Rōl Melanogenig Sy'n Ddibynnol ar Serwm/PDGF Lefel Munud y Kinase Oncogenig PAK1 mewn Celloedd Melanoma a Brofwyd Gan y Assay Kinase Hynod Sensitif

Cyswllt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Crynodeb:Gwnaethom ddangos yn flaenorol bod y kinase oncogenig PAK4, y mae melanomas a melanocytes arferol yn ei fynegi ar lefel uchel iawn, yn hanfodol ar gyfer eumelanogenesis. Yn yr astudiaeth bresennol, gan ddefnyddio'r assay kinase "Macaroni-Western" (IP-ATP-Glo) hynod sensitif, fe wnaethom ymchwilio i botensial melanogenig PAK1 kinase oncogenig arall, y mae celloedd melanoma (B16F10) yn ei fynegi ar lefel munud iawn yn unig. Ar ôl trawslifo celloedd melanoma â PAK1-shRNA ar gyfer distewi'r genyn PAK1, cynnwys melanin,tyrosinasecymharwyd gweithgaredd, a gweithgaredd kinase PAK1 rhwng y math gwyllt a thrawsffactyddion. Canfuom fod (i) PAK1 yn cael ei actifadu'n sylweddol gan hormonau melanogenig fel IBMX (3-isobutyl-1-methyl xanthine) a -MSH (hormon ysgogol melanocyte), (ii) yn distewi'r genyn PAK1 mewndarddol yn celloedd melanoma trwy PAK1-shRNA penodol yn lleihau cynnwys melanin atyrosinasegweithgaredd ym mhresenoldeb hormonau serwm a melanogenig i'r lefel waelodol, (iii) mae'r PAK1 math gwyllt a ychwanegir yn alldarddol yn y celloedd melanoma yn cynyddu'r lefel melanin anwythol -MSH o sawl plyg heb effeithio ar y gwaelodol, a (iv) - Go brin bod melanogenesis a achosir gan MSH/IBMX yn digwydd yn absenoldeb naill ai serwm neu PAK1, sy'n dangos yn glir bod PAK1 yn hanfodol yn bennaf ar gyfer serwm-a -MSH/IBMX-ddibynnolmelanogenesis, ond nid y gwaelodol, mewn celloedd melanoma. Efallai y bydd canlyniad yr astudiaeth hon yn darparu'r sail wyddonol gyntaf ar gyfer esbonio pam mae amrywiaeth eang o atalyddion PAK llysieuol fel CAPE (asid caffeic phenethyl ester), curcumin, a shikonin mewn colur yn ddefnyddiol ar gyfercroen-gwyno.

Geiriau allweddol:PAK1,melanogenesis, melanomas,tyrosinase, MITF,croen-gwyno, serwm

gwynnu cynhyrchion cistanche gofal croen

Rhagymadrodd

Mae lliw blew, irisau llygaid, a chroen yn cael eu rheoli gan deulu o bigmentau o'r enw melaninau. Ffynhonnell mewngellol melanin yw tyrosin ac mae'n cael ei drawsnewid yn melanin trwy gyfres o ocsidiad ensymatig (hydroxylation) sy'n cynnwystyrosinase, TRP (protein sy'n gysylltiedig â tyrosinase) 1, a TRP2. Mae mynegi amgodio genynnau ar gyfer yr ensymau melanogenig hyn yn gofyn am o leiaf ddau ffactor trawsgrifio oncogenig / melanogenig (MTFs): beta-catenin a MITF (ffactor trawsgrifio sy'n gysylltiedig â microffthalmia). Mae mwyafrif y cyfansoddion llysieuol yncroen-gwynomae colur naill ai'n atal yr ensymau melanogenig hyn yn uniongyrchol neu'n is-reoleiddio'r MTFs. Mae analogau tyrosin fel asid kojic yn perthyn i'r categori cyntaf (tyrosinaseatalyddion), tra bod y mwyafrif o weddillion fel CAPE (asid caffeic phenethyl ester), curcumin, a shikonin yn perthyn i'r ail gategori (rheoleiddwyr MTF) (1,2). Yn ddiddorol, mae'n hysbys bod llawer o'r rheolyddion MTF hyn, gan gynnwys CAPE, curcumin, shikonin, a cucurbitacin yn rhwystro'r kinase oncogenig / heneiddio PAK1 (RAC/CDC42-activated kinase 1) (3-5). Felly, mae'n fwyaf tebygol bod PAK1 yn ymwneud ag actifadu'r ffactorau trawsgrifio melanogenig / oncogenig hyn mewn celloedd gwallt, irisau llygad, neu felanocytes croen. Yn wir, mae beta-catenin o leiaf ymhlith swbstradau uniongyrchol PAK1 (6). PAK1 phosphorylates beta-catenin yn Ser 675 ar gyfer y activation, gan arwain at drawsnewid malaen. Ar ben hynny, mae beta-catenin yn hanfodol ar gyfer actifadu MITF, gan arwain atmelanogenesisneu / ac oncogenesis o melanocytes (7).

Yn ddiddorol, fodd bynnag, datgelwyd yn ddiweddar bod curo genyn PAK1 fel y cyfryw mewn llygod pigmentog yn methu â chynhyrchu unrhyw lygod albino (Hong He et al., arsylwi heb ei gyhoeddi), sy'n nodi'n glir bod o leiaf y melanogenesis gwaelodol yn y celloedd gwallt a'r llygad. irises yn annibynnol ar PAK1, er bod cyfraniad PAK1 i groenmelanogenesisyn aros i'w egluro.

Rydym wedi dangos yn flaenorol bod y kinase oncogenig PAK4 (CDC42-kinase dibynnol 4) wedi'i fynegi'n fawr mewn melanoma a llinellau celloedd melanocyte arferol, ac yn gyfrifol am eu melanogenesis, gan actifadu CREB/beta-catenin-MIFT-tyrosinasellwybr, tra nad yw PAK2 (RAC/CDC42-actifadu kinase 2), aelod uchel ei fynegiant arall o deulu PAK, yn chwarae unrhyw ran yn eu melanogenesis (8).

Yn yr astudiaeth hon, rydym yn darparu'r dystiolaeth biocemegol gyntaf ar gyfer rôl benodol kinase oncogenig arall o'r enw PAK1 mewn croenmelanogenesis, er gwaethaf y ffaith bod ei lefel mynegiant yn fach iawn: roedd tawelu genyn PAK1 mewn melanocytes (B16F10) sy'n deillio o felanoma'r llygoden yn lleihau'n sylweddol y -MSH/IBMX-induciblemelanogenesisi'r lefel waelodol, tra bod gorfynegiant o enyn PAK1 wedi rhoi hwb i'r melanogenesis -MSH-inducible heb effeithio ar y gwaelodol. Ar ben hynny, canfuom fod angen ffactor serwm ar y melanogenesis -MSH/IBMXinducible, sef PDGF (ffactor twf sy'n deillio o blatennau) yn fwyaf tebygol. Yn y cyfrwng di-serwm, dim ond gwaelodolmelanogenesisyn digwydd.

cistanchelleihau gweithgaredd tyrosinase

2. Defnyddiau a Dulliau

2.1. Defnyddiau

Prynwyd celloedd melanoma B16F10 o American Type Culture Collection (Rockville, MD, UDA). PAK1-Plasmidau SureSilencing, trawsgludiad deniadol, pecyn maxi plasmid endofree® oddi wrth Qiagen (Valencia, CA 91355, UDA). Cafwyd gwrthgyrff cynradd PAK, gwrthgyrff eilaidd biotinylated, adweithydd signalfireTM ECL gan Cell Signaling Technology (Danvers, MA, UDA). Prynwyd adweithydd Kinase Glo ac ATP (cit ATP_Glo kinase) gan Promega (Madison, Wisconsin, UDA). Prynwyd celloedd cymwys Lipofectamine a JM109 gan Invitrogen a Life Technology. Prynwyd AG1295 ac AG1478 o Calbiochem (San Diego, CA, UDA). Prynwyd yr holl gemegau eraill gan gynnwys PDGF-bb dynol gan Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, UDA).

2.2. Diswyddo genyn PAK1 mewn melanocytes llygoden (B16F10) trwy drawsluniad sefydlog gyda'r llygoden PAK 1-shRNA penodol

2.2.1. Diwylliant celloedd

Cafodd celloedd melanoma B16F10 eu meithrin mewn DMEM wedi'u hategu gan FBS wedi'i ysgogi gan wres o 10 y cant ac 1 y cant penisilin / streptomycin (10, 000 U/mL a 100 µg/mL) ar 37 gradd mewn awyrgylch llaith yn cynnwys 5 y cant o CO2.

2.2.2. Trawsnewidiad sefydlog gyda llygoden PAK1-shRNA penodol

Yn y bôn, cyflawnwyd trawsffurfiad ShRNA o linell gell B16F10 trwy'r un weithdrefn a ddisgrifiwyd yn flaenorol (9), ond gyda llygoden PAK1-shRNAs penodol (# KM04553, Qiagen). Defnyddiwyd y pedwar clon gwahanol canlynol o shRNAs ar gyfer y trawsffurfiad: clôn 1 (CCAGAGAAGTTGTCAGCTATT), clôn 2 (CATCAAGAGTGACAATATTCT), clôn 3 (GTACACACGGTTCGAGAAGAT), a chlôn 4 (GTACCACCAGTGTCAGAAGAT) yn ogystal â shCONTROL nontargeting control shWTRNA) . Fodd bynnag, yn yr astudiaeth hon, bu clonau 1 a 2 yn fwy effeithiol na chlonau 3 a 4 ar gyfer tawelu genyn llygoden PAK1 yn y llinell melanocyte hon (data heb ei ddangos). Dewiswyd trawslifyddion sefydlog ym mhresenoldeb G418 (1 mg / mL) sy'n lladd mwy na 99 y cant o gelloedd nad ydynt yn cael eu trosglwyddo.

2.2.3. Dadansoddiad Western-blot o lefel protein PAK1 a assay in vitro ar gyfer gweithgaredd kinase PAK1 mewn trawslifyddion

2.2.3.1. Dadansoddiad o blotiau gorllewinol

Er mwyn meintioli'r lefel hynod isel o PAK1 yn y llinell gell rheoli (WT) a thrawsnewidyddion tawelu PAK (g418-gwrthsefyll), trwy leihau'r lefelau "sŵn amhenodol", fe wnaethom gynnal y lefel orllewinol. dadansoddiad blot gan ddefnyddio gwrthgorff polyclonaidd cwningen yn erbyn PAK1 (#2062, Cell Signaling Technology) fel y prif wrthgorff. Yn gryno, cafodd pob clôn ei hadu ar y crynodiad o 2 × 105 o gelloedd/ffynnon mewn plât 6 ffynnon, wedi'i rhag-feithrin am 48 h, a berwyd y lysates cell mewn 25 µL o glustog SDS-PAGE am 5 munud. Defnyddiwyd wyth µL (yn cynnwys 15 µg o gyfanswm protein) o bob uwchnatur fesul slot ar gyfer SDS-PAGE. Cafodd y nitrocellwlos ei difetha gyda'r gwanhad gwrth-PAK1 IgG (1:1,000 fel gwrthgorff cynradd), ac fel gwrthgyrff eilaidd, yr IgG gwrth-gwningen sy'n gysylltiedig â HRP ac IgG gwrth-fiotin (#7074, # 7075, Signaling Cell) i ganfod bandiau PAK1 ac -actin a gafodd eu delweddu yn y pen draw gyda'r system ECL o Amersham. Roedd y profion blotiau gorllewinol yn gynrychioliadol o dri arbrawf annibynnol.

2.2.3.2. Assay kinase "Macaroni-Western" (IP- ATP_Glo) ar gyfer PAK1 mewn celloedd melanoma

Mesurwyd gweithgaredd kinase PAK1 yn y melanocytes WT a thrawsffactyddion shRNA (SHs) trwy addasiad sylweddol (5) o ddull degawd oed (a fathwyd gennym "Macaroni-Western") a ddatblygwyd gan grŵp Eidalaidd (1{{39) }}). Yn gryno, cafodd llinellau celloedd melanoma B16F10 (WT neu SHs, 2 × 105 cell/mL) eu meithrin ymlaen llaw ar 6-blat ffynnon am 24 h. Yna cafodd celloedd eu trin â 100 nM -MSH neu 100 µM IBMX am 48 h. Amharwyd ar gelloedd gan glustogiad lysis yn cynnwys 50 mM Tris HCl pH 7.5 a 150 mM NaCl ac 1 y cant Triton-X. Ar gyfer y gwrthimiwnedd (IP) o PAK1, cafodd y lysadau celloedd wedi'u clirio eu deor â gleiniau gwrth-PAK1 IgG (gwanhad 1:50) a phrotein A-agarose am 1-2 h yn yr ystafell oer gyda chymysgydd cylchdro yn ysgwyd yn barhaus. (Nissin, Suginami-ku, Tokyo, Japan). Cafodd yr IP canlyniadol (PAK1) o bob lysate ei ddeor â phecyn assay ATP Glo kinase (Promega) ym mhresenoldeb ATP a MBP (protein sylfaenol myelin) am 1 h ar 37 gradd, a mesurwyd y lefel ATP sy'n weddill gan yr ATP- adwaith dibynnol Luciferin-Luciferase sydd yn y pen draw yn cynhyrchu goleuedd (10). Cafodd yr ataliad terfynol ei allgyrchu, a throsglwyddwyd y supernatant i 96-blat ffynnon i'w ddarllen. Cofnodwyd luminescence gan MTP-880darllenydd microplate Lab (Corona, Hitachinaka-ku, Ibaraki, Japan) gydag amser integreiddio o 0.5 s y ffynnon.

2.3. Mesur cynnwys melanin a gweithgaredd tyrosinase mewn transfectants

2.3.1. Mesur cynnwys melanin

Pennwyd cynnwys melanin fel y disgrifiwyd yn flaenorol (11). Yn gryno, cafodd celloedd B16F10 (trawslifyddion shRNA math gwyllt neu PAK1-benodol) eu platio ar ddwysedd o 2 × 104 cell/ffynnon mewn 24-plât ffynnon. Ar ôl 24 h o ddiwylliant, ychwanegwyd 100 µM isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) neu 100 nM -MSH a'i ddeor am 72 h ychwanegol ar 37 gradd . Golchwyd y celloedd ddwywaith gyda byffer ffosffad, yna eu lyzed â 500 µL o hydoddiant sy'n cynnwys 1 M NaOH a 10 y cant DMSO a'u deor ar 80 gradd am 1 h, i hydoddi'r melanin, a mesurwyd y cynnwys melanin ar 490 nm. I gymharu'r cynnwys melanin yn y celloedd math gwyllt a thrawslif, ystyriwyd mai cyfanswm y melanin a gynhyrchir gan y melanocytes math gwyllt oedd y rheolaeth (100 y cant ), a chyfrifwyd y rhai gan y transfectants yn unol â hynny.

2.3.2. Assay ar gyfer gweithgaredd tyrosinase mewngellol

Tyrosinasepennwyd gweithgaredd fel y disgrifiwyd yn flaenorol (12), gydag ychydig o addasiad. Cafodd celloedd B16F10 (math gwyllt neu'r trawslifyddion) eu platio ar ddwysedd o 2 × 104 o gelloedd / ffynnon, ac ar ôl 24 h o feithriniad, ychwanegwyd a deorwyd 100 µM IBMX neu 100 nM -MSH am 72 h ychwanegol ar 37 gradd . Yna golchwyd y celloedd â byffer ffosffad oer-iâ a'u gorchuddio â byffer ffosffad (pH 6.8) yn cynnwys 1 y cant Triton-X (500 µL/wel). Cafodd y platiau eu rhewi ar −80 gradd am 30 munud. Ar ôl dadmer, ychwanegwyd 100 µL o 1 y cant L-DOPA at bob ffynnon. Yn dilyn deori ar 37 gradd am 2 h, mesurwyd yr amsugnedd ar 490 nm.

2.4. Mesur y cynnwys melanin yn y math gwyllt a PAK1-gor-fynegi melanocytes ar ôl triniaeth -MSH

Gan ddefnyddio fector Myc (2 µg), trosglwyddwyd melanocytes (B16F10) dros dro gyda naill ai math gwyllt (WT) PAK1 neu'r hyn a elwir yn "actifadu'n gyfansoddiadol" (CA) PAK1 yn cario treiglad T423E. Ar ôl 3 diwrnod o ddiwylliant, cynaeafwyd pob clon a drawsnewidiwyd ar gyfer arbrawf pellach. Mesurwyd effaith gorfynegiant PAK ar y cynnwys melanin trwy'r un gweithdrefnau a ddisgrifiwyd yn flaenorol (8). Yn gryno, cafodd melanocytes, naill ai'r gorfynegiant math gwyllt neu PAK sy'n mynegi naill ai'r math gwyllt PAK1 neu ei mutant CA, eu deor â 100 nM -MSH am 3 diwrnod. Cafodd celloedd eu gorchuddio â thoddiant sy'n cynnwys 1 M NaOH a 20 y cant DMSO i doddi'r melanin, a phenderfynwyd ei gynnwys ar 405 nm.

2.5. Melanogenesis mewn cyfrwng di-serwm

Cafodd celloedd B16F10 (trawslifyddion shRNA math gwyllt neu PAK1-benodol) eu platio ar ddwysedd o 2 × 104cells/ffynnon mewn 24-plât ffynnon ym mhresenoldeb 10 y cant FBS. Ar ôl 24 h o ddeori, caiff y cyfrwng diwylliant ei ddisodli gan gyfrwng di-serwm, a'i feithrin am 72 h ychwanegol gyda neu heb 100 µM IBMX neu 100 nM -MSH i fesur y cynnwys melanin.

2.6. Effaith atalyddion derbynnydd PDGF/EGF ar felanogenesis sy'n ddibynnol ar serwm

Cafodd celloedd 2 × 104 B16F10 eu hadu ym mhob ffynnon am 24 h mewn cyfrwng 10 y cant yn cynnwys FBS, ac yna eu meithrin am 72 h ychwanegol yn y cyfrwng ffres sy'n cynnwys 100 nM -MSH a dilyniannau: (1) dim serwm, (2) 10 y cant FBS yn unig, (3) 10 y cant FBS ynghyd â 2 µM AG1295 (atalydd derbynnydd PDGF), a (4) 10 y cant FBS ynghyd â 400 nM AG1478 (atalydd derbynnydd EGF), i fesur y cynnwys melanin.

2.7. Dadansoddiad ystadegol

Mynegir data fel gwerthoedd cymedrig gyda'u gwallau safonol. Perfformiwyd cymariaethau ystadegol gan ANOVA un ffordd ac yna prawf amrediad lluosog Duncan. Cynhaliwyd dadansoddiad ystadegol gan ddefnyddio SAS (rhyddhau 9.2; SAS Institute, Cary, NC, UDA), a p Yn llai na neu'n hafal i 0.05 yn cael ei ystyried yn arwyddocaol.

maca ginseng cistanche

3. Canlyniadau

3.1. Actifadu PAK1 mewn llinell gell melanoma (B16F10) gan hormonau melanogenig

Mae dau hormon melanogenig, -MSH (hormon sy'n ysgogi melanocyte) ac IBMX (3-isobutyl-1-methyl xanthine) yn cael eu defnyddio'n aml i ysgogimelanogenesismewn melanocytes fel llinell gell melanoma B16F10. Felly, fe wnaethom archwilio yn gyntaf a all yr hormonau hyn actifadu PAK1 yn y llinell gell hon, er bod lefel protein PAK1 yno yn hynod o isel, o'i gymharu â rhai PAK2 a PAK4 (8). Er mwyn monitro'r newidiadau yng ngweithgarwch kinase PAK1 mewn celloedd, rydym yn ddiweddar wedi datblygu assay kinase hynod sensitif / penodol o'r enw protocol assay kinase “Macaroni-Western” (IP ATP-Glo) trwy gyfuno imiwn-dyodiad (IP) PAK1 o'r gell. lysates a phecyn ATP Glo kinase Promega (5). Gan ddefnyddio'r assay kinase hwn, canfuom fod -MSH (100 nM) ac IBMX (100 µM) yn actifadu PAK1 mewn celloedd melanoma, gyda -MSH yn fwy grymus nag IBMX (gweler Ffigur 1). Fodd bynnag, dylem atgoffa darllenwyr mai dim ond yn amlwg y mae actifadu plyg PAK1 a ddangosir yma, oherwydd yn ystod yr assay tiwb prawf IP a kinase hwn sy'n cymryd llawer o amser (dros 3 h i gyd) sy'n digwydd heb yr hormonau melanogenig hyn, byddai PAK1 yn cael ei normaleiddio'n raddol drosodd. amser. Mewn geiriau eraill, ni allwn rewi union statws kinase PAK1 ar ddiwedd diwylliant celloedd sy'n cael ei drin â'r symbylyddion hyn, ac nid yw'r actifadu plyg ond yn adlewyrchiad tanamcangyfrif o actifadu PAK1 a gynhaliwyd yn ystod diwylliant celloedd gan yr efelychwyr hyn.

3.2. Distewi genyn PAK1 gan shRNAs yn llinell gell melanoma llygoden

Er mwyn ymchwilio ymhellach yn fiocemegol a yw PAK1 yn cyfrannu at ymelanogenesismewn celloedd croen (melanocytes), fe wnaethom drawsnewid y llinell gell melanoma B16F10 yn sefydlog gyda'r llygoden PAK 1-shRNA penodol i dawelu genyn PAK1 yn ddetholus.

3.2.1. Yn tawelu genyn PAK1 mewn melanocytes

Roedd ein dadansoddiad blotiau gorllewinol rhagarweiniol yn awgrymu bod lefelau protein PAK1 wedi gostwng yn sylweddol (tua 75 y cant) mewn dau glon tawelu PAK penodol (SH1 a 2), ond nid oedd cyfradd twf y llinell gell melanoma hon fel y cyfryw. yr effeithir yn sylweddol gan y tawelu PAK1 (data heb ei ddangos). Fodd bynnag, roedd meintioli lefelau protein PAK1 yn gywir trwy sganio'r blot gorllewinol hwn braidd yn anodd, yn bennaf oherwydd y sŵn cefndir uchel o amgylch y band PAK1 yn yr ymdrech i ddelweddu ei lefelau mynegiant hynod o isel. Yn lle hynny, gan ddefnyddio'r assay kinase "Macaroni-Western" (5,10), gwnaethom wirio mai dim ond tua 25-30 y cant o hynny yn y celloedd rheoli (WT) yw gweithgaredd kinase PAK1 mewn clonau SH1 a 2 ( gweler Ffigur 2A).

3.2.2. Lleihad yn y melanogenesis trwy dawelu genyn PAK1

Ein cwestiwn hollbwysig nesaf oedd a yw gostyngiad o'r fath yng ngweithgarwch kinase PAK1 yn effeithiomelanogenesis. Felly, cymharwyd y cynnwys melanin yn y clonau hyn (SH1 a 2) â'r celloedd melanoma math gwyllt (WT), ar ôl trin yr holl gelloedd hyn â -MSH, anwythydd melanogenig, am 72 h. Fel y dangosir yn Ffigur 2B, mae'r cynnwys melanin yn y melanocytes diffygiol PAK hyn (SH1 a 2) yn cael ei leihau tua 50 y cant (51-55 y cant), gan gyrraedd y lefel sylfaenol yn y WT heb hormon melanogenig. I weld a yw'r gostyngiad hwn mewn cynnwys melanin yn gysylltiedig ag atal gweithgaredd tyrosinase, fe wnaethom fesur ytyrosinasegweithgarwch mewn celloedd diffygiol PAK (clonau SH1 a 2), o gymharu â’r WT. Fel y dangosir yn Ffigur 2C, dim ond tua 45 y cant (33-58 y cant) o'r hyn yn y WT yw gweithgarwch tyrosinase mewn celloedd diffygiol PAK, gan gyrraedd y lefel waelodol (heb ei symbylu) eto, gan nodi'n glir bod PAK1 yn hanfodol ar gyfer cynhyrchu melanin a achosir gan -MSH erbyntyrosinasemewn melanocytes. Ymhellach, mewn modd tebyg iawn gostyngwyd y melanogenesis a achosir gan IBMX hefyd trwy dawelu genyn PAK1 yn y llinell gell melanoma hon (data heb ei ddangos). Fodd bynnag, gan gymryd y ddau ffactor canlynol i ystyriaeth, mae'n fwyaf tebygol mai dim ond hanner y rhainmelanogenesismewn melanocytes yn PAK1-ddibynnol, ac mae'r gweddill (yn bennaf "sylfaenol") yn PAK4-ddibynnol: (i) Mae PAK4 hefyd yn hanfodol ar gyfer y melanogenesis a achosir gan MSH mewn melanocytes (8), a (ii) ymddengys bod tua 25 y cant o enyn PAK1 yn dal i gael ei fynegi yn y trawsffactyddion hyn (SH1 a 2). Fodd bynnag, mae angen egluro'n drylwyr a yw PAK1 yn gyfrifol am yr hormon-anwythadwy neu'r gwaelodol.melanogenesis.

Ar ben hynny, rydym wedi cadarnhau bod y PAK1 mewndarddol yn cael ei actifadu'n sylweddol gan anwythyddion melanogenig fel IBMX a -MSH yn y llinell gell melanoma hon (gweler Ffigur 1), ond heb unrhyw newid sylweddol yn ei awtoffosfforyleiddiad yn Thr 423 fel y bernir gan y gwrth-pPAK1 gwrthgorff (data heb ei ddangos).

3.3. Cynnydd mewn melanogenesis -MSH-inucible gan or-mynegi PAK1

Trwy orfynegiant y genyn PAK1 math gwyllt (WT) mewn melanocytes (llinell gell B16F10) trwy drawsnewidiad, fe wnaethom ddatgelu bod y genyn PAK1 a ychwanegwyd yn alldarddol yn rhoi hwb sawl plyg i lefel melanin anwythol -MSH (gweler ochr chwith Ffigur 3, cymharwch lonydd 2 a 4), er mai prin y mae'n effeithio ar y lefel melanin "sylfaenol" annibynnol fel y cyfryw (cymharer lonydd 1 a 3 ym mhanel chwith Ffigur 3), sy'n awgrymu bod PAK1 yn cyfrannu'n bennaf at -MSH/IBMX-dependentmelanogenesis, ac nid y melanogenesis gwaelodol heb symbylydd(wyr) alldarddol.

3.4. Effaith serwm ar melanogenesis anwythol -MSH/IBMX

Yn fwy diddorol, canfuom fod sefydlu melanogenesis gan -MSH/IBMX yn gofyn am 10 y cant o FBS (serwm buchol ffetws) yn ogystal â PAK1. Fel y dangosir yn Ffigur 4A, mewn cyfrwng di-serwm, prin y bu i -MSH neu IBMX achosi'rmelanogenesisyn y celloedd WT, er bod y FBS 10 y cant yn unig (heb -MSH / IBMX) wedi achosi'rmelanogenesisyn sylweddol (o tua 60 y cant ). Yn ddiddorol, roedd y melanogenesis mewn transfectants SH (PAK1-celloedd diffygiol) ym mhresenoldeb neu absenoldeb serwm yr un lefel ag mewn celloedd WT yn absenoldeb serwm (gweler Ffigur 4B), sy'n awgrymu bod y melanogenesis sy'n ddibynnol ar serwm hefyd yn gofyn am PAK1. Wrth gefnogi'r syniad hwn, mae serwm yn unig yn actifadu gweithgaredd kinase PAK1 mewn celloedd WT yn sylweddol, ond mae angen serwm ar gyfer actifadu -MSH-ddibynnol PAK1 mewn celloedd WT (gweler Ffigur 4C).

O ran natur gemegol ffactor serwm melanogenig sydd ar ei ben ei hun yn actifadu PAK1, rydym yn dyfalu mai PDGF (ffactor twf sy'n deillio o blatennau) ydyw am y rhesymau a ganlyn: (i) fwy na degawd yn ôl rydym wedi dangos mai PDGF yw'r unig ffactor twf yn serwm sy'n actifadu PAK1 trwy draws-weithredu derbynnydd EGF (ffactor twf epidermaidd) gan dderbynnydd PDGF (13,14), ac yn ddiweddar iawn mae eraill wedi profi bod naill ai PDGF neu EGF yn unig yn ysgogi'rmelanogenesiso melanocytes (15,16).

3.5. Mae angen derbynnydd EGF ar y melanogenesis sy'n ddibynnol ar serwm/PDGF

Mewn ymgais i nodi natur gemegol benodol y ffactor serwm melanogenig hwn, rydym wedi profi effaith naill ai AG1295 (atalydd penodol ar gyfer derbynnydd PDGF) neu AG1478 (atalydd penodol ar gyfer derbynnydd EGF) ar y serwm-ddibynnolmelanogenesismewn melanocytes. Fel y dangosir yn Ffigur 5, roedd naill ai 2 µM AG1295 neu 400 nM AG1478 wedi lleihau’r dibyniaeth ar serwm yn gryfmelanogenesisi'r lefel sy'n cyfateb i'r melanogenesis sylfaenol (heb serwm). Gan fod PDGF yn bresennol yn helaeth mewn serwm, ond nid yw EGF ac AG1295 yn atal derbynnydd EGF, tra nad yw AG1478 yn atal derbynnydd PDGF (13), mae'n fwyaf tebygol bod PDGF mewn serwm yn actifadu ei dderbynnydd sydd yn ei dro yn traws-actifadu derbynnydd EGF sy'n yn y pen draw yn actifadu PAK1 sy'n hanfodol ar gyfer melanogenesis serwm-ddibynnol (am fanylion, gweler Ffigur 6). Yn seiliedig ar y dybiaeth hon, byddwn yn trafod yn ddiweddarach y mecanwaith mwyaf tebygol sy'n sail i'r synergedd ymddangosiadol rhwng -MSH a serwm/PDGF ar gyfer actifadu PAK1, gan arwain at felanogenesis cadarn.

Yn olaf, dylai fod yn werth tynnu sylw at y ffaith na chafodd y cynnwys melanin "sylfaenol" heb -MSH ei newid yn sylweddol gan mutant CA (gweithgar yn gyfansoddiadol) o PAK1 sy'n cario treiglad T423E (gweler panel chwith Ffigur 3, lôn 5) yn sylweddol. pe bai'n un ai DN (negyddol dominyddol) neu mutant anweithredol. Mewn gwirionedd, ni wnaeth -MSH ysgogi ffosfforyleiddiad WT PAK1 yn Thr 423 o gwbl (data heb ei ddangos). Felly, gellid dod i'r casgliad nad oes gan awto-ffosfforyleiddiad PAK1 yn Thr 423 unrhyw beth i'w wneud ag actifadu PAK1 a achosir gan MSH, sy'n arwain at y broses gadarn.melanogenesismewn celloedd melanoma. Gan ei bod yn hysbys bod mutant T423E o PAK1 yn oncogenig iawn (6), efallai y gallai'r awto-ffosfforyleiddiad yn Thr 423 olygu newid o signalau "melanogenig" i signalau "oncogenig".

4. Trafodaeth

O'n harsylwadau ar felanogenesis PAK1-dibynnol a PAK4-mewn celloedd melanocyte/melanoma, mae dau fater a allai fod yn ddiddorol yn codi i'w nodi: (i) Gweithgaredd melanogenig "penodol" PAK1 ( dim ond wedi'i fynegi'n fanwl) fod yn llawer uwch na PAK4 (wedi'i fynegi'n uchel) mewn celloedd melanoma. (ii) Mae'n ymddangos mai PAK1 sy'n bennaf gyfrifol am felanogenesis a achosir gan serwm, tra bod PAK4 yn bennaf gyfrifol am y cynhenid ​​(sylfaenol)melanogenesis. Mewn geiriau eraill, er bod diffyg PAK yn angheuol yn embryonig mewn llygod, tra bod diffyg PAK yn unig yn methu â chynhyrchu llygod "albino", mae'r gwahaniaeth ymddangosiadol yn lliw gwreiddiol y croen (sylfaenol).melanogenesis) gallai rhwng pobl ddu a gwyn er enghraifft fod yn adlewyrchiad rhannol o leiaf o’r gwahaniaeth yn lefel mynegiant PAK4, yn ogystal â gwahaniaeth yn lefel y melanogenigtyrosinases.

Yn vivo, gan ddefnyddio llygod HRM-2 (pigment ond heb wallt), rydym wedi dangos yn ddiweddar bod eli sy'n cynnwys 10 μM PF3758309 (PAK1/PAK4-atalydd) yn lleihau'r melanogenis a achosir gan UV yn eu croen i'r lefel sylfaenol, er ei bod yn dal i gael ei egluro a yw PAK4 neu PAK1 yn gyfrifol am ymsefydlu UV o melanogenesis (8). Gan fod PAK1 yn gyfrifol am y melanogenesis anwythol, ond nid y gwaelodol, byddai'n werth profi a yw PAK1 yn cyfrannu'n sylweddol at y melanogenesis anwytholedig UV.melanogenesis(lliw haul) hefyd, gan ddefnyddio'r mutant PAK1 KO prin (curo allan) sy'n deillio o straen C57B16 o lygod yn cario blew a llygaid tywyll (Hong He et al., arsylwi heb ei gyhoeddi), mewn ymgais i ddeall a oes amrywiaeth o PAK1 llysieuol mae atalyddion mewn colur yn ddefnyddiol ar gyfer asiantau sgrinio haul ai peidio. Yn ddiddorol, adroddwyd bod PAK1 wedi'i actifadu gan arbelydru UV ac asiantau eraill sy'n niweidio DNA (17).

Dangoswyd bod -MSH yn actifadu'r Tyr kinase JAK2 (18), sydd yn ei dro yn actifadu PAK1 trwy'r ffosfforyleiddiad yn Tyr 285, (yn lle Thr 423), gan arwain at ryngweithio PIX-PAK1 (19). Gallai hyn esbonio pam nad yw actifadu PAK1 sy'n ddibynnol ar -MSH na melanogenesis yn cynnwys awtoffosfforyleiddiad PAK1 yn Thr 423. Felly, fe wnaethom ymchwilio'n ddiweddar i weld a yw'r melanogenesis dibynnol PAK yn cael ei rwystro gan JAK llysieuol grymus2- atalydd o'r enw cucurbitacin I (CBI) o felon chwerw (Goya) sy'n atal yn uniongyrchol JAK2 (20), a chanfod bod CBI yn atal ymelanogenesisym mhresenoldeb hormonau melanogenig o fwy na 70 y cant , sy'n awgrymu'r posibilrwydd bod CBI yn blocio nid yn unig PAK1 ond hefyd PAK4 (5). Yn y cyd-destun hwn, byddai o ddiddordeb mawr i nodi y gallai'r atalyddion PAK llysieuol fel CAPE, curcumin, shikonin, a FTY 720 atal y melanogenesis a achosir gan MSH mewn llygoden neu gelloedd croen dynol yn unig o gwmpas. 50 y cant hyd yn oed yn eu crynodiadau lle mae PAK1 bron yn gyfan gwbl wedi'i rwystro (1,2), tra bod yr atalydd pan-PAK synthetig PF3758309, sy'n atal PAK1 a PAK4, yn diddymu'rmelanogenesismewn celloedd croen tua 90 y cant ar 300 nM (8). Mewn geiriau eraill, gallai'r system melanogenig a achosir gan -MSH mewn melanocytes wahaniaethu rhwng y rhwystrwyr PAK penodol a'r atalyddion padell-PAK. Hyd yn hyn nid oes unrhyw atalyddion llysieuol PAK (ac eithrio siRNAs PAK4-penodol) wedi'u nodi. Fodd bynnag, dangoswyd yn ddiweddar bod cwassinoid cryf iawn o'r enw glaucarubinone sy'n deillio o goeden chwerw a dyfwyd yn jyngl Amazon yn rhwystro PAK1 a PAK4, gan atal twf celloedd canser y pancreas in vitro ac in vivo (21). Felly, byddai o ddiddordeb mawr i brofi a yw'r atalydd PAK llysieuol hwn yn atal melanogenesis celloedd croen bron yn gyfan gwbl fel y mae PF3758309.

Prif nod yr astudiaeth hon oedd canolbwyntio ar rôl felanogenig benodol PAK1, ac nid ymchwilio'n fanwl i sut mae PAK1 yn actifadu'r llwybr signalau melanogenig gan gynnwys ensymau melanogenig a MTFs. Fodd bynnag, mae'n fwyaf tebygol bod PAK1 yn actifadu beta-catenin yn uniongyrchol trwy ffosfforyleiddio yn Ser 675, gan arwain at actifadu MITF sy'n hanfodol ar gyfer mynegi amgodio genynnau ar gyfer ensymau melanogenig feltyrosinase(Tyr).

Yn ddiweddar, canfuom fod PAK4 (CDC42-dependent kinase 4) hefyd yn rhan ohonomelanogenesiso'r un llinell gell melanoma trwy actifadu dau ffactor trawsgrifio, CREB a beta-catenin, y ddau ohonynt yn hanfodol ar gyfer activation MIFT (8). Gan ei bod yn hysbys bod CREB yn cael ei actifadu gan LIM kinase (22,23) sy'n hoffi beta-catenin, ymhlith swbstradau uniongyrchol cyffredin PAK1 a PAK4 (6,18), mae'n fwyaf tebygol bod PAK1 a PAK4 yn rhannu'r un CREB llwybrau signalau /beta-catenin-MITF i actifadu'r genynnau ensymau melanogenig.

Fodd bynnag, gallai'r llwybrau signal manwl sy'n arwain at actifadu PAK1 -MSH/IBMX-ddibynnol fod yn sylweddol wahanol i'r rhai sy'n arwain at actifadu PAK4, yn bennaf oherwydd bod y cyntaf yn cynnwys y ffactor serwm (PDGF). Mae'r serwm yn unig yn gallu actifadu PAK1 (13) ac yn rhoi hwb i actifadu -MSH / IBMXdependent o PAK1 hefyd. Mewn geiriau eraill, mae synergedd clir rhwng y serwm a'r hormonau melanogenig hyn mewn actifadu PAK1 amelanogenesis.

Mae'r canlynol yn ein rhagdybiaeth weithredol o ran sut y gallai'r synergedd hwn ddigwydd. Y prif lwybr signalau sy'n arwain at actifadu PAK1 yw'r rhaeadru EGFR oncogenig (derbynnydd ffactor twf epidermaidd)-RAS-PI 3 kinase-RAC/CDC42-PAK1. Fodd bynnag, nid yw'r rhaeadru hwn yn unig yn ddigon ar gyfer y gweithrediad llawn. Mae angen ffactor arall o'r enw PIX, sef protein addasydd SH3 sy'n clymu PAK1 yn uniongyrchol trwy ei fotiff Pro-gyfoethog o 18 asid amino o'r enw PAK18. Mae'r rhyngweithiad PIX-PAK1 angen trydydd protein o'r enw JAK2, sef Tyr-kinase, sy'n ffosfforyleiddio PAK1 yn Tyr 285. Mae RAS yn rheoleiddio JAK2 trwy brolactin i fyny. Yn ôl ychydig o ganfyddiadau blaenorol gennym ni ac eraill (13-16), PDGF (ffactor twf sy'n deillio o blatennau) yw'r prif ffactor(au) serwm melanogenig sy'n hanfodol ar gyfer y -MSH/IBMX a achosirmelanogenesis, oherwydd ei fod yn actifadu ei dderbynnydd (PDGFR) Tyr-kinase sydd yn ei dro yn traws-actifadu EGFR (derbynnydd ffactor twf epidermaidd=ErbB1) Tyr-kinase, gan arwain at actifadu PAK1 trwy'r kinase-RAC oncogenig RAS-PI3 llwybr /CDC42 (13). Felly, gall PDGF mewn serwm yn unig actifadu PAK1 a chymell melanogenesis hyd at hanner ffordd. Fodd bynnag, ar gyfer actifadu melanogenesis dibynnol PAK yn llawn, mae angen -MSH/IBMX i actifadu'r JAK2 trwy lwybr dibynnol ar cAMP (a allai gynnwys PKA) sy'n sicrhau'r rhyngweithio PIX-PAK1 yn y pen draw (am fanylion, gweler Ffigur 6).

I gloi, dyma ni'n cyflwyno'r dystiolaeth biocemegol gyntaf a allai esbonio sut y gallai amrywiaeth o atalyddion PAK llysieuol fel CAPE, curcumin, a shikonin mewn hufenau cosmetig gyfrannu at y "croen-gwyno" effeithiau. Disgwylir cyfres o astudiaethau tebyg gyda melanocytes dynol am brawf pellach neu gadarnhad.

maca ginseng cistanche

Cyfeiriadau

1. Lee JH, Jang JY, Parc C, Kim BW, Choi YH, Choi BT. Mae Curcumin yn atal melanogenesis alffa-melanocyte sy'n ysgogi hormonau mewn celloedd B16F10. Int J Mol Med. 2010; 26:101-106.

2. Lee JY, Choi HJ, Chung TW, Kim CH, Jeong HS, Ha KT. Mae ester ffenethyl asid caffeic yn atal synthesis melanin a achosir gan hormonau alffa-melanocyte trwy atal gweithgaredd trawsweithredol ffactor trawsgrifio sy'n gysylltiedig â microffthalmia. J Nat Prod. 2013; 76:1399-1405.

3. Maruta H. Therapiwteg lysieuol sy'n rhwystro'r kinase oncogenig PAK1: Agwedd ymarferol tuag at glefydau dibynnol PAK a hirhoedledd. Phytother Res. 2014; 28:656-672.

4. Nguyen BCQ, Taira N, Tawata S. Mae nifer o gyfansoddion llysieuol mewn planhigion Okinawa yn atal y kinase oncogenig/heneiddio PAK1 yn uniongyrchol. Discov Cyffuriau Ther. 2014; 8:238-244.

5. Nguyen BCQ, Be Tu PT, Tawata S, Maruta H. Cyfuniad o immunoprecipitation (IP)-ATP_assay Glo kinase a melanogenesis ar gyfer asesu rhwystrwyr PAK cryf a diogel mewn meithriniad celloedd . Discov Cyffuriau Ther. 2015; 9:289-295.

6. He H, Maruta H. Oncogenigedd PAKs a'u swbstradau. Yn: PAKs, RAC/CDC42 (t21) kinases-activated: Tuag at wella canserau a chlefydau eraill sy'n dibynnu ar PAK (Maruta H, gol.). Elsevier, Rhydychen, 2013; tt. 23-51.

7. Widlund HR, Horstmann MA, Price ER, Cui J, Lessnick SL, Wu M, He X, Fisher DE. -Mae twf melanoma a achosir gan gatenin yn gofyn am y targed i lawr yr afon ffactor trawsgrifio sy'n gysylltiedig â Microphthalmia. J Cell Biol. 2002; 158:1079-1087.

8. Yun CY, Chi ST, Kim JH, Chung JH, Han SB, Shin EY, Kim EG. p21-mae kinase 4 wedi'i actifadu yn rheoleiddio melanogenesis yn feirniadol trwy actifadu'r llwybrau CREB/MITF a -catenin/MITF. J Buddsoddi Dermatol. 2015; 135:1385-1394.

9. Mae Huynh N, Liu KH, Baldwin GS, He H. P21- wedi'i actifadu kinase 1 yn ysgogi twf celloedd canser y colon a mudo / goresgyniad trwy lwybrau sy'n ddibynnol ar ERK- ac AKT. Biochim Bioffys Acta. 2010; 1803:1106-1113.

10. Tagliati F, Bottoni A, Bosetti A, Zatelli MC, degli Uberti EC. Defnyddio technoleg luminescent i ddatblygu assay kinase: Cdk4 fel system fodel. J Pharm Biomed Rhefrol. 2005; 39:811-814.11. Yoon NY, Eom TK, Kim MM, Kim SK. Effaith ataliol fflorotanninau wedi'u hynysu o Ecklonia cava ar weithgaredd tyrosinase madarch a ffurfio melanin mewn celloedd melanoma llygoden B16F10. J Cemegydd Bwyd Amaeth. 2009; 57:4124-4129.

12. Li X, Guo L, Sul Y, Zhou J, Gu Y, Li Y. Mae Baicalein yn atal melanogenesis trwy actifadu llwybr signalau ERK. Int J Mol Med. 2010; 25:923-927.

13. Mae He H, Levitzki A, Zhu HJ, Walker F, Burgess A, Maruta H. Mae ffactor twf sy'n deillio o blatennau yn gofyn am dderbynnydd ffactor twf epidermaidd i actifadu p21-cineses teulu kinase actifedig. J Biol Chem. 2001; 276:26741-26744.

14. Saito Y, Haendeler J, Hojo Y, Yamamoto K, Berk CC. Hetero-dimerization derbynnydd: Mecanwaith hanfodol ar gyfer trawsactio derbynnydd ffactor twf epidermaidd sy'n deillio o blatennau. Mol Cell Biol. 2001; 21:6387-6394.

15. Hirobe T, Shibata T, Fujiwara R, Sato K. Mae ffactor twf sy'n deillio o blatiau yn rheoleiddio amlder a gwahaniaethu melanocytes dynol mewn modd cam gwahaniaethu-benodol. J Dermatol Sci. 2016; 83:200-209.

16. Garcez RC, Teixeira BL, Schmitt Sdos S, Alvarez-Silva M, Trentin AG. Mae ffactor twf epidermaidd (EGF) yn hyrwyddo gwahaniaethu in vitro rhwng celloedd crib niwral a niwronau a melanocytes. Cell Mol Neurobiol. 2009; 29:1087-1091.

17. Roig J, Traugh JA. p21-Protein kinase gama wedi'i actifadu Mae PAK yn cael ei actifadu gan ymbelydredd ïoneiddio ac asiantau eraill sy'n niweidio DNA. Tebygrwydd a gwahaniaethau i alffa PAK. J Biol Chem. 1999; 274:31119-31122.

18. Bygi JJ. Mae rhwymo'r hormon ysgogol alffa-melanocyte i'w dderbynnydd cyplysu protein G ar lymffocytau B yn actifadu llwybr Jak/STAT. Biochem J. 1998; 331:211-216.

19. Morthwyl A, Oladimeji P, De Las Casas LE, Diakonova M. Ffosfforyleiddiad tyrosine 285 o PAK1 yn hwyluso trosiant rhwymo a glynu'n PIX/GIT1. FFASEB J. 2015; 29:943-959.

20. Blaskovich MA, Sul J, Cantor A, Turkson J, Jove R, Sebti SM. Darganfod JSI-124 (cucurbitacin I), trosddygiadur Janus kinase/signal dethol ac actifydd atalydd llwybr signalau trawsgrifio 3 gyda gweithgaredd gwrth-tiwmor cryf yn erbyn celloedd canser dynol a murine mewn llygod. Canser Res. 2003; 63:1270-1279.

21. Mae Yeo D, Huynh N, Beutler JA, Christophi C, Shulkes A, Baldwin GS, Nikfarjam M, He H. Glaucarubinone a gemcitabine yn lleihau twf canser y pancreas yn synergyddol trwy is-reoleiddio p{2}}cineses actifedig. Cancr Lett. 2014; 346:264-272.

22. Dan C, Kelly A, Bernard O, Minden A. Mae newidiadau cytosgerbydol a reoleiddir gan y kinase serine/threonine PAK4 yn cael eu cyfryngu gan LIM kinase 1 a chofilin. J Biol Chem. 2001; 276:32115-32121.

23. Yang EJ, Yoon JH, Min DS, Chung KC. Mae LIM kinase 1 yn actifadu protein elfen-rwymol sy'n ymateb i cAMP yn ystod y gwahaniaethiad niwronaidd o gelloedd epiliaid hippocampal anfarwoledig. J Biol Chem. 2004; 279:8903-8910.