd y briwiau hyn yn eithaf clir, ond ar 0 h (Ffigur 1A, heb Stx2), roeddent yn ddibwys.

Ffigur 1. Stx2 sy'n peri i gelloedd tiwbaidd procsimol arafu yn yr aren murine. Dangosir staeniau asid cyfnodol Schiff (PAS) o stx2-toriadau murine arennau wedi'u chwistrellu. (A) 0 h (naïf), (B) 8 h, a (C) 48 h ar ôl pigiad Stx2. Mae saethau'n dangos bod celloedd tiwbaidd procsimol yn arafu. Mae pennau saethau yn dynodi malurion celloedd. Dangosir maes chwyddedig o fewn (C) yn (D) gyda chelloedd sloughing wedi'u pwyntio â saethau. Mae barrau yn (A–C) yn dynodi 50 µm. Mae'r bar graddfa yn (D) yn dynodi 10 µ

2.2. Gb3 Mynegiant mewn Llygoden a'r Arennau Dynol

2.2.1. Mynegiad Cortecs Arennol Llygoden Gb3

Gan fod y celloedd tiwbaidd procsimol yn dangos iawndal histolegol o sarhad Stx2, gwnaethom brofi mynegiant globotriaosylceramide (Gb3) derbynnydd Stx2 mewn cortecs arennau murine ynghyd â marciwr tiwbaidd procsimol aquaporin-1 (AQP1). Fel y dangosir yn Ffigur 2, dangosodd celloedd positif AQP Gb3 yn bennaf ar ochr luminal y celloedd (mae celloedd wedi'u marcio â phennau saethau caeedig, tra bod lumina wedi'i farcio â seren). Gwelsom hefyd fod staeniau tiwbaidd negyddol AQP1 Gb3 yn ôl pob tebyg yn casglu celloedd dwythell (pen saeth agored Ffigur 2) fel yr adroddwyd [28]. Roedd dwyster staen Gb3 yn gryfach yn y celloedd AQP1 (−), fodd bynnag, roedd nifer y math hwn o tiwbiau yn llai o gymharu â thiwbiau procsimol dwbl-positif Gb3/AQP1 yn y cortecs. Mae celloedd endothelaidd CD{31-positif yn Gb3 negatif yn aren y llygoden. Defnyddiwyd rheolydd gwrthgorff sy'n cyfateb i isotype ar gyfer Gb3 (llygoden fawr IgM) fel rheolydd negyddol. Ni ymatebodd Rat IgM â meinwe arennau'r llygoden (Ffigur S1)

2.2.2. Mynegiad Cortecs Arennol Dynol Gb3

Mewn meinwe arennol dynol, roedd Gb3 hefyd yn bositif mewn tiwbiau procsimol positif AQP (Ffigur 3, pennau saethau caeedig). Roedd lleoleiddio Gb3 o fewn y celloedd tiwbaidd procsimol yn gryfach ar yr ochr luminal. Gwelsom hefyd gelloedd AQP1(−) Gb3(+) (Ffigur 3, pennau saethau agored) fel y gwnaethom mewn meinwe murine. Mae celloedd endothelaidd dynol yn mynegi Gb3 (CD31/Gb3 dwbl positif, Ffigur 3, seren). Nid oedd adrannau rheoli isoteip ag IgM llygod mawr yn dangos adwaith cadarnhaol mewn meinwe arennol dynol (Ffigur S2).

2.3. Dadansoddiad Microarray

Gan fod celloedd epithelial tiwbaidd procsimol y llygoden a dynol yn bositif Gb3, mae'n awgrymu bod Stx2 yn effeithio'n uniongyrchol ar y math hwn o gell. Er mwyn canfod y genynnau yr effeithiwyd arnynt gan Stx mewn celloedd tiwbaidd murine a dynol procsimol, fe wnaethom dynnu cyfanswm RNA o arennau Stx2-llygod wedi'u chwistrellu a Stx2-trin RPTECs cynradd dynol a'u dadansoddi. mynegiant genynnau trwy ficro-arae

2.3.1. Genynnau a Fynegwyd yn Wahanol yn Arennau'r Llygoden a RPTEC

Dewiswyd genynnau a fynegwyd yn wahaniaethol (DEGs), sy'n gyffredin i arennau'r llygoden a RPTEC. Sail dewis DEGs cyffredin yw bod (1) genynnau gyda newid plygiad log2- (yn erbyn 0 h) mwy nag 1 neu lai na −1 yn aren y llygoden a micro-arae RPTEC o leiaf mewn un- pwynt amser a (2) dosbarthiad log2-plyg newid genyn yn ffitio cromliniau ciwbig yn hytrach na chromliniau cwadratig i ddarparu'n well ar gyfer brigau mynegiant genynnau yng nghanol cwrs amser yn y micro-arae arennau. Gyda'r ddau faen prawf uchod, fe wnaethom ddewis 58 o enynnau cyffredin rhwng aren llygoden a driniwyd gan Stx a RPTEC dynol (Ffigur 4A). Dangosir patrymau mynegiant y 58 genyn hyn yn aren y llygoden mewn map gwres (Ffigur 4B). Cafodd y rhan fwyaf o enynnau eu huwchreoleiddio yn ddiweddarach ar ôl pigiad Stx2; fodd bynnag, roedd gan rai genynnau batrymau mynegiant cynharach. Rhestrwyd genynnau a oedd â mwy nag 1 yn y log2-newid plyg ar gyfer pob pwynt amser (Tabl 1).

Ffigur 4. Dadansoddiad microarray. (A) Ymhlith y genynnau a ddadansoddwyd yn ôl microarray, canfuwyd bod gan 147 o enynnau (cylch gwyrdd), a 4013 o enynnau (cylch coch) o aren llygoden a driniwyd gan Stx a RPTEC, yn y drefn honno, log2- {4}}newid plyg yn llai na −1 neu fwy nag 1. Cyfanswm y genynnau a newidiwyd gan driniaeth Stx2 yn erbyn 0 h yn y ddau ficro-arae (genynnau a fynegir yn wahaniaethol yn gyffredin/DEGs) oedd 58 (ardal gorgyffwrdd coch a gwyrdd). (B) Dangosir map gwres y 58 genyn cyffredin yn llinell amser samplu aren y llygoden. Mae Z yn hafal i 0 yn dynodi cyfartaledd log2-gwerthoedd newid plyg genyn ac yn adlewyrchu tuedd mynegiant genynnau. Felly, mae lliw gwyrddlas yn cynrychioli gwerth is na chyfartaledd genyn penodol mewn rhes, tra bod lliw cochlyd yn cynrychioli newid uwch na'r cyfartaledd. Mae log{15}}plyg data o'r 58 genyn o'r set ddata 72 h wedi'i chwistrellu gan PBS o'i gymharu â 0 h yn cael ei gyflwyno fel Tabl S3 er gwybodaeth. (C) Dangosir graff bar cyfoethogi Metascape GO. Mae'r echel X yn dangos gwerthoedd −log10 p termau GO cyfoethog ar draws 58 DEG cyffredin bod nifer uwch o'r term GO cyfoethogi yn fwy tebygol o fod yn berthnasol i'r system. Dangosir yr 20 term GO cyfoethogi gorau. (D) Dangosir dadansoddiad llinynnol o 58 DEG cyffredin yn y chwe chlwstwr mwyaf cysylltiedig/cysylltiedig. Mae lliwiau sfferig yn dynodi genynnau sy'n perthyn i'r un clwstwr. Mae'r berthynas rhwng gweithredoedd rhwng genynnau yn cael eu dangos mewn modd lliw a siâp diwedd-god. Mae ENSG00000279576 bellach wedi'i godio fel ENSP00000485396, sy'n dynodi ID dynol genyn MALAT1.

I ddadansoddi ymarferoldeb DEGs cyffredin, defnyddiwyd y llwyfan Metascape. Mae'n aseinio termau Gene Ontology (GO), sy'n cynnwys swyddogaeth foleciwlaidd, cydran cellog, a phroses fiolegol, i enynnau dethol. Fe wnaethom adneuo'r 58 DEG cyffredin i Metascape a chael yr 20 termau GO uchaf y mae'r DEGs hyn yn perthyn iddynt (Ffigur 4C). Rhestrir termau GO gyda genynnau cyfatebol yn Nhabl S1. I weld rhestr genynnau o fewn pob term GO a ddangosir yn Ffigur 4C, cyfeiriwch at Dabl S2 Cyfoethogi metawedd. Gosodwyd termau GO sy'n gysylltiedig â marwolaeth celloedd, llid, a rhaeadrau signalau yn yr 20 uchaf yn ôl y disgwyl; fodd bynnag, tynnodd rhythm circadian sylw fel term GO nofel. Dangoswyd cysylltiadau hysbys genynnau cyffredin gyda dadansoddiad STRING (Ffigur 4D). Yn y dadansoddiad hwn, cafodd genynnau eu clystyru mewn chwe grŵp gwahanol y rhoddwyd cyfrif amdanynt gyda chysylltiad cryf o rwymo, dylanwadau (catalysis, actifadu neu ataliad), yn ogystal â chydfynegiant genynnau.

2.3.2. Tuedd Mynegiant Genynnau

Dangosir olion nifer o fynegiadau genynnau mewn graffiau ag echelin-x am yr amser (h) ar ôl pigiad Stx2 a'r echelin-y ar gyfer log2-plyg newid yn erbyn 0 h (Ffigur 5). Felly, mae gwerth echelin-y yn hafal i 1 yn golygu mynegiad 2-plyg newid yn erbyn 0 h.

Ffigur 5. Genynnau wedi'u mynegi'n wahaniaethol gyda llinell amser samplu llygoden. (A) Dangosir patrymau mynegiant mRNA PDK4 a CEBPB. (B) yn syth-gynnar genynnau. (C) Mynegiadau proteinau matrigellog CYR61 (CCN1) a CTGF (CCN2). (D) Dangosir genynnau sy'n gysylltiedig â UPR DDIT3 (CHOP, GADD153), partner rhwymo DDIT3 CEBPB, a ffactor adborth negyddol PPP1R15A (GADD34). (E) Dangosir ffactorau trawsgrifio DDIT3 (CHOP, GADD153) ac ATF3 a GDF15, sy'n cael eu rheoleiddio'n drawsgrifiadol gan y ffactorau hyn. (F) Dangosir genynnau sy'n gysylltiedig ag UPR- a RSR. (G) Mae EDN1 mewn perthynas â genynnau UPR yn cael eu plotio. (H) Dangosir brigau cynnar EDN1 ac EGR1 a'r uchafbwynt canlynol o PER1 gyda chynnydd graddol diweddarach ym mhob un o'r tri genyn. (I) Mae genynnau o glwstwr porffor Ffigur 4D yn enynnau sy'n gysylltiedig â rhythm circadian. (J) Dangosir genynnau craidd circadian PER1, Arntl (BAL1), Cry1, a Clock. (K) Dangosir genynnau arennol a reoleiddir gan gloc PER1 a circadian. (L) Dangosir genynnau llidiol gyda genynnau sy'n gysylltiedig â llwybr NF-kB. I weld pwyntiau data log2 unigol, cyfeiriwch at Ffigur Atodol S4. Cyflwynir Ffigur S5, sy'n dangos log2 cyfartalog gyda bariau gwyriad safonol, fel cyfeiriad.

Gwasanaeth Cefnogol Wecistanche - Yr allforiwr cistanche mwyaf yn Tsieina:

E-bost:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Ffôn:+86 15292862950

Siop Am Fwy o Fanylion:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

CAEL DYFYNIAD O'R CISTANCHE ORGANIG NATURIOL GYDA 25% ECHINACOSIDE A 9% ACTEOSIDE AR ​​GYFER Haint YR ARennau