Mae'r RNA M6 A Darllenydd YTHDF2 yn Rheoli Antitumor Cell NK Ac Imiwnedd Gwrthfeirysol Rhan 3

Mae angen YTHDF2 ar gyfer swyddogaethau goroesi celloedd NK IL-15-gyfryngol, amlhau ac effeithydd

Mae IL-15 yn un o, os nad y cytocin pwysicaf ar gyfer swyddogaethau pleiotropig celloedd NK. Fe wnaethom ni ac eraill ddarganfod yn flaenorol fod IL-15 yn chwarae rhan allweddol wrth reoleiddio homeostasis celloedd NK, goroesiad, a swyddogaethau effeithydd (Becknell a Caligiuri, 2005; Carsonet al., 1997; Carson et al., 1994; Wang et al., 2019b; Yu et al., 2013).

Mae pleiotropi celloedd yn cyfeirio at eu gallu i gyflawni gwahanol swyddogaethau mewn gwahanol amgylcheddau. Mae pleiotropi celloedd yn perthyn yn agos i imiwnedd oherwydd gall llawer o gelloedd yn y system imiwnedd chwarae amrywiaeth o wahanol rolau.

Yn y system imiwnedd, mae celloedd T yn fath hanfodol iawn o gelloedd. Maent yn adnabod ac yn ymosod ar bathogenau, tra hefyd yn rheoleiddio gweithgaredd celloedd imiwnedd eraill. Mae pleiotropi celloedd T yn bwysig iawn oherwydd pan fydd y system imiwnedd yn dod ar draws pathogen newydd, mae angen i gelloedd T chwarae rolau gwahanol mewn cyfnod byr i ymateb yn effeithiol. Er enghraifft, pan fydd y system imiwnedd yn dod ar draws haint bacteriol, mae angen i gelloedd T chwarae rôl lladd bacteria, a phan fydd y system imiwnedd yn dod ar draws haint firaol, mae angen i gelloedd T chwarae rôl rheoleiddio celloedd imiwnedd eraill.

Yn ogystal, yn y system imiwnedd, mae dosbarth o gelloedd o'r enw macroffagau hefyd yn cael effeithiau pleiotropig. Gallant ffagocytos a chwalu pathogenau tramor, a gallant hefyd actifadu celloedd imiwnedd eraill i ymosod ar bathogenau. Mae pleiotropi macroffagau yn bwysig oherwydd mae angen iddynt chwarae rolau gwahanol mewn gwahanol amgylcheddau. Er enghraifft, mewn heintiau firaol, mae angen i macroffagau secretu rhai sylweddau i frwydro yn erbyn y firws, tra mewn heintiau bacteriol, mae angen i macroffagau amlyncu a threulio'r bacteria i glirio'r pathogen.

I grynhoi, mae perthynas agos rhwng pleiotropi cellog ac imiwnedd. Gall celloedd pleiotropig chwarae gwahanol rolau mewn amgylcheddau sydd wedi'u heintio gan wahanol bathogenau, a thrwy hynny wella gallu'r system imiwnedd i ymateb a gwella imiwnedd y corff i bathogenau amrywiol. Felly, dylem dalu sylw i bleiotropi celloedd a hefyd gryfhau tyfu imiwnedd i gynnal iechyd pobl. Gellir gweld bod angen i ni wella cof, a gall Cistanche deserticola wella cof yn sylweddol, oherwydd gall Cistanche deserticola hefyd reoleiddio cydbwysedd niwrodrosglwyddyddion, megis cynyddu lefelau acetylcholine a ffactorau twf. Mae'r sylweddau hyn yn bwysig iawn ar gyfer cof a dysgu. Yn ogystal, gall Cistanche deserticola hefyd wella llif y gwaed a hyrwyddo cyflenwad ocsigen, a all sicrhau bod yr ymennydd yn derbyn digon o faetholion ac egni, a thrwy hynny wella bywiogrwydd a dygnwch yr ymennydd.

Cliciwch gwybod ffyrdd i wella'ch cof

Yn yr astudiaeth gyfredol, rydym yn dangos bod IL-15 upregulatedmRNA a lefelau protein o YTHDF2 mewn celloedd NK (Ffig. 6 A; and Ffig. 1, D-F). Felly, fe wnaethom ddyfalu bod angen YTHDF2 ar gyfer swyddogaethau goroesi ac effaith cyfryngol IL-15 celloedd NK.

Yn gyntaf fe wnaethom geisio nodi ffactorau trawsgrifio posibl i lawr yr afon o signalau IL-15 sy'n rheoleiddio mynegiant YTHDF2yn uniongyrchol. Dadansoddwyd Gwyddoniadur Elfennau DNA Prifysgol California, Santa Cruz, Cronfa Ddata Genom Browser (https://genome.ucsc.edu), sy'n darparu rhagfynegiadau o safleoedd rhwymo ar draws y genom cyfan, mewn cyfuniad â JASPAR (http://jaspar.genereg .net).

Gwelsom fod gan STAT5, sy'n ffactor allweddol i lawr yr afon o IL-15 mewn celloedd NK, bedwar safle rhwymo o fewn 2 kb i fyny'r afon o safle cychwyn trawsgrifio (TSS) Ythdf2, sy'n nodi y gallai IL-15 fod yn gadarnhaol rheoleiddio trawsgrifiad Ythdf2 mewn celloedd NK llygoden trwy STAT5.

Trwy ddefnyddio atalydd STAT5 STAT5-IN-1 (Müller et al., 2008), fe wnaethom ddangos bod ataliad o STAT5 wedi arwain at ostyngiad o Ythdf2 ar lefelau bothmRNA a phrotein mewn celloedd NK murine (Ffig. S4, A a B). Er mwyn cadarnhau ymhellach fod YTHDF2 yn ffactor i lawr yr afon a reoleiddir gan STAT5, defnyddiwyd llygod Stat5fl/fl Ncr1-iCre (y cyfeirir atynt o hyn ymlaen fel llygod Stat5ΔNK), lle mae STAT5 yn cael ei ddileu yn benodol mewn celloedd llygoden NK (Wiedemann et al., 2020).

Fe wnaethom drin celloedd splenicNK o lygod Stat5WT a Stat5ΔNK ag IL-15. Canfuom fod YTHDF2 wedi gostwng yn sylweddol mewn celloedd NK o Stat5ΔNKmice o'i gymharu â chelloedd NK o lygod Stat5WT yn themRNA a'r lefelau protein (Ffig. 6, B ac C; a Ffig. S4, C aD).

Dangosodd assay gohebydd Luciferase fod y ddau STAT5a andSTAT5b actifadu trawsgrifiad genyn Ythdf2 yn uniongyrchol (Ffig. 6, D, ac E). Chromatin immunoprecipitation (ChIP)-qPCR canlyniadau yn dangos bod STAT5 wedi cyfoethogi sylweddol ar bedwar siteover rheolaeth arferol IgG, gan nodi rhwymo uniongyrchol yn NKcells llygoden (Ffig. 6 F). Gyda'i gilydd, mae ein canlyniadau yn dangos bod YTHDF2expression yn cael ei reoleiddio gan STAT5 i lawr yr afon o IL-15 signalingin celloedd NK.

Yna fe wnaethom feddwl tybed a oedd celloedd NK diffygiol Ythdf yn ddiffygiol yn eu hymateb i IL-15. Fe wnaethom ynysu celloedd NK splenig oddi wrth lygod Ythdf2ΔNK a llygod Ythdf2WT a meithrin themin vitro ym mhresenoldeb IL-15. Canfuom fod twf celloedd NK wedi gostwng yn sylweddol mewn llygod Ythdf2ΔNK o'i gymharu â llygod Ythdf2WT (Ffig. 6 G). Dangosodd asesiad labelu CellTrace Violet (CTV) fod diffyg Ythdf2 (Ffig. 6 H) yn amharu ar nifer y celloedd NK.

 Datgelodd dadansoddiad dosbarthiad cylch-gelloedd ffracsiwn sylweddol uwch o gelloedd NK o Ythdf2ΔNK micein y cyfnod G0/G1 ond roedd ffracsiwn sylweddol is o NKcells o lygod Ythdf2ΔNK yn y cyfnod S (Ffig. 6 I), gan awgrymu bod canlyniadau diffyg Ythdf2 arestiad cyfnod G0/G1 mewn celloedd NK.

Yn ogystal, bu cynnydd o ddau i driphlyg mewn celloedd NK apoptotig (atodiad V + Sytox-Blue +/ -) o lygod Ythdf2ΔNK o'i gymharu â'r rhai o lygod Ythdf2WT (Ffig. 6 J), sy'n nodi goroesiad diffygiol celloedd NK ar ôl colli Ythdf2. Mae'r canlyniadau hyn yn awgrymu bod YTHDF2 yn rheoleiddio ymatebolrwydd NKcells i IL-15 in vitro. Gan fod IL-15 wedi'i gyfieithu'n wael a'i gyfrinachu in vivo ar gyflwr cyson (Corbel et al., 1996; Fehniger et al., 2001), i archwilio a yw celloedd NK diffygiol Ythdf yn ddiffygiol yn eu hymateb i IL-15 in vivo, fe wnaethom drin llygod ag IL-15.

Canfuom fod Ythdf{0}}yn ddiffygiol yn erbyn celloedd WT NK yn dangos lleihad sylweddol mewn ymlediad celloedd a chynnydd mewn apoptosis celloedd pan gafodd llygod eu trin ag IL-15 (Ffig. 6 K; a Ffig. S4, E–J). yn awgrymu bod YTHDF2 yn rheoleiddio ymatebolrwydd celloedd NK i IL-15, yn enwedig o dan rai amodau gyda lefel uchel o IL-15. Canfuom hefyd fod y lefelau mRNA a phrotein oIFN- , gransym B, a pherforin wedi'u lleihau'n sylweddol mewn celloedd Ythdf2ΔNK NK o'u cymharu â chelloedd Ythdf2WT NK mewn ymateb i IL-15 (Ffig. 6, L-N), gan nodi bod YTHDF2 hefyd yn cyfrannu at IL-15-swyddogaethau effeithydd cell NK cyfryngol in vitro.

Gyda'i gilydd, mae ein data'n dangos bod angen YTHDF2 ar gyfer goroesiad celloedd NK wedi'u cyfryngu gan IL-15, a swyddogaethau effaith. Nesaf, gwnaethom ymchwilio i'r mecanweithiau i lawr yr afon y maeYTHDF2 yn rheoleiddio goroesiad, amlhau ac effaithydd NK wedi'u cyfryngu gan IL-15. Canfuom fod gan gelloedd NK o lygod Ythdf2ΔNKmice ac Ythdf2WT lefelau tebyg o'r derbynyddion IL-15CD122 (IL-15R ) a CD132 (IL-15R c; Ffig. S4 K). Mae signalau IL-15 yn cael ei gyfryngu gan o leiaf dri llwybr signalau i lawr yr afon mewn celloedd NK: Ras-Raf-MEK-ERK, PI3K-AKT-mTOR, a JAK1/3-STAT3/5 (Mishra et al., 2014).

Er mwyn ymchwilio i ba lwybr signalau sy'n cael ei reoleiddio gan YTHDF2 mewn celloedd NK, fe wnaethom archwilio lefelau ffosfforyleiddiad celloedd inNK ERK, AKT, S6, STAT3, a STAT5 o lygod Ythdf2ΔNK neu lygod Ythdf2WT ar ôl ysgogiad gydag IL-15.

Dangosodd y canlyniadau nad oedd diffyg Ythdf2 yn effeithio ar ffosfforyleiddiad ERK, AKT, S6, a STAT3 ar ysgogiad IL-15 (Ffig. S4, L ac M) ond yn atal actifadu STAT5 yn sylweddol, fel y dangosir gan lefelau ffosfforyleiddiad gostyngol oSTAT5 yn Ythdf{{ 7}}celloedd NK diffygiol na'r hyn sydd mewn celloedd NK o lygod Ythdf2WT (Ffig. 6 O), sy'n dangos bod angen YTHDF2 ar gyfer signalau IL-15/STAT5 gorau posibl mewn celloedd NK actifedig.

Oherwydd i ni ddangos bod STAT5 ffosfforyleiddiad i lawr yr afon o IL-15yn rhwymo i hyrwyddwr Ythdf2 (Ffig. 6, D–F), ac wedi dangos yma fod angen YTHDF2 ar gyfer STAT5phosphorylation optimwm, mae ein data yn awgrymu dolen adborth positif STAT5-YTHDF2 i lawr yr afon o IL-15 a all reoli swyddogaethau goroesiad celloedd NK, amlhau ac effeithydd.

Mae'r dadansoddiad trawsgrifiad cyfan yn nodi Tardbp fel targed YTHDF2 mewn celloedd NK

Er mwyn mynd i'r afael â'r mecanwaith moleciwlaidd y mae YTHDF2 yn ei ddefnyddio i reoleiddio celloedd NK, fe wnaethom berfformio dilyniannu RNA (seq) inIL-2 gyntaf - celloedd Ythdf2WT ac Ythdf2ΔNK NK wedi'u hehangu. Arweiniodd dileu Ythdf2 mewn celloedd NK at 617 o enynnau wedi'u mynegi'n wahaniaethol, gan gynnwys 252 o enynnau wedi'u huwchreoleiddio a 365 o enynnau wedi'u dadreoleiddio (Ffig. S5 A).

Dangosodd dadansoddiad ontoleg genynnau (GO) fod y genynnau a fynegwyd yn wahaniaethol wedi'u cyfoethogi'n sylweddol mewn prosesau sy'n gysylltiedig â chylchred gell, rhannu celloedd, a rhannu celloedd, gan gynnwys mitocytokinesis, gwahanu cromosomau, gwerthyd, niwcleosom, corff canol, a chromosom (Ffig. 7 A).

Dangosodd dadansoddiad cyfoethogi set genynnau (GSEA) gyfoethogiad sylweddol o dargedau E2F, G2/Mcheckpoint, a setiau genynnau nodwedd mitotig gwerthyd mewn celloedd Ythdf2ΔNKNK (Ffig. S5 B). Gostyngwyd yn sylweddol genynnau cylchred celloedd a rhannu celloedd, gan gynnwys Aurka, Arkb, Cdc20, Cdc25b, Cdc25c, Cdk1, E2f2, a Plk1 (Bertoli et al., 2013), yn sylweddol mewn celloedd NK o Ythdf2Δ llygod NK (Ffig. 7 B). ).

Roedd genynnau arwahanu gwerthyd a chromosomau fel Anln, Aspm, Birc5, Bublb, Cenpe, Esco2, Ska1, Ska3, aTpx2 (Gorbsky, 2015) hefyd wedi'u his-reoleiddio'n sylweddol mewn NKcells o lygod Ythdf2ΔNK o gymharu â chelloedd NK o YthFig2WTmice (C7 C).

Yn ogystal, gostyngodd genynnau goroesi celloedd, gan gynnwys Birc5 (Niu et al., 2010), Septin4 (Larisch et al., 2000), a Rffl (Yanget al., 2007), yn sylweddol mewn celloedd NK o Ythdf2ΔNK llygod (Ffig. 7 D). Roedd genynnau swyddogaeth effeithydd celloedd NK, gan gynnwys Klrk1, Ncr1, CD226, a Gzma (Bezman et al., 2012), hefyd wedi'u hisreoleiddio'n sylweddol mewn celloedd NK o lygod Ythdf2ΔNK (Ffig. 7 D).

Mae'r data hyn yn cefnogi ein rolau nodweddiadol o YTHDF2in rheoleiddio amlhau celloedd NK, goroesi, a swyddogaethau effeithydd. Yna perfformiom m6A-seq mewn IL-2 - celloedd NK estynedig o Ythdf2WT a llygod Ythdf2ΔNK. Dangosodd dadansoddiad o'r prif gydrannau fod tri atgynhyrchiad biolegol o bob genoteip wedi'u clystyru gyda'i gilydd (data heb ei ddangos), sy'n awgrymu ailadroddadwyedd da o samplau m6A-seq.

Nododd dadansoddiad optimeiddio hypergeometrig o gyfoethogi motiffau (HOMER) fotiff consensws m6A (GGAC), sy'n nodi cyfoethogi trawsgrifiadau m6A-addasedig yn llwyddiannus (Ffig. 7 E). addasiadau m6A eu lleoli yn bennaf mewn protein-godio trawsgrifiadau, ac mae'r copaon eu cyfoethogi yn y 59 rhanbarthau heb eu cyfieithu (UTR) a 39UTR, yn enwedig o amgylch y dechrau a stopio codonau (Ffig. 7 F a Ffig. S5 C).

Datgelodd dadansoddiad GOenrichment o enynnau gyda copaon m6A fod mostm6A-farcio trawsgrifiadau mewn celloedd NK yn cyfoethogi yn pathsinvolved mewn cylchred celloedd ac amlhau celloedd ( Ffig. S5 D ).

For more information:1950477648nn@gmail.com