Y Llwybr I Gynyddu Astudiaethau Rhag-glinigol o Glefydau Niwro-ddirywiol sy'n Gysylltiedig ag Oedran: Safbwynt Ar Fodelau sy'n Deillio o Gnofilod A HiPSC Rhan 3

Mae dulliau fector firaol tebyg wedi'u hasesu mewn modelau amrywiol o PD, gyda'r datganiadau cynharaf yn defnyddio AAV2/2 neu LVs.123–126Defnyddiwyd y fectorau hyn a chwistrellwyd i ymennydd llygod mawr i oedolion i ddosbarthu mwtaniaid WT, A30P, neu A53T o a-syn dynol ar gyfer afiechyd. sefydlu.

Gall y berthynas rhwng firysau a chof ymddangos yn negyddol i lawer o bobl, gan fod firysau yn aml yn achosi anghysur corfforol a salwch. Fodd bynnag, gall firysau hefyd gael effaith gadarnhaol ar wella cof, yn bennaf oherwydd gall ymosodiadau firaol hyrwyddo gweithgaredd y system imiwnedd.

Mae astudiaethau wedi dangos y gall ymosodiadau firaol achosi i system imiwnedd y corff ymateb, a thrwy hynny wella ymwrthedd y corff i firysau. Mae'r ymateb system imiwnedd hwn yn cynnwys cynyddu nifer y celloedd gwaed gwyn a chelloedd imiwn eraill a gynhyrchir, yn ogystal â chynhyrchu gwrthgyrff. Mae'r ymatebion hyn nid yn unig yn helpu'r corff i wrthsefyll ymlediad firaol ond hefyd yn helpu i gryfhau swyddogaeth y system imiwnedd a gwella iechyd cyffredinol y corff.

Mae ymosodiadau firaol hefyd yn actifadu celloedd imiwn yn yr ymennydd. Gall y celloedd imiwnedd hyn gael gwared ar wastraff a chelloedd llygredig o'r ymennydd, gwella swyddogaeth y system nerfol, a hyrwyddo trosglwyddo gwybodaeth a phrosesu cof. Mae astudiaethau hefyd wedi dangos y gall pobl â rhai heintiau firaol berfformio'n well wrth ddelio â thasgau cof.

Yn ogystal, mae rhai astudiaethau wedi canfod y gall rhai firysau ysgogi'r corff i gynhyrchu ffactor niwrotroffig sy'n deillio o'r ymennydd (BDNF), sylwedd sy'n hyrwyddo twf a datblygiad niwronau. Mae'r sylwedd hwn yn cael effaith gadarnhaol ar swyddogaeth yr ymennydd a gall hyrwyddo atgyweirio corfforol a gwella cof.

Wrth gwrs, yn y frwydr yn erbyn y firws, mae angen inni fabwysiadu'r dull a'r strategaeth gywir, cynnal arferion hylendid da, a chael digon o gwsg ac ymarfer corff, fel bod ein system imiwnedd yn y cyflwr gorau. Yn fyr, er y gall y firws achosi anghysur corfforol i ni, mae tystiolaeth gynyddol y gall hefyd hyrwyddo gweithgaredd y system imiwnedd a chael effaith gadarnhaol ar ein hiechyd a'n cof. Gellir gweld bod angen i ni wella ein cof, a gall Cistanche wella ein cof yn sylweddol oherwydd gall Cistanche hefyd reoleiddio cydbwysedd niwrodrosglwyddyddion, megis cynyddu lefelau acetylcholine a ffactorau twf, sy'n bwysig iawn ar gyfer cof a dysgu. Yn ogystal, gall Cistanche hefyd wella llif y gwaed a hyrwyddo darpariaeth ocsigen, a all sicrhau bod yr ymennydd yn cael digon o faeth ac egni, a thrwy hynny wella bywiogrwydd a dygnwch yr ymennydd.

Cliciwch gwybod atchwanegiadau i wella cof

Dangosodd yr awduron fynegiant effeithlon o a-syn mewn niwronau DA nigral, ynghyd â phatholegau moleciwlaidd a cellog a dirywiad nigralDA a esblygodd yn raddol dros amser.

Serch hynny, roedd y genhedlaeth gyntaf o fectorau rAAV2/2 a ddefnyddiwyd yn yr astudiaethau hyn yn dangos colled niwronau cynyddol, er bod niwroddirywiad y niwronau tyrosine-hydroxylase-positif, yn ogystal â'r cwrs amser, yn amrywio'n fawr (25%-80% a 6 wythnos i 1 flwyddyn). , yn y drefn honno).123,124

Mewn cyferbyniad, roedd LVs sy'n amgodio WT-, A30P-, neu A53T-synwer treiglo yn gallu achosi colled celloedd niwronaidd mewn llygod mawr mewn modd mwy oedi a mwy cyson (25%-40% a 5 mis, yn y drefn honno).126 Dangosodd y ddwy astudiaeth colled gynyddol mewn hyd niwrit a pherikarya chwyddedig yn y niwronau DA sy'n weddill.

Ymhellach, canfuwyd croniadau cytoplasmig enfawr o a-syn mewn cyrff cell a niwritau. Mae'r canlyniadau hyn wedi'u hailadrodd yn ddiweddar mewn astudiaethau lluosog a ddefnyddiodd y ddau lwyfan firaol.127–131

Mae LVs hefyd wedi cael eu defnyddio mewn amrywiaeth o fodelau PD llygod. Dangosodd Forexample, Lauwers a chydweithwyr125 fod chwistrelliad o LV sy'n cario WT neu mutant A30P o a-syn yn y llygod striatum, amygdala, neu SNof yn gallu achosi newidiadau niwroddirywiol sy'n gysylltiedig â PD mewn modd a oedd yn dibynnu ar amser ac yn cynnwys ehangiad niwritig a-annibynnol a chynhwysion sytoplasmig.

Ymhellach, dangosodd yr astudiaeth hon fod gorfynegiant nigral o A30P-a-syn wedi arwain at golli tua 25% o gelloedd am 10-12 mis.125 Roedd cyflwyno A30P, E57K, ac E35K i SN y llygoden fawr gan ddefnyddio LV yn dangos graddau tebyg mewn niwron DA colled (tua 50%) o gymharu â'r WT (30%), ond ni ddangosodd y mutant cyflymach ffurfio ffibril A53T a ddefnyddiwyd yn yr un astudiaeth ostyngiad sylweddol yn nifer celloedd DA.

Yn ddiddorol, roedd y nodweddion niwropatholegol cyffredinol a welwyd mewn llygod (hy, cychwyniad a difrifoldeb) yn ymddangos yn llai difrifol o'u cymharu â'r llygod mawr, er y gallai'r gwahaniaethau hyn fod yn arteffact o burdeb firaol neu lefelau cynhyrchu'r firws a chwistrellwyd a / neu anghysondebau technegol cysylltiedig eraill.

Ystyriaethau Pwysig ar gyfer Modelau Fector Feirol TA a PD

Mae datblygu seroteipiau newydd, gan gynnwys AAV2/1, AAV2/5, AAV2/6, AAV2/8, AAVrh10, DJ, a DJ8, wedi ehangu targedau cellog a gwella effeithlonrwydd trawsgludo AAV.

Mae'r AAVs seroteipio gyda'r capsidau newydd hyn wedi'u profi mewn llygod mawr a nonhumanprimates i or-fynegi a-syn.132-137 Mae gorfynegiant o'r S129Aform a ddarperir trwy AAV2/5 ac AAV2/6 yn dangos gwenwyndra uwch yn gyson yn y broses niwroddirywiad.134,138

Roedd yr arbrofion hyn hefyd yn dangos bod dosio'r trawsgenyn gorfynegiant yn ofalus yn hanfodol, gan y gall hyd yn oed fectorau rheoli sy'n cario dim ond gohebwyr fflworoleuol a ddarperir ar lefelau uchel ddangos effeithiau gwenwynig amhenodol.135

Dylid ystyried y cafeat hwn yn ofalus wrth ddylunio arbrofion achub yn seiliedig ar AAV. Er enghraifft, dangoswyd bod yr AAV therapiwtig sy'n cynnal RNA ymyrraeth fach (siRNA) sy'n targedu SNCA wedi arwain at lefel uchel o wenwyndra ac wedi achosi colled sylweddol o niwronau DA nigrostriatal. Amlygodd yr astudiaeth hon ymhellach gyfyngiadau cymwysiadau AAV mewn astudiaethau anifeiliaid.

Fodd bynnag, ni ellir ei eithrio bod y niwrowenwyndra a achosir gan ostyngiad cadarn mewn lefelau SNCA mewn modelau llygod mawr, mae asa-syn yn chwarae rhan biocemegol hanfodol mewn niwronau DA, a gallai ei leihad cadarn leihau hyfywedd celloedd.139 Gyda'i gilydd, mae hyn yn tanlinellu pwysigrwydd datblygu offeryn ar gyfer mireinio mynegiant genynnau sy'n gysylltiedig â chlefydau ar gyfer dylunio dulliau therapi genynnau.

Yn hyn o beth, gall y system CRISPR-dCas fwy diweddar gyflwyno system fwy manteisiol ar gyfer modiwleiddio mynegiant genynnau mewn modd manwl gywir a manwl.

Ar hyd y llinell hon, rydym yn ddiweddar wedi datblygu system LV-CRISPR-Cas9 i gyflawni rheoleiddio manwl gywir a manwl gywir o fynegiant genynnau SNCA. Darparodd yr astudiaeth brawf o'r cysyniad bod trin mynegiant genynnau (ee, gwrthdroi gorfynegiant) trwy olygu epigenom yn strategaeth therapiwtig werthfawr ar gyfer anhwylderau niwrolegol, megis PD,140 a achosir gan ddadreoleiddio genynnau.

O'r herwydd, mae'r modelau fector firaol PD gan ddefnyddio LV ac AAV ar gyfer gorfynegiant arddangosiad protein a-syn PD patholeg sy'n gysylltiedig â niwroddirywiad DA, ac mae defnyddio seroteipiau AAV newydd yn gwella mynegiant a-syn mewn niwronau DA o'i gymharu ag AAV2/2.

Ar y cyfan, mae AAVs a LVs yn gallu ysgogi mynegiant trawsgenaidd ac yn dangos lefel uchel o dropiaeth ar gyfer niwronau DA, gan arwain at lefelau tebyg o niwroddirywiad. Bydd angen gwella'r systemau firaol hyn ymhellach er mwyn osgoi dilyniant araf y ffenoteipiau PD cellog a lefelau cymharol isel o namau ymddygiadol.

Modelau Diwylliant Celloedd In Vitro Trosolwg o Fodelau OC a PD Cyfredol In Vitro: Cyfyngiadau a Chyfleoedd

Dros y pedwar degawd diwethaf, mae amrywiaeth o fodelau AD a PD in vitro wedi'u datblygu i archwilio'r rhyngweithiadau rhwng agweddau allweddol ar eu pathoffisioleg clefyd perthynol ac wedi hynny eu defnyddio ar gyfer sgrinio therapiwtig cyn-glinigol.

Mae modelau AD a PD presennol in vitro yn anelu'n bennaf at ail-ddangos nodweddion clefyd moleciwlaidd a chellog, megis camweithrediad mitocondriaidd, straen ocsideiddiol, goroesiad celloedd, a phresenoldeb agregau protein mewngellol a / neu allgellog. Er enghraifft, mae'r modelau cellog ADare amlycaf ac a ddefnyddir fwyaf yn seiliedig ar sefydlu agregau Ab40 42 neu hyperffosfforyleiddiad tau ac agregu141,142 (Tabl 1).

Yn yr un modd, mae modelau in vitro ofPD yn seiliedig ar y swyddogaeth mitochondrial a achosir gan docsin uchod (ee, MPTP, rotenone, paraquat, 6-OHDA) a phroteostasis tarfu (ee, thapsigargin, ionomycin, tunicamycin), gorfynegiant a-syn, a mynegiant o'r genynnau teuluol PD treigledig (ee,a-syn, Parkin, PINK1)92 (Tabl 2).

Er bod y modelau cell-ddiwylliant hyn wedi bod yn amhrisiadwy wrth ddatblygu ein dealltwriaeth o niwrobioleg berthnasol, nid ydynt eto wedi arwain at DMTs hyfyw sydd wedi'u hanelu at atal, oedi cyn dechrau, neu arafu dilyniant clefydau, gan gwestiynu eu perthnasedd a'u dilysrwydd trosiadol.

Mae'n bwysig cydnabod sawl cyfyngiad clir yn y modelau hyn er mwyn gwella arferion rhag-glinigol presennol.

Er enghraifft, mae modelau sy'n seiliedig ar orfynegiant a dymchwel/lawr genynnau sy'n gysylltiedig â chlefydau yn hynod amrywiol yn y newidiadau meintiol i lefelau protein a'r dulliau a ddefnyddir i ysgogi newidiadau i fynegiant genynnau (hy, mynegiant cyfryngol firaol, seiliedig ar fridio, cyfansoddiadol, neu fynegiant dros dro) gall hynny arwain at ddata a chasgliadau gwrth-ddweud.92

Mae'r diffyg cysondeb hwn wrth ennyn ffenoteipiau sy'n gysylltiedig â chlefydau yn cyflwyno cafeat i astudiaethau rhag-glinigol sy'n defnyddio'r modelau hyn i brofi DMTs posibl. Ar ben hynny, mae amrywioldeb mewn ffenoteipiau cellog a methodoleg a welwyd mewn modelau NDD cyn-glinigol (ee, newid plyg o orfynegiant protein neu ddymchwel) yn awgrymu'n gryf heterogeneity genetig mwy na ellir ei archwilio'n llawn mewn modelau celloedd cyfredol.

Cymhlethir hyn ymhellach gan nifer yr achosion o fodelau celloedd sy'n seiliedig ar amrywiadau genetig a nodwyd mewn carfannau teuluol, er bod amrywiadau teuluol yn cynrychioli lleiafrif bach o achosion NDD cyffredinol.109,143

Oherwydd yr achosion genetig sydd heb eu darganfod, mae'n parhau i fod yn anodd cynrychioli carfannau NDD achlysurol neu isdeipiau afiechyd yn gywir gyda geneteg an-Fendeliaidd mewn modelau rhag-glinigol, gan greu rhwystr sylweddol wrth egluro mecanweithiau clefyd perthnasol, nodi targedau therapiwtig posibl, a datblygu cyffuriau.

O ystyried yr heriau hyn, mae ymchwilwyr wedi'u gorfodi i werthuso'r modelau hyn i nodi meysydd i'w gwella ac i werthuso'r cyfleoedd a gyflwynir gyda thechnegau diwylliant celloedd newydd.

Yn ystod y blynyddoedd diwethaf, rydym wedi adeiladu ar y modelau hyn, gan ymgorffori technoleg golygu genynnau newydd a gwerthuso cysylltiadau clefydau genetig pwysig a gafwyd mewn GWASs mewn modelau meithrin meinwe gwell.144,145

Mae ymgorfforiad cynyddol technoleg hiPSC yn cynrychioli dilyniant mawr ym maes modelu in vitro NDD ac yn darparu cyfleoedd nad oedd ar gael o'r blaen i ddefnyddio mathau o gelloedd sy'n berthnasol i glefydau sy'n deillio o gleifion i archwilio pathogenesis afiechyd yng nghyd-destun y genom dynol.

Mae sbectrwm llawn manteision a chyfyngiadau modelau NDD sy'n deillio o hiPSC, yn enwedig y rhai am AD a PD, yn cael eu harchwilio'n llawn yn yr adran nesaf.

Modelau o NDDs sy'n Deillio o HiPSC: Amlbwrpas ac yn Enetig "Ffyddlon"

Mae datblygiadau modern mewn technoleg cell-ddiwylliant yn cynrychioli un o'r datblygiadau mwyaf cyffrous yn yr ymchwil i anhwylderau niwroddatblygiadol, gan ddarparu cyfleoedd ar gyfer gwell modelu clefydau, sgrinio cyffuriau, a meddygaeth bersonol.

Tan yn ddiweddar, roedd archwiliad post mortem ar yr ymennydd yn ystyried y deunydd biolegol safon aur sy'n seiliedig ar ddyn er mwyn cael cipolwg ar brosesau patholegol cyflyrau niwroddirywiol dynol.

Fodd bynnag, mae technolegau bôn-gelloedd modern, gan gynnwys dadansoddi niwronau cleifion-benodol a chelloedd glial, wedi agor llwybrau newydd ar gyfer ymchwilio i fecanweithiau patholegol anhwylderau niwroddatblygiadol ac maent wedi'u harneisio'n gynyddol wrth ddyrannu moleciwlaidd NDDs gyda chymhlethdod genetig gwell, megis AD a PD.

Trwy fiopsi syml, anfewnwthiol o samplau croen cleifion, yn ogystal ag amrywiaeth o samplau biolegol amgen, mae cynhyrchu hiPSCs yn galluogi ymchwilwyr i ddatgelu llwybrau moleciwlaidd a mecanweithiau afiechyd sydd o dan NDDs mewn ffordd a oedd yn amhosibl gyda dulliau meithrin celloedd blaenorol.

Ar hyn o bryd, y celloedd rhoddwyr mwyaf cyffredin yw ffibroblastau, a ddefnyddir mewn dros 80% o'r holl arbrofion ailraglennu cyhoeddedig; 146 fodd bynnag, gellir cael hiPSCs o amrywiaeth o ffynonellau, gan gynnwys bôn-gelloedd llinyn embryonig, gwaed llinyn bogail, celloedd epithelial cornbilen, a chelloedd gwaed, fel celloedd mononiwclear gwaed ymylol147–149 (Ffigur 1).

O ganlyniad, mae modelau sy'n deillio o hiPSC yn cynrychioli dewis amgen amlbwrpas i fodelau clefyd cellog sy'n bodoli eisoes ac fe'u ceir o feinweoedd somatig cleifion sy'n cael eu gorfodi i ddefnyddio amrywiaeth o offer ailraglennu, megis plasmidau, fectorau (ee, episomal), a thrawsgludiad firaol (e.e. , adenovirus, firws Sendai,lentivirus; mae'r dulliau hyn yn cael eu hadolygu'n gynhwysfawr yn Brouweret al.150 a Malik a Rao151).

Mae'r celloedd hyn yn hunan-adnewyddu ac yn cynnig dewis amgen i fôn-gelloedd embryonig (ESCs), sy'n cyd-fynd ag ystyriaethau moesegol a phryderon cymdeithasol. Ar hyn o bryd mae yna nifer o ystorfeydd hiPSC sy'n casglu ac yn dosbarthu llinellau hiPSC sy'n deillio o gleifion ag NDDs a rheolyddion iechyd sy'n cyfateb i oedran i ganoli samplau a sicrhau eu bod ar gael yn hawdd i ymchwilwyr (Tabl S2).

Un o brif gymwysiadau hiPSCs yw'r gwahaniaethu i fathau penodol o gelloedd, sydd o ganlyniad wedi'u defnyddio mewn amrywiaeth o gyd-destunau biolegol, gan gynnwys astudiaethau niwroddatblygiadol152 a niwroddirywiad,144 trawsblannu ex vivo, modelu clefydau 153,154, dilysu targedau, a darganfod cyffuriau.155

Hyd yn hyn, mae protocolau gwahaniaethu sawl cell wedi'u datblygu sy'n cynhyrchu nid yn unig niwronau generig ond hefyd boblogaethau math celloedd niwronaidd penodol, gan gynnwys niwronau cynhyrfus, colinergig, DA, ac ataliolGABAergig. gan gynnwys astrocytes, 159–161oligodendrocytes,162,163 a microglia.164–166

Cyflwynodd sawl techneg golygu genynnau newydd, gan gynnwys CRISPR-Cas9, niwcleasau bys sinc (ZFN), a niwcleasau effeithydd tebyg i actifadu trawsgrifio (TALENS), ddimensiwn ychwanegol i'r system sy'n deillio o hiPSC - creu modelau isogenig sydd â'r un cefndir genetig. ac yn gwahaniaethu yn unig yn y treiglad detholedig.167

Mae amrywiaeth protocolau gwahaniaethu celloedd wedi hwyluso astudiaethau mecanistig, ac mae argaeledd llinellau isogenig wedi cefnogi dadansoddiadau genetig o swyddogaeth genynnau a'i rôl pathogenig mewn NDDs. Mae modelau sy'n deillio o hiPSC yn addas ar gyfer yr ymchwiliadau hyn, gan eu bod yn arddangos nodweddion allweddol sy'n gysylltiedig â chlefydau.

Er enghraifft, mae modelau hiPSCneuronal sy'n deillio o fAD a sAD sy'n cario treigladau PS1 a PS2 (A246E a N14II, yn y drefn honno)168 a threiglad dyblygiad APP169 yn dangos nodweddion biocemegol AD ​​pwysig, gan gynnwys secretion Ab, cymhareb Ab42:Ab40 uwch, a hyperffosfforyleiddiad uwch.

Mae'n bwysig nodi bod defnyddio modelau hiPSC sy'n cynhyrchu ffenoteipiau sy'n gysylltiedig ag Ab yn ffordd fwy cywir o archwilio rôl mynegiant Ab mewn niwroddirywiad AD o'i gymharu â modelau mynegiant ectopig traddodiadol neu fodelau sy'n gofyn am ategu a/neu anwytho agregau Ab, fel mae'r rhain yn mabwysiadu'r prosesau patholegol "naturiol" sy'n gysylltiedig â dyddodion Ab.

For more information:1950477648nn@gmail.com