Mae'r Ysgrifennydd Gwarchodedig Sy'n Gyfoethog o Gystein Protein MaCFEM85 yn Rhyngweithio â MsWAK16 i Weithredu Amddiffynfeydd Planhigion
Oct 26, 2023
Crynodeb: Metarhizium anisopliaeyn ffwng entomopathogenig a all wella tyfiant a gwrthiant planhigion wrth weithredu fel endoffyt mewn planhigion cynnal. Fodd bynnag, ychydig a wyddys am y rhyngweithiadau protein na'u mecanweithiau actifadu. Mae proteinau sy'n gyffredin mewn pilen allgellog ffwngaidd (CFEM) wedi'u nodi fel rheolyddion imiwnedd planhigion sy'n atal neu'n actifadu ymatebion ymwrthedd planhigion. Yma, fe wnaethom nodi protein sy'n cynnwys parth CFEM, MaCFEM85, a leolwyd yn bennaf yn y bilen plasma. Dangosodd tyniad i lawr burum dau-hybrid (Y2H), glutathione-S-transferase (GST), a phrofion ategu fflworoleuedd bimoleciwlaidd fod MaCFEM85 yn rhyngweithio â pharth allgellog aMedicago sativa(alfalffa) protein bilen, MsWAK16. Dangosodd dadansoddiadau mynegiant genynnau fod MaCFEM85 a MsWAK16 wedi'u huwchreoleiddio'n sylweddolM. anisopliaeaM. sativa, yn y drefn honno, o 12 i 60 h ar ôl cyd-brechu. Dangosodd profion burum dau hybrid ychwanegol a threiglad safle-benodol asid amino fod angen parth CFEM a 52fed cystein yn benodol ar gyfer rhyngweithio MaCFEM85 â MsWAK16. Dangosodd profion swyddogaeth amddiffyn fod JA wedi'i uwch-reoleiddio, ond cafodd maint briwiau Botrytis cinerea ac atgenhedliad Myzus persicae eu hatal gan fynegiant dros dro MaCFEM85 a MsWAK16 yn y model cynnal planhigion Nicotiana benthamiana. Gyda'i gilydd, mae'r canlyniadau hyn yn rhoi mewnwelediadau newydd i'r mecanweithiau moleciwlaidd sydd wrth wraidd rhyngweithiadau M. anisopliae â phlanhigion lletyol.
budd-daliadau atodiad cistanche-cynyddu imiwnedd
Geiriau allweddol: kinase sy'n gysylltiedig â wal; CFEMs; Metahizium anisopliae; imiwnedd planhigion; Medicago sativa
1. Rhagymadrodd
Mae rhyngweithiadau rhwng planhigion a microbau yn eang ac yn ganlyniad cyd-esblygiad yn y gorffennol a pharhaus. Gall y rhyngweithiadau hyn gael canlyniadau buddiol, niwtral neu andwyol i bob cyfranogwr [1-3]. Gall microbiota rhizosfferig buddiol wella tyfiant planhigion a gwella iechyd cyffredinol trwy amddiffyn rhag afiechydon a gludir gan y pridd neu gynyddu'r nifer sy'n cymryd maetholion [4,5]. Gall ystod eang o ficrobau buddiol wella galluoedd planhigion megis cymeriant maetholion, twf, ac amddiffynfeydd pathogen a phryfed [6,7]. Mae Metarhizium Sorok¯ın yn genws pwysig o ffyngau entomopathogenaidd gyda'r gallu i gytrefu planhigion [8], ond mae tystiolaeth hefyd i awgrymu y gall aelodau'r genws wella ymwrthedd pathogenau planhigion. Er enghraifft, canfu astudiaeth labordy ataliad 60% o Fusarium solani (Mart.) Sacc. ym mhresenoldeb Metarhizium robertsii (M. anisopliae gynt) o'i gymharu â rheolyddion heb M. robertsii [9]. Mae gan rai mathau o Metarhizium y potensial i wella ymwrthedd planhigion i blâu a chlefydau pryfed trwy newid mynegiant genynnau amddiffyn planhigion. Mae cytrefu endoffytig ag M. Roberts yn ysgogi mynegiant y llwybrau amddiffyn asid jasmonig (JA) ac asid salicylic (SA) mewn dail indrawn; ar ben hynny, mae cytrefu o'r fath yn gysylltiedig â hyrwyddo twf planhigion ac atal datblygiad larfaol Agrotis epsilon (Hufnagel) [10]. Fe wnaeth Metarhizium guizhouense actifadu'r -1,3-glwcanas a chitinase yng nghroen ffrwythau Lansium parasiticum gan arwain at ataliad twf Botrytis sp. a Fusarium sp. ar ffrwyth Aglaia dookkoo Griff [11]. Ar ben hynny, pan gymhwyswyd M. anisopliae i eginblanhigion cnau daear, cafodd amrywiaeth o ffactorau trawsgrifio gan gynnwys WRKYs, MYCs, TGAs, a ffactorau trawsgrifio sy'n ymateb i ethylene eu actifadu, tra bod cludwyr nitrad a phroteinau yn rhwymo elfennau dadhydradu-ymatebol hefyd wedi'u mynegi'n wahaniaethol [12] . Mae hyn yn awgrymu bod M. anisopliae yn rheoleiddio genynnau amddiffyn planhigion wrth iddo gytrefu'r planhigyn. Fodd bynnag, ychydig iawn sy'n hysbys am y mecanweithiau sydd wrth wraidd ymatebion amddiffyn planhigion yn dilyn haint gan Metarhizium. Mae effeithwyr yn fodd cyffredin i ficro-organebau reoleiddio ymwrthedd planhigion [13]. Mae gweithrediad ymwrthedd planhigion fel arfer yn cael ei nodweddu gan fyrst ocsideiddiol ac anwythiad hormonau, metabolion, a signalau eraill [13]. Mae'r hormonau planhigion SA a JA yn chwarae rhan bwysig wrth ysgogi ymwrthedd planhigion, gan gyfryngu dau lwybr signalau amddiffyn ar wahân [14]. Mae llwybr signalau'r SA yn gweithredu'n bennaf yn yr ymateb alergaidd i blanhigion ac mewn ymwrthedd a gafwyd yn systemig i bathogenau, ond gall hefyd fod yn rhan o ymatebion amddiffyn planhigion anuniongyrchol a achosir gan fwydo pryfed yn pigo [15]. Mae cronni SA yn gysylltiedig â mynegiant cynyddol genynnau sy'n amgodio proteinau trosglwyddo lipid (LTPs) a ffenylalanine amonia-lyase (PAL) [16], sy'n cyfryngu synthesis a chronni metabolion arbenigol i lawr yr afon fel flavonoids a lignin [17]. Mae llwybr signalau JA yn gweithredu mewn ymatebion uniongyrchol ac anuniongyrchol i ddifrod mecanyddol, pathogenau ffwngaidd, a phlâu pryfed. Mae astudiaethau wedi dangos bod signalau JA yn cael effaith reoleiddiol ar synthesis metabolion arbenigol megis terpenoidau, ffenylpropanoidau, ac alcaloidau, sydd ag ystod eang o swyddogaethau biolegol [18]. Dangoswyd bod rhai metabolion arbenigol yn cronni mewn celloedd planhigion yn dilyn triniaeth â methylJA (MeJA), gan gynnwys paclitaxel mewn rhywogaethau Taxus [19,20], terpenoidau yn Centella Asiatica (L.) Urban [21], a saponins mewn ginseng [22] . Roedd cymhwyso SA a chitosan (CHT) fel elicitors yn achosi croniad lignin ac adweithiau ensymau amddiffyn mewn tomatos, a oedd yn lleihau nifer yr achosion o haint Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi [23]. Yn ogystal, cronnwyd lefelau JA a SA mewn gwenith yn sylweddol trwy gymhwyso'r elicitor PeaT, gan wella ymateb yr amddiffyniad i'r llyslau ceirch Sitobion avenae (Fabricius) [24]. Mae hyn yn dangos y gallai imiwnedd planhigion gael ei reoleiddio gan yr effeithwyr hyn trwy hormonau a metabolion planhigion.
cistanche tubulosa-gwella system imiwnedd
Yn gyffredin yn y bilen allgellog ffwngaidd (CFEM) mae proteinau yn bresennol mewn ystod eang o ffyngau. Maent yn amgodio parthau sydd fel arfer yn 60 asid amino (aa) o hyd ac yn cynnwys wyth cystein â bylchau nodweddiadol [25]. Mae parthau CFEM yn debyg i barthau tebyg i ffactor twf epidermaidd (EGF), sy'n gweithredu fel derbynyddion allgellog, trawsddygwyr signal, neu foleciwlau adlyniad mewn rhyngweithiadau host-pathogen [26]. Gall proteinau sy'n cynnwys parthau CFEM drin yr ymateb ymwrthedd planhigion trwy weithredu fel effeithwyr. Yn y ffwng rhwd dail gwenith Puccinia triticina Erikas, cyflymodd yr ymgeisydd effeithydd CFEM PTTG_08198 gynnydd marwolaeth celloedd a hyrwyddo cronni rhywogaethau ocsigen adweithiol (ROS) [27]. Mae'r ffwng anthracnose Colletotrichum graminicola (Ces.) GW Wils yn cynnwys pum effeithydd (CgCFEM6, 7, 8, 9, a 15) y dangoswyd eu bod yn atal marwolaeth celloedd rhaglenedig a achosir gan BAX yn Nicotiana benthamiana Domin [28]. Adroddwyd bod y ffwng mycorhisol ffytosymbiotig Laccaria bicolor (Maire) PDOrton yn secrete nifer o broteinau CFEM, megis Lac310796, Lac296573, a Lac296572, mewn meinweoedd symbiotig [29]. Er nad yw swyddogaethau cymhleth y proteinau hyn wedi'u hastudio ymhellach mewn symbiosis mycorhisol, mae canlyniadau blaenorol yn awgrymu y gall proteinau CFEM weithredu mewn signalau rhwng ffyngau a phlanhigion. Gall M. anisopliae weithredu naill ai fel ffwng entomopathogenig neu endoffytig mewn planhigyn lletyol [30]. Fodd bynnag, nid yw rolau proteinau CFEM wedi'u hadrodd eto. Yn flaenorol, gwnaethom nodi protein sy'n cynnwys parth CFEM yn M. anisopliae, MaCFEM85 (GenBank ID: MZ682609) [31]. Yma, rydym yn adrodd ar y berthynas rhwng MaCFEM85 a kinase MsWAK16 sy'n gysylltiedig â wal Medicago sativa. Fe wnaethom ddadansoddi dilyniant MaCFEM85 a chynnal arbrofion i benderfynu pa weddillion sy'n hanfodol ar gyfer rhyngweithio â MsWAK16. Yn olaf, gan ddefnyddio N. benthamiana fel ein model o blanhigyn, fe wnaethom werthuso ymatebion amddiffyn planhigion i Botrytis cinerea a'r llyslau Myzus persicae gyda a heb fynegiant dros dro o MaCFEM85 a MsWAK16.
Manteision cistanche tubulosa- cryfhau'r system imiwnedd
Cliciwch yma i weld cynhyrchion Gwella Imiwnedd Cistanche
【Gofyn am fwy】 E-bost:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
2. Canlyniadau
2.1. Roedd MaCFEM85 yn Perthynas Agosaf i CFEMs Ffwngaidd An-Bathogenig ac Wedi'i Leoli i'r Pilen Plasma
Adeiladwyd coeden ffylogenetig i ddadansoddi'r berthynas rhwng MaCFEM85 a phroteinau CFEM eraill o ffyngau model pathogenig ac an-pathogenig. Roedd y rhain yn cynnwys Magnaporthe oryzae, Fusarium oxysporum (Schl), Neurospora crassa Shear & BODodge, a Beauveria bassiana (Bals.) (gweler Adran 4). Roedd MaCFEM85 yn perthyn agosaf i broteinau CFEM yn B. bassiana, ac felly, yn esblygiadol agosach at ffyngau nad ydynt yn bathogenaidd nag at ffyngau pathogenig (Ffigur 1a).
Ffigur 1a
2.2. MaCFEM85 Wedi'i Upreoli yn ystod Rhyngweithiadau ag M. sativa
Mae kinases tebyg i dderbynnydd sy'n gysylltiedig â wal (WAKs) yn cynrychioli is-grŵp o fewn yr uwch-deulu kinases protein tebyg i dderbynyddion (RLKs), ac maent yn cynnwys parth allgellog, helics trawsbilen, a pharth kinase mewngellol. Maent yn chwarae rhan bwysig wrth reoleiddio twf planhigion, datblygiad, ymateb straen, a llwybrau signalau ymwrthedd pathogen [32]. Tynnwyd RNA o wreiddiau M. anisopliae hyphae a M. sativa ar ôl cyd-deoriad i ymchwilio i batrymau mynegiant MaCFEM85 a MsWAK16. Mynegwyd MaCFEM85 a MsWAK16 ar lefelau sylweddol uwch yn ystod deori ar y cyd o 12 i 60 h (Ffigur 1c,d). O 0 i 36 h, cynyddodd mynegiant MaCFEM85 yn raddol, gan gyrraedd uchafbwynt o 36 h. Roedd × 593 gwaith yn uwch wedi'i fynegi yn y cyfuniad o M. anisopliae ac M. sativa o'i gymharu â M. anisopliae a dyfwyd ar ei ben ei hun. Er bod mynegiant MaCFEM85 ychydig yn llai yn y cyfnod 48-60 h, roedd yn dal i gael ei fynegi ar lefelau sylweddol uwch nag yn M. anisopliae a dyfwyd yn unig. Roedd MsWAK16 hefyd wedi'i uwchreoleiddio'n sylweddol, gyda mynegiant yn cyrraedd uchafbwynt o 36 h. Mewn M. sativa heintiedig â M. anisopliae, roedd MsWAK16 × 89.06 gwaith yn uwch wedi'i fynegi nag yn M. sativa heb M. anisopliae. O 36 i 60 h, gostyngodd lefelau MsWAK16 ychydig, ond roedd ei fynegiant yn dal yn sylweddol uwch nag yn y planhigion heb eu brechu.
2.3. MaCFEM85 Yn rhyngweithio â MsWAK16 In Vitro ac In Vivo
Er mwyn ymchwilio i fecanwaith swyddogaethol posibl MaCFEM85 mewn ymateb i driniaeth M. anisopliae, perfformiwyd sgrin dau-hybrid burum (Y2H) i nodi proteinau lletyol sy'n rhyngweithio â MaCFEM85 yn rhagarweiniol. Archwiliwyd y rhyngweithio rhwng parth allgellog MsWAK16 (MsWAK16-ED) a MaCFEM85 gydag assay dau-hybrid burum un-i-un gan ddefnyddio MaCFEM85 yn pGBKT7 fel y fector BD a MsWAK16 yn pGADT7 fel y fector AD. Tyfodd yr holl furum wedi'i drawsnewid yn dda ar gyfrwng diffygiol SD-T/L, a thyfodd y grŵp rheoli cadarnhaol a'r grŵp arbrofol yn llwyddiannus ar gyfrwng diffygiol SD-T/L/H/A + X- -gal. Roedd hyn yn dangos y gallai MaCFEM85 ryngweithio â MsWAK16-ED (Ffigur 2a).
Ffigur 2. Dilysu'r rhyngweithio rhwng MaCFEM85 a MsWAK16.
Ar gyfer dilysu in vitro, mewnosodwyd MsWAK16-ED wedi'i thagio gan glutathione-S-transferase (GST) (gan amgodio cynnyrch o 60 kDa) i pGEX{5}}P2, a MaCFEM85 (His) â thag polyhistidine (His) ( amgodio cynnyrch o 17 kDa) wedi'i fewnosod yn pET-21b. Dangosodd imiwnoblotio gyda gwrthgyrff Ei a GST fod y protein ailgyfunol MaCFEM85-Ei yn rhyngweithio â'r ysglyfaeth GST-MsWAK16-ED ond nid gyda GST yn unig a bod GST-MsWAK16- ED yn rhyngweithio â His -MaCFEM85 (Ffigur 2b). Er mwyn cadarnhau ymhellach y rhyngweithio rhwng MaCFEM85 a MsWAK16, fe wnaethom gynnal assay ategiad fflworoleuedd bimoleciwlaidd (BiFC) gyda MaCFEM 85-YFPN a MsWAK16-YFPC Constructs. Cynhyrchodd cydfynegiant MaCFEM a MsWAK YFPC mewn dail tybaco signal fflworoleuedd melyn, sy'n dangos bod MaCFEM85 yn rhyngweithio â MsWAK16 (Ffigur 2c).
2.4. Safleoedd Allweddol ar gyfer Rhyngweithiadau MaCFEM85 a MsWAK16
I ddiffinio'r rhanbarth o MaCFEM85 sydd ei angen ar gyfer y rhyngweithio â MsWAK16-ED, rhagfynegwyd parthau protein gyda'r meddalwedd ar-lein SMART (Ffigur 3a). Roedd MaCFEM85 yn cynnwys parth CFEM yn rhanbarth 19-86 aa. Rhagfynegwyd y strwythur trydyddol hefyd (Ffigur 3b). Arweiniodd yr wyth cystein yn y maes hwn at bedwar bond disulfide (CYS26 a CYS69, CYS30 a CYS64, CYS43 a CYS50, a CYS52 a CYS85), gan gynnal sefydlogrwydd y protein (Ffigur 3b). I ddilysu'r safle(oedd) rhyngweithio tybiedig yn MaCFEM85, cynhyrchwyd saith fersiwn treigledig o'r protein a'u mewnosod yn pGBKT7 fel proteinau abwyd. Cafodd pob fector ailgyfunol ei gyd-drawsgludo ag AD-MsWAK16-ED yn y straen Y2H Gold. Ni thyfodd y straen gyda threiglo CYS52 ar gyfryngau dethol (Ffigur 3c, wedi'i amlinellu mewn coch), sy'n dangos bod angen CYS52 ar gyfer rhyngweithio MaCFEM85 â MsWAK16-ED.
2.5. Mae Rhyngweithio MaCFEM85 â MsWAK16 yn Ysgogi'r Ymateb Imiwnedd Planhigion
2.5.1. Gwerthuso Rôl MaCFEM85 a MsWAK16 mewn Gwrthsefyll Clefydau yn erbyn B. cinerea
Er mwyn archwilio cyfranogiad posibl MaCFEM85 a MsWAK16 mewn ymatebion amddiffyn pathogenau, archwiliwyd a allai gorfynegiant MaCFEM85, MsWAK16, neu MaCFEM85 a MsWAK16 roi mwy o wrthwynebiad i B. cinerea. Mynegwyd y fectorau hyn mewn dail N. benthamiana dros dro. Dangosodd assay blot Gorllewinol fod MaCFEM85 a MsWAK16 wedi’u mynegi ar lefelau tebyg pan gawsant eu mynegi ar eu pen eu hunain neu gyda’i gilydd, sy’n dangos bod MaCFEM85 a MsWAK16 wedi’u mynegi’n llwyddiannus mewn tybaco (Ffigur 4a). Perfformiwyd profion afiechyd hefyd gan ddefnyddio N. benthamiana wedi'i ymdreiddio â MaCFEM85, MsWAK16, MaCFEM85+MsWAK16, neu reolaeth GFP. Roedd y briwiau gryn dipyn yn llai (o ~30% ar 2 d ar ôl brechiad) ar ddail a ymdreiddiwyd â MaCFEM85, MsWAK16, neu MaCFEM85+MsWAK16 o gymharu â'r gweithfeydd rheoli (Ffigur 4b). Mae'r data hyn yn dangos bod mynegiant dros dro MaCFEM85 yn N. benthamiana wedi rhoi mwy o wrthwynebiad i B. cinerea a bod MaCFEM85 a MsWAK16 wedi rheoleiddio ymateb yr amddiffyniad yn erbyn B. cinerea yn gadarnhaol.
Ffigur 3. Nodi'r safle rhyngweithio rhwng MaCFEM5 a MsWAK16.
Ffigur 4. Sefydlu ymwrthedd planhigion trwy fynegiant dros dro MaCFEM85 a MsWAK16.
2.5.2. Gwerthuso Rôl MaCFEM85 a MsWAK16 yn Aphid Defense yn N. benthamiana
Er mwyn ymchwilio ymhellach i rôl MaCFEM85 a MsWAK16, roedd planhigion N. benthamiana sy'n mynegi MaCFEM85 a MsWAK16 dros dro wedi'u heintio â M. persicae, ac aseswyd y poblogaethau. Ar gyfer yr arbrawf hwn, cafodd ardal fawr o bob deilen N. benthamiana ei hidlo amaeth gyda'r fector deuaidd ailgyfunol pYBA1132 sy'n cynnwys MaCFEM85 a MsWAK16. Defnyddiwyd GFP fel y rheolydd. Ar 12 awr ar ôl ymdreiddiad, cafodd 20 M. oedolyn persicae eu cewyll ar bob deilen, gan amlygu'r ardal ymdreiddiedig i bryfed gleision. Yn ystod y tridiau canlynol, cofnodwyd marwolaethau llyslau oedolion a nifer y nymffau; yna tynnwyd y nymffau. Nid oedd unrhyw wahaniaeth arwyddocaol yn y risg marwolaethau ymhlith poblogaethau M. persicae sy'n bwydo ar blanhigion sy'n mynegi MaCFEM85, MsWAK16, neu MaCFEM85+MsWAK16 (χ2=3.65827, DF=3, t < 0.30081 ) (Ffigur 4c). Fodd bynnag, ar 24, 48, a 72 h, roedd nifer cyfartalog yr epil a gynhyrchwyd gan bob llyslau llawndwf yn sylweddol uwch ar N. benthamiana yn mynegi rheolaeth GFP o'i gymharu â'r rhai a fynegodd MaCFEM85, MsWAK16, neu MaCFEM85+MsWAK16 (Ffigur 4d).
2.5.3. Gwerthuso Rôl MaCFEM85 a MsWAK16 mewn Cronni Hormon a Mynegiant Genynnau Cysylltiedig â Hormon
Er mwyn dadansoddi'r gwahaniaethau rhwng ymatebion amddiffyn planhigion N. benthamiana sy'n mynegi eGFP, MaCFEM85, MsWAK16, a MaCFEM85+ MsWAK16, fe wnaethom fesur lefelau JA, SA, a chyfanswm flavonoid, a mynegiant genynnau cysylltiedig. Dangosodd y canlyniadau fod lefelau JA a SA yn amrywio rhwng planhigion sy'n mynegi eGFP, MaCFEM85, MsWAK16, a MaCFEM85+MsWAK16 (Ffigur 5a). O'u cymharu â'r rhai a fynegodd eGFP, roedd lefelau JA yn sylweddol is mewn planhigion a fynegodd MaCFEM85; Cynyddwyd lefelau'r Arfarniad o Gynaliadwyedd ychydig, ond nid oedd y gwahaniaethau'n arwyddocaol. Mewn cyferbyniad, ni ddangosodd planhigion a fynegodd MsWAK16 unrhyw wahaniaethau sylweddol mewn lefelau JA o gymharu â rheolaeth eGFP, tra bod lefelau SA yn sylweddol is nag yn y rheolaeth (Ffigur 5a). Cynyddwyd a gostyngwyd lefelau JA ac Arfarniad o Gynaliadwyedd yn sylweddol, yn y drefn honno, mewn gweithfeydd yn mynegi MaCFEM85+MsWAK16 o gymharu ag eGFP.
Ffigur 5. Lefelau hormonau a mynegiant genynnau ymateb hormonau
Roedd cyfanswm y cynnwys flavonoid yn sylweddol uwch mewn gweithfeydd a oedd yn mynegi MaCFEM85+MsWAK16 o gymharu â phob grŵp triniaeth arall (Ffigur 5a). Roedd y lefelau mynegiant genynnau biosynthetig yn debyg mewn planhigion sy'n mynegi MsWAK16 a MaCFEM85+MsWAK16. Er enghraifft, cafodd genynnau sy'n ymwneud ag ymateb JA, sef COI1, MYC2, a PDF1.2, eu huwchreoleiddio'n sylweddol o gymharu â phlanhigion sy'n mynegi GFP (Ffigur 5b). Yn yr un modd, mynegwyd y genynnau sy'n gysylltiedig â SA NPR1, WRKY70, a PR1 yn sylweddol wahaniaethol mewn planhigion sy'n mynegi MsWAK16 a MaCFEM85+MsWAK16; Cafodd NPR1 ei uwchreoleiddio, tra bod WRKY70 a PR1 wedi'u hisreoleiddio o gymharu â'r rheolaeth (Ffigur 5b). Fe wnaethom hefyd archwilio mynegiant genynnau allweddol yn y llwybrau synthesis asid Shikimic a ffenylpropanoid, sydd ill dau yn gysylltiedig â synthesis flavonoid. Yn gyffredinol, nid oedd mynegiant MaCFEM85 yn unig yn achosi mynegiant sylweddol uwch o'r genynnau hyn mewn tybaco. Fodd bynnag, cafodd y genynnau hyn eu huwchreoleiddio mewn tybaco sy'n mynegi MsWAK16 neu MsWAK16+MaCFEM85 o gymharu â rheolaeth GFP (Ffigur 5c).
cistanche tubulosa-gwella system imiwnedd
3. Trafodaeth
3.1. Mae'r Motiff Protein CFEM Wedi'i Gadw yn Gwasanaethu Swyddogaethau Lluosog mewn Rhywogaethau Ffwngaidd
Mae parth CFEM yn unigryw i ffyngau ac mae'n digwydd yn aml mewn proteinau pilen allgellog ffwngaidd. Tarddodd y parth yn hynafiad cyffredin mwyaf diweddar Ascomycota a Basidiomycota [33]. Mae ymchwil diweddar wedi dangos y gall proteinau CFEM mewn pathogenau ffwngaidd weithredu fel rheolyddion imiwnedd planhigion, gan achosi ataliad neu actifadu imiwnedd planhigion lletyol yn dibynnu ar y math o haint [28,34,35]. Ychydig o adroddiadau a gafwyd am broteinau sy'n cynnwys parth CFEM yn M. anisopliae, dim ond yng nghyd-destun cymhariaeth esblygiadol â ffyngau eraill [36]. Yn yr astudiaeth hon, buom yn cymharu proteinau M. anisopliae CFEM â phroteinau CFEM hysbys eraill mewn ffyngau pathogenig ac nad ydynt yn bathogenaidd. Gwnaethom gadarnhau mai'r homolog agosaf o MaCFEM85 yw Cfem5 a geir yn Beauveria bassiana, un o 12 proteinau CFEM yn y rhywogaeth honno (Ffigur Atodol S1). Mae bbCfem5 yn hanfodol ar gyfer caffael haearn [37]. Ar ben hynny, yn seiliedig ar y strwythur trydyddol a ragwelir, mae parth CFEM yn MaCFEM85 yn debyg iawn i Surface Antigen Protein 2 (CSA2) a geir yn Candida albicans (CPRobin) Berkhout, lle mae 65 o weddillion (96% o'r dilyniant) wedi'u modelu â 99.8 % hyder [31]. Mae Candida albicans yn bathogen anifail; Mae CSA2 yn chwarae rhan bwysig mewn twf a phathogenedd trwy dynnu heme o haemoglobin a chludo heme o'r cellfur i'r plasma [38-40]. Rydym yn damcaniaethu y gall MaCFEM85 fod yn gysylltiedig â ffyrnigrwydd M. anisopliae gwesteiwyr pryfed. Mae'r swyddogaethau cyfunol hyn o MaCFEM85 mewn haint pathogenig anifeiliaid ac actifadu imiwnedd planhigion yn gwneud y protein yn ffocws ymchwil cyffrous yn y dyfodol.
3.2. Mae Bondiau Disulfide yn Strwythurau Pwysig ar gyfer Gweithrediad Protein
Mae uniondeb cydffurfiadol adeiledd protein yn uniongyrchol gysylltiedig â'i allu i weithredu. Mae'r bondiau disulfide a ffurfiwyd gan barau cystein yn hyrwyddo plygu protein a sefydlogrwydd cydffurfiad ac fe'u hystyrir yn ffurfio safleoedd allweddol ar gyfer adnabod a rhwymo derbynyddion neu ligandau penodol [41]. Er enghraifft, mae tarfu ar unrhyw un o'r tri bond disulfide a gadwyd yn y pathogen planhigion Cladosporium fulvum effector protein AVR4 yn arwain at sensitifrwydd proteas a llai o allu i rwymo chitin [42]. Mewn tri phrotein C. fulvum arall (ECP1, ECP2, ac ECP5), mae amnewidiadau sengl o alaninau ar gyfer cystein yn lleihau'r ymateb tomato hypersensitive, gan nodi bod y cysteinau yn hanfodol i gynnal sefydlogrwydd a gweithgaredd hypersensitif sy'n ysgogi ymateb [43]. Ar ben hynny, yn y protein aeddfed MC69 o Magnaporthe oryzae, gall mutagenesis dau weddillion cystein a gadwyd (Cys36 a Cys46) amharu ar swyddogaeth MC69 heb effeithio ar secretion, gan awgrymu pwysigrwydd y bond disulfide yn benodol yn pathogenedd MC69 [44]. Mae'n ymddangos bod parth CFEM yn debyg o ran maint ac ym mhatrwm y gweddillion cystein i barthau tebyg i EGF, sy'n cynnwys tri neu bedwar pâr o fondiau disulfide. Gall proteinau EGF weithredu fel derbynyddion arwyneb celloedd, trawsddygwyr signal, neu foleciwlau adlyniad mewn rhyngweithiadau lletyol-pathogen [45]. Yn yr astudiaeth hon, canfuom nid yn unig fod parth CFEM MaCFEM85 yn cynnwys wyth cystein cadw a oedd yn ffurfio pedwar pâr o fondiau disulfide (Ffigur 3b), ond fe wnaethom ddilysu hefyd mai CFEM oedd y parth hanfodol ar gyfer y rhyngweithio rhwng MaCFEM85 a MsWAK16. Ymhellach, trwy fwtaniad safle-gyfeiriedig o weddillion cystein i alanin, canfuom mai'r gweddillion cystein yn safle 52 oedd y safle craidd oedd ei angen ar gyfer y rhyngweithiad (Ffigur 3c). Mae'r canlyniadau hyn yn darparu sail ar gyfer astudiaethau pellach o swyddogaethau ffisiolegol y rhyngweithio CFEM85-WAK16.
3.3. Rhyngweithio MaCFEM85 ag Amddiffynfeydd Planhigion Actifedig MsWAK16
Mewn rhyngweithiadau microbaidd-planhigion, mae ymatebion amddiffyn planhigion yn cael eu hysgogi'n gyffredinol gan broteinau effaith microbaidd. Mae amddiffyniad ysgogedig yn dod yn arf pwysig mewn rheoli plâu biolegol i hyrwyddo ymwrthedd. Mae proteinau CFEM wedi'u nodi fel effeithwyr sy'n ymwneud â rheoleiddio actifadu neu ataliad imiwnedd planhigion [28,46]. Fodd bynnag, mae yna brinder ymchwil gyhoeddedig sy'n cysylltu rheoleiddio'r ffactorau imiwnedd hyn â'u rolau penodol mewn clefydau planhigion ac ymwrthedd i bryfed. Yn yr astudiaeth hon, defnyddiwyd ffwng entomopathogenig ac endoffytig, M. anisopliae, i nodi rhyngweithiad rhwng MaCFEM85 a kinase sy'n gysylltiedig â wal gell, MsWAK16, yn M. sativa. Dangosodd y canlyniadau fod y rhyngweithiad hwn wedi lleihau'r gymhareb anafiadau ar ôl brechu â B. cinerea (Ffigur 4b) ac wedi gostwng cyfradd twf poblogaeth M. persicae (Ffigur 4d), sy'n dangos bod y rhyngweithio rhwng MaCFEM85 a MsWAK16 wedi cynyddu ymwrthedd M. sativa i lyslau. Gellir defnyddio newidiadau yn lefelau JA, SA, ac ethylene (ET) fel marcwyr i werthuso anwythiad ymwrthedd planhigion [47,48]. Yma, gwnaethom ddangos bod MaCFEM85 yn rhyngweithio â MsWAK16 i ddylanwadu ar ymwrthedd planhigion trwy reoleiddio hormonaidd ac i atal cyfradd atgenhedlu M. persicae (Ffigur 4d). Mae astudiaethau tebyg wedi'u hadrodd yn flaenorol. Er enghraifft, dangoswyd bod y protein effeithydd Brevibacillus laterosporus PeBL1 yn peri i JA a SA gronni mewn tomatos ac i leihau cyfradd twf poblogaethau ail a thrydedd genhedlaeth o M. persicae a oedd yn bwydo ar y planhigion hynny. Ar ben hynny, mae planhigion tomato wedi'u chwistrellu ag effeithyddion yn cael effaith ymlid ar M. persicae [49]. Mae cymhwyso'r protein elicitor PeBC1 i ffa cyffredin (Phaseolus vulgaris L.) yn arwain at effeithiau is-farwol amlwg a sylweddol ar lyslau eirin gwlanog gwyrdd. Mae planhigion sy'n cael eu trin â PeBC1 yn dangos dadreoleiddiad sylweddol o enynnau sy'n gysylltiedig â JA a SA [50]. Mae'r elicitor Beauveria bassiana PeBb1 yn lleihau ffrwythlondeb M. persicae ar dybaco ac yn cymell mynegiant genynnau sy'n gysylltiedig â JA ac ET [51]. Yn yr astudiaeth bresennol, roedd mynegiant dros dro MaCFEM85 a MsWAK16 mewn tybaco yn uwch-reoleiddio'n sylweddol y genynnau COI1, MYC2, a PDF1.2 sy'n gysylltiedig ag ymateb JA (Ffigur 5b) a chynyddu JA a chyfanswm cynnwys flavonoid (Ffigur 5a), a oedd yn debyg i'r canlyniadau yn y llenyddiaeth fel y disgrifir uchod. Fodd bynnag, ni wnaethom ganfod lefelau uchel o SA mewn tybaco 12 h ar ôl ymdreiddiad, a dangosodd planhigion a oedd yn mynegi MsWAK16 neu MaCFEM dros dro85+MsWAK16 yn sylweddol llai o lefelau SA a diffyg rheoleiddio genynnau yn yr ymateb SA (Ffigur 5a,b) . Dangosodd hyn y gall ysgogi gwahanol hormonau planhigion arwain nid yn unig at weithgareddau synergaidd ond hefyd at groessiarad ac adborth, gan ganiatáu i blanhigion ymateb yn briodol i wahanol ysgogiadau. Lefelau JA uwch ond mae lefelau AC isel wedi cael eu hadrodd yn flaenorol mewn gweithfeydd. Er enghraifft, yn A. thaliana diffygiol ar gyfer cronni SA, roedd lefelau JA 25-plyg yn uwch nag yn A. thaliana math gwyllt, a chafodd genynnau ymatebol i JA eu gweithredu [52]. Adroddwyd hefyd y gall rhai bacteria gynyddu lefelau JA mewn planhigion i atal cronni SA, gan osgoi'r niwed a achosir gan SA. Er enghraifft, mae Pseudomonas syringae yn targedu'r derbynnydd COI1 trwy tocsin, coronatin, sy'n rheoleiddio llwybr JA yn negyddol [53]. Mae hyn yn hyrwyddo MYC2-upregulation a achosir gan MYC o'r ffactorau trawsgrifio ANAC019, ANAC055, ac ANAC072 [54], gan atal trawsgrifio ICS1 (genyn allweddol ar gyfer synthesis SA) a thrwy hynny is-reoleiddio cynhyrchu SA a thrawsgludo signal. Yn yr astudiaeth bresennol, arweiniodd y rhyngweithio rhwng MaCFEM85 a MsWAK16 at fwy o gronni JA ac uwchreoleiddio genynnau ymatebol i JA ond ataliad rhag cronni SA a thrawsgrifio genynnau sy'n gysylltiedig â SA. Roedd hyn yn dangos bod y rhyngweithio rhwng MaCFEM85 a MsWAK16 wedi ysgogi JA, gan wella ymwrthedd planhigion i bryfed gleision.
Yn N. benthamiana yn mynegi MaCFEM85 a MsWAK16 dros dro, cynyddwyd lefelau JA a gostyngwyd meintiau briwiau B. cinerea (Ffigur 4b), yn gyson ag astudiaethau blaenorol. Mae JA yn ymwneud ag ymwrthedd planhigion i bryfed a phathogenau necrotroffig [52,55]. Fel pathogen necrotroffig, cafodd B. cinerea ei atal gan groniad JA ac ET [56]. Yn ein2-1 mutant A. thaliana ET-ddiffygiol a'r coi mutant ymateb JA1-1, gostyngwyd lefelau'r genyn amddiffyn i lawr yr afon, PDF1.2 yn sylweddol a gwellwyd sensitifrwydd i B. cinerea [ 57]. Canfuom yma fod croniad JA a thrawsgrifio genynnau sy'n gysylltiedig â JA wedi cynyddu'n sylweddol mewn N. benthamiana dros dro gan fynegi MaCFEM85 a MsWAK16, tra bod y casgliad o SA a thrawsgrifio genynnau cysylltiedig â SA wedi'u rhwystro. Roedd mynegiant MaCFEM85 a MsWAK16 hefyd yn dangos effaith ataliol ar B. cinerea. Roedd hyn yn dangos bod JA wedi'i actifadu gan MaCFEM85 a MsWAK16 a'i fod yn chwarae rhan flaenllaw mewn ymwrthedd planhigion i B. cinerea.
4. Defnyddiau a Dulliau
4.1. Straenau Ffwngaidd, Defnyddiau Planhigion, a Dulliau Diwyllio
Mathau ynysu Metarhizium anisopliae Cafodd Ma 9 eu meithrin ar gyfrwng tatws-siwgr-agar (PSA) (200 g echdyniad tatws wedi'i blicio wedi'i ferwi mewn dŵr, 20 g swcros, a 15 g agar/L). Casglwyd powdr sporangium ffres ar ôl 10 d. Tyfwyd planhigion Nicotiana benthamiana mewn siambr hinsawdd artiffisial gyda chylch golau / tywyll 14/10 h (27/25 ◦C). Ar gyfer mynegiant genynnau dros dro trwy drawsnewidiad trwy gyfrwng Agrobacterium, cafodd straen Agrobacterium tumefaciens GV3101 ei feithrin mewn cyfrwng Luria Broth (LB) (10 g tryptone, 5 g echdyniad burum, a 10 g NaCl/L). Roedd straen burum Aur (OE Biotech Co., Ltd., Shanghai, Tsieina) diwylliedig ar burum dyfyniad peptone dextrose (YPDA) cyfrwng (10 g burum dyfyniad, 20 g peptone, 20 g glwcos, a 0.03 g hemisulffad adenine/L). Ar gyfer pob fector a straen, defnyddiwyd gwrthfiotigau priodol, sef rifampin, kanamycin, neu ampicillin (25, 50, neu 50 µg/mL, yn y drefn honno). Rhestrir y straenau a'r plasmidau a ddefnyddiwyd yn yr astudiaeth hon yn Nhabl Atodol S1. Cafodd hadau Medicago sativa eu sterileiddio ar yr wyneb gyda 75% ethanol am 1 munud, ac yna 50% NaClO (5.5%) am 15 munud. Cymysgwyd yr hadau'n drylwyr ac yna eu golchi mewn dŵr di-haint dair gwaith am 5 munud yr un. Deorwyd yr hadau ar 4 ◦C yn y tywyllwch am dros 24 awr, yna'n egino ar blatiau agar dŵr 1% ar dymheredd yr ystafell dros nos. Dri diwrnod ar ôl egino, trosglwyddwyd yr eginblanhigion a oedd yn datblygu i bapur hidlo ar 9-cm o brydau petri di-haint, gyda 20 eginblanhigion fesul pryd. Dyrannwyd y triniaethau a'r rheolaeth i 15 pryd yr un, yn y drefn honno. Yna cafodd yr eginblanhigion eu dyfrhau â 10 ml o ataliad sbôr M. anisopliae yn cynnwys 107/mL, a chafodd y rheolaeth ei ddyfrhau â 10 ml o ddŵr di-haint. Ar 0, 12, 24, 48, a 60 h, cymerwyd detholiad ar hap o eginblanhigion o dri dysgl petri ar gyfer pob cyfnod amser. Cafodd y samplau eu rhewi mewn nitrogen hylifol a'u storio ar −80 ◦C.
4.2. qRT-PCR ac Adeiladu Plasmid
Tynnwyd cyfanswm RNA o M. anisopliae (hyphae) a M. sativa (gwreiddiau) gydag adweithydd TRIzol (Invitrogen, CA, UDA) yn dilyn cyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Mesurwyd ansawdd a helaethrwydd yr RNA canlyniadol gyda NanoPhotometer® (Implen, Münich, yr Almaen). Perfformiwyd synthesis cDNA llinyn cyntaf (hyd at 2ug RNA) gan ddefnyddio 5 × All-In-One RT Master Mix (Applied Biological Materials Inc., Vancouver, BC, Canada) yn dilyn cyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Perfformiwyd qRT-PCR gan ddefnyddio 2×SYBR Green qPCR Master Mix o'r US EVER BRIGHT ® INC. a system ABI QuantStudio 5 gan ddilyn cyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Rhestrir y paent preimio a ddefnyddir ar gyfer pob genyn yn Nhabl Atodol S2. Defnyddiwyd Maury [58], Msactin [59], a Nbactin [60] fel y genynnau cyfeirio mewnol ar gyfer normaleiddio data mynegiant. Perfformiwyd yr adwaith o dan yr amodau canlynol: 5 munud ar 95 ◦C, ac yna 40 cylch ar 95 ◦C am 15 s ac ar 60 ◦C am 40 s. Roedd tri atgynhyrchiad technegol ar gyfer pob sampl. Cyfrifwyd mynegiant cymharol gan ddefnyddio'r dull 2−∆∆Ct [61]. Pennwyd arwyddocâd ystadegol gan ddefnyddio dadansoddiad un ffordd o amrywiant (ANOVA) a phrawf aml-ystod Duncan yn SPSS v20.0 (SPSS).
4.3. Mynegiant Dros Dro o Broteinau mewn N. benthamiana
Ychwanegwyd at ddilyniant codio MaCFEM85 (CDS) gyda DNA polymeras tra-ffyddlondeb gan ddefnyddio cDNA fel y templed. Ar gyfer y profion lleoleiddio isgellog, cafodd cynhyrchion PCR sy'n cynnwys y CDS ar gyfer MaCFEM85 eu clonio i mewn i pYBA1132-eGFP (wedi'i dreulio gydag EcoRI a SalI) a pcambia1300-cherry (EcoRI a SacI), yn y drefn honno. Dilyswyd yr holl luniadau gyda dilyniant (Tsingke Biotechnology Co., Ltd. Beijing, China). Rhestrir y paent preimio a ddefnyddiwyd yn yr astudiaeth hon yn Nhabl Atodol S2. Ar gyfer mynegiant dros dro o MaCFEM85-eGFP a MaCFEM85-mCherry yn N. benthamiana, cafodd straen A. tumefaciens GV3101 ei drawsnewid gyda phob plasmid a'i ddilysu â PCR. Cafodd yr Agrobacterium ei feithrin dros nos ar 28 ◦C gydag ysgwyd. Casglwyd y celloedd trwy allgyrchiad 5 munud 5000 rpm ar dymheredd yr ystafell, eu golchi dair gwaith â dŵr distyll dwbl di-haint, a'u hailddarparu mewn byffer MgCl2 10 mM (yn cynnwys 10 mM MES a 10 mM acetosyringone, pH 5.7). Addaswyd ataliad y gell i OD600 o 0.5, yna ei ymdreiddio i ochr isaf 4- i 5-ddail N. benthamiana wythnos oed gyda chwistrell 1-mL. Ymdreiddiwyd pob deilen â 50 µL A. tumefaciens; triniwyd tair deilen fesul planhigyn ac roedd tri phlanhigyn ym mhob grŵp triniaeth. Casglwyd y dail wedi'u trin ar ôl 30 h a'u delweddu â microsgop confocal Zeiss LSM980 (Carl Zeiss, yr Almaen) i bennu'r lleoleiddio is-gellog.
manteision cistanche i ddynion-cryfhau system imiwnedd
4.4. Dadansoddiad Ffylogenetig
Adeiladwyd coeden ffylogenetig gan ddefnyddio'r dull uno cymdogion yn MEGA X. Roedd 1000 o atgynhyrchiadau bootstrap yn defnyddio'r model P-pellter. Cafwyd y dilyniannau asid amino a ddefnyddiwyd i gynhyrchu'r goeden gyda chwiliadau BLASTP yn erbyn cronfa ddata NCBI o ffyngau cysylltiedig (ee, Magnaporthe oryzae, Botrytis cinerea, Fusarium graminearum, Colletotrichum graminicola, Fusarium oxysporum, Neurospora crassa, Aspergillus fumigatus, Lasbroiodii, Aspergillus fumigatus, Lasbroiodii, Lasbroiodii , Trichoderma harzianum, Beauveria bassiana, a Paecilomyces lilacinus) gan ddefnyddio MaCFEM85 fel yr ymholiad.
4.5. Profion Burum Dau-Hybrid
Defnyddiwyd System Dau-Hybrid Burum Aur Matchmaker (Labordai Clontech, Inc.; bellach yn Takara Bio USA, Inc.) i wirio'r rhyngweithio rhwng MaCFEM85 a MsWAK16. Cyflwynwyd MaCFEM85 heb y peptid signal i pGBKT7 wrth i'r abwyd a pharth allgellog MsWAK16 (MsWAK16-ED) gael ei fewnosod yn pGADT7 fel ysglyfaeth. Perfformiwyd paratoadau a thrawsnewidiadau celloedd cymwys burum gan ddefnyddio Pecyn Trawsnewid Burum II Frozen-EZ™ (ZYMO Research, CA, UDA) yn dilyn cyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Cyd-drawsnewidiwyd yr abwyd a'r plasmidau ysglyfaeth i'r straen burum Aur. Dadansoddwyd rhyngweithiadau protein-protein yn seiliedig ar dwf ar blatiau cyfrwng gollwng dwbl SD (DDO, SD/-Trp-Leu) a chyfrwng gollwng pedwarplyg SD (QDO, SD/-Trp-Leu-His-Ade).
4.6. Assay BiFC
Er mwyn cynhyrchu'r lluniadau BiFC, cafodd y fectorau pUC-SPYNE a pUC-SPYCE eu llinellu trwy dreulio gyda BamHI. Cafodd CDSs hyd llawn MaCFEM85 a MsWAK16 eu clonio a'u gosod yn y plasmidau llinol gan ddefnyddio ensym ailgyfunol i gael lluniadau MaCFEM a MsWAK YFPC. Cafodd y plasmidau sy'n cynnwys MaCFEM85 a MsWAK16 eu cyd-drawsnewid â fectorau gwag fel rheolyddion negyddol (MaCFEM85-YFPN + pUC-SPYCE, MsWAK16-YFPC + pUC-SPYNE, a pUC-SPYNE + pUC-SPYCE) . Cyflwynwyd yr holl fectorau i N. benthamiana trwy drawsnewidiad wedi'i gyfryngu gan Agrobacterium fel y disgrifir uchod. Gwelwyd signalau fflworoleuedd mewn celloedd epidermaidd dail gan ddefnyddio microsgop confocal Zeiss LSM980 (Carl Zeiss, yr Almaen). Rhestrir y paent preimio a ddefnyddir ar gyfer adeiladu fector yn Nhabl Atodol S2.
4.7. Assay Tynnu i Lawr GST
Ar gyfer y profion tynnu i lawr GST, mewnosodwyd MsWAK16-ED yn y fector pGEX-6P-2 a gosodwyd MaCFEM85 yn pET-21b. Defnyddiwyd y proteinau ymasiad puredig (GST- MsWAK16- ED) a'r pGEX-6P-2 protein no-load (GST) fel y protein abwyd a'r pET pur -21 Defnyddiwyd protein ymasiad b-MaCFEM85 (His-MaCFEM85) fel ysglyfaeth. Perfformiwyd profion tynnu i lawr GST gyda system puro protein Mag-Beads GST Fusion (Sangon Biotech, Shanghai, China) yn dilyn cyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Yn gryno, golchwyd Mag-Beads bum gwaith gyda halwynog 1 × wedi'i glustogi â ffosffad (PBS, pH 7.4) i ryddhau'r amddiffynnydd alcohol ac yna ychwanegwyd 10 ml o GST neu GST-MsWAK16-ED. Cymysgwyd y gleiniau trwy wrthdroad ar dymheredd yr ystafell am 30 munud. Ar ôl tynnu'r supernatant, golchwyd y Mag-Beads bum gwaith gyda 1 × PBS. Ychwanegwyd His-MaCFEM85 at Mag-Beads eisoes wedi'i rwymo â GST, a chafodd y gymysgedd ei ddeor dros nos ar 4 ◦C gyda chylchdroi. Yna golchwyd y gleiniau bum gwaith gyda 1 × PBS i gael gwared ar broteinau heb eu rhwymo. Yn dilyn hynny, proteinau ansymudol ar y gleiniau eu gwahanu gan SDS-TUDALEN, trosglwyddo i bilen nitrocellulose (100 V, 1 h), a'u dadansoddi drwy blot Gorllewinol. Cafodd y pilenni eu golchi dair gwaith am 10 munud yr un gyda PBS + Tween (PBST). Cafodd y pilenni eu rhwystro am 2 h ar dymheredd ystafell gyda 5% o laeth sgim, yna eu deor â gwrthgorff monoclonaidd ProteinFind gwrth-Ei llygoden (TransGen Biotech, Beijing, Tsieina) (gwanhau 1:3000) neu ProteinFind gwrth-gorff monoclonaidd llygoden gwrth-GST ar gyfer 2 h yn 4 ◦C. Yna trochwyd y pilenni mewn gwrthgorff gwrth-gwningen ProteinFind gafr IgG(H+L) (HRP) (TransGen Biotech, Beijing, Tsieina) (gwanhau 1:5000) am 1 awr ar dymheredd ystafell. Delweddwyd y pilenni gyda'r EasySee® Western Blot Kit (TransGen Biotech, Beijing, Tsieina) yn dilyn cyfarwyddiadau'r gwneuthurwr.
4.8. Nodi'r Safle Allweddol yn MaCFEM85
Er mwyn pennu'r maint sydd ei angen ar gyfer rhyngweithio MaCFEM85 â MsWAK16, perfformiwyd ymhelaethiad PCR i gynhyrchu ffurfiau cwtogi lluosog o MaCFEM85. Mewnosodwyd y parth CFEM (MaCFEM85-CFEM; aa gweddillion 19–86) a'r derfynell C heb y parth CFEM (MaCFEM85-C, aa gweddillion 87–170) yn y fector). pGBKT7 fel y protein abwyd (Tabl Atodol S1). Adeiladwyd pum amrywiad arall gan ddefnyddio synthesis polypeptide i dreiglo cystein i alanin yn safleoedd 26, 30, 43, 52, a 26/30/43/50/52/64/69/85 (∆CFEM8526, ∆CFEM8530, ∆4CF, ∆4C, ∆ CFEM8552, a ∆CFEM858 i gyd, yn y drefn honno). Defnyddiwyd yr amrywiadau hyn i berfformio arbrofion Y2H gyda MsWAK16-ED. Assayed y celloedd burum wedi'u trawsnewid ar gyfer twf ar blatiau dropout synthetig SD/- Trp-Leu a phlatiau SD/-Trp-Leu-His-Ade yn cynnwys X- -Galactosidase (X{- -Gal).
4.9. Asesiadau Gwrthsefyll Planhigion
Cafwyd Myzus persicae gan Henan Quanying Biological Co., Ltd. Wythnos cyn dechrau bio-brofion, gosodwyd 150 o lyslau oedolion ar dri phlanhigyn N. benthamiana (50 llyslau fesul planhigyn). Ar ôl 72 h, tynnwyd yr holl oedolion â brwsh artist meddal, a chaniatawyd i'r nymffau fwydo am bedwar diwrnod ychwanegol cyn cael eu trosglwyddo i N. benthamiana ar gyfer y profion perfformiad pryfed gleision.
4.10. Asesiadau Perfformiad Llyslau
Nicotiana benthamiana Domin. (Solanales: Solanaceae) i asesu perfformiad M. persicae, ymwrthedd i glefydau planhigion yn erbyn B. cinerea, a mynegiant genynnau sy'n gysylltiedig â hormonau. Tyfwyd agrobacterium sy'n cario naill ai pYBA-eGFP, pYBA-MaCFEM85, pYBA-MsWAK16, neu pYBA-MaCFEM85+pYBA-MsWAK16 mewn LB ynghyd â gwrthfiotigau priodol am 36 h ar 28 ◦C. Cafodd y celloedd eu golchi deirgwaith, yna eu hailddarparu mewn byffer ymdreiddiad (10 mM MgCl2, 10 mM MES, a 100 µM acetosyringone, pH 5.6) i OD600 o 0.6. Ar gyfer cyd-heintio, addaswyd bacteria sy'n cario MaCFEM85 a MsWAK16 i OD600 o 1.2, ac yna cymysgwyd mewn cyfeintiau cyfartal. Cafodd dail llawn ehangu eu treiddio â bacteria gan ddefnyddio 1-mL chwistrellau heb nodwydd. Ymdreiddiwyd tair deilen ar bob planhigyn a rhoddwyd pob triniaeth ar dri phlanhigyn ar gyfer cyfanswm o 12 planhigyn fesul arbrawf.
Ar gyfer y profion perfformiad llyslau, rhoddwyd 20 o lyslau llawndwf ar ardal ymdreiddiedig pob deilen 12 awr ar ôl i'r Agrobacterium gael ei roi. Cyfyngwyd y pryfed gleision gan ddefnyddio cewyll clip diamedr 5 mm. Ailadroddwyd pob triniaeth bum gwaith. Cofnodwyd marwolaethau llyslau oedolion a nifer y nymffau newydd eu gosod yn ddyddiol am dri diwrnod. Bu B. cinerea yn ddiwylliedig am bum niwrnod ar PDAY. Tua 12 awr ar ôl ymdreiddiad Agrobacterium, cafodd y B. cinerea a oedd newydd ei drin ei dyrnu i mewn i gacen ffwng 5-mm, ac roedd wyneb twf y myseliwm ynghlwm wrth yr ardal ymdreiddiad ar wyneb y ddeilen. Er mwyn hwyluso datblygiad y clefyd, cadwyd y planhigion yn llaith trwy eu gorchuddio â ffilm blastig mewn hambyrddau ar 22 ◦C i hwyluso datblygiad afiechyd. Ar ôl 48 h, amcangyfrifwyd cynnydd y clefyd mewn dail wedi'u brechu trwy fesur maint y briw. Ar gyfer meintioli mynegiant cymharol genynnau perthnasol, casglwyd y tair deilen ymdreiddiedig o bob planhigyn 12 awr ar ôl ymdreiddiad, yna eu rhewi mewn nitrogen hylifol a'u storio ar −80 gradd. Cynhaliwyd cyfanswm echdynnu RNA, synthesis cDNA, a qRT-PCR fel y disgrifir yn Adran 3.2. Mesurwyd lefelau asid salicylic (SA), asid jasmonig (JA), a flavonoid mewn 15 dail N. benthamiana wedi'u hidlo fesul triniaeth. Casglwyd y dail, eu rhewi mewn nitrogen hylifol, yna eu storio ar −80 gradd. Mesurwyd hormonau planhigion gan ddefnyddio Pecynnau ELISA Asid Salicyclic Planhigion ac Asid Jasmonig Planhigion (Beijing WeLab Scientific Co., Ltd.), a mesurwyd flavonoidau gan ddefnyddio'r Pecyn Assay Micro Plant Flavonoids (Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.) yn dilyn cyfarwyddiadau'r gwneuthurwr.
4.11. Dadansoddiad Ystadegol
Dadansoddwyd data yn SPSS v20.0. Canfuwyd gwahaniaethau sylweddol mewn lefelau mynegiant MaCFEM85 a MsWAK16 gan ddefnyddio prawf-t Myfyriwr. Penderfynwyd ar wahaniaethau sylweddol mewn lefelau SA, JA, a flavonoid gan ddefnyddio prawf aml-ystod ANOVA a Duncan gyda throthwy o p <0.05.
5. Casgliadau
Yn yr astudiaeth hon, fe wnaethom nodi a nodweddu protein wedi'i secretu newydd, MaCFEM85, yn M. anisopliae. Canfuwyd ei fod yn effeithydd cadw a all ryngweithio â MsWAK16 ac actifadu ymateb amddiffyn N. benthamiana. Fe wnaethom ddangos bod y parth CFEM a'r gweddillion cystein yn safle 52 yn MaCFEM85 yn hanfodol ar gyfer y rhyngweithio. Gall y rhyngweithio hwn ysgogi ymatebion imiwn sy'n gysylltiedig â JA a mecanweithiau sy'n gwrthsefyll afiechydon ac sy'n gwrthsefyll pryfed yn y planhigyn.
Cyfeiriadau
1. Paulucci, NS; Anta, GG; Gallarato, ALl; Vicario, JC; Cesari, AB; Reguera, YB; Cilmurai, C.; Bueno, MA; García, MB; Dardanelli, MS Partneriaethau planhigion-microb: Goblygiadau ar gyfer twf ac iechyd planhigion. Mewn Symbiosis Microb Planhigion: Hanfodion a Datblygiadau; Springer: Berlin/Heidelberg, yr Almaen, 2013; tt 105–117. [CrossRef]
2. Schenk, PM; Carvalhais, LC; Kazan, K. Datrys rhyngweithiadau planhigion-microb: A all trawsgrifomeg amlrywogaeth helpu? Tueddiadau Biotechnol. 2012, 30, 177–184. [CrossRef]
3. Sasse, J.; Martinoia, E.; Northen, T. Bwydo Eich Cyfeillion: A yw Planhigion Exudates yn Siapio'r Microbiome Gwraidd? Tueddiadau Gwyddonol Planhigion. 2018, 23, 25–41. [CrossRef]
4. Lugtenberg, B. ; Kamilova, F. rhizobacteria sy'n hybu twf planhigion. Annu. Microbiol Parch. 2009, 63, 541–556. [CrossRef]
5. Shoresh, M. ; Harman, GE; Mastouri, F. Ymwrthedd systemig ysgogedig ac ymatebion planhigion i gyfryngau bioreoli ffwngaidd. Annu. Phytopathol Parch. 2010, 48, 21–43. [CrossRef]
6. van de Mortel, JE; de Vos, RC; Dekkers, E. ; Pineda, A. ; Guillod, L. ; Bouwmeester, KJ; van Loon, J. ; Dicke, M.; Raaijmakers, JM Newidiadau metabolaidd a thrawsgrifio a achosir yn Arabidopsis gan y rhizobacterium Pseudomonas fluorescens SS101. Physiol Planhigion. 2012, 160, 2173–2188. [CrossRef]
7. Lareen, A. ; Burton, F.; Schafer, P. Cyfathrebu gwraidd-microb planhigion wrth siapio microbiomau gwreiddiau. Planhigyn Mol. Biol. 2016, 90, 575–587. [CrossRef]
8. Sasan, RK; Bidochka, MJ Mae'r ffwng pryfed-pathogenig Metarhizium Roberts (Clavicipitaceae) hefyd yn endoffyt sy'n ysgogi datblygiad gwreiddiau planhigion. Yn. J. Bot. 2012, 99, 101–107. [CrossRef]
9. Sasan, RK; Bidochka, MJ Antagoniaeth y ffwng pathogenig pryfed endoffytig Metarhizium robertsii yn erbyn y pathogen planhigyn ffa Fusarium solanif. sb. cyfnodoli. Gall. J. Pathol Planhigion. 2013, 35, 288–293. [CrossRef]
10. Ahmad, I. ; Jiménez-Gasco, MdM; Luthe, DS; Shakeel, SN; Mae Barbercheck, ME Endophytic Metarhizium robertsii yn hyrwyddo twf indrawn, yn atal tyfiant pryfed, ac yn newid mynegiant genynnau amddiffynfeydd planhigion. Biol. Rheolaeth 2020, 144, 104167. [CrossRef]
11. Chairin, T. ; Petcharat, V. Sefydlu ymatebion amddiffyn yn Hongkong ffrwythau (Aglaia dookkoo Griff.) yn erbyn ffyngau pydredd ffrwythau gan Metarhizium guizhouense. Biol. Rheolaeth 2017, 111, 40–44. [CrossRef]
12. Hao, K. ; Wang, F.; Nong, X. ; McNeill, MR; Liu, S.; Wang, G. ; Cao, G. ; Zhang, Z. Ymateb gwreiddiau cnau daear Arachis hypogaea i bresenoldeb ffyngau buddiol a phathogenig trwy ddadansoddiad transcriptome. Sci. Rep. 2017, 7, 964. [CrossRef] [PubMed]
13. Patel, ZM; Mahapatra, R.; Jampala, SSM Pennod 11 - Swyddogaeth y rhai sy'n dod i'r afael â ffwngaidd mewn mecanwaith amddiffyn planhigion. Mewn Agweddau Moleciwlaidd ar Ficrobau Planhigion Buddiol mewn Amaethyddiaeth; Sharma, V., Salwan, R., Al-Ani, L., eds.; Gwasg Academaidd: Caergrawnt, MA, UDA, 2020; pp. 143–158. [CrossRef]
14. Dong, X. ; Sa, JA Ethylene, ac ymwrthedd i glefydau mewn planhigion. Curr. Barn. Biol Planhigion. 1998, 1, 316–323. [CrossRef] [PubMed]
15. Thomma, BP; Eggermont, K.; Penninckx, IA; Mauch- Mani, B. ; Vogelsang, R.; Cammue, BP; Broekaert, WF Mae llwybrau ymateb amddiffyn dibynnol ar jasmonad a dibynnol ar salicylate yn Arabidopsis yn hanfodol ar gyfer ymwrthedd i bathogenau microbaidd penodol. Proc. Natl. Acad. Sci. UDA 1998, 95, 15107–15111. [CrossRef] [PubMed]
16. Pant, SR; Irigoyen, S.; Liu, J. ; Bedre, R. ; Christensen, SA; Schmelz, EA; Sedbrook, JC; Scholthof, K.-BG; Mandadi, KK Brachypodium Ffenylalanine amonia lyase (PAL) Yn hyrwyddo amddiffynfeydd gwrthfeirysol yn erbyn firws mosaig Panicum a'i loerennau. Bio 2021, 12, e03518-20. [CrossRef]
17. Liu, R. ; Xu, S.; Li, J. ; Hu, Y.; Lin, Z. Proffil mynegiant genyn PAL o Astragalus membranaceus var. Mongholicus a'i rôl hanfodol yn fflwcs i mewn i flavonoid biosynthesis. Cynrychiolydd Celloedd Planhigion 2006, 25, 705–710. [CrossRef]
18. De Geyter, N.; Gholami, A. ; Goormachtig, S.; Goossens, A. Peiriannau trawsgrifio mewn metabolaeth eilaidd planhigion sy'n deillio o jasmonad. Tueddiadau Gwyddonol Planhigion. 2012, 17, 349–359. [CrossRef]
19. Mirjalili, N.; Linden, JC Effeithiau cyfansoddiad cyfnod nwy ar ddiwylliannau atal o Taxus cuspidata. Biotechnol. Bioeng. 1995, 48, 123–132. [CrossRef]
20. Li, ST; Zhang, P.; Zhang, M.; Fu, CH; Zhao, CF; Dong, YS; Guo, AY; Yu, LJ Proffil trawsgrifio o gelloedd taxus chinensis mewn ymateb i jasmonad methyl. Genom BMC. 2012, 13, 295. [CrossRef]
21. Tugizimana, F. ; Ncube, EN; Stevenkamp, PA; Dubery, IA Mewnwelediadau sy'n deillio o Metabolomeg ar drin synthesis terpenoid mewn celloedd Centella asiatica gan methyl jasmonate. Biotechnol Planhigion. Cynrychiolydd 2015, 9, 125–136. [CrossRef]
22. Lu, M. ; Wong, H. ; Teng, W. Effeithiau ennyn ar gynhyrchu saponin yn niwylliant celloedd Panax ginseng. Cynrychiolydd Celloedd Planhigion 2001, 20, 674–677. [CrossRef]
23. Mandal, S.; Kar, I. ; Mukherjee, AK; Acharya, P. Ymatebion amddiffyn a achosir gan elictor yn Solanum lycopersicum yn erbyn Ralstonia solanacearum. Sci. Byd J. 2013, 25, 561056. [CrossRef]
24. Li, L. ; Wang, S.; Yang, X. ; Francis, F.; Qiu, D. Elicitor protein PeaT1 gwell ymwrthedd yn erbyn llyslau (Sitobion avenae) mewn gwenith. Manag Pla. Sci. 2020, 76, 236–243. [CrossRef] [PubMed]
25. Bujalowski, W. Ehangu rôl ffisiolegol yr hofrennydd hecsamig DnaB. Tueddiadau Biocemeg. Sci. 2003, 28, 116–118. [CrossRef]
26. Vaknin, Y. ; Shadkchan, Y.; Levdansky, E.; Morozov, M.A.; Romano, J.; Osherov, N. Mae'r tri phrotein Aspergillus fumigatus CFEM-parth wedi'i hangori gan GPI (CfmA-C) yn effeithio ar sefydlogrwydd cellfuriau ond nid ydynt yn chwarae rhan mewn ffyrnigrwydd ffwngaidd. Ffwngaidd. Genet. Biol. 2014, 63, 55–64. [CrossRef]
27. Zhao, S.; Shang, X. ; Bi, W. ; Yu, X. ; Liu, D.; Kang, Z. ; Wang, X. ; Wang, X. Genom-Eang Adnabod ymgeiswyr effeithyddion gyda motiffau cadw o'r ffwng rhwd dail gwenith Puccinia triticina. Blaen. Microbiol. 2020, 11, 1188. [CrossRef]
28. Gong, A. ; Jing, Z.; Zhang, K.; Tan, Q. ; Wang, G. ; Liu, W. Dadansoddiad biowybodol a nodweddu swyddogaethol y proteinau CFEM mewn ffwng anthracnose indrawn Colletotrichum graminicola. J. Integr. Amaeth. 2020, 19, 541–550. [CrossRef]
29. Martin, F.; Aerts, A. ; Ahren, D.; Brun, A. ; Danchin, EG; Duchaussoy, F.; Gibon, J.; Kohler, A.; Lindquist, E.; Pereda, V. ; et al. Mae genom Laccaria bicolor yn rhoi cipolwg ar symbiosis mycorhisol. Natur 2008, 452, 88–92. [CrossRef]
30. Stefan, V. ; Lara, RJ Ffyngau entomopathogenig fel endoffytau: Rhyngweithiadau planhigion-endoffyt-llysysydd a rhagolygon i'w defnyddio mewn rheolaeth fiolegol. Curr. Sci. 2015, 109, 46–54.
31. Cai, N. ; Liu, R. ; Yan, D.; Zhang, N.; Zhu, K.; Zhang, D.; Nong, X. ; Tu, X. ; Zhang, Z.; Wang, G. Dadansoddiad biowybodeg a nodweddu swyddogaethol proteinau CFEM Metarhizium anisopliae. J. Ffyngau. 2022, 8, 661. [CrossRef]
32. Stephens, C. ; Hammond-Kosack, KE; a Kanyuka, K. WAKsing imiwnedd planhigion, gwanhau clefydau. J. Exp. Bot 2022, 73, 22–37. [CrossRef]
33. Zhang, ZN; Wu, QY; Zhang, GZ; Zhu, YY; Murphy, RW; Liu, Z. ; Zou, CG Mae dadansoddiadau systematig yn datgelu unigrywiaeth a tharddiad y parth CFEM mewn ffyngau. Sci. Rep. 2015, 5, 13032. [CrossRef] [PubMed]
34. Fang, A. ; Gao, H.; Zhang, N.; Zheng, X. ; Qiu, S.; Li, Y. ; Zhou, S.; Cui, F. ; Sun, W. Mae genyn effeithydd newydd SCRE2 yn cyfrannu at ffyrnigrwydd llawn Ustilaginoidea virens i reis. Blaen. Microbiol. 2019, 10, 845. [CrossRef] [PubMed]
35. Zhu, W. ; Wei, W. ; Wu, Y. ; Zhou, Y.; Peng, F. ; Zhang, S.; Chen, P.; Xu, X. Mae BcCFEM1, protein sy'n cynnwys parth CFEM gyda safle tybiedig wedi'i angori gan GPI, yn ymwneud â phathogenedd, cynhyrchu conidial, a goddefgarwch straen yn Botrytis cinerea. Blaen. Microbiol. 2017, 8, 1807. [CrossRef]
36. Xu, X. ; Li, G. ; Li, L. ; Su, Z. ; Chen, C. Dadansoddiad cymharol genom-eang o dderbynyddion cyplydd protein G cysylltiedig â Pth mewn ffyngau sy'n perthyn i Pezizomycotina. BMC Microbiol. 2017, 17, 166. [CrossRef] [PubMed]
37. Peng, YJ; Hou, J. ; Zhang, H.; Lei, JH; Lin, HY; Ding, JL; Feng, MG; Ying, SH Mae cyfraniadau systematig o barth CFEM sy'n cynnwys proteinau i gaffael haearn yn hanfodol ar gyfer rhyngweithio rhyngrywogaethol y ffwng pathogenig ffilamentous Beauveria bassiana. Amgylch. Microbiol. 2022, 24, 3693–3704. [CrossRef] [PubMed]
38. Roy, U. ; Kornitzer, D. Heme-haearn caffael mewn ffyngau. Curr. Barn. Microbiol. 2019, 52, 77–83. [CrossRef] [PubMed]
39. Okamoto-Shibayama, K.; Kikuchi, Y.; Kokubu, E.; Sato, Y.; Mae Ishihara, K. Csa2, aelod o'r teulu protein Rbt5, yn ymwneud â defnyddio haearn o haemoglobin dynol yn ystod twf hyffaidd Candida albicans. Burum FEMS Res. 2014, 14, 674–677. [CrossRef]
40. Perez, A. ; Pedros, B. ; Murgui, A. ; Casanova, M.A.; Lopez-Ribot, JL; Martinez, JP Ffurfiant Biofilm gan mutants Candida albicans ar gyfer genynnau sy'n codio proteinau ffwngaidd sy'n arddangos y parth CFEM sy'n cynnwys wyth cystein. Burum FEMS Res. 2006, 6, 1074–1084. [CrossRef]
41. Hogg, PJ Bondiau disulfide fel switshis ar gyfer swyddogaeth protein. Tueddiadau Biocemeg. Sci. 2003, 28, 210–214. [CrossRef]
42. van den Burg, HA; Westerink, N.; Francoijs, KJ; Roth, R. ; Woestennk, E.; Boeren, A.S.; de Wit, PJ; Joosten, MH; Vervoort, J. Mae mwtaniaid o AVR4 o'r pathogen tomato Cladosporium fulvum sy'n tarfu ar fondiau disulfide naturiol yn sensitif i proteolysis, yn gwrthsefyll Cf-4-cyfryngol, ond yn cadw eu gallu i rwymo chitin. J. Biol. Cemeg. 2003, 278, 27340–27346. [CrossRef] 43. Hu, K.; Cao, J. ; Zhang, J.; Xia, F.; Ke, Y.; Zhang, H.; Xie, W.; Liu, H.; Cui, Y. ; Cao, Y.; et al. Gwella nodweddion agronomig lluosog gan enyn gwrthsefyll afiechyd trwy atgyfnerthu cellfur. Nat. Planhigion 2017, 3, 17009. [CrossRef] [PubMed]
44. Saitoh, H. ; Fujisawa, S.; Mitsuoka, C.; Ito, A. ; Hirabuchi, A.; Ikeda, K.; Irieda, H.; Yoshino, K.; Yoshida, K.; Matsumura, H.; et al. Mae tarfu genynnol ar raddfa fawr yn Magnaporthe oryzae yn nodi MC69, protein wedi'i gyfrinachu sydd ei angen ar gyfer haint gan bathogenau ffwngaidd monocot a dicot. PLoS Pathog. 2012, 8, e1002711. [CrossRef] [PubMed]
45. Kulkarni, RD; Kelkar, HS; Dean, R. Parth CFEM sy'n cynnwys wyth cystein sy'n unigryw i grŵp o broteinau pilen ffwngaidd. Tueddiadau Biocemeg. Sci. 2013, 28, 118–121. [CrossRef] [PubMed]
46. Peng, J. ; Wu, L. ; Zhang, W.; Zhang, Q.; Xing, Q. ; Wang, X. ; Li, X. ; Yan, J. Adnabod systemig a nodweddu swyddogaethol sy'n gyffredin mewn proteinau pilen allgellog ffwngaidd yn Lasiodiplodia theobromae. Blaen. Gwydd Planhigion. 2021, 12, 804696. [CrossRef]
47. Bari, R. ; Jones, JD Rōl hormonau planhigion mewn ymatebion amddiffyn planhigion. Planhigyn Mol. Biol. 2009, 69, 473–488. [CrossRef]
48. Verma, V. ; Ravindran, P.; Kumar, PP Plant rheoleiddio ymatebion straen wedi'i gyfryngu gan hormonau. Biol Planhigion BMC. 2016, 16, 86. [CrossRef]
49. Javed, K. ; Qiu, D. Protein elicitor PeBL1 o Brevibacillus laterosporus yn gwella ymwrthedd yn erbyn Myzus persicae mewn Tomato. Pathogenau 2020, 9, 57. [CrossRef]
50. Basit, A. ; Hanan, A. ; Nazir, T.; Majeed, MZ; Qiu, D. Nodweddu moleciwlaidd a swyddogaethol elicitor PeBC1 a echdynnwyd o Botrytis cinerea sy'n ymwneud â sefydlu ymwrthedd yn erbyn llyslau eirin gwlanog gwyrdd (Myzus persicae) mewn ffa cyffredin (Phaseolus vulgaris L.). Pryfed 2019, 10, 35. [CrossRef]
51. Nazir, T. ; Hanan, A. ; Basit, A. ; Majeed, MZ; Anwar, T.; Nawaz, I. ; Qiu, D. Rôl dybiedig ysgogydd protein nad yw eto'n nodweddu PeBb1 Yn deillio o Beauveria bassiana ARSEF 2860 Straen yn erbyn Myzus persicae (Homoptera: Aphididae) yn Brassica rapa ssp. pekinensis. Pathogenau 2020, 9, 111. [CrossRef]
52. Spoel, SH; Koornneef, A. ; Claessens, SM; Korzelius, YH; Van Pelt, JA; Mueller, MJ; Buchala, AJ; Metraux, YH; Brown, R. ; Kazan, K.; et al. Mae NPR1 yn traws-siarad rhwng llwybrau amddiffyn sy'n ddibynnol ar salicylate a jasmonad trwy swyddogaeth newydd yn y cytosol. Cell Planhigion 2003, 15, 760–770. [CrossRef]
53. Xin, XF; Ef, SY Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000: Model o bathogen ar gyfer archwilio tueddiad i glefydau a signalau hormonau mewn planhigion. Annu. Phytopathol Parch. 2013, 51, 473–498. [CrossRef] [PubMed]
54. Zhang, X. ; Wang, C. ; Zhang, Y.; Haul, Y. ; Mou, Z. Mae is-uned cymhleth cyfryngwr Arabidopsis16 yn rheoleiddio'n gadarnhaol ymwrthedd caffael systemig wedi'i gyfryngu â salicylate a llwybrau amddiffyn a achosir gan jasmonad/ethylen. Cell Planhigion 2012, 24, 4294–4309. [CrossRef] [PubMed]
55. Doares, SH; Narvaez-Vasquez, J.; Conconi, A. ; Ryan, CA Mae asid salicylic yn atal synthesis atalyddion proteinas mewn dail tomato a achosir gan systemin ac asid jasmonig. Physiol Planhigion. 1995, 108, 1741–1746. [CrossRef] [PubMed]
56. Pieterse, CM; Leon-Reyes, A.; Van der Ent, S.; Van Wees, SC Rhwydweithio gan hormonau moleciwlaidd bach mewn imiwnedd planhigion. Nat. Cemeg. Biol. 2009, 5, 308–316. [CrossRef]
57. Penninckx, IA; Thomma, BP; Buchala, A. ; Métraux, YH; Broekaert, WF Mae angen actifadu llwybrau ymateb jasmonad ac ethylene ar yr un pryd ar gyfer sefydlu genyn amddiffynfa planhigion mewn Arabidopsis. Cell Planhigion 1998, 10, 2103–2113. [CrossRef]
58. Fang, W. ; Bidochka, MJ Mynegiant genynnau sy'n ymwneud ag egino, conidiogenesis a phathogenesis mewn Metarhizium anisopliae gan ddefnyddio RT-PCR amser real meintiol. Mycol. Res. 2006, 110, 1165–1171. [CrossRef]
59. Guerriero, G. ; Legay, S.; Hausman, JF Alfalfa Mynegiant genyn synthase cellwlos o dan straen anfiotig: Canllaw Hitchhiker i normaleiddio RT-qPCR. PLoS ONE 2014, 9, e103808. [CrossRef]
60. Yang, Y.; Zhang, Y.; Li, B. ; Yang, X. ; Dong, Y.; Qiu, D. Mae Verticillium dahliae pectate lyase yn ysgogi ymatebion imiwnedd planhigion ac yn cyfrannu at ffyrnigrwydd. Blaen. Gwydd Planhigion. 2018, 9, 1271. [CrossRef]
61. Livak, KJ; Schmittgen, TD Dadansoddiad o ddata mynegiant genynnau cymharol gan ddefnyddio PCR meintiol amser real a'r Dull 2 (-Delta Delta C(T)). Dulliau 2001, 25, 402–408. [CrossRef]
