Y Berthynas Rhwng Cyclo-oxygenase(COX-2) A Chlefyd a Achosir gan Hypocsia

am ragor o wybodaeth:ali.ma@wecistanche.com

Mae prostaglandin mewngellol E2 yn cyfrannu at farwolaeth celloedd tiwbaidd procsimol a achosir gan hypocsia

Coral Garcia-Pastorl, Selma Benito-Martinez, Ricardo J.Bosch1, Ana B. Fernandez-Martinez, Francisco J. Lucio-Cazana

Mae celloedd tiwbaidd agos (PTC) yn arbennig o agored i apoptosis a achosir gan hypocsia, ffactor perthnasol ar gyferclefyd yr arennau. Fe wnaethom ddamcaniaethu yma bod marwolaeth PTC o dan hypocsia yn cael ei gyfryngu gan gynhyrchiad dibynnol cyclo-oxygenase (COX-2) o prostaglandin E, (PGE,), a gadarnhawyd mewn celloedd HK tiwbaidd procsimol dynol oherwydd hypocsia (1 y cant O,)-apoptosis (i) a achosir gan COX-2(cyclo-Roedd atalydd oxygenase) a gan wrthwynebwyr derbynyddion prostaglandin (EP) a (ii)yn gysylltiedig â chynnydd mewn PGE mewngellol, (iPGE,)oherwydd ffactor hypocsia-anwythol-1 -uwch-reoliad trawsgrifiadol dibynnol o COX{{3 }}(cyclo-ocsigenas). Cafodd apoptosis ei atal hefyd gan atalyddion y cludwr derbyniad prostaglandin PGT, a nododd fod iPGE, yn cyfrannu at apoptosis a achosir gan hypocsia (i'r gwrthwyneb, roedd marwolaeth PTC a achosir gan hypocsia / ail-ocsigeniad oherwydd PGE allgellog yn unig). Felly, mae iPGE yn actor newydd yn pathogenesis anaf tiwbaidd a achosir gan hypocsia a gallai PGT fod yn darged therapiwtig newydd ar gyfer atal briwiau sy'n ddibynnol ar hypocsia mewn clefydau arennol.

Mae wedi'i hen sefydlu bod hypocsia tiwbaidd yn ffactor perthnasol ar gyfer acíwt a chronigclefyd yr arennau'2 Mae celloedd tiwbaidd agos (PTC) yn hynod weithgar o ran defnydd ocsigen oherwydd eu gweithgareddau adamsugno sy'n gofyn am ynni ac, o ganlyniad, maent yn agored i hypocsia. Dangoswyd bod apoptosis yn chwarae rhan berthnasol mewn PTC diwylliedig sy'n agored i hypocsia-, ond nid yw'r llwybrau signalau sy'n gyfrifol am actifadu'r peiriannau apoptotig wedi'u hymchwilio. Rydym ni ac eraill wedi canfod bod prostaglandin E, (PGE,), cyfryngwr lipid pwysig o brosesau ffisiolegol a phatholegol niferus yn yaren, yn chwarae rhan berthnasol yn y signalau sy'n arwain at apoptosis PTC ar driniaeth â cisplatin7, albumin8or leptin, a gentamycin. Ym mhob achos, canfuwyd bod y cynnydd mewn PGE yn dibynnu ar fynegiant gwell o cyclo-oxygenase-2(COX-2)(cyclo-oxygenase), ensym anwythol sydd, ynghyd â COX-1l, yn gam sy'n cyfyngu ar gyfradd yn synthesis prostaglandinau. Yn y dynolaren, COX gwaelodol-2(cyclo-oxygenase)mae mynegiant yn llai dwys na mynegiant COX-1. COX-2(cyclo-oxygenase)wedi'i nodi mewn podocytes a rhannau o ddolen Henle a fasgwleiddiad arennol o dan amodau ffisiolegol10.Mewn cyflyrau patholegol, fodd bynnag, mae'n bosibl y bydd imiwn-adweithedd COX-2 i'w gael mewn llawer mwy o fathau o gelloedd o fewn yarengan gynnwys PTC, ac o bosibl yn cyfrannu at anaf arennol. Yn ddiddorol, mae hypocsia yn cynyddu mynegiant COX-2(cyclo-oxygenase)a/neu gynhyrchu PGE,12-i7 mewn llawer o fathau o gelloedd. Mewn gwirionedd, rydym wedi canfod o'r blaen bod hypocsia yn gwella'r cynnwys mewngellol yn PGE, yn ogystal â'i ryddhau i'r cyfrwng allgellog8. Felly, mae'n ddamcaniaethol bosibl bod PGE yn cyfryngu effaith apoptotig hypocsia ar PTC.

Mae'r rhan fwyaf o astudiaethau ar apoptosis dibynnol PGE wedi canolbwyntio yn y bôn ar fecanweithiau sy'n cynnwys PGE allgellog oherwydd derbynnir yn eang bod PGE, yn cyflawni ei effeithiau biolegol trwy actifadu derbynyddion plasma sy'n rhychwantu G-protein ynghyd â PGE, derbynyddion (derbynyddion prostaglandin cyfres E). EP1-4)1. Serch hynny, mewn rhai modelau, mae PGE mewngellol,(iPGE,)yn berthnasol mewn marwolaeth celloedd apoptotig720-22. Mae hyn yn awgrymu, er mwyn ysgogi apoptosis, bod yn rhaid i PGE gyrraedd y cyfrwng mewngellol eto ac actifadu is-set o dderbynyddion EP, sydd wedi'u lleoli y tu mewn i'r gell (derbynyddion iEP). Gan fod y dasg o ddal PGE, yn cael ei chyflawni'n bennaf gan y cludwr derbyn prostaglandin(PGT)23-26, mae ataliad PGT yn arwain at atal marwolaeth celloedd apoptotig-cyfryngol iPGE7.

Gan ystyried y cefndir hwn, yn y gwaith presennol, fe wnaethom astudio a yw COX-2(cyclo-oxygenase)- cynnydd dibynnol mewn iPGE, lefelau cyfryngu apoptosis a achosir gan hypocsia yn PTC.

Cliciwch i Cistanche organig ar gyfer clefyd yr arennau

Dulliau

Adweithyddion.

AG1478, Bromocresolgreen (BG), PGE, AH6809, GW627368X, fioled grisial, toddiannau glas trypan, Bromosulfophthalein (BRS), 3-(5'-Hydroxymethyl2'-furyl)-1-benzyl indazole (YC1), ac actinomycin D eu prynu oddi wrth Sigma (St. Louis, MO, UDA). Roedd Z-VAD-FMK a celecoxib yn dod o Calbiochem (Darmstadt, yr Almaen) a Cayman Chemical (Ann Arbor, MI, UDA), yn y drefn honno. Prynwyd TriReagent oddi wrth Vitro (Madrid, Sbaen), a chaffaelwyd pilenni PVDF ac adweithydd luminol blotio Gorllewinol gan Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA. UDA). }}Prynwyd pecyn canfod apoptosis ffenyl indole (DAPI), anecsin-V-FITC (fluorescein isothiocyanate)/propidium ïodide (PI) a chwiliwr diasetad 2',7'-dichlorofluorescein (DCFH-DA) gan Invitrogen (Carlsbad, CA,). UDA), a Chwilwyr Moleciwlaidd (Oregon, UDA), yn y drefn honno. Cafwyd gwrthgyrff o'r ffynonellau canlynol: gwrth-PGE a gwrth-COX-2(cyclo-oxygenase)roedd gwrthgyrff yn dod o Abcam (Caergrawnt, DU); roedd gwrth-Bax a gwrth-Bcl-2 yn dod o Santa Cruz Technologies (Santa Cruz, CA.USA); roedd gwrthgorff gwrth-HIF-la a -cwningen-Alexa-Fluor 488 o BD Biosciences (Palo Alto, CA, UDA) ac Invitrogen (Carlsbad, CA, UDA), yn y drefn honno; gwrth- -actin a chwningen gwrth-lygoden IgG peroxidase conjugate ei brynu oddi wrth Sigma (St.Louis, MO, UDA).

Diwylliant celloedd ac amodau arbrofol.

Prynwyd celloedd tiwbaidd HK-2 procsimol dynol o'r Casgliad Diwylliant Math Americanaidd (ATCC)(Rockville, MD, UDA). Cadwyd celloedd mewn 5 y cant CO, ar 37 gradd Cin DMEM/F12 wedi'i ategu â 10 y cant o wartheg ffetws serwm (FBS), 1 y cant penisilin / streptomycin / amffotericin B ac 1 y cant glutamine (Invitrogen. Carlsbad, CA, UDA) ac 1 y cant inswlin-transferrin-seleniwm (ThermoFisher. Grand Island, NY, UDA). wedi'u platio ar gydlifiad 70-90 y cant, a phan fyddant wedi'u cysylltu'n llwyr, cawsant eu meithrin o dan amodau hypocsig (1 y cant o ocsigen) neu normocsaidd (21 y cant o ocsigen).Hypocsiacynhaliwyd arbrofion mewn In vivo200hypocsiagweithfan (Ruskin Technology, Gorllewin Swydd Efrog, y Deyrnas Unedig). Canyshypocsia/arbrofion ail-ocsigeniad, bu celloedd yn destunhypocsiaam 24 h, ac, wedi hynny, deorwyd celloedd o dan amodau normocsig am hyd at 3 h (cyfnod ail-ocsigeniad).

Dadansoddiad imiwnofflworoleuedd o iPGE, a dadansoddiad blotiau gorllewinol o COX-2(cyclo-oxygenase)a HIF-1 .

Rhannwyd celloedd ar gyfer dadansoddi imiwnfflworoleuedd a dadansoddiad blot y Gorllewin yn y drefn honno ar orchuddion gwydr (4 × 104 celloedd / slip gorchuddio gwydr) neu'n blatiau chwe ffynnon (15 × 104 cell / ffynnon) a'u deor fel y disgrifir yn "Canlyniadau". Yna, perfformiwyd imiwnfflworoleuedd, a dadansoddiad imiwnoblotting yn y bôn fel y disgrifiwyd yn flaenorol. Y gwanediadau gweithio gwrth-gorff oedd: 1/50 ar gyfer PGE,,1/1000 ar gyfer COX-2(cyclo-oxygenase)/HIF{0}}a/a-cwningen-Alexa-Fluor 568 a 1/5000 ar gyfer -actin. Perfformiwyd canfod imiwnofflworoleuedd gan ddefnyddio microsgop confocal Leica SP5 (Leica Microsystems, Wetzlar, yr Almaen), trwy'r Gwasanaeth Microsgopeg Cydffocal (ICTS 'NANBIOSIS'U17) y Ganolfan Rhwydweithio Ymchwil Biofeddygol ar Fiobeirianneg, Bioddeunyddiau, a Nanomeddygaeth (CIBER-BBN yn y Prifysgol Alcal, Madrid, Sbaen)

Trawsnewidiad dros dro.

Trawsnewidiad dros dro gyda siRNA PGT (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), y fector mynegiant mamalaidd pcDNA3 sy'n cynnwys cDNA y dynol math gwyllt 15-hydroxy-prostaglandin dehydrogenase (p15-PGDH) neu'r lluniadau plasmid gohebydd luciferase ar gyfer COX dynol-2(cyclo-oxygenase)phPES2-Luc, dynolhypocsiaelfen ymateb (HRE)p9HIF1-Perfformiwyd Luc ac R. reniformis pRL-CMV(Promega, Madison, WI) a phennu gweithgaredd luciferase fel y disgrifir mewn man arall27,28.

Cyfrif celloedd a morffoleg celloedd/cnewyllyn.

Pennwyd nifer y celloedd ymlynol yn sbectroffotometrig gyda dull staenio fioled grisial wedi'i addasu2. I ganfod tystiolaeth o apoptosis, arsylwyd morffoleg celloedd gan ddefnyddio microsgopeg cyferbyniad cam. Delweddwyd niwclysau celloedd ar ôl staenio DNA gyda DAPI fel y disgrifiwyd yn flaenorol0, Roedd morffoleg apoptotig nodweddiadol a archwiliwyd yn cynnwys crebachu cellog, cyddwysiad a darniad niwclear, a ffurfio cyrff apoptotig. Ar gyfer meintioli, archwiliwyd chwe maes ym mhob cyflwr arbrofol mewn modd dall i amcangyfrif canran y niwclysau ag ymddangosiad tebyg i apoptosis.

Assay apoptosis sytometreg llif a assay hyfywedd celloedd gan trypan prawf gwahardd llifyn glas.

Gwahanwyd celloedd a oedd yn glynu wrth y plât trwy drypsineiddiad ac, ynghyd â'r celloedd datgysylltiedig a adferwyd yn flaenorol o'r cyfrwng meithrin, fe'u defnyddiwyd ar gyfer yr assay.

Roedd pecyn canfod apoptosis Annexin-V-FITC/PI yn caniatáu ar gyfer canfod cytometreg llif celloedd HK-2 apoptotig a necrotig, fel y disgrifiwyd yn flaenorol7. Roedd celloedd apoptotig cynnar a hwyr yn gadarnhaol, yn y drefn honno, i staenio anecsin V a'r ddau ac atodiad V staenio. Dim ond positif i PI oedd celloedd necrotig ac ni ddangosodd celloedd HK-2 byw unrhyw staen.

Defnyddiwyd prawf gwahardd llif glas Trypan i asesu hyfywedd celloedd. Cafodd celloedd hyfyw (gwyn) a chelloedd marw (glas) eu cyfrif gan ddefnyddio microsgop golau a hemocytomedr.

Dadansoddiad ystadegol.

Ailadroddwyd pob arbrawf o leiaf dair gwaith. Mynegir y canlyniadau fel y cymedr ± SEM. Buont yn destun dadansoddiad un ffordd o amrywiant (ANOVA) ac yna prawf Bonferroni ar gyfer cymariaethau lluosog. Gosodwyd lefel yr arwyddocâd ar P Llai na neu'n hafal i 0.05.

Canlyniadau

Mae hypocsia yn achosi marwolaeth cell tiwbaidd HK-2 procsimol.

Hypocsialleihau nifer y celloedd HK-2, fel yr aseswyd gan assay fioled grisial (Ffig. la), a hefyd talgrynnu celloedd anwythol a datgysylltu oddi wrth y plât (Ffig. lb, panel uchaf). Yn ôl y disgwyl,hypocsiasbarduno model o farwolaeth celloedd gyda nodweddion morffolegol clir o apoptosis (gweler staenio niwclear gyda DAPI yn Ffig. lb, panel isaf, chwith) megis crebachu celloedd gyda anwedd niwclear sylweddol, darnio, a ffurfio cyrff tebyg i apoptotig.Hypocsia- cadarnhawyd apoptosis a achosir ymhellach gan y cynnydd o anexin V-FITCstaining, fel yr aseswyd gan cytometreg llif, a'i atal ag atalydd pan-caspase Z-VAD-FMK (Ffig. lc).Hypocsiahefyd yn pennu gostyngiad yn nifer y celloedd hyfyw ond nid oedd yn achosi newidiadau ystadegol arwyddocaol yn nifer y celloedd necrotig (Ffig. lc, mewnosodiad).

Ffigur 1. Mae hypocsia yn achosi marwolaeth celloedd tiwbaidd HK-2 procsimol.(a)Cyfrif celloedd gostyngol (profiad fioled grisial). (b)Nodweddion morffolegol apoptosis. Ffotomicrograffau cyferbyniad cam cynrychioliadol (panel uchaf, chwyddhad gwreiddiol, 10 ×) ffotomicrograffau staenio DAPI (panel is, chwyddhad gwreiddiol, 40 ×). (c) Cynnydd mewn apoptosis (astudiaethau cytometreg llif). Mae celloedd Atodiad V plws yn cynnwys celloedd ïodid Annexin V plws /propidium (hy celloedd apoptotig cynnar gyda chyfanrwydd pilen plasma wedi'i gadw) ac atodiad V plws /propidium ïodid plws celloedd (hy celloedd apoptotig hwyr). Mewnosodiad: Mathau o boblogaethau celloedd (Atodiad V-/ propidium ïodid plws celloedd yw celloedd necrotig ac atodiad V-/ propidium ïodid-yn gelloedd yn fyw). Mynegir canlyniadau fel canrannau mewn perthynas â chyfanswm y digwyddiadau. Gwybodaeth gyffredinol:(1) Deorwyd celloedd am 24 awr mewn amodau normocsig (21 y cant O2) neu hypocsig (1 y cant O,) fel y nodir yn "Methods?. Atalydd pan-caspase Z-VAD-FMK (25 μM) oedd ychwanegu 1 h cyn dechrau dod i gysylltiad âhypocsia. (2) Mae microffotograffau yn enghreifftiau cynrychioliadol o dri arbrawf annibynnol. Bariau a bariau gwall mewn graffiau: Mae pob bar yn cynrychioli cymedr ± SEM 3 arbrawf gwahanol *P<0.01 vs.=""><0.01 vs="">hypocsia;**P<0.01 vs.="" normoxia="" and="">hypocsiaynghyd â ZVAD.

COX{0}}(cyclo-oxygenase)Mae llwybr derbynnydd /iPGE,/EP yn cyfryngu marwolaeth celloedd tiwbaidd HK-2 procsimol a achosir gan hypocsia.

Er mwyn asesu rôl y COX-2(cyclo-oxygenase)/iPGE2/EP llwybr derbynnydd i mewnhypocsia-marwolaeth celloedd HK-2 wedi'i achosi, fe wnaethom rag-deor celloedd yn gyntaf gyda celecoxib, a COX-2(cyclo-oxygenase)atalydd1; AH6809, antagonist o dderbynyddion EP1, EP2 ac EP3 neu GW627368X, antagonist derbynnydd EP433; neu gyda gwyrdd bromocresol neu bromosul-foffthale yn y ddau ohonynt yn atalyddion o PGT435.PGT hefyd yn bwrw i lawr drwy transfection gyda siRNA.

Ffigur 2. COX-2(cyclo-oxygenase)Mae llwybr derbynnydd /iPGE,/EP yn cyfryngu marwolaeth cell tiwbaidd HK-2 procsimol a achosir gan hypocsia.(a) Atal marwolaeth celloedd gan atalyddion y llwybr. Panel uwch; Mae'r bariau'n dangos y ganran o gyfanswm marwolaeth celloedd (chwith) neu'r cant o atodiad apoptotig V ynghyd â chelloedd (dde). Cyn bod yn agored ihypocsia, cafodd celloedd eu deor ymlaen llaw am 1 awr gyda 3 μM celecoxib （COX-2(cyclo-oxygenase)atalydd ）;10 μuM AH6809, （ EP 1-3 antagonist derbynyddion ）, 10 μM GW627368X （ antagonist derbynnydd EP4 ）; neu gyda gwyrdd bromocresol 50 μM (BG) neu 25 μM bromosulfophthalein(BrS), dau atalydd PGT. Panel isaf: Chwith: Atal marwolaeth celloedd trwy ddymchwel PGT trwy drawsnewid gyda siRNA (prawf gwahardd plymio glas trypan). Mewnosodiad: Effeithiolrwydd dymchwel PGT (dadansoddiad blot Gorllewinol) I'r dde: Dibyniaeth grynodiad o effaith ataliol gwyrdd bromocresol (BG). (b) Atal marwolaeth celloedd trwy drawsnewid â fector mynegiant mamalaidd sy'n cynnwys ensym anactifadu prostaglandin 15-hydroxy-prostaglandin dehydrogenase(15-PGDH) cDNA(prawf gwahardd llifyn glas trypan). Mewnosod: Mynegiad o {{ 11}}PGDH (dadansoddiad blot gorllewinol) mewn celloedd wedi'u trawsyrru. (c)Hypocsiayn achosi cynnydd PGT-sensitif mewn iPGE, Chwith: PGE, dangosir immunofluorescence dibynnol yn unig neu wedi'i gyfuno â staenio niwclear â DAPI (chwyddiad gwreiddiol, 40 ×) Ar y dde: Dull meintiol o ymdrin â'r delweddau a gyflwynir yn y panel chwith gan ddefnyddio meddalwedd Image J. (d) Nid yw atalydd actifadu EGFR AG1478 yn atal marwolaeth celloedd HK-2 EGFR. Cafodd celloedd eu deori ymlaen llaw am 1 awr gyda l μM AG1478 cyn eu dioddefhypocsia. （e） Nid yw atalydd PGT BG yn addasu mynegiant Bax a Bcl-2 mewn celloedd HK-2 o danhypocsia(Dadansoddiad blot gorllewinol). dd Atalhypocsia/marwolaeth celloedd a achosir gan ail-ocsigeniad gan atalyddion y llwybr (prawf gwahardd llifyn glas trypan). Roedd celloedd wedi'u deori ymlaen llaw ag atalyddion y llwybr ac yn destunhypocsiafel yn (a). Yna, roedd celloedd yn agored i normocsia am 3 h. Gwybodaeth gyffredinol: (1) Deorwyd celloedd am 24 awr mewn amodau normocsig (21 y cant O,) neu hypocsig (1 y cant O,), fel y nodir yn "Dulliau". (2) Mae microffotograffau yn enghreifftiau cynrychioliadol o dri arbrawf annibynnol. (3) Nid oedd toddyddion yr atalyddion (cyfrwng luL / mL) yn addasu effaithhypocsiaar farwolaeth celloedd (ni ddangosir y canlyniadau). (4) Dadansoddiad blotiau gorllewinol: Cadarnhawyd protein cyfartal trwy stilio ag actin gwrth- -neu wrthgorff gwrth-GAPDH. (5)Barrau a bar gwall mewn graffiau: Mae pob bar yn cynrychioli cymedr ± SEM 3 arbrawf gwahanol.*P<0.01><0.01>hypocsianeuhypocsia/ailocsigeniad.

Fel y dangosir yn Ffig. 2a,hypocsia- ataliwyd marwolaeth celloedd tiwbaidd procsimol a achosir ym mhob achos. Roedd ataliad apoptosis gan celecoxib yn dangos bod COX-2(cyclo-oxygenase)yn chwarae rhan berthnasol mewnhypocsia-marwolaeth celloedd apoptotig a achosir (Ffig. 2a, panel uchaf, ar y dde). Yn fwy penodol, mae'r ffaith bod apoptosis wedi'i atal gan elyniaeth derbynyddion EP yn golygu bod apoptosis yn cael ei gyfryngu gan COX-2(cyclo-oxygenase)-dibynnol ar gynhyrchu PGE. Ar y llaw arall, mae'n fwyaf tebygol bod iPGE yn cyfrannu athypocsia-marwolaeth celloedd HK-2 oherwydd iddo gael ei atal gan;(i) ataliad o PGT(Ffig.2a) neu(i) gorfynegiant o 15-PGDH(Ffig. 2b), sy'n anactifadu iPGE2 drwy ei ocsidiad25(o bwys, cynyddodd y weithdrefn drawsnewid ei hun sensitifrwydd celloedd HK-2 ihypocsia: roedd marwolaeth celloedd yn 45-55 y cant ar gyfer trawsnewid mewn amodau rheoli o'i gymharu â 15-20 y cant mewn celloedd nad ydynt yn cael eu trosglwyddo). Cefnogaeth bellach i gyfraniad iPGE, ihypocsia-marwolaeth celloedd HK-2, yw ein canfyddiadau blaenorolhypocsiayn pennu cynnydd yng nghynnwys celloedd iPGE, 1 a bod y cynnydd hwn wedi'i atal gan atalyddion PGT (Ffig. 2c).

Gall llwybrau signalau MAPK gymell apoptosis, Oherwydd bod derbynyddion iEP yn trawsactifadu derbynnydd ffactor twf epidermaidd (EGFR)36, sy'n arwain at actifadu kinases MAP ERK1/2 a p38 mewn celloedd HK-20, fe wnaethom ofyn a oedd cyn -deoriad celloedd HK-2 gydag atalydd actifadu EGFR AG1478 wedi'i atalhypocsia- marwolaeth celloedd a achosir. Daethom o hyd i ganlyniadau negyddol (Ffig.2d) ac felly, mae'n annhebygol bod trawsweithredu EGFR yn cyfryngu marwolaeth celloedd HK-2 o danhypocsia.

Mewn sawl model arbrofol, lleihau ATP sy'n deillio o mitocondriaidd yn ystodhypocsiayn achosi cynnydd yn y protein pro-apoptotig Bax i gymhareb mynegiant protein gwrth-apoptotig Bcl-2, sy'n arwain at ryddhau cytochrome C i'r cytosol, actifadu caspase 9, a holltiad ac actifadu dilynol i lawr yr afon, effeithydd caspasau37,38. Fodd bynnag, mae cyn-deor gydag atalydd PGT BG mewn celloedd HK-2 o danhypocsiaheb arwain at newidiadau sy'n gydnaws â newid gwrth-apoptotig yn y cydbwysedd rhwng mynegiant Bc-2 a Bax(Ffig.2e), nad yw'n cefnogi rôl y proteinau hyn mewn cell HK-2 marwolaeth danhypocsia.

Yn dilyn datguddiad hypocsig, gall cyfnodau o ad-ocsigeniad (anaf isgemia/atlifiad) achosi niwed ychwanegol i gelloedd. Gellir deall y "paradocs" o anafiad ad-ocsigeniad gan gymryd i ystyriaeth bod celloedd yn mynd trwy newidiadau penodol mewn gweithgareddau ensymau, swyddogaeth mitocondriaidd, adeiledd sytosgerbydol, cludiant pilen, ac amddiffynfeydd gwrthocsidiol mewn ymateb ihypocsia, sydd wedyn gyda'i gilydd yn dueddol o gael anaf ail-ocsigen39. Mae reoxy-genation yn cyfrannu at anaf acíwt i'r arennau yn ystod strôc isgemig, trawsblannu aren, methiant cylchrediad y gwaed, neu lawdriniaeth arennol a chardiofasgwlaidd. Yn y cyd-destun hwn, mae gwerth therapiwtig posibl ataliadhypocsia/marwolaeth celloedd tiwbaidd procsimol a achosir gan reoxygenation trwy ymyrraeth yn COX-2(cyclo-oxygenase)/iPGE,/iEP llwybr derbynnydd yn amlwg. Felly, gofynnwyd a yw iPGE yn cyfryngu'n benodolhypocsia-marwolaeth celloedd a achosir neu hefyd yn cyfrynguhypocsia/marwolaeth celloedd a achosir gan ail-ocsigen (model in vitro sy'n dynwared isgemia arennol in vivo / anaf atdlifiad). Fel y dangosir yn Ffig.2f, cafodd marwolaeth celloedd (fel yr aseswyd gan brawf gwahardd plymio glas trypan) ei hatal gan COX-2(cyclo-oxygenase)atalydd celecoxib yn ogystal â gan antagonists derbynnydd EP AH6809 neu GW627368X. Yn yr un modd ag ar gyfer Ffig.2a, mae'r canlyniadau hyn yn awgrymu bod COX-2 yn chwarae rhan berthnasol mewnhypocsia/marwolaeth celloedd a achosir gan ail-ocsigeniad ac, yn fwy penodol, mae marwolaeth celloedd yn cael ei chyfryngu gan COX-2(cyclo-oxygenase)-dibynnol ar gynhyrchu PGE, gan ei fod wedi'i atal gan elyniaeth derbynyddion EP. Fodd bynnag, oherwydd na chafodd marwolaeth celloedd ei atal gan atalyddion PGT bromocresol gwyrdd neu fro-mosulfophthalein (Ffig.2f a Ffigur Atodol 2d), mae'n fwy tebygol y byddhypocsiaMae marwolaeth celloedd HK-2 a achosir gan ail-ocsigen yn cael ei chyfryngu gan PGE allgellog yn unig.

HIF-1 -rheoliad trawsgrifiadol dibynnol o COX-2(cyclo-oxygenase)mynegiant genynnau yn cyfrannu at ahypocsia-cynnydd a achosir mewn iPGE, mewn celloedd tiwbaidd HK-2 procsimol. PGE, mae biosynthesis yn golygu rhyddhau asid arachidonic o glycerophospholipids bilen gan ffosffolipase A, ac yna trosi isoensymau COX o asid arachidonic i prostaglandin H, ac, yn olaf, gan isomerization chwarren prosta yn H, i PGE, gan prostaglandin E synthases megis synthase PGE microsomal-1 (mPGES-1)19. Rydym wedi darganfod hynnyhypocsia- mae apoptosis a achosir mewn celloedd HK-2 yn fwyaf tebygol o gael ei gyfryngu gan COX-2(cyclo-oxygenase)-cynnydd dibynnol mewn cynhyrchu PGE, (Ffig.2). O wybod bod COX-2(cyclo-oxygenase)yn ensym y gall ei fynegiant gael ei ysgogi ganhypocsia, damcaniaethasom fod ahypocsia-cynnydd a achosir mewn PGE, gallai cynhyrchiant mewn celloedd HK-2 fod o ganlyniad i gynnydd yn y mynegiant o COX-2(cyclo-oxygenase). Er mwyn cadarnhau ein rhagdybiaeth, astudiwyd (i)effaithhypocsiaar fynegiant COX-2(cyclo-oxygenase)protein ac mRNA a (ii) effaith COX-2(cyclo-oxygenase)atalydd celecoxib ar yhypocsia-cynnydd a achosir mewn iPGE, Dangosodd ein canlyniadau fodhypocsiapennu mewn modd dros dro uwch-reoliad trawsgrifiadol o COX-2(cyclo-oxygenase)mynegiant (Ffig. 3a,b)a'r COX hwnnw-2(cyclo-oxygenase)roedd ataliad yn pylu'r cynnydd mewn iPGE, mewn celloedd HK-2 o danhypocsia(Ffig.3c). Yn ddiddorol,hypocsiahefyd yn pennu uwch-reoleiddio dros dro o fynegiant protein mPGES-1 (Ffig, 3a, mewnosodiad), ond nid oedd yn effeithio ar fynegiant mRNA mPGES-1 (Ffig, 3b. mewnosod). Roedd y canlyniadau hyn yn dangos bod mwy o fynegiant o COX-2(cyclo-oxygenase)ac mae mPGES-1 yn gyfrifol am yhypocsia-cynnydd a achosir mewn iPGE.

Ffigur 3. Rheoliad trawsgrifio HIF-la-ddibynnol o COX-2(cyclo-oxygenase)mynegiant genynnau yn cyfrannu at y cynnydd a achosir gan hypocsia mewn iPGE, mewn celloedd tiwbaidd HK-2 procsimol.(a) Mynegiant COX-2(cyclo-oxygenase)protein yn cael ei gynyddu dros dro ganhypocsia(Dadansoddiad blot gorllewinol). Mewnosod: Mynegiant mPGES-1 protein hefyd yn cael ei uwch-reoleiddio dros dro ganhypocsia. (b)Mynegiad COX-2(cyclo-oxygenase)cynyddir mRNA dros dro ganhypocsia. Mewnosodiad: Nid yw mynegiant mPGES-1 mRNA yn cael ei effeithio ganhypocsia. (c)Atal gan celecoxib, a COX-2(cyclo-oxygenase)atalydd, o'r cynnydd mewn iPGE, a achosir ganhypocsia. Cafodd celloedd eu deori ymlaen llaw am 1 awr gyda 3 μM celecoxib. Dangosir imiwnfflworoleuedd chwith∶PGE, dibynnol yn unig neu wedi'i gyfuno â staenio niwclear â DAPI (chwyddiad gwreiddiol, 40 ×). Ar y dde: Dull meintiol o ymdrin â'r delweddau a gyflwynir yn y panel chwith gan ddefnyddio meddalwedd Image J. (d) Cyfraniad mecanweithiau trawsgrifio. Chwith: Atalydd trawsgrifio actinomycin D(Act. D) yn atal ahypocsia-cynnydd a achosir yn COX-2(cyclo-oxygenase)mynegiant protein (dadansoddiad blot gorllewinol). Cafodd celloedd eu trin ymlaen llaw am lh gyda Deddf 1 ug/ml. D cyn bod yn agored ihypocsiaam 3 h. I'r dde: Cynnydd yng ngweithgaredd COX-2(cyclo-oxygenase)lluniad gohebydd. (e) Atalydd HIF-la YC-1 yn atalhypocsia-COX trawsgrifiadol wedi'i ysgogi-2(cyclo-oxygenase)uwch-reoliad. Cafodd celloedd eu rhag deori am 1 awr gyda 0.5 uM YC-1. Chwith: Atal COX-2(cyclo-oxygenase)uwch-reoliad. Roedd celloedd yn agored ihypocsiaam 8 h. Canolfan: Atal y cynnydd mewn actifedd COX-2(cyclo-oxygenase)lluniad gohebydd. Ar y dde: Gwahardd gweithgaredd lluniad gohebydd a yrrir gan HRE. Roedd celloedd yn agored ihypocsiaam 8 h.(f) Mae atalydd HIF-la YC-1 yn cynyddu marwolaeth celloedd apoptotig (astudiaethau cytometreg llif). Cyn bod yn agored ihypocsia, cafodd celloedd eu deor ymlaen llaw am 1 h gyda 0.5 μM YC-1. Mae Inset∶ YC-1 yn atal yhypocsia-cynnydd a achosir mewn HIF-1mynegiant (dadansoddiad blotiau gorllewinol). Gwybodaeth gyffredinol: (1) Deorwyd celloedd am 24 h mewn amodau normocsig (21 y cant O,) neu hypocsig (1 y cant O,), fel y nodir yn "Dulliau". (2) Mae microffotograffau yn enghreifftiau cynrychioliadol o dri arbrawf annibynnol. (3)Dadansoddiad blotiau gorllewinol: Cadarnhawyd protein cyfartal trwy stilio gyda gwrthgorff gwrth- -actin (4) Bariau a bariau gwall mewn graffiau: Mae pob bar yn cynrychioli cymedr ± SEM 3 arbrawf gwahanol *P<0.01 vs.="" other="">

I archwilio ymhellach gyfraniad mecanweithiau trawsgrifio i'r cynnydd mewn COX-2(cyclo-oxygenase)mynegiant protein o danhypocsia, mynegiant COX-2(cyclo-oxygenase)wedi'i asesu mewn celloedd HK-2, a gafodd eu meithrin ymlaen llaw gyda'r atalydd trawsgrifio actinomycin D cyn bod yn destunhypocsiaam 5 h. Fel y dangosir yn Ffig.3d,hypocsia-cynnydd a achosir yn COX-2(cyclo-oxygenase)ataliwyd mynegiant protein gan actinomycin D. Ar ben hynny,hypocsiahefyd wedi pennu cynnydd yng ngweithgaredd COX-2(cyclo-oxygenase)lluniad hyrwyddwr a drosglwyddwyd yn flaenorol mewn celloedd HK-2 (Ffig.3d ar y dde). Gyda'i gilydd, mae'r canlyniadau a ddangosir yn Ffig. 3d yn awgrymu bod mecanweithiau trawsgrifio yn cyfrannu at ahypocsia-cynnydd a achosir yn COX-2(cyclo-oxygenase)mynegiant protein. Serch hynny, roedd anghysondeb rhwng amseriad actifadu'r hyrwyddwr COX-2 ac amseriad COX uchaf-2(cyclo-oxygenase)Mynegiant mRNA: tra bod y cynnydd dros dro yn COX-2(cyclo-oxygenase)Roedd mynegiant mRNA yn uchafsymiol ar ôl 2 h (Ffig.3b), cafodd hyrwyddwr COX-2 ei actifadu ar ôl 3 h (Ffig.3d), sydd fwy na thebyg yn adlewyrchu cyfraniad mecanweithiau ôl- drawsgrifio i'r cynnydd mewn COX{{6} }}(cyclo-oxygenase)mynegiant4. Yn unol â hynny, rydym yn dyfalu bod COX-2(cyclo-oxygenase)mRNA yn sefydlogi o danhypocsia, a fyddai'n arwain at lefelau uwch o COX-2(cyclo-oxygenase)mynegiant mRNA heb unrhyw gyfraniad (ar y foment honno) o weithgarwch cynyddol y COX-2(cyclo-oxygenase)hyrwyddwr. Fodd bynnag, mae hefyd yn bosibl y gallai oedi rhwng actifadu'r hyrwyddwr a chroniad swbstrad mesuradwy hefyd gyfrannu at yr anghysondeb rhwng amseriad actifadu'r hyrwyddwr COX-2 ac amseriad COX uchaf{{1} }}(cyclo-oxygenase)mynegiant mRNA.

Mae HIF{0}} yn ffactor trawsgrifio heterodimerig sy'n cynnwys yr is-uned sy'n ddibynnol ar ocsigen a'r is-uned a fynegir yn gyfansoddiadol. Danhypocsia, Mae HIF-l yn cronni ac yn mynd i mewn i'r cnewyllyn, lle mae'n cynhyrchu'r ffactor trawsgrifio HIF-1 ar ôl pylu gyda HIF-1 . Mae HIF-1 wedyn yn hyrwyddo mynegiant ei genynnau targed drwy rwymo ihypocsia-elfennau ymatebol (HREs) sy'n bresennol yn eu rhanbarth rheoleiddio ac wedyn yn trefnu ymatebion addasol cellog i frwydrohypocsia 3. O ystyried hynnyhypocsiagall actifadu COX-2(cyclo-oxygenase)mynegiant mewn modd dibynnol HIF-1-trwy HRE swyddogaethol sy'n bresennol yn y dilyniant hyrwyddwr COX-22, archwiliwyd rôl HIF-l mewn ahypocsia-cynnydd a achosir yn COX-2(cyclo-oxygenase)mynegiant. Fe wnaethom hefyd edrych ar weithgarwch lluniad hyrwyddwr COX-2 wedi'i drawsffurfio mewn celloedd HK-2. Fel y dangosir yn Ffig. 3e,cyn-deori gyda'r HIF-1atalydd YC-1, a bylchoddhypocsia-cynnydd a achosir mewn mynegiant HIF-la a gweithgaredd lluniad gohebydd HRE, wedi arwain at atal y cynnydd yn y ddau fynegiant o COX-2(cyclo-oxygenase)a gweithgarwch y COX-2(cyclo-oxygenase)lluniad hyrwyddwr yn HK-2 yn amodol arhypocsia. I grynhoi, mae'r canlyniadau i'w gweld yn Ffig,3a-e yn cefnogi'r syniad bod HIF-1 -uwch-reoliad trawsgrifiadol dibynnol o COX-2(cyclo-oxygenase)yn gyfrifol am yhypocsia-cynnydd a achosir yn iPGE2.

Er bod canlyniadau ysgogi HIF-1a ymlaenhypocsia-mae apoptosis a achosir yn ddadleuol (yn ôl pob tebyg oherwydd gallant fod yn ddibynnol ar gyd-destun), dadansoddwyd (mewn modd rhagarweiniol) rôl HIF-1a yn ein system arbrofol. Ers i ni ganfod yr ymyriad hwnnw yn y COX-2 yn flaenorol(cyclo-oxygenase)/iPGE, mae llwybr derbynnydd EP yn atal y cynnydd mewn mynegiant HIF-la a ysgogwyd ganhypocsia8,56 gofynnwyd a yw atal HIF-la yn arwain at atalhypocsia-apoptosis cell HK-2 a achosir. Fel y dangosir yn Ffig. 3f, cynyddodd cyn-deoriad ag YC-1, atalydd HIF-l, mewn gwirioneddhypocsia- apoptosis a achosir. Felly, mae'n annhebygol y bydd HlF-la

Trafodaeth

Meinwehypocsiacredir ei fod yn hollbwysig ym pathoffisioleg clefyd cronig yn yr arennau ac anafiadau acíwt i'r arennau, gan mai PTC yw'r gyfran fwyaf tueddol o diwbiau arennol yn erbynhypocsia. Yma buom yn archwilio rôl PGE, yn y difrod a achoswyd ganhypocsiai PTC dynol a chanfuwyd bod mwy o gynhyrchu iPGE yn deillio o uwch-reoleiddiad HIF-la-ddibynnol o COX-2(cyclo-oxygenase)mynegiant genynnau a mynegiant cynyddol o mPGES-1, yn cyfrannu athypocsia-marwolaeth celloedd apoptotig a achosir mewn celloedd HK-2. O ystyried bod hypocsia tiwbaidd yn ffactor perthnasol ar gyfer clefyd acíwt a chronig yr arennau-2, mae'r canlyniadau hyn yn nodi PGT cludwr prostaglandin fel targed therapiwtig newydd mewn clefydau arennol.

Hypocsianid yn unig yn cynyddu iPGE ond hefyd ei ryddhau i'r cyfrwng allgellog8 fel y gallai secretu (allgellog) PGE, hefyd chwarae rhan mewnhypocsia- apoptosis a achosir (er enghraifft, sbarduno rhaeadrau apoptotig trwy actifadu canonaidd derbynyddion EP sydd wedi'u lleoli yn y gellbilen). Mae dwy astudiaeth flaenorol wedi dangos bod marwolaeth celloedd o danhypocsiaroedd hefyd oherwydd COX-2(cyclo-oxygenase)-cynhyrchiad dibynnol o PGE,1345. Ar y llaw arall, mewn rhai mathau o gelloedd (fibroblasts, microglia, niwronau, a llinellau celloedd lewcemia lymffoblastig acíwt), caiff apoptosis a achosir gan PGE. ei gyfryngu gan weithrediad PGE, dibynnol ar dderbynyddion EP46-48. Rydym wedi darganfod yma hynnyhypocsia-cafodd apoptosis cell HK-2 ei atal gan wrthwynebedd derbynyddion EP hefyd (Ffig.2a, panel uchaf, ar y dde). Ond oherwydd bod derbynyddion EP wedi'u disgrifio'n glasurol fel derbynyddion pilen plasma—fel eu bod yn anhygyrch ar gyfer iPGE2-rydym yn dyfalu bod y derbynyddion EP sy'n cyfryngu effaith apoptotig iPGE, mewn celloedd HK hypocsig-2 yn a is-set wedi'i lleoli'n fewngellol (hy derbynyddion iEP).

Mewn cyferbyniad â rôl iPGE2 ynhypocsia- apoptosis wedi'i achosi mewn celloedd HK-2, canfuom mai dim ond PGE allgellog sy'n cyfrynguhypocsia/marwolaeth celloedd HK-2 a achosir gan ail-ocsigen oherwydd na chafodd ei atal gan atalyddion PGT(Ffig. 2f). Er bod y mecanweithiau patholegol o anaf cellog ar ôlhypocsiaNid yw /reoxygenation yn cael eu deall yn llwyr, derbynnir bod marwolaeth celloedd yn digwydd yn bennaf trwy gynhyrchu rhywogaethau ocsigen adweithiol gormodol (ROS). Mae hyn yn arbennig o wir ar gyfer celloedd HK-249,50. Fodd bynnag, erhypocsiagall hefyd gynyddu cynhyrchiad ROS, hyd eithaf ein gwybodaeth nid oes unrhyw dystiolaeth bod ROS yn chwarae rhan berthnasol ynhypocsia-induced HK-2 celloedd marwolaeth. Mae hyn yn awgrymu bod effeithiau marwol hypocsia a hypocsia/ailocsigeniad mewn celloedd HK-2 yn cael eu cyfryngu gan fecanweithiau gwahanol, a allai esbonio pam mae BG a BS yn amddiffyn rhaghypocsiaond nid yn erbynhypocsia/ailocsigeniad. O ganlyniad, gallai atal PGT ddarparu buddion therapiwtig yn PTC yn erbyn anaf celloedd a achosir gan hypocsia ond nid yn erbyn effaith niweidiolhypocsia/ailocsigeniad.

HIF-1 -uwch-reoliad dibynnol o COX-2(cyclo-oxygenase)yn ddigwyddiad tyngedfennol ihypocsia-apoptosis cell HK-2 a achosir (Ffig.3e). Fodd bynnag, mae ein harsylw bod atalydd HIF YC-1 wedi gwella marwolaeth celloedd apoptotig (Ffig.3f) yn ddryslyd, er bod adroddiadau blaenorol eisoes wedi dangos canlyniadau tebyg1. Un esboniad posibl yw senario damcaniaethol lle mae HIF-la nid yn unig yn cyfryngu uwch-reoleiddiad pro-apoptotig COX-2(cyclo-oxygenase)ond hefyd uwch-reoleiddio moleciwlau amddiffynnol. Yn wir, mynegodd HIF-1-fynegiant moleciwlau amddiffynnol yn erbynhypocsiamegis hir di-godio RNA DARS-AS1'a microRNA-2103 wedi'i ganfod yn benodol mewn celloedd HK-2. Fodd bynnag, er bod y darnau hyn o dystiolaeth yn cefnogi ein senario damcaniaethol, dylid cynnal arbrofion penodol i'w gadarnhau.

Ymchwiliad i ymateb celloedd arennol ihypocsiagall wella ein dealltwriaeth o batholeg arennol. Rydym wedi astudio, er mewn modd rhagarweiniol, rôl cynnydd yn y protein pro-apoptotig Bax i brotein gwrth-apoptotig Bcl-2 gymhareb mynegiant ynhypocsia-apoptosis a achosir mewn celloedd HK-2. Dangosodd ein canlyniadau nad oedd ataliad o PGL yn arwain at newidiadau sy'n gydnaws â newid gwrth-apoptotig yn y cydbwysedd rhwng mynegiant Bcl-2 a Bax(Ffig.2e), nad yw'n cefnogi rôl y proteinau hyn yn iPGE-ddibynnol HK-2 marwolaeth cell o danhypocsia. Hyd eithaf ein gwybodaeth, dim ond dwy astudiaeth sydd ar oblygiad yr echel Bcl{{{{0}}/Bax mewn apoptosis a achosir gan hypocsia yn PTC ac roedd y ddau ohonynt yn ymwneud â chrynodiadau anocsig" neu anocsig O bron,5 Pan amlygwyd PTC i 0.2 y cant O., arhosodd mynegiant Bax heb ei newid ac roedd apoptosis yn gysylltiedig â gradd mynegiant Bcl-2 gostyngol. Fodd bynnag, nid oedd mynegiant Bcl-2 wedi'i effeithio gan 1 y cant O, er gwaethaf y presenoldeb apoptosis, sy'n cyd-fynd â'n canlyniadau. Felly, dylid ystyried mecanweithiau eraill nad ydynt o reidrwydd yn golygu newidiadau meintiol mewn mynegiant Bcl-2 neu Bax: er enghraifft, dim ond angen i sefydlu apoptosis mewn celloedd glioma meithrinedig gan iPGE2 ei gysylltiad ffisegol â Bax, sy'n sbarduno trawsleoli Bax i mitocondria 202. Felly, mae'r mecanwaith y mae iPGE yn cyfrannu at apoptosis cell HK-2 yn haeddu astudiaeth bellach.

Mae ein grŵp wedi canfod bod COX-2(cyclo-oxygenase)-cynnydd dibynnol mewn iPGE, yn cyfryngu marwolaeth apoptotig mewn celloedd HK-2 sy'n agored i cisplatin', cyrff apoptotig7" ahypocsia(ein canlyniadau presennol). Oherwydd bod PGE yn cael ei ryddhau'n gyflym i'r tu allan i'r gell ar ôl cael ei svnthesized2, mae ei gludo i mewn gan PGl yn chwarae rhan hanfodol mewn apoptosis a achosir gan iPGE mewn celloedd HK-2. Felly, pryd bynnag y caiff y difrod PTC hwnnw ei gyfryngu gan iPGE, gallai triniaeth ag atalyddion PGT fod yn ddull therapiwtig defnyddiol gyda chymwysiadau posibl megis atal difrod PTC a achosir gan cisplatin, atal lledaeniad anaf tiwbaidd trwy gyrff apoptotig, neu gyfyngu ar y difrod PTC a achosir gan cisplatin. effaith andwyol ohypocsiaar PTC.