Crynodebon
Ymchwilio i effeithiau ataliol synergaiddCistanche DeserticolaGlycosidau Phenylethanoid (PHGs) a glabridin (GLA) ar bigmentiad y croen, cafodd y gymhareb màs orau o PHGs i GLA ei sgrinio'n rhagarweiniol drwoddin vitrotyrosinase activity inhibition assays, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging, and 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS⁺) radical scavenging experiments. Cynhaliwyd gwerthusiadau pellach gan ddefnyddio tri model cellog:

Model melanogenesis B16F10 a ysgogwyd gan UVB i asesu ataliad synthesis melanin trwy weithgaredd tyrosinase a chynnwys melanin;

Model llidiol HACAT lipopolysacarid (LPS) i werthuso effeithiau gwrthlidiol trwy fesur interleukin -6 (il -6) a sail ffactor necrosis tiwmor- (tnf-);

Model AAPH (2,2'-azobis ({2- amidinopropane) model straen ocsideiddiol HACAT a achosir gan dihydrochloride i bennu gweithgaredd gwrthocsidiol trwy welliant superoxide dismutase (SOD) a catalase (CAT).

Nodwyd y gymhareb màs PHGs/GLA gorau posibl trwy'r modelau hyn. Dangosodd y canlyniadau fod datrysiadau PHGS/GLA (wedi'u paratoi mewn halwynog â ffosffad, PBS, pH 6.8) mewn cymarebau torfol o 1: 1, 5: 1, a 10: 1 yn arddangos ataliad tyrosinase sylweddol ac effeithiau gwrthocsidiol synergaidd. Cyfraddau atal tyrosinase oedd 94.37%, 92.93%, ac 88.06%, yn y drefn honno; Cyrhaeddodd cyfraddau scavenging radical DPPH 89.44%, 88.72%, ac 88.10%; Roedd cyfraddau scavenging ABTS⁺ yn 100.13%, 100.01%, a 99.87%. Ar 25 ug/ml yn DMEM, ni ddangosodd PHGS/GLA (1: 1, 5: 1, 10: 1) unrhyw cytotoxicity tuag at gelloedd B16F10 na HACAT. PHGS/GLA (1: 1) Datrysiad DMEM wedi'i arddangosataliad tyrosinase uwchraddol(23.80% o weithgaredd gweddilliol), yn sylweddolLlai o gynnwys melanin(30.90%), ac yn perfformio'n well na chymarebau a monotherapïau eraill wrth atal IL -6/TNF- Rhyddhau a gwella gweithgaredd SOD/CAT. Roedd y cyfuniad synergaidd o PHGs a GLA i bob pwrpas yn lliniaru S.hyperpigmentation perthnasau trwy atal melanogenesis, lleihau llid, agwella gallu gwrthocsidiol.

Geiriau allweddol
Cistanchehanialwch glycosidau phenylethanoid; Glabridin; effaith synergaidd; Gwrth-Melanogenesis; gwrthocsidydd; gwrthlidiol; deunyddiau crai fferyllol

 

 

 

Cistanchehanialwch echdynnu gydaLefel uchelglycosidau phenylethanoid ar gyfer gwynnu croen

Whatsapp ni am ragor o fanylion

 

Adran arbrofol

1.1 deunyddiau, adweithyddion ac offerynnau

Celloedd melanoma llygodenB16F10 (Catalog Rhif: STCC20013G -1), Wuhan ServiceBio Technology Co., Ltd.

Ceratinocytes anfarwol dynolHACAT (Catalog Rhif: Icell-H066), Icell Bioscience Inc., Shanghai, China.

Glycosidau ffenylethanoid cistanche (PHGs)aglabridin, Shaanxi Tianxingjian Biological Chemical Technology Co., Ltd.

Tyrosinase, Hefei Basf Biotechnology Co., Ltd.

Arbutin (ARB)aL-tyrosin, Aladdin Biocemical Technology Co, Ltd., Shanghai, China.

1, 1- diphenyl -2- picrylhydrazyl (dpph), Tokyo Chemical Industry Co., Japan.

2,2'-azino-bis (3- ethylbenzothiazoline -6- asid sulfonig) halen diammonium (ABTS), Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd.

Asid asgorbig (VC), Ffatri Adweithydd Cemegol Tianjin Damao.

Potasiwm Persulfateaethanol anhydrus, Tianjin Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd.

Sodiwm hydrocsid, Chengdu Huayi Pharmaceutical Excipient Manufacturing Co., Ltd.

Ffosffad dipotasum, Shanghai Sanpu Chemical Co., Ltd.

L-dopa, Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd.

Pecyn cyfrif celloedd -8 (cck8), Beijing Sinoinvitrogen Biotechnology Co., Ltd.

Triton x -100, sylffocsid dimethyl (DMSO), 2,2'-azobis (2- methylpropionamidine) dihydrochloride (aaph), aLipopolysacarid (LPS), Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.

Cyfrwng glwcos uchel dmem, Thermo Fisher Scientific (China).

Serwm buchol y ffetws (FBS), Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co., Ltd.

Datrysiad Penicillin-Streptomycin, Shanghai Dashier Bio-Technology Co., Ltd.

Cit il -6 elisa, cit tnf- elisa dynol, acit cath ddynol elisa, Wuhan Fine Biotech Co., Ltd.

Cyfanswm pecyn assay dismutase superoxide (SOD), Sefydliad Bio -beirianneg Nanjing Jiancheng. Roedd yr holl adweithyddion o radd ddadansoddol.

Offerynnau a ddefnyddir:

Darllenydd Microplate Tonfedd Llawn Multiskan FCaDeorydd Heracell 371 CO2, Thermo Fisher Scientific, UDA.

Kq -200 glanhawr ultrasonic vdb, Kunshan Ultrasonic Instruments Co., Ltd.

Dvkw-d -2 baddon dŵr thermostatig digidol, Ffatri Offeryn Meddygol Beijing Yongguangming.

DHG -9246 BLAST Thermostatig Trydan yn sychu popty, Shanghai Jinghong Experiment Equipment Co., Ltd.

KN4006B Offeryn Ymbelydredd Uwchfioled UVB(Dwysedd arbelydru: 8 MW/cm²), Xuzhou Kenuo Medical Instrument Equipment Co., Ltd.

1.2 Dulliau

Yn gyntaf, diddymwyd PHGs a GLA mewn naill ai halwynog â ffosffad (PBS, pH =6. 8) neu hydoddiant ethanol 50% i baratoi toddiannau gyda chrynodiadau màs o{{{0}}. 0 0 1, 0. {{{1 {0}} 05, 0.025, 0.1, 0.4, 0.8, 1.2, 1.6, a 2.0 G/L.. Yna, cymysgwyd PHGs a GLA mewn cymarebau oM (PHGS): M (GLA)=40: 1, 20: 1, 10: 1, 5: 1, 1: 1, 1: 5, 1:10, 1:20, ac 1:40, i baratoi toddiannau PHGS/GLA gyda chyfanswm crynodiad màs o0.4 g/L, wedi'i labelu felPHGS/GLA (40: 1) ~ PHGS/GLA (1:40), yn y drefn honno.

 

1.3 arbrofion biocemegol

1.3.1 Assay Gwahardd Gweithgaredd Tyrosinase

Mewn plât 96- wel,50 μl o ddatrysiad sampl y prawf, 50 μl o PBS (pH =6. 8), a50 μl o doddiant L-tyrosine (1 g/L)eu hychwanegu'n olynol. Deorwyd y plât mewn baddon dŵr 37 gradd am 10 munud. Yna,5 0 μl o doddiant tyrosinase (0.4 g/l, sy'n cyfateb i 200 U/mL)ychwanegwyd, a deorwyd y plât eto yn y baddon dŵr 37 gradd am 10 munud arall.

Arbutin (ARB)ei ddefnyddio fel y rheolaeth gadarnhaol, aPBS (pH =6. 8)ei ddefnyddio fel y rheolaeth wag.

Amsugnedd yr hydoddiant yn490 nmei fesur gan ddefnyddio darllenydd microplate, a chyfrifwyd y gyfradd atal tyrosinase in vitro (%) gan ddefnyddio hafaliad (1).

 

 

Yn y fformiwla:

A _ Adwaithyw amsugnedd yr hydoddiant sampl sy'n cynnwys toddiant L-tyrosine, PBS, a hydoddiant tyrosinase.

Rheolaeth adwaith _yw amsugnedd yr hydoddiant sampl sy'n cynnwys toddiant L-tyrosine a PBS heb doddiant tyrosinase.

A _ gwagyw amsugnedd yr hydoddiant sy'n cynnwys toddiant L-tyrosine, PBS, a hydoddiant tyrosinase heb y sampl.

A _ rheolaeth wagyw amsugnedd yr hydoddiant sy'n cynnwys toddiant l-tyrosine a PBS heb y sampl a hydoddiant tyrosinase.

1.3.2 Pennu Gweithgaredd Scavenging Radical Rhydd DPPH

Yn gyntaf, roedd {{0}}. 0197 g (0.05 mmol) o DPPH yn cael ei bwyso a'i ddiddymu'n gywir mewn 250 ml o ethanol anhydrus i baratoi toddiant gweithio DPPH gyda chrynodiad o0. 2 mmol/l.

Yna, diddymwyd PHGs a GLA mewn 50% ethanol i baratoi toddiannau ethanol o PHGs a GLA gyda chrynodiadau màs o{{{0}}. 0 0 1, 0. 0 1, 0.1, 0.4, 0.4, 0.8, 1.2, 1.6, a 2.0 g/l. Paratowyd toddiannau ethanol o VC yn yr un modd.

Yn dilyn hynny, cymysgwyd toddiannau ethanol PHGs a GLA mewn cymarebau oM (Datrysiad PHGS): M (Datrysiad GLA)=40: 1, 20: 1, 10: 1, 5: 1, 1: 1, 1: 5, 1:10, 1:20, 1:40I gael 9 datrysiad ethanol o PHGs/GLA gyda chymarebau màs gwahanol, wedi'u labelu felPHGS/GLA (40: 1) ~ PHGS/GLA (1:40).

Yn olaf,100 μl o bob datrysiad sampla100 μl o ddatrysiad gweithio DPPHeu hychwanegu at blât 96- da, wedi'i gymysgu'n gyfartal, a'i ddeor ar dymheredd yr ystafell yn y tywyllwch am 30 munud. Yr amsugnedd yn517 nmei fesur gan ddefnyddio darllenydd microplate. Defnyddiwyd VC fel y rheolaeth gadarnhaol, ac ailadroddwyd pob arbrawf dair gwaith.

Cyfrifwyd cyfradd scavenging radical rhydd DPPH (%) gan ddefnyddio hafaliad (2).

 

Yn y fformiwla:

A1yw amsugnedd yr hydoddiant sampl + datrysiad gweithio dpph.

A2yw amsugnedd datrysiad gweithio 50% ethanol + dpph.

A3yw amsugnedd yr hydoddiant sampl + 50% ethanol.

 

1.3.3 Pennu Gweithgaredd Scavenging Radical Rhydd ABTS⁺

Yn gyntaf,1 g (1.82 mmol) o ABTSei ddiddymu mewn dŵr wedi'i ddad -ddyneiddio i baratoi toddiant gweithio ABTS gyda chrynodiad terfynol o7.4 mmol/l. 0. 5 g o potasiwm persulfatetoddwyd mewn dŵr wedi'i ddad -ddyneiddio i baratoi toddiant gweithio persulfate potasiwm gyda chrynodiad terfynol o2.6 mmol/l. Cymysgwyd cyfeintiau cyfartal o doddiant gweithio ABTS a datrysiad gweithio persulfate potasiwm a chaniatawyd iddynt ymateb yn y tywyllwch am 12 awr i baratoi datrysiad gweithio ABTS⁺.

Yna, toddiannau ethanol o PHGs, GLA, a VC, yn ogystal â datrysiadau ethanol PHGS/GLA gyda chymarebau oPHGS/GLA (40: 1) ~ PHGS/GLA (1:40), eu paratoi yn unol â'r dull a ddisgrifir yn Adran 1.3.2.

Yn olaf,40 μl o bob toddiant sampla160 μl o ddatrysiad gweithio ABTS⁺eu hychwanegu at blât 96- yn dda, ei gymysgu'n gyfartal, ac ymateb yn y tywyllwch ar dymheredd yr ystafell am 6 munud. Amsugnedd yr hydoddiant yn734 nmei fesur gan ddefnyddio darllenydd microplate.

Cyfrifwyd cyfradd scavenging radical rhydd ABTS⁺ (%) gan ddefnyddio hafaliad (3).

 

 

Yn y fformiwla:

A1yw amsugnedd yr hydoddiant sampl + datrysiad gweithio ABTS⁺.

A2yw amsugnedd Datrysiad Dŵr Deionized + ABTS⁺.

A3yw amsugnedd y toddiant sampl + dŵr wedi'i ddad -ddyneiddio.

1.4 arbrofion celloedd

1.4.1 Diwylliant Cell

Ar ôl adfywio celloedd B16F10 a HACAT, cawsant eu hadu i gyfrwng glwcos uchel DMEM (yn cynnwys serwm buchol ffetws 10% ac hydoddiant 1% penisilin-streptomycin) a diwylliwyd yn37 gradd, 5% CO2, aLleithder 70%mewn deorydd am 24 awr. Gwelwyd statws twf celloedd o dan ficrosgop, a pherfformiwyd newidiadau neu basio canolig yn ôl yr angen yn seiliedig ar yr amod twf celloedd.

1.4.2 Grwpio Arbrofol

Cafodd celloedd logarithmig B16F10 a HACAT eu hadu i mewn i blatiau 96- ffynnon ar ddwysedd celloedd priodol a'u diwyllio am 24 awr i ganiatáu ymlyniad celloedd. Paratowyd toddiannau sampl gyda chrynodiadau gwahanol gan ddefnyddio cyfrwng DMEM.

Roedd y grwpiau arbrofol fel a ganlyn:

Grŵp arferol

Grŵp Model

Grŵp dos isel PHGS(125 ug/ml)

Grŵp dos canolig PHGS(250 ug/ml)

Grŵp dos uchel PHGS(500 ug/ml)

Grŵp dos isel GLA(6.25 ug/ml)

Grŵp dos canolig GLA(12.5 ug/ml)

Grŵp dos uchel GLA(25 ug/ml)

Grŵp PHGS/GLA (1: 1)(25 ug/ml)

Grŵp PHGS/GLA (5: 1)

Grŵp PHGS/GLA (10: 1)

Ar gyfer yModel pigmentiad a achosir gan UVB mewn celloedd B16F10, cafodd celloedd y grŵp enghreifftiol eu trin â30 μl o PBS (pH =7. 4)ac arbelydredig o dan offeryn ymbelydredd uwchfioled UVB yn3 cm o dan y ddyfaisdros110 eiliad. Roedd y grwpiau arbrofol yn cael eu pretreated gyda100 μl o wahanol atebion samplam 1 awr cyn ychwanegu30 μl o PBSac arbelydru o dan y ddyfais UVB am 110 eiliad. Roedd y grŵp arferol yn cael ei drin yn barhaus â chyfrwng DMEM glwcos uchel, ac nid oedd y grŵp gwag yn cynnwys celloedd ond yn ei le yr un faint o gyfrwng.

Ar gyfer yModel llid a achosir gan LPS mewn celloedd HACAT, cafodd y grŵp enghreifftiol ei drinDatrysiad PBS 20 ug/ml lpsam 24 awr. Roedd y grwpiau arbrofol yn cael eu pretreated gyda100 μl o wahanol atebion samplam 24 awr cyn ychwaneguDatrysiad 20 ug/ml lpsam 24 awr arall. Roedd y grŵp arferol yn cael ei drin yn barhaus â chyfrwng DMEM glwcos uchel, ac nid oedd y grŵp gwag yn cynnwys celloedd ond yn ei le yr un faint o gyfrwng.

Ar gyfer yModel straen ocsideiddiol a achosir gan AAPH mewn celloedd HACAT, cafodd y grŵp enghreifftiol ei drinDatrysiad 25 mmol/l aapham 24 awr. Roedd y grwpiau arbrofol yn cael eu pretreated gyda100 μl o wahanol atebion samplam 24 awr cyn ychwaneguDatrysiad 25 mmol/l aapham 24 awr arall. Roedd y grŵp arferol yn cael ei drin yn barhaus â chyfrwng DMEM glwcos uchel, ac nid oedd y grŵp gwag yn cynnwys celloedd ond yn ei le yr un faint o gyfrwng.

Sefydlwyd pob grŵp gyda3 Dyblygu Ffynhonnaua diwylliedig yn37 gradd, 5% CO2, aLleithder 70%mewn deorydd.

1.4.3 assay cytotoxicity

Mesurwyd y cytotoxicity gan ddefnyddio'rDull CCK8. Treuliwyd celloedd logarithmig B16F10 a HACAT gyda0. 25% trypsinam 3 munud. Ar ôl i dreuliad gael ei stopio gyda'r cyfrwng, cafodd y celloedd eu pibetio dro ar ôl tro i baratoi ataliad celloedd gyda dwysedd o1 × 10⁴ celloedd/ml. Cafodd y celloedd eu hadu'n gyfartal i mewn i blatiau 96- yn dda yn100 μl y ffynnon, ac ychwanegwyd PBS at y ffynhonnau ymylol. Ar ôl ymlyniad celloedd, ychwanegwyd crynodiadau gwahanol o doddiannau sampl, gyda3 Dyblygu ffynhonnau i bob grŵp, a diwylliwyd y celloedd yn37 gradd, 5% CO2, aLleithder 70%dros24, 48, a 72 awrcyn taflu'r cyfrwng.

Ar gyfer pob grŵp,100 μl o gyfrwng glwcos uchel CCK8 DMEM (sy'n cynnwys 10% CCK8)ychwanegwyd a deorwyd amdano60 munud. Amsugnedd yr hydoddiant yn450 nmei fesur gan ddefnyddio darllenydd microplate.

Cyfrifwyd hyfywedd celloedd (%) gan ddefnyddio hafaliad (4).

 

Yn y fformiwla:

A _ wedi'i drinyw amsugnedd y celloedd sy'n cynnwys ffynnon, toddiant CCK8, a'r toddiant sampl.

A _ gwagyw amsugnedd y toddiant cyfrwng a CCK8 sy'n cynnwys ffynnon ond heb gelloedd.

A0yw amsugnedd y celloedd sy'n cynnwys ffynnon a datrysiad CCK8 ond heb yr hydoddiant sampl.

1.4.4 Assay Gweithgaredd Tyrosinase

Defnyddiwyd y dull L-DOPA i fesur gweithgaredd tyrosinase. Ar ôl trin y celloedd ar gyfer48 awrFel y disgrifir yn Adran 1.4.2, cafodd yr uwchnatur ei daflu, a golchwyd y ffynhonnau ddwywaith gyda PBS (pH =7. 4). Yna,50 μl o 1% Triton X -100 Datrysiadychwanegwyd at bob ffynnon a'i roi ar unwaith mewn rhewgell –80 gradd ar gyfer30 munud. Cafodd y celloedd eu dadmer ar dymheredd yr ystafell i gymell lysis.

Ar ôl cyn-gynhesu yn37 gradddros5 munud, 10 μl o doddiant 10 mmol/l l-dopaychwanegwyd at bob ffynnon a'i ddeor yn37 gradd, 5% CO2, a lleithder 70%dros1 awr. Yr amsugnedd yn475 nmei fesur gan ddefnyddio darllenydd microplate. Ailadroddwyd pob arbrawfnheirgwaith, a chyfrifwyd y gweithgaredd tyrosinase (%) gan ddefnyddio hafaliad (5).

Yn y fformiwla:

A arbrawf _yw amsugnedd y celloedd sy'n cynnwys ffynnon a datrysiad sampl o dan arbelydru UVB.

A _ normalyw amsugnedd y celloedd sy'n cynnwys ffynnon a hydoddiant sampl heb arbelydru UVB.

A _ gwagyw amsugnedd y ffynnon sy'n cynnwys cyfrwng ond heb gelloedd.

 

1.4.5 Mesur Cynnwys Melanin

Defnyddiwyd dull Lysis NaOH i fesur cynnwys melanin. Ar ôl trin y celloedd ar gyfer72 awrFel y disgrifir yn Adran 1.4.2, cafodd yr uwchnatur ei daflu, a golchwyd y ffynhonnau ddwywaith gyda PBS.100 μl o doddiant dyfrllyd NaOH sy'n cynnwys 10% DMSO (1 mol/L)ychwanegwyd at bob ffynnon, a gosodwyd y plât mewn aPopty 90 gradddros1 awr. Yr amsugnedd yn490 nmei fesur gan ddefnyddio darllenydd microplate. Ailadroddwyd pob arbrawfnheirgwaith, a chyfrifwyd y cynnwys melanin (%) gan ddefnyddio hafaliad (5).

 

1.5 Mesur ffactorau llidiol a dangosyddion straen ocsideiddiol

Ar ôl trin y celloedd ar gyfer48 awrFel y disgrifir yn Adran 1.4.2,Celloedd hacatCasglwyd o bob grŵp gan ddefnyddio sgrafell celloedd, ei centrifugio, a chasglwyd yr uwchnatur. Mesurwyd crynodiadau il -6 a TNF- yn unol â chyfarwyddiadau'r citiau ELISA.

Ar ôl trin y celloedd ar gyfer48 awr, Casglwyd celloedd HACAT gan ddefnyddio sgrafell celloedd, yn destun cylchoedd rhewi-dadmer dro ar ôl tro i gymell lysis celloedd, a'u canoli yn12, 000 rpm am 10 munud ar 4 gradd. Casglwyd yr uwchnatur, a gweithgareddauNarodwra chrynodiadau oGathodeu mesur gan ddefnyddio cyfarwyddiadau Kit ELISA.

 

1.6 Mesur Mynegai Cyfuniad

YDull Mynegai Cyfuniad (CI)Defnyddiwyd [20] i werthuso a oedd y cyfuniad o PHGs a GLA ar wahanol gymarebau màs yn arddangos effeithiau synergaidd wrth atal gweithgaredd tyrosinase a gwrthocsidiad. Cyfrifwyd y mynegai cyfuniad gan ddefnyddio hafaliad (6).

 

Yn y fformiwla:

D1aD2cynrychioli crynodiadau priodol (g/l) y ddau gyffur yn y driniaeth gyfuniad sydd ei hangen i gyflawnigweithgaredd x%.

Dxyn cynrychioli crynodiad (g/l) pob sylwedd unigol wrth ei ddefnyddio ar ei ben ei hun i gyflawnigweithgaredd x%.

YMeddalwedd Compusynei ddefnyddio ar gyfer cyfrifiadau:

Ci> 1yn dynodi effaith antagonistaidd.

Ci=1yn dynodi effaith ychwanegyn.

Ci <1yn dynodi effaith synergaidd.

 

1.7 Dadansoddi Data

Mynegwyd yr holl ddata fel"Gwyriad cymedrol ± safonol (x̄ ± s)", ac roedd trafodaethau yn seiliedig ar y gwerthoedd cymedrig.

Perfformiwyd dadansoddiad ystadegol gan ddefnyddioGraphpad Prism 9.5. 0. Defnyddiwyd ANOVA unffordd (dadansoddiad o amrywiant) ar gyfer cymariaethau ymhlith grwpiau lluosog. AP-value <0. 05yn cael ei ystyried yn ystadegol arwyddocaol.