Yr Embryo Sebrafish Fel Model I Brofi Effeithiau Amddiffynnol Cyfansoddion Gwrthocsidiol Bwyd

Ebosttina.xiang@wecistanche.comam fwy o wybodaeth.

Haniaethol: yrgwrthocsidiolgweithgaredd cyfansoddion bwyd yw un o'r priodweddau sy'n cynhyrchu'r diddordeb mwyaf, oherwydd ei fanteision iechyd a'i gydberthynas ag atal afiechyd cronig. Mae'r gweithgaredd hwn fel arfer yn cael ei fesur gan ddefnyddio profion in vitro, na all ragweld effeithiau in vivo na mecanweithiau gweithredu. Amcan yr astudiaeth hon oedd gwerthuso effeithiau amddiffynnol in vivo chwe chyfansoddyn ffenolig (naringenin, apigenin, rutin, oleuropein, asid clorogenig, a curcumin) a thri carotenoid (lycopen B, -caroten, ac astaxanthin) sy'n bresennol yn naturiol mewn bwydydd sy'n defnyddio model embryo pysgod sebra. Cafodd yr embryo pysgod sebra ei drin ymlaen llaw gyda phob un o'r naw cyfansoddyn gwrthocsidiol ac yna'n agored i tertbutyl hydroperoxide (tBOOH), ysgogydd hysbys ostraen ocsideiddiolmewn pysgod sebra. Penderfynwyd ar wahaniaethau sylweddol trwy gymharu ymateb crynodiad y marwoldeb a achoswyd gan tBOOH a dysmorphogenesis yn erbyn yr embryonau a ragdriniwyd â'rgwrthocsidiolcyfansoddion. Canfuwyd effaith amddiffynnol pob cyfansoddyn, ac eithrio -caroten, yn erbyn marwoldeb ocsideiddiol a achosir gan straen. Ar ben hynny, dangosodd apigenin, rutin, a curcumin effeithiau amddiffynnol yn erbyn dysmorphogenesis. Ar y llaw arall, dangosodd -caroten fwy o farwoldeb a dysmorphogenesis o'i gymharu â'r driniaeth tBOOH yn unig.

Geiriau allweddol: straen ocsideiddiol; embryo pysgod sebra; effaith gwrthocsidiol; polyffenolau; carotenoidau

1. Rhagymadrodd

Mae rhywogaethau ocsigen adweithiol (ROS) a rhywogaethau nitrogen adweithiol (RNS) yn tarddu yn ystod metaboledd celloedd. Maent yn hanfodol i gyflwr ffisiolegol arferol, ond maent yn cymryd rhan mewn prosesau patholegol pan fyddant yn ormodol [1]. Mae gan organebau aerobig amddiffynfeydd i atal difrod ocsideiddiol a achosir gan ROS, sy'n cynnwysgwrthocsidiolensymau a/neu fecanweithiau nad ydynt yn ensymatig, gan gynnwys cyfansoddion gwrthocsidiol a gynhyrchir yn fewndarddol neu amlyncu gwrthocsidyddion yn y diet [2].
Mae'r anghydbwysedd, pan fydd y crynodiad o rywogaethau adweithiol yn uwch na'rgwrthocsidiolamddiffynfeydd yr organeb, yn cael ei alwstraen ocsideiddiol(OS) [3]. Mae canlyniadau OS yn cynnwys recriwtio macrophage; atal gweithrediad arferol lipidau a phroteinau; a difrod mitocondriaidd, pilen, a DNA [4–7]. Mae'r newidiadau hyn wedi'u cydberthyn â sawl patholeg, megis canser, heneiddio, diabetes, arthritis gwynegol, a chlefydau cardiofasgwlaidd a niwroddirywiol, ymhlith eraill [8-11].

Mae sawl astudiaeth wedi canfod bod organeb yn ei gwneud yn ofynnol i gymeriant gwrthocsidyddion trwy'r diet leihau difrod ocsideiddiol [12] mewn sefyllfaoedd ffisiopatholegol (oherwydd amlygiad UV, ysmygu, aer llygredig, ac ati), sy'n cynhyrchu ROS gormodol. Mae gwrthocsidyddion amrywiol yn cael eu llyncu trwy'r diet, fel cyfansoddion ffenolig, fitaminau, carotenoidau, aflavonoidau. Mae'r term "cyfansoddion ffenolig" yn cyfeirio at unrhyw sylwedd sydd â grŵp ffenol ynghlwm wrth strwythurau aromatig neu aliffatig. Daw cyfansoddion ffenolig o blanhigion ac maent ymhlith y metabolion eilaidd pwysicaf; y mae eu presenoldeb yn y deyrnas anifeilaidd i'w briodoli i'w bwyta trwy yr ymborth. Ymhlith y cyfansoddion hyn,flavonoidauyw'r rhai mwyaf astudiedig a niferus; mae eu strwythurau cemegol yn cynnwys aflavonoidniwclews sy'n cynnwys 15 atom carbon wedi'u trefnu'n dri chylch (C6–C3–C6) [13]. Mae eu mecanweithiau gwrthocsidiol yn cynnwys atal ensymau neu gelu elfennau hybrin sy'n ymwneud â chynhyrchu radicalau rhydd, derbyniad ROS, a diogelu amddiffynfeydd gwrthocsidiol mewndarddol [14]. Y cymedrflavonoidamcangyfrifir y cymeriant yn 23 mg / dydd [15,16], a'r ffynonellau sylfaenol yw te du, gwin coch, winwns, afalau, a chwrw [17,18].

Grŵp arall o gyfansoddion sydd wedi'u hastudio oherwydd eu gweithgaredd gwrthocsidiol yw'r carotenoidau. Pigmentau ydyn nhw y mae eu strwythurau yn cynnwys cyfres o fondiau C=C (polyen) cyfunedig, sy'n caniatáu iddynt ryngweithio â radicalau rhydd; felly, gallant weithredu fel gwrthocsidyddion effeithiol [19]. Mae carotenoidau wedi'u dosbarthu'n fras mewn systemau naturiol, ac astudiwyd eu rôl wrth atal gwahanol glefydau, yn bennaf ar gyfer y cyfansoddion sy'n bresennol yn y diet fel -caroten, lutein, a lycopen [18,20,21].

Adnabod rolaugwrthocsidyddionmewn clefydau ac anhwylderau sy'n gysylltiedig â phrosesau ocsideiddiol yn hanfodol ar gyfer dadansoddi effeithiau amddiffynnol in vivo. Am y rheswm hwn, mae ein labordy wedi datblygu model embryo zebrafish (ZF) ar gyfer gwerthuso effeithiau amddiffynnol y rhain.gwrthocsidiolcyfansoddion [22].Straen ocsideiddiolyn cael ei ysgogi gan ddefnyddio tertbutyl hydroperoxide (tBOOH). Mae tBOOH yn cynhyrchu radicalau butocsyl trwy adwaith Fenton [23]. Mae'r radicalau a ffurfiwyd yn ffafrio disbyddiad mewngellol o grwpiau thiol a chronfeydd wrth gefn glutathione, gan gynhyrchu cynnydd sylweddol mewn marwoldeb a dysmorphogenesis mewn embryonau pysgod sebra. Mae'r model hwn yn caniatáu cymhariaeth rhwng cromliniau effaith crynodiad marwoldeb a dysmorphogenesis ar gyfer embryonau pysgod sebra sy'n agored i tBOOH a chromliniau embryonau sydd wedi'u rhag-drin â gwrthocsidyddion; gellir cynnal dadansoddiad ystadegol i archwilio effaith amddiffynnol y cyfansawdd gwrthocsidiol a ddadansoddwyd.

Amcan y gwaith presennol oedd gwerthuso effeithiau amddiffynnol in vivo cyfansoddion bwyd gyda gweithgaredd gwrthocsidiol yn erbyn gwenwyndra datblygiadol a achosir gan ocsidyddion mewn embryonau pysgod sebra.

2. Canlyniadau

2.1. Cromliniau Effaith Crynodiad ar gyfer tBOOH mewn Embryonau Zebrafish

Datblygodd a dilysodd ein grŵp ymchwil embryo ZF yn flaenorolstraen ocsideiddiolmodel ar gyfer gwerthuso gweithgaredd amddiffynnolgwrthocsidiolsylweddau (22).

Mae embryonau pysgod sebra yn agored i hydroperocsid tertbutyl (tBOOH) i gael cromliniau marwoldeb a dysmorphogenesis. Mae'r embryonau pysgod sebra yn agored i tBOOH 24 i 48 h ôl-ffrwythloni (hpf) mewn crynodiadau gwahanol, yn amrywio o 1 i 3.5 mM (Ffigur 1). Darganfuwyd bod y crynodiad marwol 50 (LC50) yn 2.1 mM, tra bod y crynodiad effeithiol 50 ar gyfer dysmorphogenesis (EC50) yn 1.7 mM. Defnyddiwyd y cromliniau a grybwyllwyd uchod i gymharu embryonau zebrafish a oedd yn agored i gyfansoddion gwrthocsidiol yn flaenorol, neu beidio, ac ar ôl hynny cawsant eu hamlygu i tBOOH.

2.2. Nodi Effeithiau Amddiffynnol Cyfansoddion Gwrthocsidiol mewn Embryonau Sebrafish

Defnyddiwyd y model zebrafish a ddisgrifiwyd yn flaenorol i werthuso effeithiau amddiffynnol chwe polyphenol a thri carotenoid sy'n bresennol mewn bwyd.

Allan o'r chwe polyphenol, roedd triflavonoidau: naringenin (20 uM), apigenin (10 uM), a rutin (10 uM). Y triflavonoidaucynhyrchu drifft sylweddol yn y cromliniau crynodiad-ymateb ar gyfer marwoldeb. Ar ben hynny, dangosodd apigenin a rutin effeithiau amddiffynnol yn erbyn dysmorphogenesis, tra nad oedd naringenin yn arddangos unrhyw effaith amddiffynnol yn erbyn dysmorphogenesis (Ffigur 2).

Dadansoddwyd Oleuropein （15 μM）, asid clorogenig (20 uM）, a curcumin (15 μM) hefyd. Arweiniodd y polyffenolau hyn at ddrifft sylweddol yn y cromliniau crynodiad-ymateb ar gyfer marwoldeb. Dim ond curcumin arddangosodd effaith amddiffynnol yn erbyn dysmorphogenesis (Ffigur 3).

Yn ogystal, gwerthuswyd y lycopen carotenoidau (20 μM), astaxanthin (20 μM) a -caroten (25 μM). Arweiniodd lycopen ac astaxanthin at ddrifft sylweddol yn y cromliniau crynodiad-ymateb ar gyfer marwoldeb. Mewn cyferbyniad, ni ddangosodd yr un o'r carotenoidau effaith amddiffynnol yn erbyn dysmorphogenesis (Ffigur 4). Ar ben hynny, arweiniodd -caroten at ddrifft i'r chwith yn y cromliniau ar gyfer marwoldeb a dysmorphogenesis, a allai ddangos effaith prooxidant posibl.

3. Trafodaeth

Mae ocsigen yn hanfodol ar gyfer bywyd dynol; fodd bynnag, ar yr un pryd, mae'n cynhyrchu sylweddau gwenwynig, megis radicalau rhydd a rhywogaethau ocsigen adweithiol (ROS); mae'r sylweddau hyn yn ocsideiddio, yn ansefydlog, ac yn adweithiol. Ar ben hynny, gallant adweithio ag unrhyw macromolecule ac achosi difrod celloedd [24]. Er mwyn gwrthweithio'r sylweddau ocsideiddio hyn, mae'r corff yn cyflogi ensymau gwrthocsidiol, megis superoxide dismutase a glutathione peroxidase, a chyfansoddion gwrthocsidiol sy'n deillio o'r diet. Felly, mae astudio gallu gwrthocsidiol cyfansoddion wedi bod yn ennyn diddordeb yn ystod yr ychydig flynyddoedd diwethaf. Mae yna nifer o dechnegau in vitro ar gyfer pennu gweithgaredd gwrthocsidiol, er bod ganddynt gyfyngiadau o safbwynt maethol oherwydd nid oes yr un ohonynt yn atgynhyrchu sefyllfa ffisiolegol [25]. Am y rheswm hwn, byddai dull a oedd yn cynnwys technegau in vivo yn arwain at ganlyniadau mwy dylanwadol, oherwydd mae straen ocsideiddiol yn awgrymu mecanweithiau sy'n dibynnu ar lawer o amodau system, yn enwedig rhannau cinetig adweithiau. Defnyddiodd ein tîm fodel embryo ZF [22], a allai fod yn ddull in vivo gwerthfawr, i brofi effeithiau amddiffynnol naw cyfansoddyn gwrthocsidiol sydd wedi'u hastudio'n fras mewn vitro. Fe wnaethom werthuso chwe chyfansoddyn ffenolig a thri charotenoid. Mae cyfansoddion ffenolig yn gyfraniad pwysig at botensial gwrthocsidiol y diet dynol; o'r cyfansoddion hyn, flavonoidau yw'r rhai mwyaf astudiedig a niferus. Astudiwyd gweithgaredd gwrthocsidiol y flavonoids apigenin, rutin, a naringenin. Mae'r flavonoidau hyn yn gyfansoddion bioactif a geir yn bennaf mewn amrywiol ffrwythau, planhigion a llysiau, cnau a winwns. Mae astudiaethau In vitro wedi dangos bod y flavonoidau hyn yn niwtraleiddio radicalau hydroxyl, superocsid, hydrogen perocsid, radicalau nitrig ocsid, DPPH, a perocsidiad lipid [26-29] yn effeithiol. Perfformiodd Chen et al., yn 2012 [30], ddadansoddiad QSAR gan ddefnyddio model larfa zebrafish i werthuso galluoedd chwilota ROS pymtheg flavonoid, gan gynnwys rutin, yn erbyn ffotowenwyndra a achosir gan UV. Yn unol ag astudiaethau blaenorol, daethant i'r casgliad bod pwysigrwydd y ddau grŵp hydroxyl a'u safleoedd, gydag o leiaf ddau grŵp hydroxyl yn angenrheidiol ar gyfer gweithgaredd biolegol cryf [30,31]. Ar ben hynny, penderfynwyd bod grwpiau hydroxyl mewn safleoedd C3, C5, a C7 yn rhoi gwell sefydlogrwydd a gweithgaredd flavone [31]. Dangosodd ein canlyniadau effaith amddiffynnol yn erbyn marwoldeb a achosir gan tBOOH ar gyfer y tri flavonoid. Dangosodd Apigenin a rutin hefyd effeithiau amddiffynnol yn erbyn dysmorphogenesis; fodd bynnag, ni ddangosodd naringenin unrhyw effaith yn erbyn dysmorphogenesis.

Yn ogystal â rhai flavonoidau, gwerthuswyd effeithiau gwrthocsidiol oleuropein, asid clorogenig, a curcumin hefyd. Mae astudiaethau in vitro ac in vivo wedi dangos bod y rhain

mae gan dri chyfansoddyn ffenolig effeithiau gwrthocsidiol pwysig [32-34]. Mae Oleuropein yn bioffenol a geir mewn dail olewydd, olew olewydd gwyryfon ychwanegol, a rhai rhywogaethau o'r teulu Oleaceae [32]. Mae asidau clorogenig (CGAs) yn esterau a ffurfiwyd rhwng asidau caffeig a quinic ac maent yn cynrychioli grŵp o polyffenolau sy'n bresennol yn y diet dynol [35]. Mae sawl astudiaeth wedi dangos bod yfed diodydd sy'n cynnwys CGAs fel coffi, te, gwin, a sudd ffrwythau amrywiol yn lleihau'r risg o ddatblygu gwahanol glefydau cronig [36-38]. Un o'r rhesymau dros y gostyngiad hwn yw gallu gwrthocsidiol y CGAs, sy'n rhoi atomau hydrogen i leihau radicalau rhydd ac yn atal adweithiau ocsideiddio [35]. Mae Curcumin yn polyphenol a ddefnyddir ar gyfer lliwio a sesnin mewn cynhyrchion bwyd. Mae ei weithgaredd gwrthocsidiol wedi'i astudio yn ystod yr ychydig flynyddoedd diwethaf, ac mae un astudiaeth yn awgrymu y gall amddiffyn biomembranes rhag difrod peroxidative [39]. Gan ddefnyddio model embryo ZF, sylwyd bod rhag-drin ag oleuropein, asid clorogenig, neu curcumin yn lleihau'r effaith sy'n achosi marwolaethau o straen ocsideiddiol a achosir gan tBOOH; fodd bynnag, dim ond ar gyfer curcumin y gwelwyd effaith amddiffynnol sylweddol yn erbyn dysmorphogenesis.

Grŵp arall sydd â phriodweddau gwrthocsidiol yw'r carotenoidau, grŵp hollbresennol o bigmentau isoprenoid. Maent yn diffoddwyr ocsigen singlet ac yn sborionwyr ROS [40]. Nid yw'r mecanweithiau moleciwlaidd sy'n sail i weithgaredd gwrth-a pro-oxidant carotenoidau yn cael eu deall yn llawn o hyd. Ymhlith y carotenoidau a astudiwyd fwyaf mae lycopen a -caroten. Gellir dod o hyd i'r rhain yn helaeth mewn tomatos, saws tomato, ffrwythau amrywiol, algâu a llysiau [18,41]. Wrth werthuso effeithiau amddiffynnol y carotenau hyn, canfuwyd bod lycopen yn dangos gweithgaredd gwrthocsidiol, gydag effaith amddiffynnol yn erbyn marwoldeb embryonig; fodd bynnag, ni ddarganfuwyd unrhyw effaith yn erbyn dysmorphogenesis. Ar y llaw arall, cynyddodd -caroten nifer yr achosion o farwoldeb a dysmorphogenesis yn embryonau ZF o'i gymharu ag effaith yr ocsidydd yn unig; mae hyn yn unol ag astudiaethau sydd wedi dangos bod dosau uchel o -caroten yn cael effeithiau gwrthocsidiol a ddilynir gan weithred prooxidant ar densiwn ocsigen uchel, a allai fod yn gysylltiedig â'i effeithiau andwyol [42]. Ar ben hynny, dangosodd astudiaeth nad oedd ychwanegiad -caroten yn cael unrhyw effaith amddiffynnol ar gyfanswm marwolaethau ysmygwyr gwrywaidd diabetig o gymharu â plasebo [43]. Carotenoid arall a werthuswyd oedd astaxanthin; mae'n garotenoid xanthophyll a geir mewn algâu, burum, eog, brithyll, crill, berdys, a chimwch yr afon. Mae'n pigment gwrthocsidiol coch, sy'n hydoddi mewn braster, nad oes ganddo unrhyw weithgaredd pro-Fitamin A [44]. Yn ein hastudiaeth, dangosodd astaxanthin effaith amddiffynnol yn erbyn marwoldeb, ond ni ddarganfuwyd unrhyw effaith yn erbyn dysmorphogenesis.

I gloi, dangosodd wyth o'r naw moleciwl a werthuswyd weithgaredd gwrthocsidiol gydag effeithiau amddiffynnol yn erbyn marwoldeb embryonig ZF. Dim ond apigenin (10 µM), rutin (10 µM), a curcumin (15 µM) oedd hefyd yn arddangos effeithiau amddiffynnol yn erbyn dysmorphogenesis o ganlyniad i straen ocsideiddiol a achosir gan tBOOH. Mewn cyferbyniad, canfuwyd bod -caroten yn cynhyrchu'r effaith groes, gan gynyddu'r gyfradd marwolaethau a dysmorphogenesis oherwydd ei fod yn lleihau gwerthoedd LC50 ac EC50. Mae cydbwysedd ac amseriad grymoedd ocsideiddiol a gwrthocsidiol yn allweddol i reoleiddio ac amseru datblygiad embryonig yn briodol [45]. Gallai gwahaniaethau yng nghineteg neu fecanwaith gweithredu'r gwrthocsidyddion hyn fod y prif reswm dros y gwahanol alluoedd amddiffynnol yn erbyn dysmorphogenesis. Mae angen mwy o astudiaethau i archwilio pam mai dim ond rhai cyfansoddion a ddangosodd effeithiau amddiffynnol ar morffogenesis yn ystod datblygiad embryonig. Ceisiodd yr astudiaeth hon wahaniaethu rhwng effaith embryotoxic (marwoldeb) ac effaith dysmorphogenesis (teratogenicity). Mewn rhai achosion, mae camffurfiadau yn debygol o ragflaenu ac arwain at farwolaeth. Mewn achosion eraill, gall marwoldeb a chamffurfiad fod o ganlyniad i wahanol achosion. Byddai annibyniaeth y ddau amlygiad hyn yn cael ei amau ​​​​pe bai cyfansoddyn yn cynyddu'r gwahaniad rhwng y cromliniau ymateb crynodiad angheuol a dysmorphogenesis. Ni chynyddodd yr holl gyfansoddion gwrthocsidiol a brofwyd yn ein hastudiaeth yr effaith teratogenig dros y dos marwol fwy na dwywaith; felly, ni welwyd unrhyw botensial teratogenig cynyddol ar gyfer unrhyw gyfansoddyn gwrthocsidiol [46].

Gyda'i gilydd, mae'r canlyniadau hyn yn dangos bod y model embryo ZF hwn yn arf gwerthfawr i ddadansoddi effeithiau amddiffynnol y moleciwlau gwrthocsidiol sy'n ffurfio bwyd. Er mwyn pennu'r rhesymau cemegol-strwythurol y dangosodd apigenin, rutin, a curcumin yr effeithiau amddiffynnol uchaf yn ein hastudiaeth, mae angen dadansoddiadau pellach; er enghraifft, i bennu perthnasoedd strwythur-gweithgaredd meintiol (QSARs).

4. Defnyddiau a Dulliau

4.1. Datganiad Moesegol

Awdurdodwyd y gweithdrefnau yn ymwneud â larfa pysgod sebra ac embryonau gan Bwyllgor Moeseg Anifeiliaid Prifysgol Barcelona, ​​​​rhif awdurdodi neu brotocol 7971 o Adran Da Byw a Physgodfeydd Llywodraeth Catalwnia (ProcedureDAAM 7971).

4.2. Cemegau ac Ateb

Caffaelwyd PreparationTert-butyl hydroperoxide (tBOOH, rhif CAS: 75-91-2) a'r gwrthocsidyddion com gan TCI Europe. Diddymwyd tBOOH mewn 0.3X byffer Danieau(17.4 mM NaCl; 0.23 mM KCl; 0.12 mM MgSO4·7 H2O; 0.18 mM Ca (NO3)2; 1.5 mM HEPES(N-(2-hydroxyethyl) piperazine-N0 -({2-asid ethanesylffonig); pH 7.4).

Naringenin (20 µM) (rhif CAS: 67604-48-2), oleuropein (15 µM) (rhif CAS:32619-42-4), rutin (10 µM) (rhif CAS : 207671-50-9), asid clorogenig (20 µM) (rhif CAS: 327-97-9), apigenin (10 µM) (rhif CAS: 520-36-5), curcumin (15 µM) (rhif CAS: 458-37-7), lycopen (20 µM) (rhif CAS: 502-65-8), astaxanthin (20 µM) (rhif CAS: 472-61-7), a -caroten (25 µM) (rhif CAS: 7235-40-7) eu caffael gan Sigmar-Aldrich®. Diddymwyd gwrthocsidyddion mewn 100% dimethyl sulfoxide (DMSO, Sigma Aldrich, Madrid, Sbaen) a'u gwanhau wedyn mewn byffer 0.3 × Danieau i grynodiad DMSO terfynol o 0.05 y cant (v/v). Defnyddiwyd gwrthocsidyddion mewn crynodiadau gwahanol, yn dibynnu ar y crynodiad uchaf lle na welwyd unrhyw effaith ar farwoldeb na datblygiad embryonig (crynodiad goddefadwy uchaf, MTC)

4.3. Cynnal a Chadw Pysgod Sebrafi a Chynhyrchu Wyau

Roedd pysgod sebra gwyllt llawndwf yn cael eu cadw dan amodau safonol. Cafodd yr embryonau eu casglu, eu glanhau, a'u dewis yn ôl eu hyfywedd. Cafodd yr embryonau wedi'u ffrwythloni eu trin â dŵr wedi'i safoni yn unol â safonau'r Sefydliad Rhyngwladol ar gyfer Safoni (ISO) 7346-1 a 7346-2 (ISO, 1998; 2 mM CaCl2·2H2O, 0.5 mM MgSO4 ·7H2O, 0.75 mM NaHCO3, a 0.07 mM KCl). Cafodd wyau wedi'u ffrwythloni eu llwyfannu yn ôl astudiaethau blaenorol gan Kimmel et al., 1995 [47], a'u dewis ar gyfer datguddiad dilynol o dan stereomicrosgop dyrannu (Motic SMZ168, Motic China Group, LTD., Luwan, Shanghai, China). Cadwyd yr embryonau pysgod mewn ffiolau gwydr ar dymheredd rheoledig o 27 ± 1 ◦C.

4.4. Embryonau Sebrafish yn dod i gysylltiad â Straen Ocsidiol (Tert-Butyl Hydroperoxide)

Er mwyn paratoi'r gromlin tBOOH, dilynwyd methodoleg Boix, 2020. Mae'r fethodoleg hon yn seiliedig ar gael cromlin ymateb crynodiad-marwoldeb (LC50) a dysmorphogenesis (EC50) trwy amlygu'r embryonau ZF i anwythydd straen ocsideiddiol, tertbutyl hydroperoxide (tBOOH). Unwaith y ceir embryonau zebrafish, cânt eu cadw mewn 0.3X Danieau cyfrwng o 0 i 24 hpf. O 24 i 48 hpf, mae'r embryonau yn agored i hydoddiannau tBOOH mewn crynodiadau gwahanol, o 1, 1.5, 2, 2.5, 3, a 3.5 mM. Defnyddiwyd embryonau o 3 gwahanol grafangau o bysgod sebra mewn triphlyg (Ffigur 5A).

4.5. Penderfynu ar Effeithiau Amddiffynnol Cyfansoddion Gwrthocsidiol

Er mwyn sefydlu a oedd cyfansoddyn yn cael effaith amddiffynnol yn erbyn straen ocsideiddiol, cafodd embryonau zebrafish eu hamlygu gyntaf i'r cyfansawdd gwrthocsidiol o 0 i 24 hpf. Cyfrifwyd y crynodiadau yn dibynnu ar y profion crynodiad uchaf y gellir eu goddef. Yna, o 24 i 48 hpf, roedd yr embryonau yn agored i'r anwythydd straen, tBOOH. Yn dilyn hynny, gwerthuswyd pob grŵp o embryonau ym mhob un o'r crynodiadau o tBOOH (Ffigur 5B). I benderfynu a oedd gwahaniaeth sylweddol, cymharwyd y gromlin ar gyfer dod i gysylltiad â tBOOH yn unig a'r gromlin ar gyfer cyn-amlygiad i'r cyfansawdd gwrthocsidiol.

Amlygwyd deg wy wedi'u ffrwythloni i 2.5 mL ar gyfer pob sylwedd a chrynodiad. Perfformiwyd tri atgynhyrchiad annibynnol, gan ddefnyddio wyau o wahanol ddigwyddiadau silio. Roedd embryonau ZF yn agored i'r cyfansoddion gwrthocsidiol am 24 h, yna tynnwyd yr ateb gwrthocsidiol, perfformiwyd golchi gan ddefnyddio cyfrwng Danieau, ac roedd yr embryonau ZF yn agored i wahanol grynodiadau tBOOH. Gwerthuswyd y marwoldeb ar ôl 48 h, a chyfrifwyd cymedr embryonau marw ar ôl y profion priodol. Ar gyfer y gwerthusiad dysmorphogenesis, dilynwyd y system sgorio a ddisgrifiwyd gan Teixido et al. [48] ​​i gyfrifo dysmorphogenesis yr embryonau tua 48 hpf. Dewiswyd naw nodwedd morffolegol, a ddisgrifir yn Nhabl 2. Cyfrifwyd amlder embryonau annormal (a ddiffinnir fel yr embryonau â sgôr o 1 mewn unrhyw nodwedd morffolegol) ar gyfer pob grŵp crynodiad a grŵp wedi'i drin.

Mae symud y gromlin ymateb crynodiad i'r dde oherwydd cyn-amlygiad i'r gwrthocsidyddion yn dangos effaith amddiffynnol yn erbyn y ysgogydd straen ocsideiddiol oherwydd bod angen crynodiad uwch o anwythydd i gael yr un canlyniadau â'r rhai sy'n dod i gysylltiad â tBOOH yn unig. Oherwydd y cyn-amlygiad i gwrthocsidyddion, mae newid i'r chwith o'r gromlin ymateb crynodiad yn awgrymu cynnydd mewn straen ocsideiddiol.

4.6.Dadansoddiad Ystadegol

Cyfrifwyd a gwerthuswyd y cromliniau crynodiad-ymateb ar gyfer marwolaethau a dysmorphogenesis gan ddefnyddio GraphPad 7.02 Software Inc. Defnyddiwyd y prawf F all-swm-o-sgwariau i gymharu ffit paramedrau pob grŵp data o'r gromlin. Addaswyd y cyfwng hyder i 95 y cant.

5. Casgliadau

Defnyddiodd yr astudiaeth hon embryonau zebrafish fel organeb enghreifftiol i brofi gallu amddiffynnol chwe chyfansoddyn ffenolig a thri charotenoid a geir yn gyffredin mewn bwydydd. Dangosodd yr holl gyfansoddion, ac eithrio -caroten, effeithiau amddiffynnol yn erbyn marwoldeb ocsideiddiol a achosir gan straen. Ar ben hynny, roedd apigenin, rutin, a curcumin hefyd yn arddangos effeithiau amddiffynnol yn erbyn dysmorphogenesis a achosir gan tBOOH. Rydym yn cynnig y gellid cymhwyso prawf embryo pysgod sebra, fel y'i cyflwynir yma, i werthuso effeithiau amddiffynnol in vivo cydrannau bwyd bioactif newydd gyda gallu gwrthocsidiol posibl.

Cristina Arteaga 1,20, Nuria Boix13, Elisabet Teixido 13⑤, Fernanda Marizande 2, Santiago Cadena4 ac Alberto Bustillos 5,*

1 Uned Tocsicoleg, Adran Ffarmacoleg, Tocsicoleg a Chemeg Therapiwtig, Ysgol Fferylliaeth,

Prifysgol Barcelona, ​​Avda Joan XXIIs/n,08028Barcelona, ​​Sbaen;

2 Cyfadran y Gwyddorau Iechyd, Maeth, a Dieteteg, Prifysgol Dechnegol Ambato, Ambato 180207, Ecwador;

3 Sefydliad Ymchwil Maeth a Diogelwch Bwyd INSA-UB, Campws Torribera Bwyd a Maeth,

Prifysgol Barcelona, ​​Prat de la Riba 171, 08921 Santa Coloma de Gramenet, Sbaen

4 Cyfadran y Gwyddorau Cymhwysol, Prifysgol Ryngwladol SEK, Quito 170134, Ecwador;

5 Cyfadran y Gwyddorau Iechyd, Meddygaeth, Prifysgol Dechnegol Ambato, Ambato 180207

Cyfeiriadau

1.Tan, BL; Norhaizan, ME; Liew, W.-P.-P. Maetholion a Straen Ocsidyddol: Ffrind neu Gelyn? Ocsid. Med. Cell. Longev. 2018, 2018, 9719584. [CrossRef] [PubMed]
2. Sies, H. Biocemeg Straen Oxidative. Angew. Chemie Int. Ed. Eng. 1986, 25, 1058–1071. [CrossRef]
3. Dröge, W. Radicaliaid Rhydd yn Rheolaeth Ffisiolegol Gweithrediad Cell. Physiol. Parch 2002, 82, 47–95. [CrossRef] [PubMed]
4. Rendra, E.; Riabov, V. ; Mossel, DM; Sevastyanova, T.; Harmsen, MC; Kzhyshkowska, J. Rhywogaethau ocsigen adweithiol (ROS) mewn actifadu macrophage a swyddogaeth mewn diabetes. Imiwnobioleg 2019, 224, 242–253. [CrossRef]
5. Lin, MT; Beal, MF camweithrediad Mitocondriaidd a straen ocsideiddiol mewn clefydau niwroddirywiol. Natur 2006, 443, 787–795. [CrossRef] [PubMed]
6. Therond, P. Straen ocsideiddiol, ac iawndal i fiomoleciwlau (lipidau, proteinau, DNA). Ann. Pharm. Mae Tad. 2006, 64, 383–389. [CrossRef]
7. Ermak, G. ; Davies, KJA Calsiwm a straen ocsideiddiol: O signalau celloedd i farwolaeth celloedd. Mol. Imiwnol. 2002, 38, 713–721. [CrossRef]
8. Wadhwa, R. ; Gupta, R.; Maurya, PK Straen Ocsidiol a Heneiddio Carlam mewn Anhwylder Niwro-ddirywiol a Niwroseiciatrig. Curr. Pharm. Des. 2018, 24, 4711–4725. [CrossRef]
9. Maritim, AC; Sanders, RA; Watkins, Diabetes JB, straen ocsideiddiol, a gwrthocsidyddion: Adolygiad. J. Biochem. Mol. Gwenwynig. 2003, 17, 24–38. [CrossRef]
10. Sinha, N.; Dabla, PK Straen ocsideiddiol, a gwrthocsidyddion yn y gorbwysedd - adolygiad cyfredol. Curr. Hypertens. Parch 2015, 11, 132–142. [CrossRef]
11. Klaunig, JE Straen Oxidative a Chanser. Curr. Pharm. Des. 2018, 24, 4771–4778. [CrossRef] [PubMed]
12. Sies, H. Straen ocsideiddiol: Cysyniad mewn bioleg rhydocs a meddygaeth. Redox Biol. 2015, 4, 180–183. [CrossRef]
13. Pietta, P.-G. Flavonoids fel gwrthocsidyddion. J. Nat. Prod. 2000, 63, 1035–1042. [CrossRef]
14. Halliwell, B. ; Gutteridge, Radicaliaid Rhydd JMC mewn Bioleg a Meddygaeth, 5ed arg.; Gwasg Prifysgol Rhydychen: Rhydychen, DU, 2015; ISBN 9780198717478.
15. Hollman, PC; Katan, MB Flavonoidau dietegol: cymeriant, effeithiau iechyd, a bio-argaeledd. Cemegydd Bwyd. Gwenwynig. Int. J. Cyhoedd. Br. Ddiwydiannol Biol. Res. Cymdeithasfa. 1999, 37, 937–942. [CrossRef]
16. Hertog, MG; Hollman, PC; Katan, MB; Kromhout, D. Cymeriant flavonoidau a allai fod yn wrthgarsinogenig a'u penderfynyddion mewn oedolion yn yr Iseldiroedd. Nutr. Canser 1993, 20, 21–29. [CrossRef]
17. Martinez, A.S.; González, J.; Culebras, J.; Tuñón, M. Flavonoides: Propiedades y acciones gwrthocsidyddion. Nutr. Hosp. 2002, 17, 271–278.
18. Arteaga, C. ; Bustillos, A. ; Gómez, J. Migración de neutrófifilos en larvas de pez cebra expuestos a extractos de sofrito de tomate. Arch. Latinoam. Nutr. 2021, 70, 216–224. [CrossRef]
19. Ifanc, AJ; Carotenoidau Lowe, GL - Priodweddau gwrthocsidiol. Gwrthocsidyddion 2018, 7, 28. [CrossRef] [PubMed]
20. Xavier, AO; Pérez-Gálvez, A. Carotenoidau fel Ffynhonnell Gwrthocsidyddion yn y Diet. Isgell. Biocemeg. 2016, 79, 359–375. [CrossRef] [PubMed]
21. Stahl, W. ; Sies, H. Gweithgaredd gwrthocsidiol carotenoidau. Mol. Asp. Med. 2003, 24, 345–351. [CrossRef]
22. Boix, N. ; Teixido, E.; Pique, E. ; Llobet, JM; Gomez-Catalan, J. Modiwleiddio ac Amddiffyn Effeithiau Cyfansoddion Gwrthocsid yn erbyn Gwenwyndra Datblygiadol a Achosir gan Ocsidyddion mewn Sebrafish. Gwrthocsidyddion 2020, 9, 721. [CrossRef]
23. Fenton, HJH Ocsidiad asid tartarig ym mhresenoldeb haearn. J. Chem. Soc. traws. 1894, 65, 899–910. [CrossRef]
24. Phaniendra, A. ; Jestadi, DB; Periyasamy, L. Radicaliaid Rhydd: Priodweddau, Ffynonellau, Targedau, a'u Goblygiad Mewn Amryw Glefydau. Indiaidd J. Clin. Biocemeg. 2015, 30, 11–26. [CrossRef] [PubMed]
25. Fernández-Pachón, MS; Villaño, D.; Troncoso, AC; García-Parrilla, MC Revisión de los métodos de evaluación de la actividad antioxidante in vitro del vino a valoración de sus efectos in vivo. Arch. Latinoam. Nutr. 2006, 56, 110–122. [PubMed] 26. Cavia-Saiz, M.; Busto, MD; Pilar-Izquierdo, MC; Ortega, N.; Perez-Mateos, M.; Muñiz, P. Priodweddau gwrthocsidiol, gweithgaredd scavenging radical, a gallu amddiffyn biomoleciwl o naringenin flavonoid a'i naringin glycoside: Astudiaeth gymharol. J. Sci. Bwyd Amaeth. 2010, 90, 1238–1244. [CrossRef] [PubMed]
27. Patel, K. ; Singh, GK; Patel, DK Adolygiad o Agweddau ffarmacolegol a dadansoddol ar naringenin. Gên. J. Integr. Med. 2014, 24, 551–560. [CrossRef]
28. Rashmi, R.; Magesh, SB; Ramkumar, KM; Suryanarayanan, S.; Subbarao, MV Mae potensial gwrthocsidiol naringenin yn helpu i amddiffyn meinwe'r afu rhag difrod a achosir gan streptozotocin. Biochem Cynrychiolydd. Mol. Biol. 2017, 7, 76–84.
29. Shukla, R.; Pandey, V. ; Vadnere, Meddyg Teulu; Lodhi, S. Pennod 18 - Swyddogaeth flavonoidau wrth Reoli Anhwylderau Llidiol. Mewn Bwyd Bioactif fel Ymyriadau Deietegol ar gyfer Arthritis a Chlefydau Llidiol Cysylltiedig; Watson, RR, Preedy, VR, Gol.; Gwasg Academaidd: Llundain, DU, 2019; tt 293–322; ISBN 978-0-12-813820-5.
30. Chen, YH; Yang, ZS; Wen, CC; Chang, YS; Wang, CC; Hsiao, CA; Shih, TL Gwerthusiad o berthynas strwythur-gweithgaredd flavonoidau fel gwrthocsidyddion a gwenwynyddion larfa pysgod sebra. Cemegydd Bwyd. 2012, 134, 717–724. [CrossRef]
31. Cushman, M.; Zhu, H.; Geahlen, RL; Kraker, Synthesis AJ a Gwerthusiad Biocemegol o Gyfres o Aminofllavones fel Atalyddion Posibl Kinases Protein-Tyrosine p56lck, EGFr, a p60v-src. J. Med. Cemeg. 1994, 37, 3353–3362. [CrossRef]
32. Ciffi, G. ; Pesca, MS; De Caprariis, P.; Braca, A.; Severino, L.; De Tommasi, N. Cyfansoddion ffenolig mewn olew olewydd a pomace olewydd o Cilento (Campania, yr Eidal) a'u gweithgaredd gwrthocsidiol. Cemegydd Bwyd. 2010, 121, 105–111. [CrossRef]

33. Bulotta, S.; Corradino, R.; Celano, M.; D'Agostino, M.; Maiuolo, J. ; Oliverio, M.; Procopio, A. ; Ianone, M.A.; Rotiroti, D.; Russo, D. Effeithiau antiproliferative a gwrthocsidiol ar gelloedd canser y fron oleuropein a'i ddeilliadau hyperasetylaidd lledsynthetig. Cemegydd Bwyd. 2011, 127, 1609–1614. [CrossRef]
34. Han, J. ; Talorete, TPN; Yamada, P.; Isoda, H. Effeithiau gwrth-amlhau ac apoptotig oleuropein a hydroxytyrosol ar gelloedd MCF-7 canser y fron dynol. Cytotechnoleg 2009, 59, 45–53. [CrossRef] [PubMed]
35. Liang, N. ; Kitts, DD Rôl asidau clorogenig wrth reoli cyflyrau straen ocsideiddiol a llidiol. Maetholion 2015, 8, 16. [CrossRef] [PubMed]
36. Park, S.-Y.; Freedman, ND; Haiman, CA; Le Marchand, L.; Wilkens, o'r chwith i'r dde; Setiawan, Cymdeithas Bwyta Coffi VW Gyda Marwolaethau Cyfanswm ac Achosion Penodol Ymhlith Poblogaethau Heb fod yn Wyn. Ann. Intern. Med. 2017, 167, 228–235. [CrossRef] [PubMed]
37. Tajik, N.; Tajik, M.; Mack, I. ; Enck, P. Effeithiau posibl asid clorogenig, y prif gydrannau ffenolig mewn coffi, ar iechyd: Adolygiad cynhwysfawr o'r llenyddiaeth. Eur. J. Nutr. 2017, 56, 2215–2244. [CrossRef] [PubMed]
38. Poole, R. ; Kennedy, IO; Roderick, P.; Fallowfifield, JA; Hayes, PC; Parkes, J. Defnydd coffi ac iechyd: adolygiad ymbarél o feta-ddadansoddiadau o ganlyniadau iechyd lluosog. BMJ 2017, 359, j5024. [CrossRef] [PubMed]
39. Tanvir, EM; Hossen, Llsgr.; Hossain, MF; Afroz, R.; Gan, SH; Khalil, MI; Karim, N. Priodweddau Gwrthocsidiol Tyrmerig Poblogaidd (Curcuma longa) Amrywiaethau o Bangladesh. J. Cymhwyster Bwyd. 2017, 2017, 8471785. [CrossRef]
40. Fiedor, J. ; Burda, K. Rôl bosibl carotenoidau fel gwrthocsidyddion mewn iechyd a chlefydau dynol. Maetholion 2014, 6, 466–488. [CrossRef]
41. Eggersdorfer, M.; Wyss, A. Carotenoidau mewn maeth ac iechyd dynol. Arch. Biocemeg. Bioffys. 2018, 652, 18–26. [CrossRef]
42. Padmanabhan, P. ; Cheema, A. ; Paliyath, G. Ffrwythau Solanaceous Yn Cynnwys Tomato, Eggplant, a Phupurau, argraffiad 1af.; Elsevier Ltd: Llundain, DU, 2015.
43. Kataja-Tuomola, MK; Kontto, YH; Männistö, S.; Albanes, D.; Virtamo, JR Effaith ychwanegiad alffa-tocopherol a beta-caroten ar gymhlethdodau macro-fasgwlaidd a marwolaethau llwyr o ddiabetes: Canlyniadau Astudiaeth ATBC. Ann. Med. 2010, 42, 178–186. [CrossRef]
44. Ambati, RR; Moi, PS; Ravi, A.S.; Aswathanarayana, RG Astaxanthin: Ffynonellau, echdynnu, sefydlogrwydd, gweithgareddau biolegol, a'i gymwysiadau masnachol - Adolygiad. Mar. Cyffuriau 2014, 12, 128–152. [CrossRef] [PubMed]
45. Dennery, PA Effeithiau straen ocsideiddiol ar ddatblygiad embryonig. Diffygion Geni Res. C Embryo Heddiw 2007, 81, 155–162. [CrossRef] [PubMed]
46. ​​Selderslaghs, IWT; Blust, R. ; Witters, AU Astudiaeth ddichonoldeb o'r assayfish zebra fel dull amgen i sgrinio ar gyfer gwenwyndra datblygiadol ac embryotoxicity gan ddefnyddio set hyfforddi o 27 cyfansoddion. Atgynhyrchu. Gwenwynig. 2012, 33, 142–154. [CrossRef]
47. Kimmel, CB; Ballard, WW; Cimmel, SR; Ullmann, B. ; Schilling, TF Camau datblygiad embryonig y pysgodyn sebra. Dev. Dyn. 1995, 203, 253–310. [CrossRef] [PubMed]
48. Teixidó, E. ; Piqué, E.; Gómez-Catalán, J.; Llobet, JM Asesiad o oedi datblygiadol yn y asesiad teratogenedd embryo zebrafish. Gwenwynig. In Vitro 2013, 27, 469–478. [CrossRef] [PubMed]