Mae'r Protease Calpain2a yn Cyfyngu ar Imiwnedd Cynhenid ​​Trwy Dargedu TRAF6 mewn Pysgod Teleost

Mae ffactor 6 sy'n gysylltiedig â derbynyddion TNF (TRAF6) yn chwarae rôl trawsgludo signal allweddol mewn llwybrau signalau gwrthfacterol a gwrthfeirysol. Fodd bynnag, mae llai o adroddiadau am fecanweithiau rheoleiddio TRAF6 mewn fertebratau is. Yn yr astudiaeth hon, rydym yn nodi calpain2a, fel aelod o'r teulu proteasau sy'n ddibynnol ar galsiwm gyda gweithgaredd ensymau hydrolytig unigryw, ac yn gweithredu fel rheolydd allweddol ar gyfer imiwnedd gwrthfacterol a gwrthfeirysol mewn pysgod teleost. Ar ôl ysgogi lipopolysaccharide (LPS), mae dymchwel calpain2a yn hyrwyddo dadreoleiddio cytocinau llidiol. Yn fecanyddol, mae calpain2a yn rhyngweithio â TRAF6 ac yn lleihau lefel protein TRAF6 trwy hydrolysu. Ar ôl colli gweithgaredd ensymatig, mae mutant calpain2a yn gystadleuol yn atal ffurfio pylu ac awto-ubiquitination TRAF6. Mae Knockdown calpain2a hefyd yn hyrwyddo ymateb gwrthfeirysol cellog. Mutant calpain2a diffyg gweithgaredd hydrolase yn atal hollbresennol o ffactor rheoleiddio IFN (IRF) 3/7 o TRAF6. Gyda'i gilydd, mae'r canfyddiadau hyn yn dosbarthu calpain2a fel rheolydd negyddol o ymatebion imiwn cynhenid ​​trwy dargedu TRAF6 mewn pysgod teleost.

cistanche tubulosa-gwella system imiwnedd

Fel y llinell amddiffyn gyntaf yn erbyn pathogenau goresgynnol, mae imiwnedd cynhenid ​​​​yn chwarae rhan bwysig wrth amddiffyn y corff rhag goresgyniad bacteriol a heintiau firaol. Mae derbynyddion adnabod patrymau (PRRs) ar y bilen yn adnabod patrymau moleciwlaidd sy'n gysylltiedig â phathogenau (PAMPs)1–3 ar unwaith. Y tri PRR a astudiwyd fwyaf mewn imiwnedd cynhenid ​​yw derbynyddion tebyg i dollau (TLRs), derbynyddion tebyg i RIG-I (RLRs), a derbynyddion tebyg i NOD (NLRs), sy'n cydnabod gwahanol PAMPs a rhaeadrau signal sbarduno i actifadu cytocinau prolidiol a ffactor gwrthfeirysol 4-6. Mae ffactor sy'n gysylltiedig â derbynyddion TNF (TRAF) 6 yn rhan anhepgor o'r frwydr yn erbyn goresgyniad bacteriol a heintiau firaol. Fel llwybr signal pwysig a weithredir gan lipopolysaccharide (LPS), mae'r llwybr ffactor trawsgrifio niwclear-κB (NF-κB) wedi'i fapio'n fanwl. Mae'r rhan fwyaf o'r swyddogaethau protein yn llwybr signalau NF-κB wedi'u hastudio'n helaeth1,7. Mae ffactor gwahaniaethu myeloid 88 (MyD88) yn cael ei actifadu gyntaf gan TLRs mewn ymateb i LPS, ac mae IRAK4 yn gweithredu fel cyfryngwr trwy actifadu IRAK1 ac IRAK2, sy'n cysylltu MyD88 â TRAF68-11. Mae Ubc13 ac Uev1A yn cataleiddio hollbresennol cysylltiedig K TRAF6, sy'n trosglwyddo'r gadwyn ubiquitin K63 i TAB2 a TAB3, gan arwain at actifadu TAK112–16. Mae TRAF6-ysgogydd IKK 2 (TRIKA2) a reoleiddir gan TRAF, sy'n cynnwys TAK1, TAB1 a TAB2, yn actifadu atalydd IκB kinase (IKK) / ffosfforyleiddiad17–19. Mae ffactor trawsgrifio NF- κB yn mynd i mewn i'r cnewyllyn ac yn hyrwyddo cynhyrchu cytocinau llidiol20. Pan fydd TLR7/9 yn adnabod y firws, mae cyfadeilad MyD{88- IRAKs-TRAF6 yn trawsyrru signalau i ffactor rheoleiddio IFN (IRF) 7, yn hyrwyddo hollbresennol IRF7, ac yn actifadu ei ffosfforyleiddiad i'r cnewyllyn21,22. Yn y llwybr signalau RLR, mae RIG I a genyn 5 sy'n gysylltiedig â gwahaniaethu melanoma (MDA5) yn actifadu protein signalau gwrthfeirysol mitocondriaidd (MAVS)23,24. Mae cydgasglu MAVS yn nodwedd bwysig o ddechrau trawsyrru signal RLR23,25,26. TRAF2/3/6 yw'r ffactorau cyntaf a weithredir gan MAVS27,28. Bydd TRAF3 yn actifadu signalau TBK{1-IRF3), a bydd cyfadeilad MAVS-TRAF6 yn actifadu signalau NF-κB, sy'n hyrwyddo mynegiant IFN{-127,29.

manteision cistanche ar gyfer dynion-cryfhau system imiwnedd

Mae mecanwaith moleciwlaidd actifadu TRAF6 eisoes wedi'i ddangos. Mae TRAF6 ar ffurf dimer yn cael awtoubiquitination o dan gatalysis Ubc13 ac Uev1A, sy'n gysylltiedig â pharth bys Ring a pharth bysedd ZF. Mae model TRAF6/Ubc13~UB yn cadarnhau rôl bwysig dimer TRAF6 wrth agregu a throsglwyddo'r gadwyn ubiquitin K6330. Yn ogystal, adroddwyd bod parth bys Ring a bysedd ZF yn recriwtio cyfuniadau E2~ub yn y model crisial TRAF6 zebrafish, a darganfuwyd y gallai TRAF6 ffurfio heterodimer gyda TRAF5 o'r un teulu TRAF am y tro cyntaf16. Mae'r proteinau teulu deubiquitination: A20, CYLD, USP2a, USP4, ac USP20 yn targedu TRAF6 i gael gwared ar hollbresennol sy'n gysylltiedig â K a lleihau signalau i lawr yr afon31–35. Mae'r system burum dau hybrid yn sgrinio'r rhyngweithio rhwng UBE2O a TRAF6 allan ac yn cadarnhau bod y rhyngweithio hwn yn effeithio'n uniongyrchol ar actifadu TRAF6 gan MyD8836. Yn y broses trawsgludo signal i lawr yr afon o TRAF6, mae ECSIT fel protein canolraddol yn rhyngweithio â TRAF6 a TAK1 yn y drefn honno, ac mae'r rhyngweithio hwn yn cryfhau rhwymiad TRAF6 a TAK137. Mewn signalau TLR4 a achosir gan LPS, mae PRDXs yn atal TRAF6 rhag recriwtio ECSIT i gyflenwi'r gadwyn ubiquitin K63 a hefyd yn atal BECN1 a weithredir gan TRAF6 yn y llwybr awtophagi38. Mae MST4 yn actifadu ffosfforyleiddiad TRAF6 yn Thr463 a Thr486 ac yn atal pylu TRAF6 a hollbresennol39. Mewn mamaliaid, mae mecanwaith rheoleiddio protein TRAF6 wedi'i astudio'n eang mewn imiwnedd gwrthfacterol a gwrthfeirysol. Fodd bynnag, mae llai o astudio ymchwil TRAF6 mewn fertebratau is. Mae'r ymateb imiwn mewn pysgod teleost yn bennaf yn dibynnu ar lwybrau TLR a RLR i weithredu'r ymateb imiwn ar ôl haint pathogen. Felly, mae'n hanfodol archwilio mecanwaith rheoleiddio llwybrau signalau cyfryngol TRAF. Mae calpain2 (m-calpain) yn deulu o broteasau dibynnol ar galsiwm, sy'n cynnwys mwy nag 16 aelod mewn mamaliaid a llawer o organebau eraill40. Mae'r astudiaeth gynharaf o'r teulu protein calpain yn gysylltiedig â symudiad celloedd41. mae calpain yn hybu mudo celloedd a chanfuwyd ei fod yn atal mudo neutrophil ac actifadu p38 MAPK ac ERK MAPK42. Mae gweithgaredd hydrolase yn un o swyddogaethau pwysig calpain. Mewn rheoleiddio imiwn, mae calpain-2 yn hyrwyddo rhyddhau NF-κB trwy hydroleiddio IkB ac yn actifadu'r llwybr signalau43. Yn yr astudiaeth hon, rydym wedi pennu bod calpain2a yn rhyngweithio â TRAF6 ac yn gweithredu fel rheolydd negyddol mewn ymatebion gwrthfacterol a gwrthfeirysol mewn pysgod teleost, croaker miiuy (Miichthys miiuy). Mae calpain2a yn hyrwyddo diraddio lefel protein TRAF6 trwy ei weithgaredd hydrolase. Yn y cyfamser, mae diffyg gweithgaredd hydrolase mutant calpain2a yn atal ffurfio cadwyn ubiquitin K63 trwy atal dimer TRAF6. Adlewyrchir bod calpain2a a mutant calpain2a yn terfynu hollbresennoldeb TRAF6 i ECSIT/ BENC1/IRF3/IRF7. Mae calpain2a yn atal proses signalau NF-κB ac IFN trwy dargedu TRAF6. Mae ein canlyniadau yn darparu moleciwl ar gyfer astudio rheoleiddio imiwnedd cyfryngol TRAF mewn fertebratau is.

Canlyniadau

Mae calpain2a yn rhyngweithio â TRAF6 ac yn rheoleiddio signalau NF- κB yn negyddol.

Er mwyn cael mewnwelediad i broteinau sy'n gysylltiedig â TRAF mewn ymateb imiwnedd cynhenid ​​​​mewn pysgod teleost, fe wnaethom nodweddu'r crocer miiuy TRAF6 interactiveome gan ddefnyddio puro affinedd a sbectrometreg màs. Wedi'i drefnu yn ôl dwyster meintioli di-label (LFQ), fe wnaethom ryng-gipio rhan o'r data a'i arddangos (Ffig. 1a). Ymhlith proteinau sy'n gysylltiedig â TRAF, mae'n bosibl bod calpain2a wedi'i reoleiddio ar gyfer gweithgarwch TRAF6 a llwybrau signalau cyfryngol TRAF wedi'u heffeithio. Yn gyntaf, dylid ymchwilio i'r berthynas rhwng calpain2a a TRAF6 ar y lefel protein, gwnaethom wirio'r rhyngweithio rhwng calpain2a a TRAF6 yn llinellau celloedd arennau Miiuy croaker (MKC). Dangosodd arbrofion communoprecipitation mewndarddol fod calpain2a yn rhyngweithio â TRAF6 (Ffig. 1b, c). Fel y dangosir gan transfection dros dro ac arbrofion coimmunoprecipitation, calpain2a overexpressed a TRAF6 rhyngweithio â'i gilydd (Ffig. 1d, e). Mae'r rhain i gyd yn dynodi bod calpain2a yn rhyngweithio â TRAF6 a bod angen arbrofion pellach i ymchwilio i fecanwaith eu gweithred. Trwy aliniad dilyniant Lluosog o broteinau dynol, llygoden, pysgod sebra, a gall croaker calpain2a proteinau, calpain2a yn cael ei warchod esblygiadol rhwng pysgod a mamaliaid (Ffig. 1f). Er mwyn pennu swyddogaeth calpain2a mewn imiwnedd cynhenid, fe wnaethom archwilio a oedd calpain2a yn gysylltiedig ag actifadu NF-κB a achosir gan ysgogiad LPS. Fe wnaethom drosglwyddo celloedd epithelioma papulosum cyprinid (EPC) gyda gohebydd luciferase NF-κB, gohebydd rheolaeth fewnol renilla luciferase, a fector amgodio calpain2a neu fector gwag. gostyngodd calpain2a weithgaredd gohebydd NF-κB yn sylweddol ar ysgogiad LPS mewn modd sy'n dibynnu ar ddos ​​(Ffig. 1g). Ar ben hynny, gostyngwyd cytocinau proinflammatory megis IL-1 ac IL-8 hyrwyddwr sy'n ymateb i symbyliad LPS yn sylweddol mewn celloedd EPC calpain2a-gor-bwysleisio (Ffig. 1h, i), gan awgrymu rôl bosibl i calpain2a mewn signalau llidiol llwybrau a achosir gan ysgogiad LPS.

cistanche tubulosa-gwella system imiwnedd

Cliciwch yma i weld cynhyrchion Gwella Imiwnedd Cistanche

【Gofyn am fwy】 E-bost:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Rheoleiddio signalau NF-κB a achosir gan LPS yn negyddol gan calpain2a.

Er mwyn ymchwilio i rôl bosibl calpain2a mewn signalau NF-κB, fe wnaethom drawsgludo calpain2a yn MKC gyda graddiant amser o LPS ac asesu cytocinau prolidiol a oedd yn ymatebol i LPS. Arweiniodd gorfynegiant calpain2a at is-reoleiddio mynegiant IL-1 , IL-8, ac IL-6 (Ffig. 2a). Nesaf, rydym yn cynllunio dau calpain2a-benodol RNAs ymyrryd bach (siRNAs) is-reoledig calpain2a effeithlon (Ffig. 2b, d). Fe wnaeth cnocio calpain2a wella cytocinau prolidiol a achosir gan LPS yn sylweddol gan gynnwys IL-1 ac IL-8 yn llinellau celloedd coluddyn croaker MKC a Miiuy (MIC) (Ffig. 2c, e). Yn y grŵp o gelloedd a symbylwyd gan LPS, fe wnaeth dymchwel calpain2a gynyddu amlhau celloedd. Yn yr un modd, yn absenoldeb unrhyw ysgogiad, canfuom fod dymchwel calpain2a hefyd yn cynyddu amlhau celloedd (Ffig. 2f). Er mwyn penderfynu a oedd calpain2a yn atal proteinau mewn signalau NF-κB a achosir gan LPS, roedd calpain2a yn atal lefel protein mewndarddol o TRAF6 yn sylweddol ond nid MyD88, IRAK4, neu TAK1 (Ffig. 2g). I grynhoi, roedd cineteg calpain2a a mynegiant cytocin proinflammatory yn awgrymu bod calpain2a yn cael ei gynnwys yn swyddogaethol mewn signalau NF-κB a achosir gan LPS.

Ffig. 1 mae calpain2a yn rhyngweithio â TRAF6 ac yn atal y Llwybr Signalau NF-κB. a Rhestr o ryngweithio TRAF6 yn seiliedig ar ddwysedd meintioli di-Label (adran). b, c Celloedd MKC wedi'u hadu mewn dysglau 6 cm2. Ar ôl 24 h, cafodd lysadau celloedd eu gwrthimiwnedd (IP) gyda geliau affinedd gwrth-TRAF6 neu gwrth-calpain2a. Yna dadansoddwyd y immunoprecipitates a lysates cell gan IB gyda'r gwrth-TRAF6 a gwrth-calpain2a Abs, yn y drefn honno. d, d Trawsnewidiwyd 293 o gelloedd HEK wedi'u hadu mewn dysglau 6 cm2 â'r plasmidau calpain2a-Flag a TRAF6-Myc (2 ug yr un). Ar ôl 24 h, cafodd lysadau celloedd eu gwrthimiwnedd (IP) gyda geliau affinedd gwrth-Myc d neu gwrth-Flag e. Yna dadansoddwyd y immunoprecipitates a lysates cell gan IB gyda'r gwrth-Myc a gwrth-Flag Abs, yn y drefn honno. f Amlygir yr un asidau amino ymhlith calpain2a dynol (Hu-calpain2), calpain2a llygoden (Mu-calpain2), calpain2a pysgodyn sebra (ZF-calpain2a) a crocer miiuy calpain2a (M-calpain2a) gyda chefndir du. Trawsnewidiwyd celloedd EPC g–I â calpain2a-Flag neu fector gwag ynghyd â'r gohebwyr NF-κB, IL-1 , ac IL-8 luciferase. Ar 24 h ar ôl y trosglwyddiad, ni chafodd celloedd eu trin (Ffwg) neu eu trin ag LPS am 6 h. Cyflawnwyd y gwerth gweithgaredd luciferase yn erbyn y gweithgaredd Renilla luciferase (n=3 fesul grŵp). Defnyddiwyd dadansoddiad blotiau gorllewinol i fesur mynegiant y Faner calpain2a a drosglwyddwyd dros dro. Defnyddiwyd mynegiant Tubulin fel rheolydd llwytho. Dadansoddwyd data gan ANOVA dwy ffordd (g, h, i). **p < 0.01. Perfformiwyd pob arbrawf mewn o leiaf dri arbrawf annibynnol.

Rhyngweithiad calpain2a â TRAF6.

Gwnaed dadansoddiad parth gan ddefnyddio Cronfa Ddata Parthau Cadw (CDD) NCBI. Mae calpain2a yn cynnwys tri pharth: parth protease cystein teulu Calpain (CysPc) (aa 46-339), is-uned fawr ganolog Calpain parth III (aa 360-499), a pharth llaw Penta-EF terfynell C ( aa 500-697). Er mwyn pennu pa barth(au) o calpain2a oedd eu hangen ar gyfer ei ryngweithiad â TRAF6, rydym wedi creu tri mwtant cwtogi: calpain2a (1-339), calpain2a (340-697), a calpain (500-697). (Ffig. 3a). Trawsnewidiwyd celloedd HEK293 â math gwyllt calpain2a-Flag (WT), mutants cwtogi calpain2a-Flag, neu fector TRAF6-HA. Canfuom y gallai calpain2a hyd llawn a thri mutants cwtogi ryngweithio â TRAF6 (Ffig. 3c). Mae TRAF6 yn cynnwys parth TRAF terfynell-C, parth coil torchog, parth bysedd Sinc, a pharth bys cylch38. Er mwyn archwilio pa barth(au) o TRAF6 oedd eu hangen ar gyfer ei ryngweithiad â calpain2a, gwnaethom gyfres o fwtaniaid cwtogi TRAF6, gan gynnwys TRAF6 (1-139), TRAF6 (140-574), TRAF6 ({{36) }}), a TRAF6 (400-574). Yn y cyfamser, gwnaethom y mutants parth: TRAF6ΔRing (lle mae'r parth bys Ring yn cael ei ddileu), TRAF6ΔZF (lle mae'r parth bysedd Sinc yn cael ei ddileu), TRAF6ΔCC (lle mae'r parth coiled-coil yn cael ei ddileu), a TRAF6ΔTRAF-C ( lle mae parth C-terminal TRAF yn cael ei ddileu) (Ffig. 3b). roedd calpain2a yn rhyngweithio â'r TRAF6 hyd llawn yn ogystal â chwtogi TRAF6 a oedd yn cynnwys parth TRAF terfynell-C, parth coiled-coil, parth bysedd Sinc (Ffig. 3d, f), ond nid â pharth bys Ring (Ffig. 3e) . Dangosodd profion Luciferase fod gorfynegiant calpain2a a'r mutants cwtogi hyn yn atal gweithgarwch gohebwyr NF-κB ac IL-1 mewn celloedd EPC yn sylweddol (Ffig. 3h). Ymhellach, ymchwiliwyd i gydleoli isgellog calpain2a gyda TRAF6. Trawsnewidiwyd celloedd EPC gyda TRAF6-GFP a fector gwag neu calpain2a-mCherry. Dangosodd dadansoddiad microsgopeg confocal fod signalau gwyrdd TRAF6 yn gorgyffwrdd â signalau coch calpain2a, a ddangosodd fod calpain2a yn cyd-leoli â TRAF6 mewn celloedd EPC (Ffig. 3i, j). Mae'r data hyn yn dangos bod sail strwythurol parthau lluosog o TRAF6 (C-terminal parth TRAF, parth torchog-coil, parth bysedd Sinc) ond nid y parth bys Ring yn benderfynydd ar gyfer ei gysylltiad â calpain2a (Ffig. 3g).

Mae Ffig. 2 calpain2a negatif yn rheoleiddio Llwybr Signalau NF-κB a achosir gan LPS. mRNA IL-1 , IL-8, ac IL-6 mRNA yn MKC wedi'u trawsliwio â calpain2a-Flag neu fector gwag a'i drin â halwynog (0) neu ei herio â LPS ar gyfer gwahanol amseroedd (2 h, 4 h, 6 h, 8 h, 10 h) (n=3 fesul grŵp). b, d Trawsnewidiwyd celloedd MKC a chelloedd MIC gyda si-calpain2a #1 a si-calpain2a #2 (100 nM) neu si-ctrl (100 nM). Ar ôl trosglwyddo 48 h, roedd mynegiant calpain2a yn cael ei fesur gan qRT PCR (n=3 fesul grŵp). Pennwyd lefel y protein calpain2a gan blotio Gorllewinol. c, e IL-1 , IL-8 mRNA yn MKC a MIC wedi'u trawsliwio'n sefydlog â si-calpain2a #1 neu si-ctrl (fector rheoli) a'i drin â saline (0) neu ei herio â LPS ar gyfer gwahanol amseroedd (4 h, 8 h) (n=3 fesul grŵp). f Trawsnewidiwyd celloedd MKC gyda naill ai si-ctrl neu si-calpain2a #1. Ar ôl trosglwyddo 36 h, ysgogwyd y celloedd â LPS am 12 h, yna mesurwyd assay amlhau celloedd (n=3 fesul grŵp). Bar graddfa, 100 μm. g calpain2a-Flag ei ​​thrawsnewid i mewn i gelloedd MKC a heriwyd gyda LPS ar wahanol adegau (3 h, 6 h, 9 h). Dadansoddiad Immunoblot o lysates cell gyda Abs a nodir. Cafodd lefel mRNA gymharol ei normaleiddio i fynegiant yr amgodio genyn -actin ym mhob sampl. Perfformiwyd pob arbrawf mewn o leiaf dri arbrawf annibynnol. Dadansoddwyd data gan ANOVA dwy ffordd (a, c, e, f) neu ANOVA unffordd (b, d). *p < 0.05, **p < 0.01.

Ffig. 3 Rhyngweithiad calpain2a â TRAF6. a, b Defnyddiwyd diagramau sgematig o drefniadaeth parth yn miiuy croaker calpain2a, TRAF6, a mutants yn yr astudiaeth hon. Mae "+" yn cynrychioli'r rhyngweithiad gyda TRAF6 neu calpain2a, mae " -" yn golygu dim rhyngweithiad. c Trawsnewidiwyd celloedd HEK293 â ffug, math gwyllt calpain2a-Flag (WT), a mutants cwtogi calpain2a-Flag, neu TRAF6-HA fel y nodir. Am 24 h ar ôl y trawsgludiad, echdynnwyd celloedd wedi'u trawsgludo a bu i lysates celloedd gael eu himiwneiddio â gwrthgorff gwrth-HA ac yna IB gan ddefnyddio gwrthgorff gwrth-HA neu wrth-Flag. d–f cafodd celloedd HEK293 eu trawslifo â ffug, TRAF6-HA math gwyllt (WT), a TRAF6- mutants cwtogi HA, neu calpain2a-Flag fel y nodir. Am 24 h ar ôl y trawsgludiad, echdynnwyd celloedd wedi'u trawsgludo a chafodd lysadau celloedd eu rhoi i imiwnedd gyda gwrthgorff gwrth-HA d, f, neu wrthgorff gwrth-Flag e ac yna IB gan ddefnyddio gwrthgorff gwrth-HA neu wrth-Flag. g Safle rhyngweithio TRAF6 a calpain2a. h Trawsnewidiwyd celloedd EPC gyda TRAF6-HA, calpain2a-Flag, neu mutants cwtogi calpain2a-Flag ynghyd â gohebwyr luciferase NF-κB ac IL-1. Ar ôl 36 h ôl-drawsnewidiad, cyflawnwyd y gwerth gweithgaredd luciferase yn erbyn y gweithgaredd renilla luciferase (n=3 fesul grŵp). I j Trawsnewidiwyd celloedd EPC â ffug, calpain2a-mCherry, a TRAF6-GFP. Dangosir niwclysau wedi'u lliwio gan DAPI mewn glas. canfuwyd calpain2a gyda fflworoleuedd coch, a chanfuwyd TRAF6 gyda fflworoleuedd gwyrdd. Bar graddfa, 10 μm. Perfformiwyd pob arbrawf mewn o leiaf dri arbrawf annibynnol. Dadansoddwyd data gan ANOVA unffordd (h). **p < 0.01.

Mae calpain2a yn atal lefel mynegiant protein TRAF6 gan weithgaredd proteolytig.

Er mwyn archwilio mecanwaith rheoleiddio calpain2a ar TRAF6, archwiliwyd yn gyntaf a oedd calpain2a wedi cael effaith ar TRAF6 ar lefel protein. calpain2a-Myc a TRAF6-Cafodd y faner eu cyd-drosglwyddo i gelloedd EPC, cafodd lefel protein TRAF6 ei diraddio'n rhannol ar 30 h (Ffig. 4a). Fel y dangosir yn Ffig. 4b, roedd calpain2a yn hyrwyddo diraddio TRAF6 mewn modd a oedd yn dibynnu ar ddos. Ym mhresenoldeb calpain2a, nid oedd yn effeithio ar lefel mRNA TRAF6, sy'n dangos bod calpain2a yn effeithio ar lefel protein TRAF6 yn unig. Yn y cyfamser, dangosodd yr assay atalydd cycloheximide (CHX) y gallai calpain2a gyflymu hanner oes y protein TRAF6 (Ffig. 4c). Arweiniodd gorfynegiant calpain2a mewn celloedd MKC at ansefydlogi TRAF6 mewndarddol (Ffig. 4d). Er mwyn ymchwilio i weld a oedd diraddiad TRAF6 wedi'i gyfryngu gan calpain2a yn dibynnu ar y llwybrau ubiquitin-proteasome, autophagosome, lysosomal, neu eraill, cafodd celloedd EPC eu trin â'r adweithyddion a oedd yn atal y llwybrau hyn: MG132, 3-MA, a NH4Cl. Fodd bynnag, ni chafodd ansefydlogi TRAF6 wedi'i gyfryngu gan calpain2a ei wrthdroi gan yr atalydd proteasomal MG132, atalydd awtoffagic 3-MA, neu atalydd lysosomaidd NH4Cl (Ffig. 4e). Nesaf, cafodd celloedd EPC eu trin â'r adweithyddion: E-64 (atalydd calpain sy'n anactifadu gweithgaredd calpain hydrolase) a PMSF (atalydd serine protease amhenodol). Gwelsom fod atalydd calpain E-64 yn atal diraddio ar lefel protein TRAF6 (Ffig. 4f). Fel y dangosir yn Ffig. 4g, roedd E-64 hefyd yn gwrthdroi diraddiad lefelau protein TRAF6 mewndarddol gan calpain2a.

Mae Ffig. 4 calpain2a yn atal mynegiant protein TRAF6. a Cynhaliwyd yr arbrawf graddiant amser o fectorau gwag neu plasmidau calpain2a-Myc ynghyd â TRAF6- Flag mewn celloedd EPC. Roedd y lysates cell yn destun IB gyda gwrth-Myc, gwrth-Flag, a gwrth-Tubulin Abs. Tynnwyd RNA o gelloedd a'i drawsgrifio o'r cefn, ac yna cafodd TRAF6 ac actin eu chwyddo gan baent preimio PCR. b Cafodd celloedd EPC eu hadu mewn 12-platiau ffynnon dros nos a'u cyd-drawsgludo â TRAF6-Flag a calpain2a-Myc (0.3, 0.6, neu {{ 18}}.9 ug) am 48 h. Cafodd mynegiant proteinau TRAF6-Flag a calpain2a-Myc ei ganfod gan blotio Gorllewinol. Tynnwyd RNA o gelloedd a'i drawsgrifio o'r cefn, yna cafodd TRAF6 ac actin eu chwyddo gan baent preimio PCR. c cafodd calpain2a-Myc neu fectorau gwag eu cyd-drawsgludo â TRAF6-Faneru i gelloedd EPC. Ar 36 h ar ôl y trawsgludiad, cafodd y celloedd a drosglwyddwyd eu trin â cycloheximide (CHX) am 2 neu 4 h. d Trawsnewidiwyd celloedd MKC gyda calpain2a-Flag neu fectorau gwag. Ar 48 h ar ôl y trosglwyddiad, roedd y lysates cell yn destun IB gyda gwrth-TRAF6, gwrth-Flag, a gwrth-Tubulin Abs. e, f Trawsnewidiwyd celloedd EPC â'r plasmidau a nodwyd ym mhresenoldeb neu absenoldeb MG132, 3-MA, NH4CL, E-64 (50 neu 75 μM), neu PMSF ar gyfer 6 h cyn i ddadansoddiad immunoblot gael ei berfformio. g Trawsnewidiwyd celloedd MKC â calpain2a-Flag ym mhresenoldeb neu absenoldeb E{{50}} (50 neu 75 μM) am 6 h cyn i ddadansoddi immunoblot gael ei berfformio. h Cafodd calpain2a-Flag a calpain2a-ΔCysPc-Flag eu cyd-drosglwyddo â TRAF6-HA i gelloedd EPC. Ar 48 h ar ôl y trosglwyddiad, roedd y lysates gell yn destun IB gyda Abs a nodir. Cafodd I calpain2a-Flag a calpain2a-ΔCysPc-Flag eu cyd-drawsnewid i gelloedd MKC. Ar 48 h ar ôl y trosglwyddiad, roedd y lysates cell yn destun IB gyda gwrth-TRAF6, gwrth-Flag, a gwrth-Tubulin Abs. j IL-1 , IL-8 mRNA yn MKC yn cael ei drawsnewid yn sefydlog â calpain2a-Flag a calpain2a-ΔCysPc-Flag a'i drin â saline (0) neu ei herio â LPS am 4 h (n=3 fesul grŵp). Cafodd lefel mRNA gymharol ei normaleiddio i fynegiant yr amgodio genyn -actin ym mhob sampl. Perfformiwyd pob arbrawf mewn o leiaf dri arbrawf annibynnol. Dadansoddwyd data gan ANOVA dwy ffordd (j). **p < 0.01.

Penderfynu a oedd diraddiad TRAF6 yn dibynnu ar actifedd hydrolase calpain2a. Gan fanteisio ar astudiaethau strwythurol a biocemegol blaenorol o calpain2a mewn mamaliaid, fe wnaethom dreiglo gweddillion cystein, histidine, ac asparagine calpain2a i alanin (calpain2a C105A, H262A, N286A, a 3 A), a gollodd y cydlyniad catalytig-triad44-46. Gwelsom nad oedd y treiglad hwn yn effeithio ar ddiraddiad TRAF6 (Ffig Atodol 1a). Felly, fe wnaethom dreiglo'r parth proteas, sef parth calpain cystein protease (CysPc) o calpain2a (a ddynodwyd fel calpain2a-ΔCysPc). Nid yw calpain2a-ΔCysPc (Ffig. 4h, i) yn effeithio ar TRAF6 wedi'i orfynegi na TRAF6 mewndarddol. Fodd bynnag, mae cytocinau prolidiol IL-1 ac IL-8 yn cael eu heffeithio ar yr un pryd gan calpain2a math gwyllt neu dreiglo ar ysgogiad LPS (Ffig. 4j). Nid yw calpain2a mutant diffyg gweithgaredd hydrolase yn effeithio ar lefel protein TRAF6, ond roedd y mutant calpain2a diffyg gweithgaredd hydrolase yn dal i effeithio ar fynegiant cytocinau pro-llidiol i lawr yr afon. Sbardunodd hyn ein hymchwiliad i'r mecanweithiau posibl y mae calpain2a yn eu defnyddio i reoleiddio TRAF6. Gyda'i gilydd, mae'r canlyniadau hyn yn datgelu bod calpain2a yn rheoleiddio signalau NF-κB trwy atal mynegiant lefelau protein TRAF6, trwy ei weithgaredd hydrolase calpain.

Mae calpain2a yn atal gweithgaredd ubiquitin-ligase TRAF6.

Nesaf, archwiliwyd y mecanweithiau moleciwlaidd y mae calpain2a yn eu defnyddio i reoleiddio signalau NF-κB wedi'u hactifadu gan TRAF, ac a yw rhyngweithio calpain2a â TRAF6 ar ôl colli gweithgaredd enzymatig yn modiwleiddio ei weithgaredd ligas ubiquitin. Fe wnaethon ni drin celloedd MKC â LPS ac yna TRAF6 wedi'i imiwneiddio. Cadarnhaodd asesiad hollbresennol gyda phroteinau ailgyfunol puredig fod calpain2a a calpain2a-ΔCysPc wedi lleihau hollbresennoldeb TRAF6 (Ffig. 5a). Fel y dangosir yn Ffig. 5b, c, gostyngodd calpain2a a calpain2a-ΔCysPc yn sylweddol broteinau hollbresennol WT a K63 TRAF6. Gostyngodd graddiannau crynodiad calpain2a a calpain2a-ΔCysPc broteinau ubiquitinated WT a K63 o TRAF6 mewn modd sy'n dibynnu ar ddos. roedd calpain2a-ΔCysPc yn dal i atal agregu cadwyn ubiquitin K63 o TRAF6 heb effeithio ar lefel protein TRAF6 (Ffig. 5d, e). Yna fe wnaethom drawsnewid celloedd MKC i fynegi TRAF6 wedi'i dagio â Myc ym mhresenoldeb neu absenoldeb calpain2a-ΔCysPc â thag Baner, ac yna perfformio arbrofion imiwnoddodiad gyda gwrthgorff gwrth-Myc a'i ddadansoddi gan immunoblot gyda gwrth-UB. Cafodd hollbresenoldeb o'r fath o TRAF6 ei wanhau'n sylweddol gan calpain2a- ΔCysPc (Ffig. 5f). Wedi'i ysgogi gan LPS, mae TRAF6 yn cyflwyno cadwyn ubiquitin cysylltiedig K i TAK1, sy'n ysgogi awtoffosfforyleiddiad TAK1 ac yn actifadu NF-κB18. Cafodd proteinau ubiquitin WT a K63 o TAK1 eu gwella'n sylweddol ym mhresenoldeb TRAF6, tra bod ubiquitination cysylltiedig â TAK wedi'i atal ym mhresenoldeb calpain2a-ΔCysPc (Ffig. 5g, h). Mae'r data hyn yn cefnogi bod mutant calpain2a diffyg gweithgaredd hydrolase yn yr un modd yn atal gweithgaredd ligas ubiquitin TRAF6 heb effeithio ar lefelau protein TRAF6.

Manteision cistanche tubulosa- cryfhau'r system imiwnedd

calpain2a yn atal TRAF6 homo-oligomerization.

Mae cadwyn ubiquitin Lys63 wedi'i syntheseiddio gan TRAF6 yn chwarae rhan allweddol mewn trawsgludiad signal. Dywedwyd bod lleihau TRAF6 yn hanfodol ar gyfer synthesis ei gadwyn ubiquitin16. Mae cysylltiad agos rhwng y model dimerization a'r cyfuniad o Ubc13 i gynhyrchu ubiquitination K6316,30. I wirio a allai pysgod TRAF6 ffurfio dimers, defnyddiwyd plasmidau TRAF6 gyda gwahanol dagiau: TRAF6 wedi'i dagio â Myc a TRAF6 â thag HA ar gyfer arbrofion cyd-IP. Perfformiwyd assay IP gan ddefnyddio gwrthgorff gwrth-HA, roedd HATRAF6 yn rhyngweithio â Myc-TRAF6 (Ffig. 6a). Er mwyn archwilio effaith ataliol calpain2a yn y rhyngweithiad pylu TRAF, mynegwyd calpain2a â thag baner, TRAF6 wedi'i dagio gan HA a TRAF6 wedi'i dagio â Myc yn dros dro i gelloedd HEK293. Yn ôl y disgwyl, gostyngwyd rhyngweithiad pylu TRAF6-ym mhresenoldeb calpain2a (Ffig. 6b). Ar yr un pryd, er mwyn osgoi presenoldeb diraddio TRAF6 gan calpain2a. Trawsnewidiwyd calpain2a-ΔCysPc â thag baner gennym a chanfuwyd bod y rhyngweithiad dimer TRAF6- wedi gostwng yn raddol ym mhresenoldeb calpain2a- ΔCysPc (Ffig. 6c). Fel y dangosir yn Ffig. 6d, e, canfuom HA-TRAF6 wedi'i wella gan WT a K63 ubiquitination Myc-TRAF6. Tra bod celloedd HEK293 yn cael eu cyd-drawsgludo â calpain2a a calpain2a- ΔCysPc, byddai'r hollbresennol uwch yn cael ei atal. Mae'r canlyniadau hyn yn awgrymu bod calpain2a tebyg i wyllt a calpain2a mutant diffyg gweithgaredd hydrolase yn atal homooligomerization TRAF6 ac awto-ubiquitination.

mae calpain2a yn atal cyflenwi hollbresennol TRAF6 i ECSIT a BECN1.

Fel y dangosir yn Ffig. 5d, canfuom fod calpain2a yn ymyrryd â'r broses hollbresennol o TRAF6 i TAK1. Adroddwyd bod ECSIT wedi gweithredu fel protein addasydd o TAK1 a TRAF6 i hyrwyddo signalau NF-κB trwy ysgogiad LPS37. Er mwyn gwirio a oedd gan ECSIT y swyddogaethau a grybwyllwyd mewn pysgod teleost, rydym yn perfformio aliniadau dilyniant lluosog o broteinau ECSIT mewn dynol, llygoden, a gall croaker (Atodol Ffig. 1b). Fe wnaethom drawsnewid celloedd EPC gyda gohebydd luciferase NF-κB, fe wnaeth ECSIT wella gweithgaredd gohebydd NF-κB yn sylweddol ar ôl ysgogiad LPS (Ffig Atodol 1c). Arweiniodd gor fynegiant o ECSIT mewn celloedd MKC at upregulation o lefel mRNA o TNF- (Atodol Ffig. 1d). Ar ôl trawsblannu pysgod ECSIT a TRAF6 mewn celloedd HEK293, canfuom fod TRAF6 yn rhyngweithio ag ECIST (Ffig. 7a). Yn yr un modd, cyd-drosglwyddwyd ECSIT a TAK1, ac roedd y ddau brotein hefyd yn cynnal rhyngweithio (Ffig. 7b). Yn dilyn hynny, i wirio a yw calpain2a-ΔCysPc yn atal ffurfio'r cymhlyg TRAF6- ECSIT, gwnaethom drawsnewid y tri plasmid i gelloedd HEK293 a chanfod bod calpain2a-ΔCysPc wedi atal y cymhleth TRAF (Ffig. 7c) ). I wirio proses drosglwyddo'r gadwyn ubiquitin mewn signalau NF-κB. Fel y dangosir yn Ffig. 7d, gallai TRAF6 hyrwyddo hollbresennol ECSIT; yn ôl y disgwyl, rhwystrodd calpain2a-ΔCysPc y broses a ddefnyddiodd TRAF6 i drosglwyddo'r gadwyn ubiquitin i ECSIT. Mae BECN1 yn brotein pwysig mewn awtophagi a achosir gan LPS. Cadarnhawyd y gallai ubiquitination K63 addasu ac actifadu BECN1. Mae ensym deubiquitinating A20 yn cael gwared ar hollbresennoldeb BECN1 ac yn atal awtoffagi a achosir gan LPS, a TRAF6 yw'r ligas E3 sy'n gyfrifol am hollbresennoldeb BECN1 yn y signal hwn47. Fel y dangosir yn Ffig. 7e, bu TRAF6 yn rhyngweithio â BECN1 ac yn hyrwyddo hollbresennoldeb BECN1. Yna fe wnaethom drawsnewid BECN1, TRAF6, calpain2a, a calpain2a-ΔCysPc i gelloedd HEK293, hyrwyddodd TRAF6 hollbresennoldeb BECN1. ataliodd calpain2a-ΔCysPc y broses a ddefnyddiodd TRAF6 i drosglwyddo'r gadwyn ubiquitin i BECN1 (Ffig. 7f). Mae'r canlyniadau hyn yn awgrymu bod calpain2a tebyg i wyllt a calpain2a mutant diffyg gweithgaredd hydrolase yn atal gallu hollbresennol TRAF6 mewn autophagy a achosir gan LPS a signalau NF-κB.

Rheoleiddio negyddol o ymateb gwrthfeirysol gan calpain2a.

Yn y llwybr RLR, mae TRAF6 yn gweithredu fel ligas E3 a recriwtiwyd gan MAVS i actifadu NF-κB, sef cynhyrchu IFNs a cytocinau. Gwnaethom archwilio nesaf a oedd calpain2a yn chwarae rhan mewn atal TRAF6 yn y broses gwrthfeirysol a gyfryngir gan IFN. Mewn celloedd EPC, mynegwyd gohebwyr IFN-1, ISRE, ac IRF3 a yrrir gan hyrwyddwr luciferase. Canfuom fod calpain2a wedi lleihau'r gweithgareddau luciferase hyn a yrrir gan hyrwyddwr yn sylweddol mewn modd sy'n dibynnu ar ddos ​​ar ysgogiad Ploy(I:C) a haint twyllofeirws Siniperca rhabdovirus (SCRV) (Ffig. 8a, b). Fe wnaeth Knockdown calpain2a wella mynegiant genynnau Ploy(I:C) a SCRV yn sylweddol gan gynnwys Viperin, Mx1, ac ISG15 (Ffig. 8c, d). Arweiniodd dymchwel calpain2a at fynegiant uwch o hyfywedd celloedd ar haint SCRV mewn celloedd MKC (Ffig. 8e). Fel y dangosir yn Ffig. 8f, datgelodd profion ar amlhau celloedd fod dymchwel cyfalafin2a wedi cynyddu amlhau celloedd ar haint SCRV. Roedd gorfynegiant calpain2a yn hyrwyddo lluosogi firws yn sydyn, fel yr adlewyrchir gan ddyblygiad firaol ar ôl haint SCRV (Ffig. 8g). gostyngodd calpain2a a calpain2a-ΔCysPc yn sylweddol IFN-1, gohebwyr luciferase a yrrir gan hyrwyddwyr ISRE ac IRF3 ar ysgogiad Ploy(I:C) a haint SCRV (Ffig. Atodol 2a, b). Mae'r canlyniadau hyn yn awgrymu y gallai calpain2a reoleiddio llwybr signalau RLR yn negyddol trwy atal TRAF6, a thrwy hynny atal actifadu IFN.

Mae Ffig. 5 calpain2a yn atal gweithgaredd ubiquitin-ligase TRAF6. a Ubiquitination o TRAF6 mewndarddol mewn celloedd MKC trosi gyda calpain2a-Flag a calpain2a-ΔCysPc-Flag a heb ei herio (−) neu herio gyda LPS (+), a aseswyd gan ddadansoddiad immunoblot gyda gwrth-ubiquitin ar ôl imiwnoprecipitation gyda gwrth-TRAF6 a dadansoddiad imiwnoblot mewnbwn gyda Abs a nodir. b, c Cafodd celloedd HEK293 eu cyd-drawsgludo â TRAF6-HA a WT-ubiquitin-His neu K63O ubiquitin-His (lle cedwir lysin 63 yn unig) ynghyd â calpain2a-Flag, calpain2a-ΔCysPc-Flag neu fector gwag. Ar ôl 24 h ar ôl y trawsgludiad, cafodd y celloedd eu gorchuddio a'u puro â Ni-NTA agarose. d, e Cafodd celloedd HEK293 eu cyd-drawsgludo â TRAF{{30}}HA a WT-ubiquitin-His neu K63O-ubiquitin-His (lle cedwir lysin 63 yn unig) ynghyd â calpain2a-Flag ({{45) }}.5 ug, 1 ug), calpain2a-ΔCysPc-Flag (0.5 ug, 1 ug) neu fector gwag. Ar ôl 24 h ar ôl y trawsgludiad, cafodd y celloedd eu gorchuddio a'u puro â Ni-NTA agarose. f Ubiquitin of overexpressed TRAF6 mewn celloedd MKC a drosglwyddwyd gyda calpain2a-ΔCysPc-Flag, a aseswyd gan ddadansoddiad immunoblot gyda gwrth-ubiquitin ar ôl immunoprecipitation gyda gwrth-Myc a dadansoddiad imiwnoblot mewnbwn gyda Abs a nodir. g, h Cafodd celloedd HEK293 eu cyd-drawsgludo â TAK1-Myc, TRAF6-HA, a WT-ubiquitin-His neu K63O-ubiquitin-His (lle cedwir lysin 63 yn unig) ynghyd â calpain2a-Flag , calpain2a-ΔCysPc-Flag neu fector gwag. Ar ôl 24 h ar ôl y trawsgludiad, cafodd y celloedd eu gorchuddio a'u puro â Ni-NTA agarose. Mae'r holl immunoprecipitates a dadansoddiad immunoblot mewnbwn gyda gwrth-Myc, gwrth-Flag, gwrth-HA, a gwrth-Tubulin Abs. Perfformiwyd pob arbrawf mewn o leiaf dri arbrawf annibynnol.

mae calpain2a yn atal hollbresennoldeb IRF3 ac IRF7 o TRAF6.

Adroddir, yn y signal gwrthfeirysol a ysgogwyd gan y cymhleth MAVS-TRAF3/6, bod gweithgaredd TRAF6 yn angenrheidiol ar gyfer actifadu IRF3 a NF-κB48. Fel y dangosir yn Ffig. 9a, b, mae TRAF6 yn hyrwyddo hollbresennol sy'n gysylltiedig â WT a K o IRF3, ac mae mynegiant calpain2a- ΔCysPc yn atal y gwelliant hwn. Yn y cyfamser, pan fydd y firws yn sbarduno signal signalau sy'n ddibynnol ar TLR, mae TRAF6 yn perthyn yn agos i IRF7 ac yn hyrwyddo hollbresennol IRF7 ynghyd â ffactorau gwrthfeirysol wedi'u hysgogi22,49,50. Mae TRAF6 yn hyrwyddo hollbresennol sy'n gysylltiedig â WT a K o IRF7, ac mae'r gwelliant hwn yn cael ei atal gan fynegiant calpain2a-ΔCysPc (Ffig. 9c, d). Mae'r data hyn yn awgrymu bod calpain2a tebyg i wyllt a calpain2a mutant sydd â diffyg gweithgaredd hydrolase yn atal hollbresennoldeb cyfryngol TRAF o IRF3 ac IRF7.

Trafodaeth

Mae TRAF6 yn un o'r saith aelod o'r teulu ffactorau derbynnydd sy'n gysylltiedig â ffactor necrosis Tiwmor (TNF), sydd wedi'i nodi fel addasydd signal ac sy'n cyflawni trawsgludiad signal51,52. Mae teulu TRAF yn cynnwys y parth bys Ring, sy'n berchen ar y gweithgaredd ligas E3. Mae ligasau E3 gyda'r parth HECT yn hyrwyddo polyubiquitination swbstrad, ac mae E3s gyda'r parth Ring angen E2~ub i drosglwyddo polyubiquitination53,54. Cadarnhawyd bod yr ensym Ub-rwymo dimer Ubc13/Uev1A yn rhan o agregu polyubiquitination TRAF616. Tra bod K124 o lygoden TRAF6 yn cael ei fwrw allan, bydd TRAF6 yn colli gweithgaredd awto-ubiquitination K63, ac mae'r treiglad ar y wefan hon yn dileu hollbresennol TRAF6-NEMO cyfryngol ac actifadu TAK1, IKK, ac NF-κB55 . Mae'n fanwl gywir oherwydd bod PRDX1 yn clymu i barth Bysedd Cylch TRAF6 sydd wedi'i gynnwys yn K124 ac yn dileu hollbresennol TRAF638. Dywedwyd bod cysylltiad agos rhwng hollbresennol TRAF6 a gwanhau ei barth N-terminal (parth bys cylch a bysedd ZF). Treiglwyd safleoedd rhyngweithio N-terminal lluosog ag Ubc13, ac ni allai Ubc13 drosglwyddo poly~ub i TRAF616. Dangosodd y rhyngweithio rhwng mutants calpain2a a TRAF6 fod y rhan fwyaf o barthau TRAF6 yn rhyngweithio â calpain2a, ac eithrio parth bys y cylch. Oherwydd y rhyngweithio rhwng calpain2a a pharth bysedd ZF TRAF6, fe wnaethom ddyfalu y gallai calpain2a atal awto-ubiquitination trwy rwystro pylu TRAF6. Yn dilyn hynny, gwnaethom wirio rhyngweithiad gwahanol dagiau TRAF6. Wrth i fynegiant mutant calpain2a diffyg gweithgaredd hydrolase gynyddu, gwanhau rhyngweithio gwahanol dagiau o TRAF6. Mae TRAF6 sydd wedi'i dagio gan HA yn hyrwyddo hollbresennol TRAF6 wedi'i dagio â Myc, ac mae mutant calpain2a yn atal y hollbresennol a gyfoethogir gan TRAF6 wedi'i dagio gan HA. Fel canolradd yn y broses o drosglwyddo signal TRAF6-TAK1, mae ECSIT yn rhwymo i barth terfynell C TRAF6 (parth CC a pharth TRAF-C) a chadarnheir ei fod yn ymwneud â signalau NF-κB37. Gostyngodd mynegiant cytocinau proin-flammatory mewn celloedd ECSITKD THP{{-1}. Fodd bynnag, ar ôl gorfynegi ECSIT mewn celloedd ECSITKD THP{-1), cynyddodd genynnau fel IRF7, IL{{-1 , a CD44 yn sylweddol37. Mae PRDX1 yn clymu i barth bys Ring TRAF6 ac yn atal hollbresennoldeb ECSIT a BECN1 mewn signalau NF-κB ac awtophagi trwy atal ffurfio polyubiquitination TRAF638. Mewn pysgod teleost, gwnaethom gadarnhau'r llwybr signalau NF-κB wedi'i actifadu gan ECSIT, rhyngweithio â TRAF6 a TAK1 yn y drefn honno, a thrawsyrru'r gadwyn polyubiquitin a gynhyrchwyd gan TRAF6. calpain2a wedi'i rwymo i barth ZF, parth CC, a pharth TRAF-C TRAF6, a oedd yn atal rhyngweithiad TRAF6-ECSIT. Fe wnaethom gadarnhau bod diffyg gweithgaredd hydrolase mutant calpain2a wedi atal y gadwyn polyubiquitin o TRAF6 i ECSIT a BECN1.

Mae Ffig. 6 calpain2a yn gwanhau awtoubwieniad o TRAF6. cafodd celloedd HEK293 eu trawslifo â TRAF6-Myc, TRAF6-HA, neu fector gwag. Ar ôl 24 h ar ôl y trosglwyddiad, cafodd y celloedd eu lysed a'u dadansoddi IP gyda gwrthgorff HA. b Trawsnewidiwyd celloedd HEK293 â TRAF6-Myc, TRAF6-HA, fector gwag, neu calpain2a-Flag. Ar ôl 24 h ar ôl y trosglwyddiad, cafodd y celloedd eu lysed a'u dadansoddi IP gyda gwrthgorff HA. c Trawsnewidiwyd celloedd HEK293 â TRAF6-Myc, TRAF6-HA, fector gwag, neu grynodiadau gwahanol o calpain2a-ΔCysPc-Flag. Ar ôl 24 h ar ôl y trosglwyddiad, cafodd y celloedd eu lysed a'u dadansoddi IP gyda gwrthgorff HA. d, e Cafodd celloedd HEK293 eu cyd-drawsgludo â TRAF6-Myc, TRAF{6-HA, a WT-ubiquitin-His neu K63O-ubiquitin-His (lle cedwir lysin 63 yn unig) ynghyd â calpain2a-Flag , calpain2a-ΔCysPc-Flag neu fector gwag. Ar ôl 24 h ar ôl y trawsgludiad, cafodd y celloedd eu gorchuddio a'u puro â Ni-NTA agarose. Mae'r immunoprecipitates a dadansoddiad immunoblot mewnbwn gyda gwrth-Myc, gwrth-Flag, gwrth-HA, a gwrth-Tubulin Abs. Perfformiwyd pob arbrawf mewn o leiaf dri arbrawf annibynnol.

Mae Ffig. 7 calpain2a yn atal hollbresennoldeb cyfryngol TRAF o ECSIT a BECN1. cafodd celloedd HEK293 eu trawslifo â ECSIT-Myc, TRAF6-Flag, neu fector gwag. Ar ôl 24 h ar ôl y trosglwyddiad, cafodd y celloedd eu lysed a dadansoddwyd IP gyda gwrthgorff Baner. b Trawsnewidiwyd celloedd HEK293 â TAK1-Flag, ECSIT-Myc, neu fector gwag. Ar ôl 24 h ar ôl y trosglwyddiad, cafodd y celloedd eu lysed a dadansoddwyd IP gyda gwrthgorff Myc. c Trawsnewidiwyd celloedd HEK293 â TRAF6-Myc, ECSIT-HA, fector gwag, neu grynodiadau gwahanol o calpain2a-ΔCysPc-Flag. Ar ôl 24 h ar ôl y trosglwyddiad, cafodd y celloedd eu lysed a dadansoddwyd IP gyda gwrthgorff Myc. d Cafodd celloedd HEK293 eu cyd-drawsgludo ag ECSIT-Myc, TRAF6-HA, WT-ubiquitin-His ynghyd â calpain2a-Flag, calpain2a-ΔCysPc-Flag neu fector gwag. Ar ôl 24 h ar ôl y trawsgludiad, cafodd y celloedd eu gorchuddio a'u puro â Ni-NTA agarose. e Trawsnewidiwyd celloedd HEK293 â BECN1-Flag, TRAF6-Myc, neu fector gwag. Ar ôl 24 h ar ôl y trosglwyddiad, cafodd y celloedd eu lysed a dadansoddwyd IP gyda gwrthgorff Myc. f Cafodd celloedd HEK293 eu cyd-drawsgludo â BECN1-HA, TRAF6-Myc, WT-ubiquitin-His ynghyd â calpain2a-Flag, calpain2a-ΔCysPc-Flag neu fector gwag. Ar ôl 24 h ar ôl y trawsgludiad, cafodd y celloedd eu gorchuddio a'u puro â Ni-NTA agarose. Mae'r immunoprecipitates a mewnbynnau gyda gwrth-Myc, gwrth-Flag, gwrth-HA, a gwrth-Tubulin Abs. Perfformiwyd pob arbrawf mewn o leiaf dri arbrawf annibynnol.

Rydym yn sylwi bod gan calpain2a weithgaredd hydrolase fel un o'r teulu proteasau sy'n ddibynnol ar galsiwm. Mae m-calpain (calpain-2) yn chwarae rhan reoleiddiol gadarnhaol yn llwybr signalau NF-κB celloedd yr afu HepG2. Yn annibynnol ar y dull proteasome 26 s, mae calpain2a yn hydrolyzes IkB i ryddhau'r ffactor trawsgrifio NF-κB. Mae atalydd penodol protein calpain yn atal diraddio IkB 56. Fodd bynnag, ar gyfer calpain, ychydig o astudiaethau sydd ar ymateb imiwnedd cynhenid ​​pysgod. Mewn celloedd MKC, roedd gorfynegiant calpain2a yn atal cytocinau prolidiol NF-κB i lawr yr afon a achosir gan LPS. Roedd y ffenomen hon yn groes i'r canlyniadau mewn celloedd afu HepG2. Mae'n bosibl bod natur benodol y teulu protein calpain wedi achosi effeithiau gwahanol. Yn yr un modd, fe wnaethom ddefnyddio atalydd penodol y protein calpain E-64 i atal calpain2a rhag hydrolysu TRAF6. Mutant calpain2a diffyg gweithgaredd hydrolase yn atal gweithgaredd TRAF6 ubiquitin ligas heb effeithio ar ei lefelau protein. Ni ddaethom o hyd i safleoedd ensymau-actif ar gyfer calpain2a. Yn ôl astudiaethau blaenorol mewn mamaliaid, y tri safle yw cystein (C105A), histidine (H262A), a gweddillion asparagine (N286A). Fodd bynnag, mae ein harbrofion yn cadarnhau nad yw'r tri safle gweithredol o miiuy croaker calpain2a yn effeithio ar fynegiant lefelau protein TRAF6, ond mae mutant calpain2a diffyg parth hydrolase yn ei wneud. Felly, fe wnaethom ddewis treiglo'r parth strwythurol cyfan sy'n ysgogi ensymau. Er bod protein calpain2a wedi'i gadw'n gymharol mewn mamaliaid a fertebratau is, mae'r safleoedd gweithgaredd ensymatig penodol yn haeddu ymchwiliad pellach.

system imiwnedd sy'n cynyddu planhigion cistanche

I grynhoi, fe wnaethom nodi calpain2a fel rheolydd negyddol o signalau NF-κB a achosir gan LPS ac actifadu IFN a achosir gan firws (Ffig. 9e). Mewn sbectrometreg màs, gall calpain2a ryngweithio â TRAF6 a dangoswyd y ffenomen hon trwy arbrawf cyd-imiwnedd mewndarddol. Canfuom fod calpain2a yn ymwneud â rheoleiddio'r llwybr signalau NF-κB a achosir gan LPS. Yn ogystal, mae TRAF6 hefyd yn chwarae rhan bwysig mewn llwybrau signalau gwrthfeirysol. Fe wnaethom ddefnyddio SCRV a Ploy(I:C) i ysgogi llwybr signalau IFN a chanfuwyd y gallai calpain2a hefyd atal signalau IFN trwy reoleiddio lefel protein ac awtobreswyliaeth TRAF6. Gan y gall TLR3 adnabod y strwythur RNA dwbl (dsRNA) a gynhyrchir gan heintiau firaol. Mae gennym fwy o ddiddordeb mewn egluro rheoleiddio calpain2a ar lwybr signalau IFN wedi'i gyfryngu gan TRAF ond nid ydym yn eithrio perthynas bosibl rhwng llwybr signalau calpain2a a TLR3. hyrwyddodd calpain2a ddiraddio TRAF6 mewn modd hydrolytig a rhyngweithio â TRAF6 i atal ffurfio dimers ac awto-ubiquitination. Roedd yr ataliad hwn yn atal rhyngweithiad TRAF6 ac ECSIT a'r broses trosglwyddo hollbresennol o TRAF6 i ECSIT, BECN1, IRF3, ac IRF7. Bydd ein canlyniadau presennol yn cyfrannu at ddealltwriaeth o'r mecanweithiau rheoleiddio negyddol trwy dargedu TRAF6 mewn ymatebion imiwnedd cynhenid. Yn ogystal, mae'r ymchwil hwn yn dangos rôl allweddol homooligomerization TRAF6 ac awto-ubiquitination yn y broses o ymateb imiwnedd cynhenid ​​pysgod. Ar yr un pryd, cynigir calpain2a fel mecanwaith rheoleiddio protein i atal ymateb imiwn TRAF6 ac atal y llwybrau signal arferol a threfnus. Mae'r mewnwelediadau yn ddefnyddiol i ddeall imiwnoleg fertebrat ac esblygiad y system imiwnedd fertebrat.

Ffig. 8 Mae calpain2a yn atal actifadu IFN a achosir gan SCRV- neu Poly(I:C). cafodd celloedd ab EPC eu trawslifo â chrynodiadau gwahanol o calpain2a-Flag neu fector gwag ynghyd â gohebwyr IFN-1, ISRE, ac IRF3-pro luciferase. Ar ôl trosglwyddo 24 h, roedd celloedd wedi'u ffug-heintio neu wedi'u heintio â SCRV neu Poly(I:C) am 12 h (n=3 fesul grŵp). Defnyddiwyd dadansoddiad blotiau gorllewinol i fesur mynegiant calpain2a-Flag a drosglwyddwyd dros dro. Defnyddiwyd mynegiant Tubulin fel rheolydd llwytho. c, d Viperin, Mx1, ISG15 mRNA yn MKC wedi'i drawsnewid yn sefydlog â si-calpain2a #1 neu si-ctrl (fector rheoli) a'i drin â halwynog (0) neu ei herio â SCRV neu Poly(I: C) ar gyfer 24 h. Cafodd lefel cymharol mRNA ei normaleiddio i fynegiant y genyn amgodio -actin ym mhob sampl (n=3 fesul grŵp). e, f Trawsnewidiwyd celloedd MKC gyda naill ai si-ctrl neu si-calpain2a #1. Ar 24 h ar ôl y trosglwyddiad, ysgogwyd y celloedd gyda SCRV am 24 h, yna mesurwyd assay hyfywedd celloedd a assay amlhau celloedd (n=3 fesul grŵp). Bar graddfa, 100 μm. g Trawsnewidiwyd celloedd MKC â calpain2a-Flag neu pcDNA3.1, yna wedi'u heintio â SCRV am 24 h (n=3 fesul grŵp). Cynhaliwyd y dadansoddiad qRT-PCR ar gyfer mynegiant RNA SCRV mewngellol ac uwchnatur. Perfformiwyd pob arbrawf mewn o leiaf dri arbrawf annibynnol. Dadansoddwyd data gan ANOVA unffordd (a, b), ANOVA dwy ffordd (c, d, e, f), neu brawf-t Myfyriwr dwy-ffordd (g). *p < 0.05, **p < 0.01.

Dulliau

Diwylliant celloedd.

Prynwyd llinellau celloedd aren embryonig dynol (HEK) 293 a llinellau celloedd Epithelioma papulosum cyprini (EPC) o'r Casgliad Diwylliant Math Americanaidd a'u cadw yn ein labordy. Miiuy croaker (M. miiuy) llinellau celloedd arennau (MKC) a Miiuy llinellau celloedd coluddyn croaker (MIC) eu meithrin o feinweoedd yr arennau a'r coluddyn o croaker miiuy57,58. Cafodd llinellau celloedd arennau cracer Miiuy a llinellau celloedd coluddyn croaker Miiuy eu meithrin ar 26 gradd mewn deorydd llaith yn cynnwys 0.5% CO2 mewn cyfrwng L-15 (HyClone, UDA) wedi'i ategu â 15% FBS (Gibco , UDA), penisilin 100 U/ml (Gibco, UDA), streptomycin 100 ug/ml (Gibco, UDA), a 20 U/ml heparin (Solarbio, Tsieina). Tyfwyd celloedd epithelioma papulosum cyprini ar 26 gradd mewn deorydd llaith yn cynnwys 5% CO2 mewn 199 canolig (Hyclone) wedi'i ategu â 10% FBS, 2 mM L-glutamin, penisilin 100 U / ml, a streptomycin 100 mg / ml. Tyfwyd celloedd aren embryonig dynol 293 ar 37 gradd mewn deorydd llaith yn cynnwys 5% CO2 yng nghyfrwng Eagle's (DMEM) (Invitrogen) wedi'i addasu ag Dulbecco wedi'i ategu â 10% FBS, 2 mM L-glutamin, 100 U/ml penisilin, a 100 mg /ml streptomycin.

Mae Ffig. 9 calpain2a yn atal hollbresennoldeb cyfryngol TRAF o IRF7 ac IRF3. b Cafodd celloedd HEK293 eu cyd-drawsgludo ag IRF3-Myc, TRAF6-HA, a WTubiquitin-His neu K63O-ubiquitin-His (lle cedwir lysin 63 yn unig) ynghyd â calpain2a-Flag, calpain2a-ΔCysPc -Flag neu fector gwag. Ar ôl 24 h posttransfection, y celloedd yn lysed a puro gyda Ni-NTA agarose. c, d Cafodd celloedd HEK293 eu cyd-drawsgludo ag IRF7-Myc, TRAF6-HA, a WT-ubiquitinHis neu K63O-ubiquitin-His (lle cedwir lysin 63 yn unig) ynghyd â calpain2a-Flag, calpain2a -ΔCysPc-Flag neu fector gwag. Ar ôl 24 h ar ôl trawsgludiad, cafodd y celloedd eu lysio a'u puro â Ni-NTA agarose. Mae'r holl immunoprecipitates a mewnbwn gyda gwrth-Myc, gwrth-Flag, gwrth-HA, a gwrth Tubulin Abs. Perfformiwyd pob arbrawf mewn o leiaf dri arbrawf annibynnol. d Model yn manylu ar rolau calpain2a yn llwybrau signalau cyfryngol TRAF. Ar LPS a firws, gellid actifadu TRAF6, homo-oligomerization ac awto-ubiquitination. Mae BECN1, ECSIT, IRF7, ac IRF3 yn cael eu hollti gan TRAF6 ac yn sbarduno actifadu signalau i lawr yr afon. Mae calpain2a fel rheolydd negyddol yn targedu TRAF6 i atal llwybrau signalau cyfryngol TRAF.

Cyfeiriadau

1. Akira, S., Uematsu, S. & Takeuchi, O. Adnabod pathogenau ac imiwnedd cynhenid. Cell 124, 783–801 (2006).

2. Takeuchi, O. & Akira, S. Derbynyddion adnabod patrwm a llid. Cell 140, 805–820 (2010).

3. Wu, J. & Chen, ZJ Synhwyro imiwnedd cynhenid ​​​​a signalau o asidau niwclëig sytosolig. Annu. Parch Immunol. 32, 461–488 (2014).

4. Moresco, EM, LaVine, D. & Beutler, B. Derbynyddion tebyg i dollau. Curr. Biol. 21, R488–R493 (2011).

5. Schlee, M. Synwyryddion meistr o RNA pathogenig - RIG-Rwy'n hoffi derbynyddion. Imiwnobioleg 218, 1322–1335 (2013).

6. Proteinau Wilmanski, JM, Petnicki-Ocwieja, T. & Kobayashi, KS NLR: aelodau annatod o imiwnedd cynhenid ​​​​a chyfryngwyr clefydau llidiol. J. Leukoc. Biol. 83, 13–30 (2008).

7. Akira, S. & Hemmi, H. Teulu TLR yn cydnabod patrymau moleciwlaidd sy'n gysylltiedig â phathogenau. Imiwnol. Lett. 85, 85–95 (2003).

8. Kawai, T. & Akira, S. Rôl derbynyddion adnabod patrwm mewn imiwnedd cynhenid: diweddariad ar dderbynyddion tebyg i Doll. Nat. Imiwnol. 11, 373–384 (2010).

9. Kawagoe, T. et al. Rheolaeth ddilyniannol ar ymatebion derbynyddion-ddibynnol tebyg i Doll gan IRAK1 ac IRAK2. Nat. Imiwnol. 9, 684–691 (2008).

10. Suzuki, N. & Saito, T. IRAK-4 −ysgogydd NF-kappaB a rennir mewn imiwnedd cynhenid ​​​​ac wedi'i gaffael. Tueddiadau Immunol. 27, 566–572 (2006).

11. Kawai, T. & Akira, S. TLR signalau. Marwolaeth Cell yn Wahanol. 13, 816–825 (2006).

12. Deng, L. et al. Mae actifadu cyfadeilad kinase IkappaB gan TRAF6 yn gofyn am gymhleth ensym cyd-gyfunol ubiquitin dimeric a chadwyn polyubiquitin unigryw. Cell 103, 351–361 (2000).

13. Ninomiya-Tsuji, J. et al. Gall y kinase TAK1 actifadu'r NIK-I kappaB yn ogystal â'r rhaeadr kinase MAP yn y llwybr signalau IL-1. Natur 398, 252–256 (1999).

14. Takaesu, G. et al. Mae TAB2, protein addasydd newydd, yn cyfryngu actifadu TAK1 MAPKKK trwy gysylltu TAK1 â TRAF6 yn y llwybr trawsgludo signal IL-1. Mol. Cell. 5, 649–658 (2000).

15. Trawsleoli cyfryngol Qian, Y., Commane, M., Ninomiya-Tsuji, J., Matsumoto, K. & Li, X. IRAKm o TRAF6 a TAB2 yn y rhyngleukin{-1-actifadu NF-kappa BJ Biol. Cemeg. 276, 41661–41667 (2001).

16. Yin, Q. et al. Rhyngweithio E2 a dimerization yn strwythur grisial TRAF6. Nat. Strwythur. Mol. Biol. 16, 658–666 (2009).

17. Wang, C. et al. Mae TAK1 yn kinase ubiquitin-ddibynnol o MKK ac IKK. Natur 412, 346–351 (2001).

18. Ajibade, AA, Wang, HY & Wang, RF Cell swyddogaeth math-benodol TAK1 mewn signalau imiwnedd cynhenid. Tueddiadau Immunol. 34, 307–316 (2013).

19. Zhang, J., Clark, K., Lawrence, T., Peggie, MW & Cohen, P. Tro annisgwyl i actifadu IKKbeta: Mae TAK1 yn rhoi IKKbeta ar y blaen i'w actifadu gan awtoffosfforyleiddiad. Biocemeg. J. 461, 531–537 (2014).

20. Emmerich, CH et al. Ysgogi'r cymhleth IKK canonaidd gan K63/M1- cadwyni ubiquitin hybrid cysylltiedig. Proc. Natl Acad. Sci.110, 15247–15252 (2013).

21. Kawai, T. et al. Mae sefydlu interfferon-alpha trwy dderbynyddion tebyg i Doll yn cynnwys rhyngweithio uniongyrchol IRF7 gyda MyD88 a TRAF6. Nat. Imiwnol. 5, 1061–1068 (2004).

22. Kitagawa, Y. et al. Mae protein firws parainfluenza dynol math 2 V yn atal hollbresennoldeb cyfryngol TRAF o IRF7 i atal anwythiad interfferon dibynnol TLR7- a TLR9- dibynnol. J. Firol. 87, 7966–7976 (2013).

23. Kawai, T. et al. IPS-1, addasydd sy'n sbarduno anwythiad interfferon math I cyfryngol RIG-I- a Mda. Nat. Imiwnol. 6, 981–988 (2005).

24. Zust, R. et al. Mae Ribose 2'-O-methylation yn darparu llofnod moleciwlaidd ar gyfer gwahaniaethu mRNA hunan a di-hunan yn dibynnu ar y synhwyrydd RNA Mda5. Nat. Imiwnol. 12, 137–143 (2011).

25. Seth, RB, Sun, L., Ea, CK & Chen, ZJ Adnabod a nodweddu MAVS, protein signalau gwrthfeirysol mitocondriaidd sy'n actifadu NF kappaB ac IRF 3. Cell 122, 669-682 (2005).

26. Xu, LG et al. Mae VISA yn brotein addasydd sydd ei angen ar gyfer signalau beta IFN a ysgogir gan firws. Mol. Cell. 19, 727–740 (2005).

27. Yoshida, R. et al. Mae TRAF6 a MEKK1 yn chwarae rhan ganolog yn y llwybr gwrthfeirysol helicas tebyg i RIG-I. J. Biol. Cemeg. 283, 36211–36220 (2008).

28. Liu, S. et al. Mae MAVS yn recriwtio ligasau ubiquitin E3 lluosog i actifadu rhaeadrau signalau gwrthfeirysol. Elife 2, e00785 (2013).

29. Ivashkiv, LB a Donlin, LT Rheoleiddio ymatebion interfferon math I. Nat. Parch Immunol. 14, 36–49 (2014).

30. Fu, TM, Shen, C., Li, Q., Zhang, P. & Wu, H. Mecanwaith trosglwyddo ubiquitin a hyrwyddir gan TRAF6. Proc. Natl Acad. Sci. 115, 1783–1788 (2018).

31. Boone, DL et al. Mae angen yr ensym addasu ubiquitin A20 ar gyfer terfynu ymatebion derbynyddion tebyg i Doll. Nat. Imiwnol. 5, 1052–1060 (2004).

32. Kovalenko, A. et al. Mae'r atalydd tiwmor CYLD yn rheoleiddio signalau NF kappaB yn negyddol trwy ddad-ddewisiad. Natur 424, 801–805 (2003).

33. Ef, X. et al. Mae USP2a yn rheoleiddio yn negyddol IL-1ysgogiad NF kappaB a achosir gan beta a firws trwy ddadgofrestru TRAF6. J. Mol. Cell Biol. 5, 39–47 (2013).

34. Xiao, N. et al. Mae proteas 4 sy'n benodol i Ubiquitin (USP4) yn targedu TRAF2 a TRAF6 ar gyfer deubiquitination ac yn atal mudo celloedd canser a achosir gan TNFalpha. Biocemeg. J. 441, 979–986 (2012).

35. Mae Yasunaga, J., Lin, FC, Lu, X. & Jeang, KT Ubiquitin-benodol peptidase 20 yn targedu TRAF6 a threth firws math 1 firws lewcemia celloedd T dynol i reoleiddio signalau NF-kappaB yn negyddol. J. Firol. 85, 6212–6219 (2011).

36. Mae Zhang, X., Zhang, J., Zhang, L., van Dam, H. & ten Dijke, P. UBE2O yn rheoleiddio actifadu NF-kappaB yn negyddol gan gyfryngu TRAF TRAF trwy atal amryliwiad TRAF6. Cell Res. 23, 366–377 (2013).

37. Wi, SM et al. Mae cyfadeilad TAK1-ECSIT-TRAF6 yn chwarae rhan allweddol yn y signal TLR4 i actifadu NF-kappaB. J. Biol. Cemeg. 289, 35205–35214 (2014).

38. Min, Y., Kim, MJ, Lee, S., Chun, E. & Lee, KY Mae atal gweithgaredd ubiquitin-ligase TRAF6 gan PRDX1 yn arwain at atal actifadu NFKB ac actifadu awtophagi. Autophagy 14, 1347–1358 (2018).

39. Jiao, S. et al. Mae'r kinase MST4 yn cyfyngu ar ymatebion llidiol trwy ffosfforyleiddiad uniongyrchol yr addasydd TRAF6. Nat. Imiwnol. 16, 246–257 (2015).

40. Baudry, M. & Bi, X. Calpain-1 a Calpain-2: Yr Yin a'r Yang o Blastigrwydd Synaptig a Niwroddirywiad. Tueddiadau Neurosci. 39, 235–245 (2016).

41. Franco, SJ & Huttenlocher, A. Rheoleiddio mudo celloedd: calpains sy'n gwneud y toriad. J. Cell Sci. 118, 3829–3838 (2005).

42. Katsube, M. et al. Rheoleiddio trwy gyfrwng Calpain o'r llwybrau signalau gwahanol a mudo celloedd mewn niwtroffiliau dynol. J. Leukoc. Biol. 84, 255–263 (2008).

43. Schaecher, K., Goust, JM & Banik, NL Effeithiau ataliad calpain ar ddiraddiad alffa IkB ar ôl actifadu PBMCs: nodi safleoedd holltiad calpain. Neurochem. Res. 29, 1443–1451 (2004).

44. Tompa, P. et al. Ar benderfynyddion dilyniannol holltiad calpain. J. Biol. Cemeg. 279, 20775–20785 (2004).

45. Cuerrier, D., Moldoveanu, T. & Davies, PL Penderfynu penodoldeb swbstrad peptid ar gyfer mu-calpain trwy ddull sy'n seiliedig ar lyfrgell peptid: pwysigrwydd rhyngweithiadau ochr preimio. J. Biol. Cemeg. 280, 40632–40641 (2005).

46. ​​DuVerle, DA, Ono, Y., Sorimachi, H. & Mamitsuka, H. Rhagfynegiad holltiad Calpain gan ddefnyddio dysgu cnewyllyn lluosog. PLoS Un. 6, e19035 (2011).

47. Mae Shi, CS a Kehrl, JH TRAF6 ac A20 yn rheoleiddio 63-ubiquitination Beclin sy'n gysylltiedig â lysin-1 i reoli awtoffagi a achosir gan TLR. Sci. Arwydd. 3, ra42 (2010).

48. Loo, YM & Gale, M. Imiwnedd Signaling by RIG-I-like Receptors. Imiwnedd 34, 680–692 (2011).

49. Ling, T. et al. Mae TARBP2 yn atal actifadu IRF7 trwy atal hollbresennoliaeth cysylltiedig â TRAF o IRF7. Mol. Imiwnol. 109, 116–125 (2019).

50. Zhou, Z. et al. Mae Zebrafish otud6b yn rheoleiddio ymatebion gwrthfeirysol yn negyddol trwy atal hollbresennol K63-gysylltiedig o irf3 ac irf7. J. Immunol. 207, 244–256 (2021).

51. Kobayashi, T., Walsh, MC & Choi, Y. Rôl TRAF6 mewn trawsgludiad signal a'r ymateb imiwn. Mae microbau'n heintio. 6, 1333–1338 (2004).

52. Wu, H. & Arron, JR TRAF6, pont foleciwlaidd sy'n rhychwantu imiwnedd addasol, imiwnedd cynhenid, ac osteoimwnoleg. Bioessays 25, 1096–1105 (2003).

53. Pickart, CM & Eddins, MJ Ubiquitin: strwythurau, swyddogaethau, mecanweithiau. Biochim. Bioffys. Acta. 1695, 55–72 (2004).

54. Pickart, CM & Fushman, D. cadwyni polyubiquitin: signalau protein polymerig. Curr. Barn. Cemeg. Biol. 8, 610–616 (2004).

55. Lamothe, B. et al. Lys safle-benodol-63-cyswllt tiwmor necrosis ffactor derbynnydd ffactor cysylltiedig 6 awto-ubiquitination yn benderfynydd critigol o actifadu I kappa B kinase. J. Biol. Cemeg. 282, 4102–4112 (2007).

56. Han, Y., Weinman, S., Boldogh, I., Walker, RK & Brasier, AR Tumor necrosis ffactor-alpha-inducible IkappaBalpha proteolysis cyfryngu gan cytosolic m-calpain. Mecanwaith sy'n gyfochrog â'r llwybr ubiquitin-proteasome ar gyfer actifadu ffactor niwclear-kappa B. J. Biol. Cemeg. 274, 787–794 (1999).

57. Chu, Q. et al. Mae Cylchol Gwarchodedig Iawn RNA circRasGEF1B yn Gwella Imiwnedd Gwrthfeirysol trwy Reoleiddio Llwybr miR-21-3p/MITA mewn Fertebratau Isaf. J. Firol. 95, e02145–20 (2021).

58. Chen, Y., Cao, B., Zheng, W. & Xu, T. ACKR4a yn cymell autophagy i rwystro signalau NF-kappaB ac apoptosis i hwyluso haint Vibrio harveyi. iGwyddoniaeth 26, 106105 (2023).

59. Sepulcre, MP et al. Esblygiad cydnabyddiaeth a signalau lipopolysaccharide (LPS): nid yw pysgod TLR4 yn cydnabod LPS ac mae'n rheoleiddio actifadu kappaB NF yn negyddol. J. Immunol. 182, 1836–1845 (2009).

60. Zheng, W., Chu, Q. & Xu, T. Mae'r noncoding hir RNA NARL yn rheoleiddio ymatebion imiwn trwy is-reoleiddio NOD1 microRNA-gyfryngol mewn pysgod teleost. J. Biol. Cemeg. 296, 100414 (2021).

61. Zheng, W., Su, H., Lv, X., Xin, S. & Xu, T. Exon-Intron Circular RNA circRNF217 Yn Hyrwyddo Imiwnedd Cynhenid ​​a Gweithgaredd Gwrthfacterol mewn Pysgod Teleost trwy Leihau miR-130-3p Swyddogaeth. J. Immunol. 208, 1099–1114 (2022).

62. Mae Xu, T., Chu, Q. & Cui, J. Rhabdovirus-inucible microRNA-210 yn modiwleiddio ymateb imiwnedd cynhenid ​​​​gwrthfeirysol trwy dargedu STING/MITA mewn pysgod. J. Immunol. 201, 982–994 (2018).

63. Bi, D. et al. Cydnabod Lipopolysaccharide ac Ysgogi NF-kappaB gan Synhwyrydd Cytosolig NOD1 mewn Pysgod Teleost. Blaen. Imiwnol. 9, 1413 (2018).

64. Yan, X., Zhao, X., Huo, R. & Xu, T. IRF3 ac IRF8 Rheoleiddio Signalau NF-kappaB trwy Dargedu MyD88 mewn Pysgod Teleost. Blaen. Imiwnol. 11, 606 (2020).

65. Chen, Y., Cao, B., Zheng, W., Sun, Y. & Xu, T. eIF3k yn atal signalau NF-kappaB trwy dargedu MyD88 ar gyfer ATG5-diraddio awtoffagic cyfryngol mewn pysgod teleost. J. Biol. Cemeg. 298, 101730 (2022).